CN112955141A - 用于在哺乳动物细胞中诱导组织再生和衰老细胞裂解的改善方法 - Google Patents

用于在哺乳动物细胞中诱导组织再生和衰老细胞裂解的改善方法 Download PDF

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Abstract

本发明的方面包括组合物和用于发现新的组合物并将所述组合物应用于通过对调控再生和衰老细胞裂解的分子通路的调节(通过改变哺乳动物细胞的胚胎‑胎儿和出生前/出生后的过渡状态的方式)治疗包括衰老、退行性疾病、创口治疗和癌症的疾病的方法通路。

Description

用于在哺乳动物细胞中诱导组织再生和衰老细胞裂解的改善 方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年4月23日提交的美国临时专利申请序列号62/661,322的优先权及其利益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及用于筛选通过调节分子通路来治疗包括衰老、退行性疾病和癌症的疾病的新的治疗制剂的组合物和方法，所述分子通路通过改变哺乳动物细胞的胚胎-胎儿和出生前/出生后的过渡状态的方式调控再生和衰老细胞裂解。
背景技术
干细胞技术的进步，例如人多能干(hPS)细胞(包括但不限于人胚胎干(hES)和人诱导的多能干(hiPS)细胞)的分离和体外增殖，构成了医学研究的一个重要的新领域。hPS细胞具有已证明的在未分化的状态下增殖或被诱导分化成人体内任何和所有细胞类型的潜能(Thomson等,Science 282:1145-1147(1998))。hPS细胞分化成所有体细胞类型的独特固有能力在逻辑上为用于生产治疗多种退行性疾病的具有相似多样性的可移植hPS衍生细胞提供了一个平台。尽管目前hES和hiPS细胞的这种多能性已被广泛认可，但被较少认可和甚少被研究的是体外培养的hPS细胞产生相对未分化的胚胎原基的独特能力。
甚至更少被研究的是hPS细胞衍生细胞分化成被认可的细胞类型(例如仍显示出使其区别于胎儿或成年细胞的基因表达的微妙的出生前或甚至胎儿前模式的心肌细胞或骨软骨细胞)的潜能。紧接体内胚胎-胎儿过渡(EFT)之前，哺乳动物分化细胞和组织(例如皮肤、心脏和脊髓)显示出深厚的无瘢痕再生的潜能，所述无瘢痕再生的潜能在EFT之后逐渐丧失。对于某些组织(例如人心脏)而言，在出生前-出生后过渡(PPT)期约一周后，可以检测到无瘢痕再生的潜能。鉴于理解和调节组织再生和组织生长对于再生医学和肿瘤学领域的重要性，用于体外和体内生物学建模和调节的改善方法在研究和临床实践中具有重大的潜在功用。
多能干细胞和衍生的胚状体在体外自组装成三维类器官的潜能已作为获得移植组织(Singh等,Stem Cells Dev.2015.24(23):2778-95)以及对人胚胎发育建模的潜在通路引起了人们的兴趣。本发明教导了所述类器官的形成是对细胞在EFT之前经历组织生成和/或再生的固有潜能的反映。与胚胎细胞相反，胎儿和成体来源的细胞经常显示出降低的体外器官发生和体内表形(epimorphic)再生的潜能。表形再生，有时被称为“表变态”，是指组织再生的一种类型，其中相对未分化的间充质的芽基(blastema)在损伤部位增殖，然后细胞分化以恢复原始的组织学。虽然表形再生潜能丧失的发育时间无法被精确确定，并且可能随组织类型而变化，但是，约在人发育八周结束时发生的EFT(Carnegie Stage 23；O’Rahilly,R.,F.Müller(1987)Developmental Stages in Human Embryos,Including aRevision of Streeter’s‘Horizons’and a Survey of the CarnegieCollection.Washington,Carnegie Institution of Washington)似乎在时间上对应于胎盘哺乳动物中皮肤再生的丧失(Walmsley,G.G.等，2015.Scarless Wound Healing:Chasing the Holy Grail Plast Reconstr Surg.135(3):907-17)。物种之间的相关性显示出胚胎或幼体状态中增加的再生潜力(其被评论于Morgan，T.H.(1901).Regeneration(New York:The MacMillan Company)中被评论；也被评论于Sanchez Alvarado,A.，andTsonis，P.A.(2006)Bridging the regeneration gap:genetic insights from diverseanimal models.Nat Rev.Genet.7,873-884)。这启示了与瘢痕化不同，组织再生反映了胚胎表型(如不同于胎儿或成体表型)的存在，虽然目前在科学界中尚未达成表形组织再生是基因表达的胚胎(出生前的，更具体地，胎儿前的)模式的共识。对某些物种而言，发育时间的变化(异时性)与深厚的再生潜能相关，例如在墨西哥钝口螈(Mexican salamanderaxolotl，A.mexicanum)中观察到的幼体发育的发育停滞(异时性)和肢体再生的发育停滞的情况(Voss，S.R.等，Thyroid hormone responsive QTL and the evolution ofpaedomorphic salamanders.Heredity(2012)109,293-298)。
尽管有这些观察结果，但是EFT的标志物和测试特定分子在调控EFT以治疗退行性疾病或癌症中的作用的方法仍然有限。我们先前公开了在“哺乳动物物种中诱导组织再生的组合物和方法(Compositions and Methods for Induced Tissue Regeneration inMammalian Species)”(国际专利申请公开号WO 2014/197421)(其全部内容通过引用并入本文)和“用于检测和调节哺乳动物物种中胚胎-胎儿过渡的改善方法”(国际专利申请公开号WO 2017/214342，其全部内容通过引用并入本文)中描述的与哺乳动物物种中EFT的标志物有关的组合物和方法，和它们在调节组织再生和癌症诊断中的用途。前述组合物和方法部分地基于允许hPS细胞衍生的胚胎祖细胞系克隆扩增的方法，所述方法提供了增殖具有可用于以无瘢痕的方式再生组织(例如皮肤)的出生前基因表达模式的新颖多样且高度纯化的细胞系的手段。这样的细胞类型在研究中和在基于细胞的疗法的制备中具有重要的应用(参见2006年4月11日提交的题为“具有出生前的基因表达模式的细胞的新用途(NovelUses of Cells With Prenatal Patterns of Gene Expression)”的PCT申请序列号PCT/US2006/013519)；2006年11月21日提交的题为“加速从多能干细胞中分离新型细胞株的方法和由此获得的细胞(Methods to Accelerate the Isolation of Novel Cell Strainsfrom Pluripotent Stem Cells and Cells Obtained Thereby)”的美国专利申请序列号11/604,047；和2009年7月16日提交的题为“加速从多能干细胞中分离新型细胞株的方法和由此获得的细胞(Methods to Accelerate the Isolation of Novel Cell Strains fromPluripotent Stem Cells and Cells Obtained Thereby)”的美国专利申请序列号12/504,630，其中全部内容各自通过引用并入本文)。但是，需要用于调节EFT以治疗退行性疾病和癌症的其他改善方法和组合物。本发明教导了与用于无瘢痕哺乳动物再生疗法的EFT的检测和调节有关的组合物和方法，所述无瘢痕哺乳动物再生疗法被用于多种应用，包括但不限于衰老和与年龄相关的退行性疾病和多种类型的恶性肿瘤。
发明内容
本发明的发明人教导了无瘢痕组织再生的潜能存在于某些原始物种(例如水螅和涡虫)的整个生命历程中，但是在大多数哺乳动物物种中局限于早期发育。本发明的发明人进一步教导了在通过提供肿瘤抑制来使所述生物体受益的哺乳动物中，胚胎发生完成后发生次序性分子变化，但是上述变化具有抑制之后在许多组织中无瘢痕再生和衰老细胞裂解的潜能的有害作用(拮抗基因多效性)。因此，教导了胚胎发生后的对再生的抑制干扰了成体中随后的肿瘤生长。在另一个方面，本文教导了衰老细胞裂解(被定义为具有显著DNA损伤(例如与功能障碍的端粒相关的DNA损伤)的细胞的程序性细胞凋亡)在胚胎发生后被抑制，因为组织不再能够再生，无法取代已经历了衰老细胞裂解的细胞该简单原因。因此，能够再生的组织倾向于易发生衰老细胞的细胞凋亡，而那些不能够再生的组织倾向于抑制细胞凋亡。因此，本发明的发明人教导了细胞再生或经历衰老细胞裂解的固有能力是由与哺乳动物中正常发育有关的分子机制(更具体地，与EFT有关的那些改变)调控的。
此外，本发明的发明人教导了改变成年哺乳动物组织中EFT的分子调控以恢复胚胎的基因表达模式(在此被称为“诱导的组织再生(induced Tissue Regeneration)”或“iTR”，其能够诱导增加的全身无瘢痕组织再生，同时能够诱导衰老细胞裂解)。
进一步地，本发明的发明人教导了尽管大多数恶性癌细胞恢复至胚胎的基因表达模式(在本文中被称为“胚胎-肿瘤表型”或“EOP”(以例如抑制COX7A1的表达为特征)，EOP不稳定，肿瘤细胞的子集转移至成体基因表达模式。结果，当肿瘤暴露于基因毒性刺激时，例如当用化学治疗剂或放射疗法治疗患者时，大多数具有对细胞凋亡相对敏感的EOP的癌症细胞被破坏，而剩余数量的在基因表达模式中(例如在表达COX7A1中)相对成年的细胞则对细胞凋亡具有抗性并能够引起癌的进一步的生长和对化学或放射疗法的抗性。因此，出人意料地，发明人教导了违反直觉的解释，即通常被认为是“癌症干细胞”或“CSC”的细胞实际上不是未成熟的祖细胞，但出人意料地，情况恰恰相反，CSC是更成熟的成年样细胞(表达例如更多的COX7A1)。这种理解提供监测肿瘤或血液中胚胎标志物或成年标志物的存在的新的诊断和治疗策略作为使用iTR因子治疗癌症(以使癌细胞回复至胚胎基因表达模式以使它们再次能够在化学疗法或放射疗法的存在下进行衰老细胞裂解)的癌症诊断和伴随治疗策略。
本公开提供了用于鉴定和利用可用于调节哺乳动物细胞和组织中的胚胎-胎儿过渡(EFT)的化合物、组合物和方法的筛选。更具体地，本发明提供了用于鉴定和利用可用于筛选和使用能够调节调控哺乳动物细胞中的EFT的分子通路的试剂的化合物、组合物和方法的筛选，目的在于在原本完全无法引起这种无瘢痕再生的细胞和组织中引起iTR。另外，本公开提供了用于鉴定和利用能够在癌症干细胞(在本文中被称为“诱导的癌症干细胞的衰老细胞裂解”或“iS-CSC”)中引起iTR的试剂的筛选，以将CSC回复至胚胎表型的(胎儿前的)基因表达模式，并检测和靶向已回复至胚胎表型的恶性细胞以诊断和治疗癌症，并筛选能够引起iS-CSC的试剂。
最后，本公开提供了用于鉴定和利用试剂的筛选，所述试剂能够在衰老的哺乳动物组织中或总体地在整个哺乳动物体内引起iTR和衰老细胞裂解以将衰老的组织回复至具有胚胎的基因表达模式的胚胎(胎儿前)表型，从而引起衰老细胞的细胞凋亡和其从所述衰老细胞的去除(iTR相关的衰老细胞裂解)，同时另外在所述组织中诱导再生潜能以取代已经历细胞凋亡的所述衰老细胞。
在本公开的一个方面，提供了允许研究人员鉴定能够进行iTR的试剂的方法，所述方法包括以下步骤：1)以促进成年哺乳动物细胞对外源性试剂的暴露的形式培养所述细胞，2)将外源性候选分子并置(juxtaposition)添加至所述细胞，3)测量所述细胞中EFT的分子标志物的表达以确定所述试剂是否引起iTR。
在本公开的另一个方面，提供了允许研究人员鉴定能够进行iTR的试剂的方法，所述方法包括以下步骤：1)以促进成年人真皮成纤维细胞对外源性试剂的暴露的多孔形式在体外培养所述细胞，2)在不同的时间段中将iTR的外源性候选分子调节子以不同的组合并置添加至所述细胞，3)从所述细胞制备RNA并测量所述细胞中COX7A1转录本的水平，以确定所述试剂是否引起iTR。
在本公开的另一个方面，提供了允许研究人员鉴定能够进行iTR的试剂的方法，所述方法包括以下步骤：1)培养携带信号转导EFT的报告基因的TERT永生化的成年人真皮成纤维细胞，2)在不同的时间段中将iTR的外源性候选分子调节子以不同的组合并置添加至所述细胞，3)测量所述细胞中信号转导EFT的报告基因的表达，以确定所述试剂是否引起iTR。
在本公开的另一个方面，提供了在体内产生iTR以治疗退行性疾病的方法。所述方法包括将活性因子的混合物在受影响的组织上应用17天，所述活性因子的混合物为：浓度为0.05-5.0mM，优选地为1.0mM的丙戊酸；浓度为7.0nM-10uM，优选地为10uM的GSK-3抑制因子6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈(又名CHIR99021)；浓度为4.0nM-10uM的，优选地为10uM的TGFβR-1/ALK5的抑制因子2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(又名RepSox)；浓度为2.0-10uM，优选地为10uM的赖氨酸特异性去甲基化酶1的抑制因子Parnate(又名反苯环丙胺)；浓度为0.5-50uM，优选地为50uM的腺苷酸环化酶的激活因子Forskolin；浓度为1.0nM-5uM，优选地为5.0uM的类维生素A受体激动剂芳维甲酸(又名4-[(E)-2-(5,5,8,8-四甲基-6,7-二氢萘-2-基)丙-1-烯基]苯甲酸或TTNPB)；然后在另外的14天中将以下添加至所述混合物：浓度为0.05-0.24uM，优选地为0.1uM的EZH2抑制因子(1S,2R,5R)-5-(4-氨基咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)-3-(羟甲基)环戊-3-烯-1,2-二醇(又名3-Deazaneplanocin A(DZNep))；然后在最后的7天中，中止上述因子并应用浓度为0.1nM-1.0uM，优选地为1.0uM的MEK/ERK通路的抑制因子N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯胺)苯甲酰胺(又名PD0325901)和浓度为7.0nM-10uM，优选地为10uM的GSK-3抑制因子6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈(又名CHIR99021)，在生理相容性载剂中配制所有上述因子。
在本公开的另一个方面，提供了方法和激活端粒酶的试剂一起以在体内产生iTR以治疗退行性疾病。所述方法包括将活性因子的混合物在受影响的组织上应用17天，所述活性因子的混合物为：浓度为0.05-5.0mM，优选地为1.0mM的丙戊酸；浓度为7.0nM-10uM，优选地为10uM的GSK-3抑制因子6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈(又名CHIR99021)；浓度为4.0nM-10uM的，优选地为10uM的TGFβR-1/ALK5的抑制因子2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(又名RepSox)；浓度为2.0-10uM，优选地为10uM的赖氨酸特异性去甲基化酶1的抑制因子Parnate(又名反苯环丙胺)；浓度为0.5-50uM，优选地为50uM的腺苷酸环化酶的激活因子Forskolin；浓度为1.0nM-5uM，优选地为5.0uM的类维生素A受体激动剂芳维甲酸(又名4-[(E)-2-(5,5,8,8-四甲基-6,7-二氢萘-2-基)丙-1-烯基]苯甲酸或TTNPB)；然后在另外的14天中将以下添加至所述混合物：浓度为0.05-0.24uM，优选地为0.1uM的EZH2抑制因子(1S,2R,5R)-5-(4-氨基咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)-3-(羟甲基)环戊-3-烯-1,2-二醇(又名3-Deazaneplanocin A(DZNep))；然后在最后的7天中，中止上述因子并应用浓度为0.1nM-1.0uM，优选地为1.0uM的MEK/ERK通路的抑制因子N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯胺)苯甲酰胺(又名PD0325901)和浓度为7.0nM-10uM，优选地为10uM的GSK-3抑制因子6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈(又名CHIR99021)，在生理相容性载剂中与激活端粒酶催化组分TERT的试剂(例如在患病的细胞或组织中表达TERT基因治疗构建体)一起配制所有上述因子。
在本公开的另一个方面，提供了在体内产生iTR以治疗癌症，更具体地，在化学疗法或放射疗法之后敏化剩余的残留癌细胞的方法。所述方法包括将活性因子的混合物在受影响的组织上应用17天，所述活性因子的混合物为：浓度为0.05-5.0mM，优选地为1.0mM的丙戊酸；浓度为7.0nM-10uM，优选地为10uM的GSK-3抑制因子6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈(又名CHIR99021)；浓度为4.0nM-10uM的，优选地为10uM的TGFβR-1/ALK5的抑制因子2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(又名RepSox)；浓度为2.0-10uM，优选地为10uM的赖氨酸特异性去甲基化酶1的抑制因子(名为Parnate)(又名反苯环丙胺)；浓度为0.5-50uM，优选地为50uM的腺苷酸环化酶的激活因子Forskolin；浓度为1.0nM-5uM，优选地为5.0uM的类维生素A受体激动剂芳维甲酸(又名4-[(E)-2-(5,5,8,8-四甲基-6,7-二氢萘-2-基)丙-1-烯基]苯甲酸或TTNPB)；然后在另外的14天中将以下添加至所述混合物：浓度为0.05-0.24uM，优选地为0.1uM的EZH2抑制因子(1S,2R,5R)-5-(4-氨基咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)-3-(羟甲基)环戊-3-烯-1,2-二醇(又名3-Deazaneplanocin A(DZNep))；然后在最后的7天中，中止上述因子并应用浓度为0.1nM-1.0uM，优选地为1.0uM的MEK/ERK通路的抑制因子N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯胺)苯甲酰胺(又名PD0325901)和浓度为7.0nM-10uM，优选地为10uM的GSK-3抑制因子6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈(又名CHIR99021)，在生理相容性载剂中配制所有上述因子，然后进行其他适用的化学疗法或放射疗法的疗程。
在本公开的另一个方面，提供了在体内产生衰老细胞裂解以治疗与衰老相关的疾病，更具体地，使衰老细胞对细胞凋亡敏感的方法。所述方法包括将活性因子的混合物在受影响的组织上应用17天，所述活性因子的混合物为：浓度为0.05-5.0mM，优选地为1.0mM的丙戊酸；浓度为7.0nM-10uM，优选地为10uM的GSK-3抑制因子6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈(又名CHIR99021)；浓度为4.0nM-10uM的，优选地为10uM的TGFβR-1/ALK5的抑制因子2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(又名RepSox)；浓度为2.0-10uM，优选地为10uM的赖氨酸特异性去甲基化酶1的抑制因子(名为Parnate)(又名反苯环丙胺)；浓度为0.5-50uM，优选地为50uM的腺苷酸环化酶的激活因子Forskolin；浓度为1.0nM-5uM，优选地为5.0uM的类维生素A受体激动剂芳维甲酸(又名4-[(E)-2-(5,5,8,8-四甲基-6,7-二氢萘-2-基)丙-1-烯基]苯甲酸或TTNPB)；然后在另外的14天中将以下添加至所述混合物：浓度为0.05-0.24uM，优选地为0.1uM的EZH2抑制因子(1S,2R,5R)-5-(4-氨基咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)-3-(羟甲基)环戊-3-烯-1,2-二醇(又名3-Deazaneplanocin A(DZNep))；然后在最后的7天中，中止上述因子并应用浓度为0.1nM-1.0uM，优选地为1.0uM的MEK/ERK通路的抑制因子N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯胺)苯甲酰胺(又名PD0325901)和浓度为7.0nM-10uM，优选地为10uM的GSK-3抑制因子6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈(又名CHIR99021)，在生理相容性载剂中配制所有上述因子。
在本领域技术范围内的某些常规的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、微生物学、重组核酸(例如DNA)技术、免疫学等的技术可被用于本发明的方面中。这些技术中的某些的非限制性描述可在以下出版物中找到：Ausubel,F.等(编者),Current Protocols inMolecular Biology,Current Protocols in Immunology,Current Protocols inProtein Science,and Current Protocols in Cell Biology,all John Wiley&Sons,N.Y.,2008版；Sambrook、Russell和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3.sup.rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,2001；Harlow,E.and Lane,D.,Antibodies—A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,1988；Bums,R.,Immunochemical Protocols(Methods in Molecular Biology)Humana Press；第3版,2005,Monoclonal antibodies:apractical approach(P.Shepherd and C Dean(编者),Oxford University Press,2000)；Freshney,R.I.,“Culture of Animal Cells,A Manual of Basic Technique”,第5版,John Wiley&Sons,Hoboken,N J,2005)。本文提及的所有专利、专利申请、网站、数据库、科学文章和其他出版物的全部内容均通过引用并入本文。
附图说明
图1显示了在hES细胞、不同的hEP系、出生后发育全程的EFT期间的人臂成纤维细胞、在重编程为iPS细胞之前和之后的成年臂成纤维细胞和在用AGEX1547诱导iTR之前和之后的成年臂成纤维细胞中的COX7A1的表达。误差棒显示标准差(St.Dev)。
图2显示了在hES细胞、不同的hEP系、出生后发育全程的EFT期间的人臂成纤维细胞、在重编程为iPS细胞之前和之后的成年臂成纤维细胞和在用AGEX1547诱导iTR之前和之后的成年臂成纤维细胞中的ADIRF表达。误差棒显示标准差。
图3显示了在hES细胞、不同的hEP系、出生后发育全程的EFT期间的人臂成纤维细胞、在重编程为iPS细胞之前和之后的成年臂成纤维细胞和在用AGEX1547诱导iTR之前和之后的成年臂成纤维细胞中的TNFRSF11B的表达。误差棒显示标准差。
图4显示了在hES细胞、不同的hEP系、出生后发育全程的EFT期间的人臂成纤维细胞、在重编程为iPS细胞之前和之后的成年臂成纤维细胞和在用AGEX1547诱导iTR之前和之后的成年臂成纤维细胞中的AMH表达。误差棒显示标准差。
图5显示了在hES细胞、不同的hEP系、出生后发育全程的EFT期间的人臂成纤维细胞、在重编程为iPS细胞之前和之后的成年臂成纤维细胞和在用AGEX1547诱导iTR之前和之后的成年臂成纤维细胞中的COL1A1表达。误差棒显示标准差。
图6显示了在hES细胞、不同的hEP系、出生后发育全程的EFT期间的人臂成纤维细胞、在重编程为iPS细胞之前和之后的成年臂成纤维细胞和在用AGEX1547诱导iTR之前和之后的成年臂成纤维细胞中的POU5F1(OCT4)表达。误差棒显示标准差。
图7显示了TUNEL测定结果，其比较了hES细胞衍生的克隆胚胎祖细胞系4D20.8和30MV2-6与暴露于0nM、0.037nM和3.7nM的Thapsigargin的成年对应物MSC和HAEC细胞。
图8显示了可用于筛选的候选小分子iTR因子、TR抑制因子基因和TR激活因子基因的列表。
图9显示了对实施例4中第一组样品的COX7A1表达。
图10显示了对实施例5中第二组样品的COX7A1表达。
具体实施方式
缩写
AC-源自成体的细胞
AMH-抗缪勒管激素(Anti-Mullerian Hormone)
ASC-成年干细胞
cGMP-当前的良好生产流程
CM-癌症成熟
CSC-癌症干细胞
CNS-中枢神经系统
DMEM-Dulbecco改良Eagle培养基
DMSO-二甲基亚砜
DNAm-提供细胞和组织年龄的标志物或“时钟”的DNA甲基化中的变化。
DNN-深度神经网络
DPBS-Dulbecco磷酸盐缓冲盐水
ED细胞-源自胚胎的细胞；hED细胞是人ED细胞
EDTA-乙二胺四乙酸
EFT-胚胎-胎儿过渡
EG细胞-胚胎生殖细胞；hEG细胞是人EG细胞
EOP-胚胎-肿瘤表型
EP-胚胎祖细胞
ES细胞-胚胎干细胞；hES细胞是人ES细胞
ESC-胚胎干细胞
FACS-荧光激活细胞分选
FBS-胎牛血清
FPKM-每百万个来自RNA测序的映射读取的每千个碱基转录本的片段
GFER-肝再生(ALR)的生长因子、增强因子
GFP-绿色荧光蛋白
GMP-良好操作规范
HAEC-人主动脉内皮细胞
hED细胞-源自人胚胎的细胞
hEG细胞-“人胚胎生殖细胞”是源自胎儿组织的原始生殖细胞的干细胞。
HESC-人胚胎干细胞
hiPS细胞-“人诱导的多能干细胞”是具有类似于hES细胞的特性的细胞，其是通过将体细胞暴露于hES特异性转录因子(例如SOX2、KLF4、OCT4、MYC或NANOG、L1N28、OCT4和SOX2)而获得的。
HSE-“人皮肤等效物”是细胞和生物或合成基质的混合物，其是为测试目的或为促进创口修复的治疗应用而制造的。
iCM-诱导的癌症成熟。
iPS细胞-“诱导的多能干细胞”是具有类似于hES细胞的特性的细胞，其是通过将体细胞暴露于hES特异性转录因子(例如SOX2、KLF4、OCT4、MYC、或NANOG、LIN28、OCT4、和SOX2、SOX2、KLF4、OCT4、MYC和(LIN28A或LIN28B)或OCT4、SOX2、KLF4、NANOG、ESRRB、NR5A2、CEBPA、MYC、LIN28A和LIN28B的其他组合)而获得的。
iS-CSC-“诱导的癌症干细胞的衰老细胞裂解”是指通过化学治疗剂或放射疗法对难以消融的恶性肿瘤中的细胞的治疗，其中所述iS-CSC治疗导致所述难治性细胞回复至胎儿前的基因表达模式并变得对化学治疗剂或放射疗法敏感。
iTM-诱导的组织成熟
iTR-诱导的组织再生
MEM-最低基础培养基
MSC-间充质干细胞
NT-核转移
PBS磷酸盐缓冲盐水
PPT-“出生前-出生后过渡”指胎盘哺乳动物细胞在出生一周或一周之内发生的分子变化。
PS成纤维细胞“瘢痕形成前的成纤维细胞”是源自妊娠早期皮肤的皮肤或源自ED细胞的成纤维细胞，所述ED细胞显示出促进真皮创口快速愈合而不形成瘢痕的出生前的基因表达模式。
RFU-相对荧光单位
RNA-seq-RNA测序
SFM-无血清培养基
St.Dev.-标准差
TR组织再生
定义
术语“分析性重编程技术”是指将体细胞的基因表达模式重编程为更多能状态的基因表达模式(例如iPS、ES、ED、EC或EG细胞的基因表达模式)的多种方法，其中所述重编程以多个且离散的步骤发生，并且不仅仅依赖于体细胞至卵母细胞中的转移和该卵母细胞的激活(参见2001年11月26日提交的美国申请号60/332,510；2002年11月26日提交的10/304,020；2003年11月26日提交的PCT申请号PCT/US02/37899；2005年8月3日提交的美国申请号60/705625；2005年8月20日提交的美国申请号60/729173；2006年7月5日提交的美国申请号60/818813；2006年8月3日提交的PCT/US06/30632，其公开内容各自通过引用并入本文)。
术语“诱导的癌症干细胞的衰老细胞裂解”(iS-CSC)是指通过化学治疗剂或放射疗法对难以消融的恶性肿瘤细胞的治疗，其中所述iS-CSC治疗使所述难治性细胞回复至胎儿前的基因表达模式并变得对化学治疗剂或放射疗法敏感。
术语“表达基因X的细胞”、“基因X在细胞中表达”(或细胞群)或其等同物是指使用特定测定平台对细胞进行的分析提供了阳性结果。反之亦然(即不表达基因X的细胞或等同物是指使用特定测定平台对细胞进行的分析提供了阴性结果)。因此，本文所述的任何基因表达结果都与在用于所述基因的一个或多个测定平台中使用的一种或多种特异性探针相关。
术语“细胞系”是指能够在体外增殖和扩增的非永生或永生的细胞群。
术语“克隆”是指细胞群获得了从单个细胞到细胞群的扩增，所述细胞群中的细胞全部都从该原始单个细胞衍生并且不包含其他细胞。
术语“分化的细胞”在被用于指向通过本发明的方法从多能干细胞制备的细胞时是指与亲本多能干细胞相比具有降低的分化潜能的细胞。本发明的分化的细胞包含可以进一步分化的细胞(即它们可可以不终端分化)。
术语“胚胎的”或“胚胎发育阶段”是指细胞、组织或动物的出生前发育阶段，特别是与胎儿和成年细胞相比的细胞的胚胎发育阶段。就人物种而言，从胚胎发育到胎儿发育的过渡发生在出生前发育的约8周时，在小鼠中，它发生于16天或约16天时，而在大鼠物中，发生于交配后约17.5天时。(http://php.med.unsw.edu.au/embryology/index.php？title＝Mouse_Timeline_Detailed)。
术语“胚胎干细胞”(ES细胞)是指源自囊胚、卵裂球或桑椹胚的内细胞团的细胞，所述细胞已作为细胞系连续传代，同时保持未分化的状态(例如表达对所述物种的ES细胞具有特异性的TERT、OCT4和SSEA和TRA抗原)。ES细胞可由卵细胞与精子的受精、或DNA、核转移、孤雌生殖或通过产生在MHC区域中具有半合子或纯合子的hES细胞的手段衍生而来。历史上将ES细胞定义为在被移植到植入前胚胎中时能够分化为所有体细胞类型和种系的细胞；来自许多物种(包括人)的候选ES培养物在培养中的外观更为平坦，并通常不有助于种系分化，因此被称为“ES样细胞”。通常认为人ES细胞实际上是“ES样”的，但是在本申请中我们将使用术语ES细胞来指ES和ES样细胞系两者。
术语“TR的全局调节子”或“iTR的全局调节子”是指能够调节多种iTR基因或iTM基因的试剂，包括但不限于能够在源自胎儿或成年的细胞中下调COX7A1、ADIRF或TNFRSF11B而同时上调AMH并能够诱导引起响应于组织损伤或退行性疾病而增加的无瘢痕组织再生的基因表达模式的试剂。
术语“人胚胎干细胞”(hES细胞)是指人ES细胞。
术语“人诱导的多能干细胞”是指具有与hES细胞相似的特性的细胞，所述特性包括在被移植至免疫功能低下的小鼠中时形成所有三个胚层的能力，其中所述iPS细胞源自暴露于去分化因子(例如hES细胞特异性转录因子组合(KLF4、SOX2、MYC；OCT4或SOX2、OCT4、NANOG和LIN28；或OCT4、SOX2、KLF4、NANOG、ESRRB、NR5A2、CEBPA、MYC、LIN28A和LIN28B的各种组合))或其他诱导体细胞以获得具有类似于hES细胞的特性的多能干细胞状态的方法之后的变化的体细胞系的细胞。但是，通过体细胞核转移(SCNT)对体细胞进行的重编程通常被称为NT-ES细胞而非iPS细胞。
术语“诱导的癌症成熟”是指导致恶性前或恶性细胞表型变化的方法，使得所述细胞在所述诱导之后表达通常在该细胞类型的胎儿或成年发育阶段(而非胚胎阶段)表达的标志物。
术语“诱导的组织再生”是指使用本发明的方法改变胎儿或成年哺乳动物细胞的分子组成，使得所述细胞能够在破坏该组织后再生功能性组织，其中所述再生不会是该物种动物中的正常结局。虽然功能性iTR旨在在损伤处或退行性疾病中产生新的组织形成或在CSC或衰老细胞中诱导衰老细胞裂解，但是本发明的发明人教导了iTR实际上逆转了细胞衰老的许多方面，包括标志物(例如DNAm)，但不包括恢复端粒酶活性。增加的端粒酶活性与iTR一起在本发明中也被定义为“iTR”。
术语“iTR相关的衰老细胞裂解”是指通过将所述受损细胞重编程为胚胎的基因表达模式而对具有显著DNA损伤(包括但不限于细胞衰老(端粒缩短)对DNA的损伤)的衰老组织的细胞中的细胞凋亡的诱导。
术语“分离的”是指一种物质，所述物质(i)通常通过涉及人手的过程与通常在自然界中与所述物质一起被发现的至少某些其他物质分离，(ii)通过人工生产(例如化学合成)而得，和/或(iii)存在于人工环境或背景中(即在自然界中不常见的环境或背景)。
术语“iS-CSC因子”是指以导致TR以及相关的对暴露于化学治疗或放射的疗法的癌细胞的细胞凋亡的敏感性的增加的方式改变TR激活因子和TR抑制因子的水平的分子。
术语“iTR因子”是指以在不具有天然TR能力的组织中导致TR的方式改变TR激活因子和TR抑制因子水平的分子。所述iTR因子还指单个因子的组合。因此，在本文中描述的因子的混合物(包括但不限于名为AgeXl547的混合物)在本申请中被认为是“iTR因子”。
术语“iTR基因”是指当表达改变时能够在通常不能引起诱导的组织再生的组织中引起这种再生的基因。术语“核酸”可与“多核苷酸”互换使用，并且在各种实施方式中包含天然存在的核苷聚合物(例如DNA和RNA)和非天然存在的核苷聚合物或核苷类似物。在某些实施方式中，核酸包含标准核苷(缩写的A、G、C、T、U)。在其他实施方式中，核酸包含一种或多种非标准核苷。在某些实施方式中，一种或多种核苷是非天然存在的核苷或核苷酸类似物。核酸可以包含修饰的碱基(例如甲基化的碱基)，修饰的糖(2’-氟核糖、阿拉伯糖或己糖)，修饰的磷酸基团或核苷或核苷类似物之间的其他键(例如硫代磷酸酯或5’-N-亚磷酰胺键)，锁核酸或吗啉代。在某些实施方式中，核酸包含通过磷酸二酯键连接的核苷，如在DNA和RNA中。在某些实施方式中，至少某些核苷通过非磷酸二酯键连接。核酸可以是单链、双链或部分双链的。至少部分双链核酸可具有一个或多个突出端，例如5’和/或3’突出端。预期将本领域已知可为研究或治疗目的用于RNA干扰(RNAi)、适体或反义分子的背景中的核酸修饰(例如核苷和/或主链修饰，包括非标准核苷的使用)用于本发明的各种实施方式中。参见例如Crooke,S T(编者)Antisense drug technology:principles，strategies,and applications,Boca Raton:CRC Press,2008；Kurreck,J.(编者)Therapeuticoligonucleotides,RSC biomolecular sciences.Cambridge:Royal Society ofChemistry,2008。在某些实施方式中，修饰相对于相同长度和链度的RNA或DNA增加了(例如体内)核酸的半衰期和/或稳定性。在某些实施方式中，修饰相对于相同长度和链度的RNA或DNA降低了核酸的免疫原性。在某些实施方式中，核酸的一条或两条链中5％至95％的核苷被修饰。修饰可以均匀或不均匀地分布，并且可以选择修饰的位置(例如在中间附近、在末端或末端附近、交替的等)以增强所需的特性。核酸可包含可检测的标记，例如荧光染料、放射性原子等。“寡核苷酸”是指相对较短的核酸，例如通常为约4至约60个核苷酸的长度。在本文中提及多核苷酸的地方，应理解都提供了DNA、RNA，并且在每种情况下都提供了单链和双链形式(和每个单链分子的互补物)。如本文所用，“多核苷酸序列”可以指多核苷酸材料本身和/或指生物化学表征特定核酸的序列信息(即用作碱基缩写的字母序列)。除非另有说明，否则本文呈现的多核苷酸序列以5’至3’方向呈现。
术语“寡克隆”是指源自小的细胞群(通常是2-1000个似乎具有相似特征(例如形态或与同一培养中的其他细胞的分化标志物不同的分化标志物的存在或缺失)的细胞)的细胞群。从不具有这些共同特征的细胞中分离出寡克隆细胞，并允许其增殖，从而产生基本上完全源自相似细胞的原始群的细胞群。
术语“多能干细胞”是指能够分化为一种以上的分化的细胞类型的动物细胞。这样的细胞包括hES细胞、卵裂球/桑椹胚细胞及其衍生的hED细胞、hiPS细胞、hEG细胞、hEC细胞和源自成体的细胞(包括间充质干细胞、神经元干细胞和源自骨髓的干细胞)。多能干细胞可以是基因修饰的，也可以不是基因修饰的。基因修饰的细胞可以包括标志物(例如荧光蛋白)以促进它们在卵内的鉴定。
术语“多肽”是指氨基酸的聚合物。术语“蛋白”和“多肽”在本文中可互换使用。肽是相对较短的多肽，通常长度在约2至60个氨基酸之间。本文所用的多肽通常包含标准氨基酸(即在蛋白中最常见的20个L-氨基酸)。然而，在某些实施方式中，多肽可包含一种或多种非标准氨基酸(其可以是天然存在的或非天然存在的)和/或本领域已知的氨基酸类似物。多肽中的一个或多个氨基酸可以被修饰，例如通过用于缀合、官能化等的化学实体(例如糖类基团、磷酸基团、脂肪酸基团、连接子)的添加。具有与之共价或非共价结合的非多肽部分的多肽仍被认为是“多肽”。多肽可以从天然来源纯化而得，使用重组DNA技术生产而得，通过化学手段(如常规固相肽合成等)合成而得。如本文所用，术语“多肽序列”或“氨基酸序列”可以指多肽材料本身和/或生物化学表征多肽的序列信息(即用作氨基酸名称的缩写的连续的字母或三个字母的代码)。除非另有说明，否则本文呈现的多肽序列以N-末端至C-末端的方向呈现。多肽可以是环状的或含有环状部分。当本文讨论天然存在的多肽时，应理解，本发明包括与其任何同源异构体有关的实施方式(例如，由于mRNA的选择性剪接或编辑或由于一个基因的不同等位基因(例如具有一个或多个单核苷酸多态性区别的等位基因(通常此类等位基因与参照序列或共有序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更多的同一性))而从相同基因产生的不同蛋白)。多肽可包含靶向其分泌或特定细胞内区室(例如细胞核)的序列和/或靶向该多肽以进行翻译后修饰或降解的序列。某些多肽可以被合成为前体，所述前体经过翻译后切割或其他加工成为成熟的多肽。在某些情况下，这种切割可能仅在特定的激活事件后发生。在相关的情况下，本发明提供了与前体多肽有关的实施方式和与多肽的成熟版本有关的实施方式。
术语“出生前”是指胎盘哺乳动物的胚胎发育阶段，在所述阶段之前，动物在子宫外无法存活。
术语“原始干细胞”统指能够分化为所有三个主要胚层(内胚层、中胚层和外胚层)以及神经嵴的细胞的多能干细胞。因此，原始干细胞的实例包括但不限于人或非人哺乳动物的ES细胞或细胞系、卵裂球/桑椹胚细胞及其衍生的ED细胞、iPS和EG细胞。
术语“纯化的”是指已从自然界中或最初产生时与之相关的大多数组分中分离出来的试剂或实体(例如化合物)。通常，这种纯化涉及人手的动作。纯化的试剂或实体可以是部分纯化的、基本纯化的或纯的。此类试剂或实体可以是例如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或超过99％纯度的。在某些实施方式中，纯化核酸或多肽，使其构成分别存在于制剂中的核酸或多肽材料的总数的至少75％、80％、855％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。纯度可基于例如干重、色谱追踪图上峰的大小、分子丰度、凝胶上带的强度或与分子丰度相关的任何信号的强度或任何本领域公认的定量方法。在某些实施方式中，水、缓冲液、离子和/或小分子(例如诸如核苷酸或氨基酸的前体)可以任选地存在于纯化的制剂中。纯化的分子可通过将其与其他物质(例如其他细胞物质)分离或通过以达到所需纯度的方式生产来制备。在某些实施方式中，纯化的分子或组合物是指使用任何本领域公认的纯化方法制备的分子或组合物。在某些实施方式中，“部分纯化”是指细胞产生的分子不再存在于细胞内，例如，细胞已被裂解，并且任选地，至少某些细胞物质(例如细胞壁、细胞膜、细胞器)已被移除。
术语“RNA干扰”(RNAi)在本文中与其在本领域中的含义一致地用于指一种现象，凭借所述现象，双链RNA(dsRNA)触发与dsRNA链互补的对应mRNA的序列特异性降解或翻译抑制。应当理解，dsRNA链与mRNA之间的互补性不必是100％，而仅需要足以介导基因表达的抑制(也被称为“沉默”或“敲低”)。例如，互补程度使得所述链能够(i)引导RNA诱导沉默复合物(RISC)中的mRNA的切割；或(ii)引起mRNA的翻译抑制。在某些实施方式中，RNA的双链部分的长度小于约30个核苷酸，例如长度在17至29个核苷酸之间。在某些实施方式中，dsRNA的第一链与靶mRNA有至少80％、85％、90％、95％或100％的互补性，并且dsRNA的另一链与第一链具有至少80％、85％、90％、95％或100％的互补性。在哺乳动物细胞中，可以通过将适当的双链核酸引入细胞内或在细胞内表达核酸(然后在细胞内被处理以在其中产生dsRNA)来实现RNAi。能够介导RNAi的核酸在本文中被称为“RNAi试剂”。能够介导RNAi的示例性核酸是短发夹RNA(shRNA)、短干扰RNA(siRNA)和微小RNA(microRNA)前体。
这些术语是众所周知的，并且在本文中以与它们在本领域中的含义一致的含义被使用。siRNA通常包含两条独立的核酸链，所述核酸链彼此杂交形成双链体。它们可以例如通过使用标准核酸合成技术在体外合成。siRNA通常是双链寡核苷酸，每条链中都有16-30个核苷酸(例如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸(nt))，其中所述双链寡核苷酸包含长度在15至29个核苷酸之间的双链部分，并且任何一条或两条链都可包含例如长度在1-5个核苷酸之间的3’突出端，或者任一或两个末端可以是钝性的。在某些实施方式中，siRNA包含在19至25nt之间的链(例如在21至23个核苷酸之间的链)，其中一条或两条链包含1-2个核苷酸的3’突出端。siRNA的双链部分的一条链(被称为“引导链”或“反义链”)与mRNA中的靶区域基本上互补(例如至少80％或更多(例如85％、90％、95％或100％))或互补(例如具有3、2、1或0个错配的核苷酸)，而另一双链部分与第一双链部分基本上互补。在许多实施方式中，引导链与mRNA中的靶区域100％互补，而另一条过客链与第一双链部分100％互补(应理解，在各种实施方式中，如果所述引导链的3’突出部分存在，则所述3’突出部分在所述引导链与mRNA杂交时可能与mRNA互补或不互补)。在某些实施方式中，shRNA分子是包含茎环的核酸分子，其中所述双链茎的长度为16-30个核苷酸，而环的长度为约1-10个核苷酸。siRNA可以包含多种修饰的核苷、核苷类似物，并且可以包含化学或生物学修饰的碱基、修饰的主链等。没有限制地，可以使用本领域公认对RNAi有用的任何修饰。某些修饰导致增加的稳定性、细胞摄取、效力等。某些修饰导致降低的免疫原性或清除率。在某些实施方式中，siRNA包含长度约19-23(例如19、20、21、22或23)个核苷酸的双链体，以及任选地长度为1-5个核苷酸的一个或两个3’突出端，其可以是由脱氧核糖核苷酸组成。shRNA包含一条核酸链，所述核酸链包含两个互补部分，所述互补部分之间主要由非自身互补区域隔开。所述互补部分杂交以形成双链体结构，而所述非自身互补区域形成连接所述双链体的一条链的3'端和另一条链的5’端的环。shRNA经历细胞内加工以生成siRNA。通常，所述环的长度为1至8个(例如2-6个)核苷酸。
微小RNA(miRNA)是(在哺乳动物系统中)约21至25个核苷酸的小的天然非编码单链RNA，其以序列特异性方式抑制基因表达。它们在细胞内从前体(pre-miRNA)产生，所述前体具有特征性的二级结构，所述二级结构由短发夹(长度约70个核苷酸)组成，所述短发夹包含一个双链体，所述双链体通常包含一个或多个互补性不完善的区域，而所述区域又是由较大的前体(pri-miRNA)产生的。天然存在的miRNA通常仅与其靶mRNA部分互补，并且通常通过翻译抑制发挥作用。以内源性miRNA或miRNA前体为模型的RNAi试剂可用于本发明的某些实施方式中。例如，可以设计siRNA以使一条链与靶mRNA杂交，具有模仿由miRNA及其靶mRNA形成的双链体的一个或多个错配或凸起。这种siRNA可以被称为miRNA模拟物或miRNA样分子。miRNA模拟物可以由前体核酸编码，所述前体核酸的结构模仿天然存在的miRNA前体的结构。
在某些实施方式中，RNAi试剂是载体(例如质粒或病毒)，所述载体包含用于siRNA(例如作为能够彼此杂交的两条独立链)、shRNA或microRNA前体的转录的模板。如本领域中已知的，通常，编码siRNA、shRNA或miRNA前体的模板是与表达控制序列(例如启动子)可操作地连接的。此类载体可用于将模板引入脊椎动物细胞(例如哺乳动物细胞)并导致siRNA、shRNA或miRNA前体的瞬时或稳定表达。在细胞内加工前体(shRNA或miRNA前体)以产生siRNA或miRNA。
通常，小RNAi试剂(例如siRNA)可以化学合成，也可以从DNA模板体内或体外转录成两条独立的链然后杂交，或作为shRNA进行加工以生成siRNA。通常，RNAi试剂，特别是那些包含修饰的RNAi试剂，是化学合成的。寡核苷酸的化学合成方法是本领域众所周知的。
如本文所用，术语“小分子”是质量小于约2千道尔顿(KDa)的有机分子。在某些实施方式中，小分子小于约1.5KDa，或小于约1KDa。在某些实施方式中，小分子小于约800道尔顿(Da)、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da或100Da。通常，一个小分子的质量至少为50Da。在某些实施方式中，小分子包含多个碳-碳键并且可以包含一个或多个杂原子和/或一个或多个对于与蛋白的结构性相互作用(例如氢键)重要的官能团，例如胺、羰基、羟基或羧基，并且在某些实施方式中，至少两个官能团。小分子通常包含任选地被一个或多个上述官能团置换的一个或多个环状碳或杂环结构和/或芳族或多芳族结构。在某些实施方式中，小分子是非聚合的。在某些实施方式中，小分子不是氨基酸。在某些实施方式中，小分子不是核苷酸。在某些实施方式中，小分子不是糖。术语“受试者”可以是任何多细胞动物。受试者通常是脊椎动物，例如哺乳动物或禽类。示例性哺乳动物包括例如人，非人灵长类，啮齿动物(例如小鼠、大鼠、兔子)，有蹄类动物(例如绵羊、牛、马、山羊)，犬和猫。通常，受试者是(例如出于实验、诊断和/或治疗目的)向其递送化合物的个体或从其获得样品或对其进行诊断程序的个体(例如将被用于评估组织损伤和/或评估本发明化合物作用的样品或程序)。本文使用的术语“组织损伤”是指对细胞、组织、器官或其他身体结构的任何类型的损伤或损害。该术语在各种实施方式中包括由于疾病引起的退行性，由于物理创伤或手术引起的损害，由于暴露于有害物质而引起的损害以及细胞、组织、器官或其他身体结构的结构和/或功能的其他破坏。
术语“组织再生”或“TR”是指组织、器官或其他身体结构或其一部分在丢失、损坏或变形之后的至少部分再生、置换、恢复或再生长，其中所述组织再生除非以本发明中描述的方法发生，否则将不会发生。组织再生的实例包括断指或断肢的再生长，包括软骨、骨骼、肌肉、肌腱和韧带的再生长，由于损伤或疾病而丧失的骨骼、软骨、皮肤或肌肉的无瘢痕再生长，其伴随受伤或患病器官的大小和细胞数量的增加，以使组织或器官接近所述组织或器官的正常大小或其在受伤或患病之前的大小。取决于组织类型，组织再生可通过多种不同的机制(例如，预先存在的细胞和/或组织的重排(例如通过细胞迁移)，成年体干细胞或其他祖细胞的分裂及其至少某些后代的分化，和/或细胞的去分化、转分化和/或增殖)发生。
术语“TR激活因子基因”是指在胎儿和成年细胞中缺乏表达但其在胚胎发育阶段的表达促进TR的基因。
术语“TR抑制因子基因”是指其在胎儿和成年动物中的表达抑制TR的基因。
关于受试者的术语“治疗”、“疗法”、“治疗的”和类似术语是指提供对所述受试者的医学和/或外科护理。治疗可以包括但不限于将化合物或组合物(例如药物组合物)施用于受试者。根据本发明所述的对受试者的治疗通常是在促进再生的努力下进行的，例如在遭受组织损伤或预期遭受组织损伤的受试者(例如将进行手术的受试者)中进行的。治疗的效果通常可以包括组织再生后增加的再生、减少的瘢痕形成和/或改善的结构性或功能性结果(与不进行治疗的结果相比)，和/或可包括退行性疾病的严重程度或进展的逆转或减轻。
应用于特定多肽的术语“变体”是指通过一个或多个氨基酸的变化(例如添加、删除和/或置换)而与该多肽(有时被称为“原始多肽”)不同的多肽。有时，原始多肽是天然存在的多肽(例如来自人或非人动物的多肽)或与其相同的多肽。变体可以是天然存在的或使用例如重组DNA技术或化学合成产生的。添加可以是多肽内的插入或在N-或C-末端的添加。在某些实施方式中，置换、删除或添加的氨基酸的数目可以例如为约1至30，例如约1至20，例如约1至10，例如约1至5，例如1、2、3、4或5。在某些实施方式中，变体包含多肽，所述多肽的序列与原始多肽的序列在至少50个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸或更多的直至原始多肽的全长的氨基酸上同源(但在序列上与原始多肽不相同)，例如，变体多肽的序列与原始多肽的序列在至少50个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸或更多的直至原始多肽的全长的氨基酸上具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在某些实施方式中，变体包含与原始多肽的序列在至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的原始多肽长度上具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99.5％或更高的序列同一性。在某些实施方式中，变体包含至少一个功能或结构域，例如在国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)(www.ncbi.nih.gov)的保守域数据库(Conserved Domain Database，CDD)中如此标识的域(例如NCBI策展的域)。
在某些实施方式中，变体或片段的一种、一种以上或全部生物学功能或活性与原始分子的对应生物学功能或活性基本相似。在某些实施方式中，功能变体保留至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的原始多肽的活性，例如约相等的活性。在某些实施方式中，变体的活性高达原始分子的活性的约100％、约125％或约150％。在其他非限制性实施方式中，如果产生特定作用所需的变体的量或浓度在产生这种作用所需的原始分子的量或浓度的0.5至5倍之内，则认为变体或片段的活性与原始分子的活性基本相似。
在某些实施方式中，变体中的氨基酸“置换”是将一个氨基酸替换为具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸的结果，即保守氨基酸替换。可以基于所涉及残基的多种性质(例如侧链大小、极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性)中任一种的相似性进行“保守”氨基酸置换。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。极性(亲水)、中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。可能对特定组中的某些置换(例如异亮氨酸对亮氨酸的替换(反之亦然)、苏氨酸对丝氨酸的替换(反之亦然)或甘氨酸对丙氨酸的替换(反之亦然))特别感兴趣。当然，非保守置换通常也与保留的功能相容。在某些实施方式中，置换或删除不改变或删除对于活性重要的氨基酸。插入或删除的大小范围可为约1至20个氨基酸，例如1至10个氨基酸。在某些情况下，可以删除较大的结构域，而基本上不会影响功能。在本发明的某些实施方式中，变体的序列可以通过对天然酶的序列进行总共不超过5、10、15或20个氨基酸的添加、删除或置换而获得。在某些实施方式中，多肽中不超过1％、5％、10％或20％的氨基酸是相对于原始多肽的插入、删除或置换。可通过比较特定多肽的序列与同源多肽(例如来自其他生物的)的序列并最小化高同源性区域(保守区域)中氨基酸序列变化的次数或通过用同源序列中的氨基酸替换氨基酸来获得确定哪些氨基酸残基可以被替换、添加或删除而又不消除或基本不降低目标活性的指导，因为在各种物种中保守的氨基酸残基比不保守的氨基酸更可能对活性重要。
在某些实施方式中，多肽的变体包含异源多肽部分。异源部分通常具有不存在于原始多肽中或与原始多肽不同源的序列。异源部分的长度可以为例如5至约5,000个氨基酸之间或更长。通常，它的长度在5至1,000个氨基酸之间。在某些实施方式中，异源部分包含在不同多肽(例如功能域)中发现的序列。在某些实施方式中，异源部分包含用于纯化、表达、溶解和/或检测多肽的序列。在某些实施方式中，异源部分包含多肽“标签”，例如亲和标签或表位标签。例如，标签可以是亲和标签(例如HA、TAP、Myc、6xHis、Flag、GST)，荧光或发光蛋白(例如EGFP、ECFP、EYFP、Cerulean、DsRed、mCherry)，溶解度增强的标签。(例如SUMO标签、NUSA标签、SNUT标签或噬菌体T7的Ocr蛋白的单体突变体)。参见例如Esposito D和Chatterjee D K.Curr Opin Biotechnol.；17(4):353-8(2006)。在某些实施方式中，标签可以起到多种功能。标签通常相对较小，例如从几个氨基酸到约100个氨基酸长。在某些实施方式中，标签长于100个氨基酸，例如高达约500个氨基酸长或更长。在某些实施方式中，多肽具有位于N-或C-末端的标签，例如作为N-或C-末端融合物。多肽可以包含多个标签。在某些实施方式中，例如在N-末端存在6xHis标签和NUS标签。在某些实施方式中，标签是可切割的，从而可以例如通过蛋白酶将其从多肽中除去。在某些实施方式中，这是通过在编码与原始多肽同源的部分的序列和标签之间包括编码蛋白酶切割位点的序列来实现的。示例性蛋白酶包括例如凝血酶、TEV蛋白酶、因子Xa、PreScission蛋白酶等。在某些实施方式中，使用“自切割”标签。参见例如PCT/US05/05763。编码标签的序列可以位于相对于编码多肽的多核苷酸(或两者)的5’或3’。在某些实施方式中，通过多肽连接子将标签或其他异源序列与其余多肽分开。例如，连接子可以是短多肽(例如15-25个氨基酸)。连接子通常由小的氨基酸残基(例如丝氨酸、甘氨酸和/或丙氨酸)组成。异源结构域可以包括跨膜结构域、分泌信号结构域等。
在本发明的某些实施方式中，如果片段或变体(任选地不包括异源部分)存在，则其与原始多肽具有足够的结构相似性，使其在其三维结构(实际或预测的结构)叠加在原始多肽的结构上时，重叠的体积为原始多肽结构总体积的至少70％，优选地至少80％，更优选地至少90％。片段或变体的部分或全部三维结构可以通过使用标准方法来使蛋白结晶确定。或者，也可以使用标准方法生成NMR溶液结构。可以使用诸如MODELER(Sali,A.和Blundell,T L,J.Mol.Biol.,234,779-815,1993)的建模程序或任何其他建模程序来生成预测的结构。如果存在相关多肽的结构或预测结构，则模型可以基于该结构。可以使用PROSPECT-PSPP程序套件(Guo,J T等，Nucleic Acids Res.32(Web Server issue):W522-5，2004年7月1日)。当本发明的实施方式涉及多肽的变体时，其应被理解为提供了编码该变体的多核苷酸。
本文所用的术语“载体”是指能够介导核酸分子进入(例如转移、转运等)细胞的核酸或病毒或其部分(例如病毒衣壳或基因组)。当载体是核酸时，通常将待转移的核酸分子与载体核酸分子连接，例如插入载体核酸分子中。核酸载体可包含指导自主复制(例如复制起点)的序列，或可包含足以允许部分或全部核酸整合入宿主细胞DNA的序列。有用的核酸载体包括例如DNA或RNA质粒、粘粒和天然存在的或修饰的病毒基因组或其部分或可以包装成病毒衣壳的核酸(DNA或RNA)。质粒载体通常包括复制起点和一个或多个可选择的标志物。质粒可以包括部分或全部病毒基因组(例如病毒启动子、增强子、加工或包装信号等)。可以用于将核酸分子引入细胞的病毒或其部分被称为病毒载体。有用的病毒载体包括腺病毒，腺相关病毒(如AAV8、逆转录病毒、慢病毒、牛痘病毒和其他痘病毒)，疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)和其他。当被引入宿主细胞时，病毒载体可以包含或可以不包含足以产生感染性病毒的足够的病毒遗传信息，即病毒载体可能是复制缺陷型的，并且这种复制缺陷型病毒载体对于治疗用途可能是优选的。在缺少足够信息时，它可以但不一定由宿主细胞或引入该细胞的另一载体提供。可以将待转移的核酸引入天然存在的或修饰的病毒基因组或其部分中，或者其可以作为单独的核酸分子存在于病毒或病毒衣壳中。应当理解，包含部分或全部病毒基因组(通常包含足以指导可被包装到病毒衣壳中的核酸的转录和/或足以产生可被整合到宿主细胞基因组中和/或引起感染性病毒的核酸的病毒遗传信息)的某些质粒载体在本领域中有时也被称为病毒载体。载体可包含一种或多种编码适于在鉴定和/或选择已经或尚未被载体转化或转染的细胞中使用的标志物的核酸。标志物包括例如增加或降低对抗生素的抗性或敏感性的蛋白(例如编码赋予对抗生素抗性的蛋白的抗生素抗性基因，如嘌呤霉素、潮霉素或杀稻瘟菌素)或活性为可通过本领域已知的测定法测定的其他化合物、酶(例如β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶)，和可检测地影响转化或转染的细胞的表型的蛋白或RNA(例如荧光蛋白)。表达载体是包含足以指导可操作连接的核酸转录的调控序列(例如表达控制序列(如启动子))的载体。调控序列也可以包括增强子序列或上游激活子序列。载体可以任选地包含5’前导序列或信号序列。载体可以任选地包含切割和/或聚腺苷酸化信号和/或3’非翻译区域。载体通常包括一个或多个适当定位的限制性酶切位点以便于将要表达的核酸引入载体。表达载体包含用于表达的足够的顺式作用元件。宿主细胞或体外表达系统可以提供表达所需或有助于表达的其他元件。
可以采用各种技术将核酸分子引入细胞。此类技术包括使用化合物(例如磷酸钙、阳离子脂质、阳离子聚合物)的化学促进的转染，脂质体介导的转染，非化学方法(例如电穿孔、粒子轰击或显微注射)和使用含有感兴趣的核酸分子的病毒的感染(有时被称为“转导”)。标志物可用于鉴定和/或选择已摄取载体并通常表达核酸的细胞。可以在合适的培养基中培养细胞以选择此类细胞，并任选地建立稳定的细胞系。
在更详细地描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施方式，因为其当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而无意于限制本发明，因为本发明的范围仅由所附权利要求书限制。
在提供数值范围时，应理解的是，除非上下文另有明确规定，否则每个中间值均应达到下限单位的十分之一并介于该范围的上限和下限之间，所述范围内的任何其他所述值或中间值均包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包括在本发明内，受所述范围内任何明确排除的限制。在所述范围包括一个或两个极限的情况下，排除那些所包括的极限中的一个或两个的范围也包括在本发明中。
本文提供了某些具有数值的范围，所述数值之前带有术语“约”。术语“约”在本文中用于为其后的确切数字以及与该术语后的数字接近或近似的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近或近似的未列举数字可以是在给出该数字的上下文中提供与具体列举的数字基本等同的数字。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中，现在描述代表性的说明性方法和材料。
本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，就如同每个单独的出版物或专利均被具体地和单独地指出通过引用并入本文一样，并通过引用并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用均以其在申请日之前的公开为目的，并且不应被理解为承认本发明无权凭借在先发明而早于所述出版物。此外，提供的发布日期可能与实际发布日期有所不同，实际发布日期可能需要独立确认。
要注意的是，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个/种(a、an)”和“所述(the)”除非上下文另外明确指出，包括复数指示物。还应注意，权利要求书可以被撰写为排除任何可选元件。因此，该陈述旨在作为与权利要求元件的叙述相关联地使用诸如“仅(soley、only)”等排他性术语或使用“负”限制的先行基础。
对于本领域技术人员而言，在阅读本公开后将显而易见的是，本文描述和示出的每个单独的实施方式具有离散的组分和特征，这些组分和特征可以容易地与其他几个实施方式中的任何一个的特征分离或组合在一起，而不会脱离本发明的范围或精神。任何叙述的方法都可以以叙述的事件顺序或逻辑上可能的任何其他顺序执行。
方法
除了下文所述的方法，可在以下找到可用于生产和使用具有与无瘢痕的再生潜能相对应的胚胎的基因表达模式的细胞的方法：2006年4月11日提交的名为“具有出生前的基因表达模式的细胞的新用途(Novel Uses of Cells With Prenatal Patterns of GeneExpression)”的PCT申请序列号PCT/US2006/013519；2006年11月21日提交的名为“从多能干细胞和由此获得的细胞中加速分离新型细胞株的方法(Methods to Accelerate theIsolation of Novel Cell Strains from Pluripotent Stem Cells and CellsObtained Thereby)”的美国专利申请序列号11/604,47；和2009年7月16日提交的名为“从多能干细胞和由此获得的细胞中加速分离新型细株的方法”的美国专利申请序列号12/504,630(参见，例如2013年6月5日提交的美国临时专利申请第61/831,421，2014年6月3日提交的PCT专利申请PCT/US2014/040601和2015年12月7日提交的美国专利申请号14/896,664，其全部内容通过引用并入本文)；“哺乳动物物种中诱导组织再生的组合物和方法(Compositions and Methods for Induced Tissue Regeneration in MammalianSpecies)”(国际专利申请公开号WO 2014/197421)(其全部内容通过引用并入本文)和“用于检测和调节哺乳动物物种中胚胎-胎儿过渡的改善方法”(国际专利申请公开号WO 2017/214342，其全部内容通过引用并入本文)，其每一个的全部内容通过引用并入本文。
RNAi
作为非限制性实例，使用带有侧翼T7启动子的PCR产生的模板由体外转录反应(Promega)制备dsRNA，通过酚提取和乙醇沉淀纯化，并在重悬于水中后退火。从手术后两小时的第一次注射开始，在诱导的组织损伤后连续三天向完整的实验动物注射4x 30nL的dsRNA。
TR调节和iTR调节子
本公开提供了新颖的iTR调节子及其使用方法。在某些方面，本发明提供了增强再生的新颖方法，包括向需要其的多细胞生物施用改变所述iTR调节子浓度的试剂。
申请人教导了，显示深远TR潜能(例如axolotl的截肢再生、MRL或非洲多刺小鼠的皮肤再生、或涡虫的全身节段的再生)的原始动物通过简单地重演各个组织的正常胚胎发育来做到这一点。此外，申请人教导了在TR抗性哺乳动物(例如大多数鼠种和人)中不能再生受损组织的原因是这些TR抗性动物中的EFT中的某些胚胎基因转录被改变。申请人进一步教导，这些在TR抗性动物中的EFT中改变的胚胎特异性基因表达模式中的某些的恢复可以诱导任何组织中的再生能力，包括对组织中心因子的响应性，从而导致复合组织再生和附随的瘢痕形成的减少。最后，申请人教导了在哺乳动物物种中诱导TR的新型试剂和相关方法。所述方法促进哺乳动物物种体内的(特别是智人物种(Homo sapiens)中的)TR。
其表达在胎儿和成年动物中抑制TR的基因在本文中被称为“TR抑制因子”，在胎儿和成年细胞中缺乏表达但其在胚胎发育阶段的表达促进TR的基因在本文中被称为“TR激活因子”。总体上，TR抑制因子基因和TR激活因子基因在本文中被称为iTR基因。以引起TR的方式改变TR激活因子和TR抑制因子的水平的分子在本文中被称为“iTR因子”。iTR基因和iTR基因的蛋白产物通常在从海葵到哺乳动物的动物中是保守的。本文所指的基因编码的蛋白序列和编码基因的核酸(例如mRNA)序列(包括来自许多不同的非人动物物种的序列)在本领域中是已知的，并且可以在例如公开的数据库(例如国家生物技术信息中心(NCBI)(www.ncbi.nih.gov)上提供的数据库)中被找到。
观察到TR抑制基因COX7A1主要在正常组织中的基质细胞而非上皮细胞中表达，尽管它在上皮培养物中也以较低水平表达。在肿瘤的情况下，该基因在许多基质癌(如骨肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤)和某些神经胶质瘤、癌和腺癌中被下调。这与观察到的被称为瓦博格效应(Warburg effect)的癌症中糖酵解的增加一致，尽管瓦博格效应在此前未曾涉及COX7A1表达的缺失。因为申请人提出TR基因在从胚胎发育到胎儿发育的过渡过程中发生的改变部分是为了预防成人癌症，所以对基质和某些中枢神经系统和上皮肿瘤的COX7A1的抑制将使基质细胞恢复至胚胎状态，从而促进肿瘤发生。因此，在这种缺乏表达的肿瘤中的对COX7A1表达的外源性诱导将具有治疗作用，部分是通过改变p53和HIF1α和HIF3α的活性，从而抑制癌细胞的增殖和增加的细胞凋亡。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种检测癌细胞的手段。研究人员鲜少鉴定到与大多数癌细胞类型相关的异常的标志物。如本文所述，区分胚胎与其胎儿和成年对应物的标志物可用于区分显示成年表达模式的正常细胞与显示胚胎模式的恶性细胞。所述检测方法(包括但不限于COX7A1、NAALADL1、AMH和来自α、β和γ簇集的原钙粘蛋白基因的基因(包括但不限于PCDHA4、PCDHB2和PCDHGA12)在胚胎模式而非胎儿/成年模式中的表达)不仅可用于鉴定恶性细胞(血细胞除外)的表达，还可用于鉴定对以胎儿/成人的表达模式为特征的常用化学治疗剂有抗性的肿瘤。
本公开提供了多种不同的调节iTR基因的方法以及多种可用于调节iTR基因的化合物。通常，iTR因子可以是例如小分子、核酸、寡核苷酸、多肽、肽、脂质、糖类等。所述iTR因子可以是图8中列出的TR因子之一或其组合。可以通过对因子组合进行针对其对哺乳动物细胞(优选对应于胎儿或成年发育阶段的人细胞(例如表达COX7A1的人细胞))影响的筛选并确定引起显著降低的COX7A1、ADIRF、TNFRSF11B表达或显著增加的AMH表达的iTR制剂来确定因子浓度和最佳组合。
在本发明的某些实施方式中，iTR因子通过减少细胞产生的TR抑制因子RNA的量和/或通过降低TR抑制因子基因的活性水平来进行抑制。在靶向TR抑制因子的情况下，确定降低TR抑制因子基因产物水平的因子并将其用于研究和治疗中。所述TR抑制因子基因可以是先前在例如WO 2017/214342或WO 2014/197421中公开的TR抑制因子基因的任何一种或组合。所述TR抑制因子基因可以是TR抑制因子基因中的任何一种或组合。可以通过抑制细胞的TR抑制因子RNA的合成(也被称为“抑制TR抑制因子基因表达”)来减少TR抑制因子基因RNA的量，例如通过减少编码TR抑制因子基因的mRNA的量或减少编码TR抑制因子基因的mRNA的翻译。通过非限制性实例，所述因子可为靶向TR抑制因子基因内的序列的RNAi。
在某些实施方式中，TR抑制因子基因表达被RNA干扰(RNAi)抑制。如本领域中已知的，RNAi是一个过程，在所述过程中，细胞中与基因具有序列对应性的双链RNA的存在通常导致基因表达的序列特异性抑制，其通常是由所述基因转录的mRNA的切割或翻译性抑制的结果。可用于引起对RNAi表达的抑制的化合物(“RNAi试剂”)包括短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)和miRNA样分子。
一旦已经鉴定了哺乳动物TR抑制因子基因(例如人TR抑制因子基因)，本领域的技术人员就可以容易地设计用于抑制所述TR抑制因子基因表达的RNAi试剂(例如siRNA)的序列。在某些实施方式中，选择此类序列以最小化“脱靶”效应。例如，可以使用与TR抑制因子基因mRNA中存在的序列互补并且在感兴趣的物种中表达的其他mRNA中不存在的序列(或不在感兴趣的物种的基因组中存在的序列)。特定位置的化学修饰可用于减少潜在的脱靶效应。在某些实施方式中，组合使用至少两种不同的靶向TR抑制因子基因mRNA的RNAi试剂，例如siRNA。在某些实施方式中，microRNA(其可以是人工设计的microRNA)被用于抑制TR抑制因子基因表达。
在本发明的某些实施方式中，使用包含与编码TR抑制因子基因的mRNA完全或基本互补的单链寡核苷酸的反义分子抑制TR抑制因子基因的表达。寡核苷酸与TR抑制因子基因mRNA杂交，引起例如RNase H对mRNA的降解或空间位阻对翻译的阻断。在本发明的其他实施方式中，使用核酶或三链体核酸抑制TR抑制因子基因的表达。
在本发明的某些实施方式中，TR抑制因子的抑制因子抑制TR抑制因子蛋白的至少一种活性。通过使TR抑制因子蛋白与和TR抑制因子蛋白发生物理相互作用的化合物接触，可以降低TR抑制因子的活性。这样的化合物可以例如改变TR抑制因子蛋白的结构(例如通过对其进行共价修饰)和/或阻断TR抑制因子蛋白与一个或多个其他分子(例如辅因子或底物)的相互作用。在某些实施方式中，抑制或减少可以是参照水平(例如对照水平)的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的减少。对照水平可以是在缺失所述因子的情况下发生的TR抑制因子的水平。例如，TR因子可将TR抑制因子蛋白的水平降低至不超过在测试条件下在缺失所述因子的情况下发生的的水平的95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、40％、30％、25％、20％、10％或5％。在某些实施方式中，TR抑制因子的水平降低至在测试条件下在缺失所述因子的情况下发生的水平的75％或更少。在某些实施方式中，在所测试的条件下，TR抑制因子的水平降低至在测试条件下在缺失所述因子的情况下发生的水平的50％或更少。在某些实施方式中，TR抑制因子的水平降低至在测试条件下在缺失所述因子的情况下发生的水平的25％或更少。在某些实施方式中，TR抑制因子的水平降低至在测试条件下在缺失所述因子的情况下发生的水平的10％或更少。在某些情况下，调节(例如抑制或降低)水平相比于对照水平是在统计学上显著的。如本文所用，“在统计学上显著的”是指在使用适当的统计检验(例如，ANOVA、t检测(t-test))的情况下小于0.05的p值(例如小于0.025的p值或小于0.01的p值)。
在本发明的某些实施方式中，化合物直接抑制TR抑制因子蛋白，即该化合物通过涉及TR抑制因子和iTR因子之间的物理相互作用(结合)的机制抑制TR抑制因子蛋白。例如，TR抑制因子与iTR因子的结合能够干扰TR抑制因子催化反应的能力和/或能够阻塞TR抑制因子的活性位点。多种化合物可用于直接抑制TR抑制因子。直接抑制TR抑制因子的示例性化合物可以是例如小分子、抗体或适体。
在本发明的某些实施方式中，iTR因子与TR抑制因子共价结合。例如，所述化合物可以修饰酶活性所需的氨基酸残基。在某些实施方式中，iTR因子包含一个或多个与TR抑制因子的氨基酸侧链反应的反应性官能团，例如醛、卤代烷烃、烯烃、氟代膦酸酯(例如氟代烷基)、迈克尔(Michael)受体、苯基磺酸酯、甲基酮(如卤代甲基酮或重氮甲基酮)、氟代膦酸酯、乙烯基酯、乙烯基砜或乙烯基磺酰胺。在某些实施方式中，iTR因子抑制因子包含与TR抑制因子物理相互作用的化合物，其中所述化合物包含反应性官能团。在某些实施方式中，与TR抑制因子物理相互作用的化合物的结构被修饰以结合反应性官能团。在某些实施方式中，所述化合物包含TR抑制因子底物类似物或过渡态类似物。在某些实施方式中，所述化合物在TR抑制因子活性位点内或附近与TR抑制因子相互作用。
在其他实施方式中，iTR因子非共价结合至TR抑制因子和/或至包含TR抑制因子和TR抑制因子底物的复合物。在某些实施方式中，iTR因子非共价结合至TR抑制因子的活性位点和/或与底物竞争进入TR抑制因子活性位点。在某些实施方式中，iTR因子以约10-3M或更小(例如10-4M或更小，例如10-5M或更小，例如10-6M或更小，10-7M或更小，10-8M或更小，或10- 9M或更小)的Kd在测试条件下(例如在生理上可接受的溶液(如磷酸盐缓冲盐水)中)结合TR抑制因子。如本领域已知的，可以例如使用表面等离振子共振(例如使用Biacore系统)、等温滴定量热法或竞争性结合测定法来测量结合亲和力。在某些实施方式中，抑制因子包含TR抑制因子底物类似物或过渡态类似物。
在增加TR激活因子的活性的情况下，可以使用图8中列出的TR激活因子的组合中的任何一种。可以使用本文描述的载体引入这些基因的因子或产物的水平。
在其他实施方式中，iTR因子是直接或通过基因表达构建体将RNA引入细胞的构建体，如果允许所述基因表达构建体与所述细胞反应足够的时间，则所述基因表达构建体能够诱导多能性；如果反应较短的时间，则会引起iTR。优选地，RNA不包含重编程为多能性所需的所有RNA，而是仅包含LIN28A或LIN28B，任选地与增加端粒长度的试剂一起，例如端粒酶催化成分(TERT)的RNA。最优选地，诱导iTR的试剂是由LIN28A或LIN28B编码蛋白(例如GFER)诱导的基因/因子，任选地与增加端粒长度的试剂(例如编码TERT的RNA或基因)组合，和/或与本文公开的对iTR重要的因子组合，例如0.05-5mM的丙戊酸(优选1.0mM的丙戊酸)、1-100ng/mL的AMH(优选10ng/mL的AMH)和2-200ng/mL的GFER(优选20ng/mL)。当在体内施用时，这些因子优选在缓慢释放的水凝胶基质(例如包含化学修饰和交联的透明质酸和胶原蛋白的水凝胶基质(例如HyStem基质))中施用。
针对iTR因子的基于报告的筛查检测
本发明提供了使用(a)报告分子鉴定iTR因子的方法，所述报告分子包含易于检测的标志物(例如GFP或β半乳糖苷酶)，所述标志物的表达由本文所述的TR激活基因之一的启动子(例如COX7A1的启动子)驱动。本发明提供了筛选检测，所述筛选检测涉及确定测试化合物是否影响TR激活基因的表达和/或抑制TR抑制基因的表达。本发明进一步提供了用于实施该方法的报告分子和组合物。通常，使用本发明方法鉴定的化合物可以通过任何导致TR激活子或抑制因子基因分别增加或减少的机制起作用。就COX7A1启动子而言，人基因5’端侧翼的启动子序列已被定性为ATG翻译起始密码子的-756个碱基的位置(Yu，M.等，Biochimica and Biophysica Acta 1574(2002)345-353)。观察到大多数cDNA的转录起始位点在翻译起始密码子的-55个碱基处。该启动子以及基因序列的其余部分位于CpG岛中，与许多管家基因的启动子类似，尽管COX7A1的表达具有组织特异性。CpG岛的特征是CG二核苷酸的丰度超过了至少200个碱基范围内的基因组平均预期含量。启动子包含几个调控性结合位点序列：-524位的MEF2，以及分别在-58、-279和-585位的三个E盒(被称为E1、E2和E3)；E盒是结合调控蛋白的肌原性家族成员的DNA结合位点(CAACTG)。另外，在约-95至-68个碱基的区域中存在多个富含CG的区段，类似于被转录因子Sp1识别的区段。
在GRCh38.p7主要组装中被定性的所述基因本身在人18号染色体上的位36150922和36152869之间占据1948个碱基，并包含由三个内含子穿插的4个外显子。具有启动子序列的基因序列在NCBI处以位点标识符AF037372进行策展。
报告分子、细胞和膜
通常，可用于本发明的报告分子的可检测部分包含产生或猝灭可检测的荧光、化学发光或生物发光信号的光发射或吸光化合物。在某些实施方式中，TR激活因子基因的激活或TR抑制因子基因的抑制导致可检测部分释放到液体培养基中，并且检测到存在于培养基(或其样品)中的释放的可检测部分产生或猝灭的信号。在某些实施方式中，所得信号引起可检测部分的特性的改变，并且这种改变可以例如作为光信号被检测到。例如，所述信号可以通过可检测部分改变电磁辐射(例如，波长在光谱的红外、可见或UV部分内的辐射)的发射或吸收。在某些实施方式中，报告分子包含荧光或发光部分，第二分子用作猝灭荧光或发光部分的猝灭剂。可以使用本领域已知的设备和方法来检测这种改变。
在本发明的许多实施方式中，报告分子是可以由细胞表达的可遗传编码的分子，并且可检测部分包含例如可检测多肽。因此，在某些实施方式中，报告分子是包含荧光多肽(例如绿色、蓝色、蓝宝石色、黄色、红色、橙色和青色荧光蛋白及其衍生物(例如增强的GFP)，单体红色荧光蛋白及其衍生物(例如被称为“mFruits”的衍生物(例如mCherry、mStrawberry、mTomato等))，和发光蛋白(例如水母发光蛋白))的多肽。(应当理解，在某些实施方式中，所述荧光或发光在一种或多种另外的分子(例如离子(如钙离子)和/或辅基(例如腔肠素)的存在下发生)。在某些实施方式中，可检测部分包括作用在底物上以产生荧光、发光、有色或其他可检测产物的酶。可以用作可检测部分的酶的实例包括萤光素酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。(将理解的是，通过检测反应产物来检测酶。)在某些实施方式中，可检测部分包含可以通过使用第二试剂(例如标记的(例如荧光标记的)抗体)来容易地检测的多肽标签。例如，可获得与HA、Myc或多种其他肽标签结合的荧光标记的抗体。因此，本发明包括可直接检测可检测部分的实施方式(即它不需要与第二试剂相互作用而产生可检测信号)和可检测部分与第二试剂相互作用(例如结合和/或反应)的实施方式。这种相互作用例如通过导致产生可检测信号或由于第二试剂可直接检测而使得可检测部分可检测。在可检测部分与第二试剂相互作用以产生可检测信号的实施方式中，可检测部分可以与第二试剂反应，由第二试剂作用以产生可检测信号。在许多实施方式中，信号强度提供了(例如在待评估的样品中或在待成像区域中存在的)可检测部分的量的指示。在某些实施方式中，任选地(例如基于相对或绝对信号强度)定量可检测部分的量。
本发明提供了包含编码本发明报告分子多肽的序列的核酸。在某些实施方式中，核酸编码本发明的报告分子多肽的前体多肽。在某些实施方式中，编码多肽的序列与适于指导编码所述多肽的mRNA的转录的表达控制元件(例如启动子或启动子/增强子序列)可操作地连接。本发明进一步提供了包含核酸的表达载体。合适的表达控制元件的选择可以基于例如要表达的核酸的细胞类型和种类。本领域普通技术人员可以容易地选择合适的表达控制元件和/或表达载体。在某些实施方式中，表达控制元件是可调控的，例如可诱导的或可抑制的。适用于细菌细胞的示例性启动子包括例如Lac、Trp、Tac、araBAD(例如在pBAD载体中)、噬菌体启动子(例如T7或T3)。可用于指导在哺乳动物细胞中表达的示例性表达控制序列包括例如SV40的早期和晚期启动子，腺病毒或巨细胞病毒极早期启动子，或病毒启动子/增强子序列，逆转录病毒LTR，来自哺乳动物基因的启动子或启动子/增强子(例如肌动蛋白、EF-1α、磷酸甘油酸激酶等)。可调控的(例如可诱导或可抑制的)表达系统(例如Tet-On和Tet-Off系统(可被四环素和类似物(例如强力霉素)调控的))和其他可被小分子(例如激素受体配体(例如可以是或不是类固醇的类固醇受体配体))调控的表达系统、金属调节系统(例如金属硫蛋白启动子)等。
本发明进一步提供了包含此类核酸和/或载体的细胞和细胞系。在某些实施方式中，细胞是真核细胞，例如真菌、植物或动物细胞。在某些实施方式中，细胞是脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞，例如人细胞、非人灵长类细胞或啮齿动物细胞。通常，细胞是细胞系(例如已获得了在培养基中无限增殖的能力的(例如，由于突变或基因操作(例如端粒酶催化成分的组成型表达)而产生的)已建立的或永生化的细胞系)的一员。许多细胞系是本领域已知的，并且可以用于本发明中。哺乳动物细胞系包括例如HEK-293(例如HEK-293T)、CHO、NIH-3T3、COS和HeLa细胞系。在某些实施方式中，细胞系是肿瘤细胞系。在其他实施方式中，细胞是非致瘤性的和/或不是源自肿瘤的。在某些实施方式中，细胞是贴壁细胞。在某些实施方式中，使用非贴壁细胞。在某些实施方式中，使用的细胞是已显示天然具有表达的TR激活因子基因或未表达的TR抑制因子基因的子集的细胞类型或细胞系。如果细胞缺乏一个或多个TR激活因子或抑制因子基因，则可以对该细胞进行基因工程改造以表达这种蛋白。在某些实施方式中，本发明的细胞系来自单个细胞。例如，可以用编码报告多肽的核酸转染细胞群，并且可以选择衍生自单个细胞的菌落并在培养物中扩增。在某些实施方式中，用编码报告分子的表达载体瞬时转染细胞。可以用对照质粒共转染细胞，该质粒任选地表达不同的可检测多肽，以控制转染效率(例如，多次测定间的)。
TR激活因子和TR抑制因子多肽和核酸
在图8中列出了TR激活因子和TR抑制因子基因。分别在标题“胚胎标志物”和“胎儿/成体标志物”下。可通过多种方法获得可用于本发明方法的TR激活因子和TR抑制因子多肽。在某些实施方式中，使用重组DNA技术产生多肽。可以使用重组蛋白表达的标准方法。可以容易地例如从表达TR激活因子或TR抑制因子基因的细胞中(例如，通过PCR或其他扩增方法或通过克隆)或通过基于cDNA序列多肽序列的体外转录获得编码所述基因的核酸。本领域的普通技术人员将知道，由于基因编码的简并性，可以通过许多不同的核酸序列来编码基因。可选地，对序列进行密码子优化以在所选宿主细胞中表达。可以在细菌、真菌、动物或植物细胞或或生物中表达所述基因。可以从天然表达所述基因的细胞或已经瞬时或稳定地引入了编码该蛋白的核酸的细胞(例如含有编码所述基因的表达载体的细胞)中分离出所述基因。在某些实施方式中，该基因由培养中的细胞分泌并从培养基中分离。
在本发明的某些实施方式中，在本发明的筛选方法中使用了TR激活因子或TR抑制因子多肽的序列。天然存在的TR激活因子或TR抑制因子多肽可以来自其基因组编码TR激活因子或TR抑制因子多肽的任何物种，例如人、非人灵长类、啮齿类动物等。其序列与天然存在的TR激活因子或TR抑制因子相同的多肽有时在本文中被称为“天然TR激活因子/抑制因子”。用于本发明的TR激活因子或TR抑制因子多肽可以包含或可以不包含分泌信号序列或其一部分。例如，可以使用包含人TR激活因子或TR抑制因子的氨基酸20-496(或不同物种的TR激活因子或TR抑制因子的相应氨基酸)或由其组成的成熟TR激活因子或TR抑制因子。
在某些实施方式中，使用包含TR激活因子或TR抑制因子的变体或片段或由其组成的多肽。TR激活因子或TR抑制因子变体包括与TR激活因子或TR抑制因子相差一个或多个氨基酸置换、添加或缺失的多肽。在某些实施方式中，TR激活因子或TR抑制因子变体包含与至少TR激活因子或TR抑制因子(例如来自人或小鼠)的氨基酸20-496在至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的人TR激活因子或TR抑制因子的氨基酸20-496或小鼠TR激活因子或TR抑制因子的氨基酸20-503上具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的多肽。在某些实施方式中，TR激活因子或TR抑制因子变体包含与至少人TR激活因子或TR抑制因子的氨基酸20-496或小鼠TR激活因子或TR抑制因子的氨基酸20-503具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的多肽。在某些实施方式中，TR激活因子或TR抑制因子多肽包含与至少人TR激活因子或TR抑制因子的氨基酸20-496或小鼠TR激活因子或TR抑制因子的氨基酸20-503具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的多肽。可以例如通过使用例如定点诱变修饰编码天然TR激活因子或TR抑制因子的DNA或通过其他标准方法容易地产生编码TR激活因子或TR抑制因子变体或片段的核酸，并可以使用所述核酸以产生所述TR激活因子或TR抑制因子变体或片段。例如，可以通过将编码TR激活因子或TR抑制因子的序列克隆到提供编码异源部分的序列的载体中来产生融合蛋白。在某些实施方式中，使用标记的TR激活因子或TR抑制因子。例如，在某些实施方式中，使用了例如在其C末端包含6xHis标签的TR激活因子或TR抑制因子多肽。
测试化合物
多种测试化合物可用于本发明的方法中以鉴定iTR因子和iTR的整体调节子。例如，测试化合物可以是小分子、多肽、肽、核酸、寡核苷酸、脂质、糖类、抗体或杂合分子，包括但不限于本文所述的那些，包括以下基因的mRNA：单独的OCT4、SOX2、KLF4、NANOG、ESRRB、NR5A2、CEBPA、MYC、LIN28A和LIN28B和其不同的组合，和其与小分子化合物的不同组合，例如以下化合物的组合：糖原合酶3(GSK3)的抑制因子，其包括但不限于CHIR99021；TGF-β信号传导的抑制因子，其包括但不限于SB431542、A-83-01和E616452；HDAC抑制因子，其包括但不限于脂族酸化合物，所述脂族酸化合物包括但不限于丙戊酸、苯基丁酸和正丁酸，环四肽(包括曲霉毒素B和二肽)，异羟肟酸(例如曲古抑菌素A、伏立诺他(SAHA)、贝洛司他(PXD101)、LAQ824、帕诺贝司他(LBH589)和苯甲酰胺恩替司他(MS-275)、CI994、mocetinostat(MGCD0103))；特异针对I类(HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8)，IIA类(HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9)，IIB类(HDAC6和HDAC10)，III类(SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7)(包括sirtuin抑制因子烟酰胺、NAD的各种衍生物、二氢香豆素、萘并吡喃酮和2-羟基萘乙醛)，或IV类(HDAC11)脱乙酰基酶的那些；H3K4/9组蛋白脱甲基酶LSD1的抑制因子(包括但不限于parnate)；DotlL的抑制因子(包括但不限于EPZ004777)；G9a的抑制因子(包括但不限于Bix01294)；EZH2的抑制因子(包括但不限于DZNep)；DNA甲基转移酶的抑制因子(包括但不限于RG108)；5-氮杂-2’脱氧胞苷(商品名为Vidaza和Azadine)；维生素C，其能够抑制DNA甲基化，并能够增加Tetl，从而增加5hmC，这是脱甲基化的第一步；3’磷酸肌醇依赖性激酶1的激活因子(包括但不限于PS48)；糖酵解的启动子(包括但不限于槲皮素和果糖2，6-二磷酸(磷酸果糖激酶1的激活因子))；促进HIF1转录复合物活性的试剂(包括但不限于槲皮素)；RAR激动剂(包括但不限于AM580、CD437和TTNPB)；模拟缺氧的试剂(包括但不限于白藜芦醇(Resveratrol))；增加端粒酶活性的试剂，包括但不限于端粒酶催化成分(TERT)的外源表达；通过下调LSD 1(H3K4特异性组蛋白脱甲基酶)促进表观遗传修饰的试剂(包括但不限于锂)；或MAPK/ERK通路的抑制因子(包括但不限于PD032590)。其他化合物包括组蛋白脱乙酰基酶抑制因子MS-275、组蛋白甲基转移酶抑制因子BIX01294、DNA甲基转移酶抑制因子RG108、视黄酸AM580或CD437的类似物(视黄酸受体激动剂)和组蛋白甲基转移酶抑制因子EPZ004777(DOT1L的抑制因子和端粒沉默1样的破坏因子)和DNA甲基转移酶的抑制因子和HDAC RSC133。可以以各种组合、浓度和在不同的时间段内施用此类化合物以优化iTR对使用整体iTR标志物体外培养的细胞的影响，所述优化可例如通过测定COX7A1、ADIRF、TNFRSF11B或如本文所述的其他iTR抑制因子的表达的减少，和/或测定如本文所述的AMH或其他激活因子或iTR的表达的增加或在体内受伤或患病的组织中的表达的增加，或在体内调节动物的生命历程来实现。
分别进行关于基因COX7AJ、ADIRF、TNFRSF11B或AMH的iTR基因表达模式以及多能性的基因表达或蛋白标志物(包括OCT4和HELLS或Tra-1-60、Tra-1-8l和SSEA4)的体外测定以优化iTR基因表达的整体模式而无需将靶细胞恢复为多能性。筛选的单个试剂和试剂组合的实例是：OCT4、SOX2、KLF4、MYC和LIN28A；OCT4；KLF4；OCT4、KLF4；OCT4、KLF4、LIN28A；OCT4、KLF4、LIN28B；SOX2；MYC；NANOG；ESRRB；NT5A2；OCT4、SOX2、KLF4和LIN28A；OCT4、SOX2、KLF4和LIN28B；OCT4、KLF4、MYC和LIN28A；并在前四周内将上述试剂组合中的每种与0.25mM的NaB、5μM的PS48和0.5μM的A-83-01一起使用，紧接着用0.25mM的丁酸钠、5μM的PS48、0.5μM的A-83-01和0.5μM的PD0325901进行治疗，在第0、1、2、4、7、10和14天对上述每一个进行针对iTR基因表达的整体调节的标志物的检测。
改进的iTR因子筛选
用于在胎儿或成年哺乳动物细胞中产生iTR作用的化合物或化合物组合的筛选可以在体外或体内进行(例如动物模型)。优选地，所述筛选以低通量或高通量在体外进行。筛选试验分别用于增加或减少胚胎或胎儿/成体标志物。所述筛选可以采用本文所述的或在“哺乳动物物种中诱导的组织再生的组成和方法”(国际专利申请公开号WO 2014/197421)(其全部内容通过引用并入本文)和“用于检测和调节哺乳动物物种中胚胎-胎儿过渡的改进方法”(国际专利申请公开号WO 2017/214342，其全部内容通过引用并入本文)中描述的抗体、RNA测定、代谢标志物或其他标志物的使用。优选地，所述筛选测定mRNA标志物的水平，最优选地测定作为iTR指示的COX7A1表达的降低。最优选地，所述筛选以多孔形式进行，并且表达是通过使用报告基因(例如敲入基因组中COX7A1基因座的eGFP)来测定的。
化合物可以从天然来源获得或合成产生。化合物可以是至少部分纯的或可以存在于其成分至少部分是未知的或未表征的提取物或其他类型的混合物中。提取物或其级分可以从例如植物、动物、微生物、海洋生物、发酵液(例如土壤、细菌或真菌发酵液)等中产生。在某些实施方式中，测试化合物集合(“文库”)。所述文库可以包含例如100至500,000个或更多的化合物。化合物通常排列在多孔板中(例如384孔板、1596孔板等)。它们可以溶解在溶剂(例如DMSO)中或以干燥形式(例如以粉末或固体形式)提供。可以测试合成的、半合成的和/或天然存在的化合物的集合。化合物文库可包含结构相关、结构多样或结构不相关的化合物。化合物可以是人工的(具有人发明的、在自然界中找不到的结构)或天然存在的。在某些实施方式中，所述文库包含至少某些在其他药物发现程序和/或其衍生物中被鉴定为“命中”或“前导”的化合物。化合物文库可包含天然产物和/或使用非定向或定向合成有机化学方法生成的化合物。通常，化合物文库是小分子文库。其他感兴趣的文库包括肽或类肽文库、cDNA文库、抗体文库和寡核苷酸文库。可以聚焦文库(例如主要由具有相同核心结构、源自相同前体或具有至少一个共同生化活性的化合物组成)。
选择用于筛选的化合物可以选自合成的或天然产物衍生的小分子的文库，所述小分子具有多种已知可提供潜在生物活性基序的化学结构。浓度为0.05-5.0mM，优选地为1.0mM的丙戊酸；浓度为7.0nM-10uM，优选地为10uM的GSK-3抑制因子6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈(又被称为CHIR99021)；浓度为4.0nM-10uM，优选地为10uM的TGFβR-1/ALK5的抑制因子2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(又被称为RepSox)；浓度为2.0-10uM，优选地为10uM的赖氨酸特异性去甲基化酶1的抑制因子Parnate(又名反苯环丙胺)；浓度为0.5–50uM，优选地为50uM的腺苷酸环化酶的激活因子Forskolin；浓度为1.0nM-5uM，优选地为5.0uM的类维生素A受体激动剂芳维甲酸(又名4-[(E)-2-(5,5,8,8-四甲基-6,7-二氢萘-2-基)丙-1-烯基]苯甲酸或TTNPB)；浓度为0.05-0.24uM，优选地为0.1uM的EZH2抑制因子(1S,2R,5R)-5-(4-氨基咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)-3-(羟甲基)环戊-3-烯-1,2-二醇(又名3-Deazaneplanocin A(DZNep))；施用浓度为0.1nM-1.0uM，优选地为1.0uM的MEK/ERK通路的抑制因子N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯胺)苯甲酰胺(又名PD0325901)；浓度优选地为10.0uM的SB431542；浓度优选地为1.0uM的A 83-01；浓度优选地为1.0uM的4-苯基丁酸钠；浓度优选地为10nM的罗米地辛(Romidepsin)；浓度优选地为250nM的曲古抑菌素A(trichostatin A)；浓度优选地为1.0uM的SAHA(也被称为伏立诺他(vorinostat))；浓度优选地为50nM的LAQ824；浓度优选地为10-100nM的Panobionstat；浓度优选地为5.0uM的MS-275；浓度优选地为1.0uM的Mocetinostat；浓度优选地为40uM的CI-994；浓度优选地为2.0uM的BEX01294；浓度优选地为0.1-1.0uM的PD032590；浓度优选地为200nM的锂盐；浓度优选地为100nM的NVP-BEZ235；浓度优选地为20uM的SB216763；浓度优选地为0.6uM的SB203580；浓度优选地为0.1nM-1.0mM，优选地为100nM的蛋白激酶R样ER激酶(PERK)抑制因子GSK2606414；浓度优选地为10nM的2-羟基-1-萘醛；浓度优选地为1.0mM的二氢香豆素；浓度优选地为7.5mM的烟酰胺；浓度优选地为0.25mM的丁酸钠；浓度优选地为5.0uM的RG108；浓度优选地为50ug/mL的(+)-L-抗坏血酸钠；浓度优选地为1.0uM的槲皮素；浓度优选地为10uM的白藜芦醇；浓度优选地为10nM的AM580；浓度优选地为0.1uM的CD437；浓度优选地为5.0uM的PS48；浓度优选地为10uM的DMOG；浓度优选地为0.5uM-0.5mM的去铁胺；浓度优选地为5.0uM的5-氮杂胞嘧啶核苷；浓度优选地为400ng/mL的环孢素A；浓度优选地为5.0uM的EPZ 004777；浓度优选地为10nM的SGC0946；浓度优选地为1.0uM的LY-364947；浓度优选地为5.0uM的Kenpaullone；浓度优选地为0.5uM的达沙替尼(Dasatinib)；浓度优选地为10uM的PP1；浓度优选地为100uM的2-羟基-1-萘醛酰腙(2-Hydroxy-1-naphthaldehyde isonicotinoyl hydrazone)(也被称为AS8351)；浓度优选地为20–50uM的1,5-异喹啉二醇；浓度优选地为10ng/mL的蛋白因子GFER(肝再生的生长因子增强因子)；浓度优选地为20ng/mL的蛋白因子AMH(抗缪勒管激素)；浓度优选地为10ng/mL的蛋白因子成纤维细胞生长因子β；浓度优选地为100ug/mL的B18R；浓度优选地为1.0uM的佛波醇(Phorbol)12-十四酸酯13-乙酸酯；浓度优选地为10mM的LiC；浓度优选地为5.0uM的二甲双胍；浓度优选地为2.5nM的抗霉素A；浓度优选地为100ng/mL的蛋白胰岛素样生长因子1(IGF1)；浓度优选地为100ng/mL的蛋白胰岛素样生长因子2(IGF2)；浓度优选地为50uM的脱氢表雄酮(DHEA)；浓度优选地为100ng/mL的蛋白生长激素(GH)；浓度优选地为5.0nM的类固醇17-b-雌二醇；浓度优选地为1.0uM的渥曼青霉素(Wortmannin)；浓度优选地为1.0–100uM的PKC激活因子(2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-戊二烯酰氨基)苯并内酰胺(PKC激活因子V)；浓度优选地为10mM的酮体3-羟基丁酸酯(3-HB)；浓度优选地为1.0-10uM的类固醇睾丸酮；浓度优选地为1.0mM的L-肉碱(L-carnitine)；浓度优选地为10uM的RSC-133；浓度优选地为50uM的精氨酸N-甲基转移酶抑制因子-1(AMI-5)；浓度优选地为1.0uM的hedgehog通路激活因子Hh-Ag1.5；浓度优选地为10uM的JNJ10198409；浓度优选地为10nM的LDE225；浓度优选地为100nM–10uM的RasGAP和ERK1 SC-1的抑制因子；浓度优选地为50uM的自噬SMER28的小分子增强因子；浓度优选地为50uM的PDGFR酪氨酸激酶抑制因子VII SU 16f；浓度优选地为10uM的VEGFR2、FGFR1和PDGFRβSU5402的酪氨酸激酶结构域的抑制因子；浓度优选地为300ng/mL的重编程因子OCT4、NANOG、LIN28A、LIN28B、SOX2、MYC、KLF4或DNMT3B的mRNA，单独地或与上述因子结合使用。
化合物文库可从许多商业供应商(例如Tocris BioScience、Nanosyn、BioFocus)和政府机构获得。例如，美国国立卫生研究院(NIH)分子库计划的一个组成部分分子库小分子储存库(MLSMR)旨在鉴定、获取、维护和分配超过30万种具有已知和未知的用于例如高通量筛选(HTS)分析的生物学活性的化学多样性化合物。(请参见https://mli.nih.gov/mli/)。NIH Clinical Collection(NCC)是大约450种小分子的电镀阵列，这些小分子在人临床试验中已有使用历史。这些化合物具有高度已知的药物安全性。在某些实施方式中，测试了包含“批准的人药”的化合物的集合。“批准的人药”是一种经政府监管机构(例如美国食品药品监督管理局、欧洲药品评估局或负责在允许将治疗试剂投入市场之前评估至少其安全性的类似机构)批准用于治疗人的化合物。测试化合物可以是例如抗肿瘤药、抗细菌药、抗病毒药、抗真菌药、抗原生动物药、抗寄生虫药、抗抑郁药、抗精神病药、麻醉药、抗心绞痛药、抗高血压药、抗心律不齐药、抗炎药、镇痛药、抗血栓药、止吐药、免疫调节剂、抗糖尿病药、抗脂质药降胆固醇药(例如他汀类药物)、抗惊厥药、抗凝血药、抗焦虑药、催眠药(诱导睡眠)、激素或抗激素药等。在某些实施方式中，化合物是已经经历至少某些临床前或临床发展的化合物或已确定或预测具有“类似药物”的性质。例如，测试化合物可能已经完成了对非人动物的I期试验或至少一项临床前研究，并显示出安全性和耐受性的证据。
在某些实施方式中，所使用的浓度下或在某些实施方式中浓度比所使用的浓度高10倍、100倍或1,000倍，测试化合物在对所施用的化合物的生物的细胞和/或对化合物进行测试的细胞基本上无毒。例如，在各种实施方式中，对细胞活力和/或增殖可能没有统计学上显著的影响，或者活力或增殖的降低可以不超过1％、5％或10％。细胞毒性和/或对细胞增殖的影响可以使用多种测定法中的任何一种来评估。例如，可以使用细胞代谢测定(例如AlamarBlue、MTT、MTS、XTT和CellTitre Glo测定)，细胞膜完整性测定，基于细胞ATP的活力测定，线粒体还原酶活性测定，BrdU、EdU或H3-胸腺嘧啶核苷掺入测定。在某些实施方式中，测试化合物不是在本领域已知或使用的细胞培养基中发现的化合物，例如，适合于培养脊椎动物(例如哺乳动物细胞)的培养基，或者如果测试化合物是在本领域已知或使用的细胞培养基中发现的化合物，当用于本发明的方法中时，测试化合物以不同的(例如更高的)浓度使用。
iTR全局调节子的测定
测定的实施和控制方面
本发明的上述各种筛选测定涉及确定测试化合物是否抑制活性TR抑制因子的水平或增加活性TR激活因子的水平。上文描述了用于表达报告分子的合适细胞。在进行本发明的测定时，通常将测定成分(例如细胞、TR激活因子或TR抑制因子多肽和测试化合物)分配到多个容器或其他容器中。可以使用能够容纳细胞的任何类型的容器或物品。在本发明的许多实施方式中，容器是多孔板(也被称为“微孔板”、“微量滴定板”等)的孔。出于描述的目的，术语“孔”将用于指代任何孔。可以用来进行本发明筛选的容器或物品的类型，例如可以包含测定成分的任何容器或物品，应该理解，本发明不限于孔或多孔板的使用。在某些实施方式中，可以使用在基质中或基质上存在多个物理上分离的腔体(或其他限制特征)的任何制品。例如，测定成分可以被限制在液滴中，可以将所述滴液任选地排列在一个平面上，并任选地用防水物质将其隔开，所述防水物质将液滴限制在微流控设备通道等中的离散位置。
通常，测定组分可以以任何顺序添加到孔中。例如，可以在将测试化合物和靶TR激活因子或TR抑制因子多肽或具有表达构建体的细胞添加至孔之前，首先添加细胞并在选定的时间段内(例如6至48小时)保持培养。在某些实施方式中，在添加细胞多肽之前将化合物添加至孔中。在某些实施方式中，在铺板细胞之后，任选地在向孔中添加测试化合物之后，诱导报告多肽的表达。在某些实施方式中，通过用编码报告分子多肽的表达载体转染细胞来实现报告分子的表达。在某些实施方式中，先前已经对细胞进行了基因改造以表达报告多肽。在某些实施方式中，报告分子的表达在可调节的表达控制元件的控制下，并且通过使细胞与诱导(或抑制)表达的试剂接触来实现报告分子表达的诱导。
将包含细胞、测试化合物或多肽的检测组合物维持一段合适的时间，在此期间，测试化合物可能会(在没有抑制其活性的测试化合物的情况下)引起靶TR激活因子或TR抑制因子的水平或活性升高或降低。细胞的数量、TR激活因子或TR抑制因子多肽的数量以及要加入的测试化合物的数量将取决于，例如诸如容器大小、细胞类型之类的因素，并且可以由本领域普通技术人员确定。在某些实施方式中，TR激活因子或TR抑制因子多肽与测试化合物的摩尔浓度比为1:10至10：1。在某些实施方式中，可以选择细胞的数量、测试化合物的量以及维持组合物的时间长度，以使得在不存在测试化合物的情况下在选定的时间段之后易于检测的水平信号。在某些实施方式中，在添加化合物时，细胞处于约25％-75％，例如约50％的汇合度。在某些实施方式中，将1,000至10,000个细胞/孔(例如约5,000个细胞/孔)铺在96孔板中的每孔约100μl培养基中。在其他示例性实施方式中，将细胞以每孔500至2,000个(例如约1000个)细胞的约30μl至50μl的培养基接种到384孔板中。在某些实施方式中，以多种浓度(例如2-10个不同浓度)和/或以多个重复(例如2-10个重复)测试化合物。可以执行某些或所有不同浓度的多个重复。在某些实施方式中，候选TR因子以0.1μg/ml至100μg/ml之间(例如1μg/ml至10μg/ml)的浓度使用。在某些实施方式中，候选TR因子以多种浓度使用。在某些实施方式中，将化合物在接种后6小时至1天(24小时)之间添加至细胞。在任何本发明化合物筛选和/或表征方法的某些方面，将测试化合物以足以达到预定浓度的量加入测定组合物中。在某些实施方式中，浓度高达约1nM。在某些实施方式中，浓度在约1nM至约100nM之间。在某些实施方式中，浓度在约100nM至约10μM之间。在某些实施方式中，浓度为至少10μM，例如在10μM与100μM之间。在加入最后一种成分后，可以将测定组合物维持不同时间。在某些实施方式中，将测定组合物维持约10分钟至约4天，例如1小时至3天，例如2小时至2天，或任何中间范围或特定值，例如添加所有组件后的约4-8小时。可以测试多个不同的时间点。可以在该时间段内将其他等分试样的测试化合物加入测定组合物中。在某些实施方式中，将细胞维持在适合于培养该类型细胞的细胞培养基中。在某些实施方式中，使用无血清培养基。在某些实施方式中，代替细胞培养基，测定组合物包含与维持细胞膜的完整性和任选地与细胞生存力相容的生理上可接受的液体。可以使用任何合适的液体，只要其具有适当的渗透压，并且在至少足够长的时间段内(以进行测定)与维持细胞膜的合理完整性以及任选的细胞生存力相容。在孵育期间或之后，可以进行一种或多种指示活性TR激活因子水平增加或TR抑制因子减少的测量。
在某些实施方式中，被筛选为可能是iTR的整体调节子的化合物选自能够在其他条件下诱导体细胞类型多能性的药物。此类试剂单独地或组合地包含以下化合物：基因OCT4、SOX2、KLF4、NANOG、ESRRB、NR5A2、CEBPA、MYC、LIN28A和LIN28B单独地和与小分子化合物(例如以下化合物的组合)的组合：糖原合酶3(GSK3)的抑制因子，其包括但不限于CHIR99021；TGF-β信号传导的抑制因子，其包括但不限于SB431542、A-83-01和E616452；HDAC抑制因子，其包括但不限于脂族酸化合物，所述脂族酸化合物包括但不限于丙戊酸、苯基丁酸和正丁酸，环四肽(包括曲霉毒素B和二肽)，异羟肟酸(例如曲古抑菌素A、伏立诺他(SAHA)、贝洛司他(PXD101)、LAQ824、帕诺贝司他(LBH589)和苯甲酰胺恩替司他(MS-275)、CI994、mocetinostat(MGCD0103)；专门针对I类(HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8)，IIA类(HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9)，IIB类(HDAC6和HDAC10)，III类(SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7)(包括sirtuin抑制因子烟酰胺、NAD的各种衍生物、二氢香豆素、萘并吡喃酮和2-羟基萘乙醛，或IV类(HDAC11)脱乙酰基酶的那些；H3K4/9组蛋白脱甲基酶LSD1的抑制因子(包括但不限于parnate)；DotlL的抑制因子(包括但不限于EPZ004777)；G9a的抑制因子(包括但不限于Bix01294)；EZH2的抑制因子(包括但不限于DZNep)；DNA甲基转移酶的抑制因子(包括但不限于RG108)；5-氮杂-2’脱氧胞苷(商品名为Vidaza和Azadine)；维生素C，其能够抑制DNA甲基化，并能够增加Tetl，从而增加5hmC，这是脱甲基化的第一步；3’磷酸肌醇依赖性激酶1的激活因子(包括但不限于PS48)；糖酵解的启动子(包括但不限于槲皮素和果糖2，6-二磷酸(磷酸果糖激酶1的激活因子))；促进HIF1转录复合物活性的试剂(包括但不限于槲皮素)；RAR激动剂(包括但不限于AM580、CD437和TTNPB)；模拟缺氧的试剂(包括但不限于白藜芦醇(Resveratrol))；增加端粒酶活性的试剂，包括但不限于端粒酶催化成分(TERT)的外源表达；通过下调LSD 1(H3K4特异性组蛋白脱甲基酶)促进表观遗传修饰的试剂(包括但不限于锂)；或MAPK/ERK通路的抑制因子(包括但不限于PD032590)。可以以各种组合、浓度和在不同的时间段内施用此类化合物以优化iTR对使用整体iTR标志物体外培养的细胞的影响，所述优化可例如通过测定COX7A1、ADIRF、TNFRSF11B或如本文所述的其他iTR抑制因子的表达的减少，和/或测定如本文所述的AMH或其他激活因子或iTR的表达的增加或在体内受伤或患病的组织中的表达的增加，或在体内调节动物的生命历程来实现。
在某些实施方式中，将通常具有已知身份(例如结构和/或序列)的各个化合物添加至多个孔中的每个。在某些实施方式中，可以将两种或更多种化合物添加到一个或多个孔中。在某些实施方式中，可以测试一种或多种身份未知的化合物。随后可以使用本领域已知的方法来确定身份。
在各种实施方式中，本发明的前述测定方法适合于高通量筛选(HTS)实施。在某些实施方式中，本发明的筛选测定是高通量或超高通量(参见例如Fernandes,PB,Curr OpinChem.Biol.1998,2:597；Sundberg,SA,Curr Opin Biotechnol.2000,11:47)。高通量筛选(HTS)通常涉及高效地测试大量化合物，例如并行进行的测试。例如，可以在短时间(例如数小时至数天内)例行筛选数以万计的化合物。在某些实施方式中，HTS是指每天测试1,000至100,000个化合物。在某些实施方式中，超高通量是指每天筛选超过100,000种化合物，例如每天多达一百万或更多种化合物。本发明的筛选测定可以以多孔形式进行，例如96孔、384孔形式、1,536孔形式或3,456孔形式，并且适用于自动化。在某些实施方式中，微孔板的每个孔可用于针对不同的测试化合物进行单独的测定，或者，如果要观察浓度或孵育时间的影响，则多个孔可包含单个化合物的测试样品，以及至少有某些孔可以选择留空或用作对照或重复。通常，本文公开的测定的HTS实施方式涉及自动化的使用。在某些实施方式中，包括一个或多个机器人的集成机器人系统在多个测定站之间运输测定微孔板，以用于化合物、细胞和/或试剂的添加、混合、温育以及读出或检测。在某些方面，本发明的HTS系统可以同时制备、孵育和分析许多板。可以采用适当的数据处理和控制软件。高通量筛选实施方式是本领域众所周知的。在不以任何方式限制本发明的情况下，在Macarron R&Hertzberg RP.Design and implementation of high-throughput screening assays.Methods MolBiol.565:1-32,2009和/或An W F&TollidayN J.,Introduction:cell-based assays forhigh-throughput screening.Methods Mol Biol.486:1-12,2009和/或在其中任一个中的引用中描述了可以在本发明的HTS的实施方式中应用的某些基本原理和技术。在HighThroughput Screening:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)byWilliam P.Janzen(2002)和High-Throughput Screening in Drug Discovery(Methodsand Principles in Medicinal Chemistry)(2006)中也公开了示例性方法。另外的化合物可以例如具有一种或多种相比于初始命中改善的药代动力学和/或药效学特性，或者可以简单地具有不同的结构。“改善的性质”可以例如使化合物更有效或更适合于本文所述的一个或多个目的。在某些实施方式中，例如，化合物可对感兴趣的分子靶标(例如TR激活因子或TR抑制因子基因产物)具有较高的亲和力，对非靶标分子具有较低的亲和力，具有增加的溶解度(例如，增加的水溶性)、增加的稳定性(例如，在血液、血浆和/或胃肠道中的稳定性)、增加的体内半衰期、提高的生物利用度和/或减少的副作用等。可以通过对命中结构进行经验性修饰(例如合成具有相关结构的化合物并在无细胞或基于细胞的试验中或在非人类动物中对其进行测试)和/或使用计算方法来实现优化。在某些实施方式中，这种修饰可以利用药物化学的既定原理来可预测地改变一种或多种特性。在某些实施方式中，鉴定“命中”的一种或多种化合物，并对其进行系统的结构改变以产生在结构上与命中相关的化合物的第二文库(例如精制的先导化合物)。然后可以使用本文所述的任何方法筛选第二文库。在某些实施方式中，iTR因子被修饰或引入了增强稳定性(例如在血清中)、增加半衰期、降低毒性或免疫原性或赋予化合物所需性质的部分。
iTR、iTM和ICM因子的使用
药物组合物
iTR、iTM、衰老细胞裂解、iS-CSC和iCM因子具有多种不同用途。本文讨论了这种用途的非限制性实例。在某些实施方式中，iTR因子用于增强器官或组织的再生。在某些实施方式中，使用iTR因子来增强肢体，手指，软骨，心脏，血管，骨骼，食道，胃，肝脏，胆囊，胰腺，肠，直肠，肛门，内分泌腺(例如甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、胰腺的内分泌部分)，皮肤，毛囊，胸腺，脾脏，骨骼肌，局灶性受损心肌，平滑肌，脑，脊髓，外周神经，卵巢，输卵管，子宫，阴道，乳腺，睾丸，输精管，精囊，前列腺，阴茎，咽，喉，气管，支气管，肺，肾，输尿管，膀胱，尿道，眼睛(例如视网膜、角膜)或耳朵(例如柯蒂氏器(organ of Corti))。在某些实施方式中，iTR因子用于增强基质层(例如支持组织实质的结缔组织)的再生。在某些实施方式中，将iTR因子用于增强手术后的再生，例如，手术需要去除至少一部分患病或受损的组织、器官或其他结构，例如肢体、手指等。这样的手术可以去除肝脏、肺、肾、胃、胰腺、肠、乳腺、卵巢、睾丸、骨头、四肢、手指、肌肉、皮肤等的至少一部分。在某些实施方式中，该手术是去除肿瘤。在某些实施方式中，iTR因子用于促进创伤、手术、疾病和烧伤后皮肤的无疤再生。
在各种实施方式中，增强再生可包括以下的任何一种或多种：(a)提高再生速率；(b)增加再生程度；(c)促进在再生的组织或器官或其他身体结构中建立适当的结构(例如，形状、图案、组织结构、组织极性)；(d)以保持和/或恢复功能的方式促进新组织的生长。尽管特别关注使用iTR因子来增强再生，但是本发明总体上包括使用iTR因子来增强修复或创口愈合，而不一定产生可检测的再生增强。因此，本发明提供了增强修复或创口愈合的方法，其中根据本文所述的任何方法将iTR因子施用于需要其的受试者。
在本发明中教导了衰老和与年龄有关的疾病的许多方面，其可以用iTR疗法解决。这些衰老表现包括与年龄有关的血管功能障碍，包括周围血管、冠状动脉和脑血管疾病；肌肉骨骼疾病，包括骨关节炎、椎间盘退变、骨折、肌腱和韧带撕裂以及肢体再生；神经系统疾病，包括中风和脊髓损伤；肌肉疾病，包括肌肉营养不良、肌肉减少症、心肌梗塞和心力衰竭；内分泌疾病，包括I型糖尿病、艾迪生氏病(Addison’s disease)、甲状腺功能减退和垂体功能不全；消化系统疾病，包括胰腺外分泌功能不全；眼部疾病，包括黄斑退行性、色素性视网膜炎和神经视网膜退行性疾病；皮肤病，包括皮肤烧伤、撕裂伤、手术切口、脱发、头发变白和皮肤老化；肺部疾病，包括肺气肿和肺间质纤维化；听觉障碍，包括听力损失；和血液系统疾病，例如再生障碍性贫血和造血干细胞移植失败。
在某些实施方式中，本发明提供了一种在需要其的受试者中增强再生的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的iTR因子。在某些实施方式中，化合物(例如iTR因子)的有效量是与参照值(例如合适的对照值)相比导致受损组织再生的速率或程度增加的量。在某些实施方式中，参照值是在不存在化合物的情况下预期的(例如平均或典型的)再生速率或再生程度(任选地与安慰剂一起施用)。在某些实施方式中，iTR因子的有效量是与在不存在化合物的情况下预期的(例如平均或典型的)结构或功能结果相比改善的结构和/或功能结果的量。在某些实施方式中，有效量的化合物，例如iTR因子，导致增强的芽基形成和/或减少的瘢痕形成。例如，可以基于再生组织的尺寸或体积来评估再生的程度或速率。可以基于例如视觉检查(可选地包括使用显微镜或成像技术(例如X射线、CT扫描、MRI扫描、PET扫描))和/或通过评估组织、器官或其他身体部位执行通常由此类组织、器官或身体部位执行的一个或多个生理过程或任务的能力来评估结构和/或功能结果。通常，改善的结构结果是相比于不使用iTR因子进行治疗预期的结构结果(例如平均或典型结果)与正常结构(例如组织损伤之前存在的结构或正常、健康个体中存在的结构)更相似的结构结果。本领域普通技术人员可以选择适当的测定或功能测试。在某些实施方式中，再生速率或程度相比于对照值的增加在统计学上是显著的(例如，p值＜0.05，或p值＜0.01)和/或临床上显著的。在某些实施方式中，结构和/或功能结果相比于对照值的改善在统计学上和/或临床上是显著的。“临床上的显著改善”是指在医学或外科医师的合理判断范围内，赋予受试者有意义的益处(例如，足以使治疗值得的益处)的改善。将理解的是，在许多实施方式中，施用于特定物种的受试者(例如出于治疗目的)的iTR调节子(例如iTR因子)是调节(例如抑制)所述物种的受试者中表达的内源TR基因的化合物。例如，如果受试者是人，通常将施用抑制人TR抑制因子基因产物的活性并激活人TR激活因子基因产物的活性的化合物。
在某些实施方式中，iTR因子用于例如在烧伤(热或化学的)、刮擦损伤或涉及皮肤损失的其他情况(例如感染(例如坏死性筋膜炎或暴发性紫癜))之后增强皮肤再生。在某些实施方式中，烧伤是二级烧伤或三级烧伤。在某些实施方式中，皮肤损失的区域具有至少10cm2的面积。一方面，iTR因子增强移植皮肤的再生。一方面，iTR因子减少过度的和/或病理的创口收缩或瘢痕形成。
在某些实施方式中，例如在诸如不愈合骨折、植入物固定、牙周或牙槽隆起、颅面外科手术或认为新骨生成合适的其他条件的情况下，使用iTR因子来增强骨再生。在某些实施方式中，将iTR因子应用于需要骨再生的部位。在某些实施方式中，将iTR因子结合到骨移植材料中或与之结合使用。骨移植材料包括多种陶瓷和蛋白材料。骨移植材料包括自体骨(例如从髂骨、腓骨、肋骨等处收集的骨)，来自尸体的同种异体骨和异种骨。合成骨移植材料包括多种陶瓷(例如磷酸钙(例如羟基磷灰石和磷酸三钙))，生物玻璃和硫酸钙，以及蛋白材料(例如脱矿质骨基质(DBM))。可以通过研磨皮质骨组织(通常至100-500μm筛分的粒度)，然后用盐酸(通常为0.5至1N)处理研磨的组织来制备DBM。在某些实施方式中，将iTR因子与一种或多种骨移植材料一起施用于受试者。可以将iTR因子与骨移植物材料组合(在包含iTR因子和骨移植物材料的组合物中)，或者例如在放置移植物之后单独施用。在某些实施方式中，本发明提供了包含iTR因子的骨膏。骨膏是具有适当稠度和成分的产品，因此可以将它们引入到骨骼缺陷中(例如空隙、缝隙、空腔、裂缝等)并用于修补或填充此类缺陷，或应用于现有的骨骼结构。骨膏通常具有足够的延展性，以允许使用者将其操纵和模制成各种形状。这种处理的期望结果是将发生骨形成以替代膏剂，例如保持膏剂被施加的形状。骨膏为新的骨形成提供支撑结构，并且可以包含促进骨形成的物质。除了一种或多种陶瓷或蛋白骨移植材料(例如DBM、羟基磷灰石)外，通常还包含一种或多种赋予材料膏状或腻子状稠度的成分，例如透明质酸、壳聚糖、淀粉成分(如支链淀粉)。在某些实施方式中，iTR因子增强骨祖细胞从未分化的间充质细胞的形成和/或募集和/或增强骨祖细胞向形成新骨的细胞(成骨细胞)的分化。在某些实施方式中，向患有骨质减少或骨质疏松的受试者施用iTR因子，例如以增强受试者的骨再生。
在某些实施方式中，使用iTR因子来增强关节(例如纤维、软骨或滑膜关节)的再生。在某些实施方式中，关节是椎间盘。在某些实施例中，关节是髋，膝，肘或肩关节。在某些实施方式中，使用iTR因子来增强牙齿和/或牙周组织或结构(例如牙髓、牙周韧带、牙齿、牙周骨)的再生。在某些实施方式中，iTR因子用于减少CNS和PNS损伤中的神经胶质瘢痕形成。在某些实施例中，iTR因子用于减少内部手术中的粘连和狭窄形成。
在某些实施方式中，iTR因子用于减少肌腱和韧带修复中的瘢痕形成，从而改善活动性。
在某些实施方式中，iTR因子用于减少眼外伤后的视力丧失。
在某些实施方式中，将iTR因子与细胞组合施用于受试者。iTR因子和细胞可以分别施用或在相同的组合物中施用。如果分开施用，它们可以在相同或不同位置施用。在各种实施方式中，细胞可以是自体的、同种异体的或异种的。所述细胞可包含祖细胞或干细胞，例如成年干细胞。如本文所用，干细胞是具有至少以下性质的细胞：(i)自我更新，即经历许多细胞分裂循环而仍保持未分化状态的能力；(ii)多潜能或多分化潜能，即产生几种不同细胞类型(例如特定组织或器官的许多、大多数或所有不同细胞类型)的后代的能力。成人干细胞是源自非胚胎组织(例如胎儿、出生后或成体组织)的干细胞。如本文所用，术语“祖细胞”涵盖比多能干细胞更分化但未完全分化的多能细胞。与胚胎祖细胞相比，这种更高分化的细胞(可能来自胚胎祖细胞)具有较低的自我更新能力。在某些实施方式中，将iTR因子与间充质祖细胞、神经祖细胞、内皮祖细胞、毛囊祖细胞、神经嵴祖细胞、乳干细胞、肺祖细胞(例如支气管肺泡干细胞)、肌肉祖细胞(例如卫星细胞)、源自脂肪的祖细胞、上皮祖细胞(例如角质形成细胞干细胞)和/或造血祖细胞(例如造血干细胞)联合施用。在某些实施方式中，细胞包括诱导的多能干细胞(iPS细胞)或已经从iPS细胞至少部分分化的细胞。在某些实施方式中，祖细胞包括成体干细胞。在某些实施方式中，至少某些细胞是分化的细胞，例如软骨细胞、成骨细胞、角质形成细胞、肝细胞。在某些实施方式中，所述细胞包括成肌细胞。
在某些实施方式中，在包含一种或多种化合物的组合物(例如溶液)中施用iTR因子，所述一种或多种化合物在施用给受试者后原位聚合或变得交联或经历相变，通常形成水凝胶。该组合物可以包含单体、聚合物、引发剂、交联剂等。该组合物可以被施加(例如使用注射器)到需要再生的区域，在该区域它就地形成凝胶，iTR因子从该区域随时间释放。可以例如通过与体液中的离子接触或通过改变温度或pH或通过光或通过组合反应性前体(例如使用多管注射器)来触发胶凝。(参见例如美国专利号6,129,761；Yu L，DingJ.Injectable hydrogels as unique biomedical materials.Chem Soc Rev.37(8):1473-81(2008))。在某些实施方式中，水凝胶是透明质酸或透明质酸和含胶原蛋白I的水凝胶(例如本文所述的HyStem-C)。在某些实施方式中，组合物还包含细胞。
在某些实施方式中，将iTR因子与表达端粒酶催化成分的载体组合施用给受试者。载体可以单独或在相同的组合物中施用。如果分开施用，它们可以在相同或不同位置施用。载体可以从与被治疗的组织相同的物种或从另一物种表达端粒酶催化组分。所述iTR因子与端粒酶催化组分的共同施用特别有用，其中靶组织来自老年个体，并且所述个体来自人物种。本发明的其他方法包括在活体、功能组织、器官或含细胞的组合物的离体生产中使用iTR因子以修复或替换由于损伤而损失的组织或器官。例如，从个体(未来的接受者、相同物种的个体或不同物种的个体)中去除的细胞或组织可以在体外培养，任选地与基质、支架(例如三维支架)或模具(例如，包含生物相容性，任选地可生物降解的材料，例如聚合物(例如HyStem-C))一起培养，并且可以通过接触iTR因子来促进它们向功能组织或器官的发育。所述支架、基质或模具可以至少部分由天然存在的蛋白(例如胶原蛋白、透明质酸或藻酸盐(或其中任何一种的化学修饰衍生物)，或乳酸、己内酯、乙醇酸的合成聚合物或共聚物酸等，或自组装的肽，或衍生自诸如心脏瓣膜、肠粘膜、血管和气管等组织的脱细胞基质组成。在某些实施方式中，支架包含水凝胶。在某些实施方式中，支架可以用iTR因子包被或浸渍，所述iTR因子可以随时间从支架中扩散出来。离体生产后，将组织或器官移植到受试者内或受试者上。例如，可以植入组织或器官，或者在某些组织(例如皮肤)的情况下，可以将其放置在体表上。组织或器官可继续在体内发育。在某些实施方式中，至少部分离体产生的组织或器官是膀胱、血管、骨骼、筋膜、肝脏、肌肉、皮肤块等。合适的支架可以例如模拟细胞外基质(ECM)。任选地，在离体产生的组织或器官的移植之前、期间和/或之后将iTR因子施用于受试者。在某些方面，生物相容性材料是在所使用的浓度下对体外细胞基本上无毒的材料，或者在向活体受试者施用的材料的情况下，一定量的生物相容性材料对受试者的细胞基本上无毒。并且在所使用的位置上不会引起或对受试者产生显著的有害或不利影响(例如免疫学或炎性反应、不可接受的瘢痕组织形成等)。应当理解，某些生物相容性材料可能在一小部分受试者(通常小于约5％、1％、0.5％或0.1％)的体内引起此类不良反应。
在某些实施方式中，用iTR因子或包括能够引起iTR基因表达的全局模式的因子的因子的组合包被或浸渍的基质或支架任选地与细胞组合，植入需要再生的受试者中。基质或支架可以是需要再生的组织或器官的形状。所述细胞可以是产生这种组织或器官和/或在这种组织或器官中发现的一种或多种类型的干细胞。
在某些实施方式中，将iTR因子或因子的组合直接施用至组织损伤部位或附近。“直接到达组织损伤部位”包括将化合物或组合物注射入组织损伤部位或使扩散、倾倒或将化合物或组合物直接与组织损伤部位接触。在某些实施方式中，如果施用发生在距组织损伤部位或至少部分位于受损的组织或器官内的血管(例如动脉)的可见或明显边缘约10cm以内的位置，则被认为施用在“组织损伤部位附近”。“在组织损伤部位附近”施用有时是在受损器官内，但损伤不明显的位置施用。在某些实施方式中，在组织、器官或其他结构的损坏或丢失之后，将iTR因子施加到组织、器官或其他结构的其余部分。在某些实施方式中，将iTR因子施加到仍与身体连接的被切断的手指或肢体的末端，以增强已丢失的部分的再生。在某些实施方式中，将切断的部分通过外科手术重新连接，并且将iTR因子施加至创口的一个或两个表面。在某些实施方式中，施用iTR因子以增强移植器官或其部分的植入或愈合或再生。在某些实施方式中，将iTR因子用于增强神经再生。例如，可以将iTR因子注入到切断的神经中(例如在近端和/或远端残端附近)。在某些实施方式中，将iTR因子置于人工神经导管内，所述人工神经导管是由生物或合成材料组成的管，神经末梢和介入间隙被封闭在其中。可以将一种或多种因子配制成基质以促进其随时间的受控释放。所述基质可以包含生物相容性，任选地可生物降解的材料，例如聚合物，例如包含透明质酸的聚合物，包括与PEGDA交联的交联透明质酸或羧甲基透明质酸酯，或由PEGDA交联的羧甲基透明质酸酯与羧甲基改性的明胶的混合物(HyStem-C)。
在某些实施方式中，iTR因子是本文所述的AgeXl547，并且可以配制成或不配制成用于在PEGDA与羧甲基改性的明胶(HyStem-C)交联的羧甲基透明质酸酯中的定位和缓慢释放以诱导iTR。iTM和iCM因子(例如来自胎儿或成年细胞的外来体)可以在生理溶液(例如生理盐水)中施用，也可以在PEGDA与羧甲基修饰的明胶(HyStem-C)交联的羧甲基透明质酸中缓慢释放以诱导iTM或iCM。
在某些实施方式中，使用iTR因子或因子的组合来促进毛囊的产生和/或头发的生长。在某些实施方式中，iTR因子触发通常不形成头发的上皮细胞的毛囊再生。在某些实施方式中，iTR因子用于治疗男性或女性的脱发、头发稀疏、部分或完全秃发。在某些实施方式中，秃头是没有或基本上没有头发或在其经常生长的地方(例如在头部的顶部、背面和/或侧面)缺少头发的状态。在某些实施方式中，头发稀疏是这样的状态：其头发少于正常或普通头发，或者在某些实施方式中，头发少于个体过去的头发，或者在某些实施方式中，头发少于个体认为理想的头发。在某些实施方式中，iTR因子用于促进眉毛或睫毛的生长。在某些实施方式中，将iTR因子用于治疗雄激素性脱发或“男性型秃发”(其可影响男性和女性)。在某些实施方式中，使用iTR因子来治疗斑秃(其涉及头皮上的斑状脱发)、总秃发(其涉及所有头毛的损失)或通用秃头(其涉及头和身体的所有毛发的损失)。在某些实施方式中，将iTR因子应用于需要毛发生长的部位，例如头皮或眉毛区域。在某些实施例中，将iTR因子施加到眼睑的边缘或边缘附近，以促进睫毛的生长。在某些实施方式中，将iTR因子应用于液体制剂中。在某些实施方式中，将iTR因子应用于乳膏、软膏、膏剂或凝胶中。在某些实施方式中，将iTR因子用于增强烧伤、手术、化学疗法或其他引起脱发或带发皮肤损失的事件之后的毛发生长。在某些实施方式中，将iTR因子或因子的组合施用于患有与年龄相关的退行性变化的组织以再生年轻化功能。所述与年龄有关的退行性变化包括但不限于与年龄有关的黄斑退行性、冠状动脉疾病、骨质疏松、骨坏死、心力衰竭、肺气肿、外周动脉疾病、声带萎缩、听力丧失、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、皮肤溃疡以及其他与年龄有关的退行性疾病。在某些实施方式中，所述iTR因子与表达端粒酶的催化成分的载体共同施用以延长细胞寿命。
在某些实施方式中，施用一种或多种iTR因子以增强由于诸如化学疗法、放射或毒素之类的伤害而丢失或损坏的细胞的替换。在某些实施方式中，这样的细胞是实体器官和组织的基质细胞。本发明的治疗方法可以包括鉴定或提供患有疾病或病况或处于其中的风险或风险中的受试者的步骤，其中增强再生将对所述受试者有益。在某些实施方式中，所述受试者经历了损伤(例如身体创伤)或对组织或器官的损伤。在某些实施方式中，损伤的是肢体或手指。在某些实施方式中，受试者患有影响心血管、消化、内分泌、肌肉骨骼、胃肠道、肝、皮肤、神经、呼吸或泌尿系统的疾病。在某些实施方式中，组织损伤是指对组织、器官或结构的损害，例如软骨、骨骼、心脏、血管、食道、胃、肝脏、胆囊、胰腺、肠、直肠、肛门、内分泌腺、皮肤、毛囊、牙齿、牙龈、嘴唇、鼻子、嘴巴、胸腺、脾脏、骨骼肌、平滑肌、关节、大脑、脊髓、末梢神经、卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺、阴茎、咽、喉、气管、支气管、肺、肾、输尿管、膀胱、尿道、眼睛(例如视网膜、角膜)或耳朵(例如柯蒂氏器(organof Corti))。
在某些实施方式中，在受试者遭受组织损伤(例如，创伤或急性疾病相关事件，例如心肌梗塞或中风)后约2、4、8、12、24、48、72或96小时内向受试者施用化合物或组合物至少一次，并且任选地在该次之后至少再施用一次。在某些实施方式中，在受试者遭受组织损伤后约1-2周、2-6周或6-12周内将化合物或组合物施用于受试者至少一次，并且任选地在该次之后至少再施用一次。
在本发明的某些实施方式中，通过例如在需要再生或从头发展的部位去除皮肤、去除至少一些组织，摩擦需要再生或从头开始发展的关节或骨表面，和/或在受试者上造成另一类型的创口，来刺激或促进缺失或发育不良的组织、器官或结构的再生或从头发展可能是有用的。在组织损伤后再生的情况下，可能希望去除(例如通过手术切除或清创术)至少某些损伤的组织。在某些实施方式中，在这样的去除或磨损的部位或附近施用iTR因子。在某些实施方式中，将iTR因子用于增强受试者中组织或器官的生成，在所述受试者中，由于先天性疾病(例如遗传性疾病)而至少部分不存在这种组织或器官。许多先天畸形会导致发育不全或缺乏各种组织、器官或身体结构，例如四肢或手指。在其他情况下，导致组织、器官或其他身体结构发育不全的发育障碍在出生后变得很明显。在某些实施方式中，将iTR因子施用于患有发育不全或缺乏组织、器官或其他身体结构的受试者以刺激此类组织、器官或其他身体结构的生长或发育。在某些方面，本发明提供了一种在发育不全或先天性缺乏这种组织、器官或其他身体结构的受试者中增强所述组织、器官或其他身体结构的产生的方法，所述方法包括将iTR因子施用于受试者。在某些实施方式中，将iTR因子在出生前即在子宫内施用于受试者。本文中描述的本发明的关于再生的各个方面和实施方式适用于组织、器官或其他身体结构的这种从头产生，并且包括在本发明内。
在某些方面，在新的组织生长于之前不存在这种组织的位置且所述生长有益的多种情况中的任一情况下，使用iTR因子来增强组织的产生。例如，在脊柱或其他关节融合的情况下，在关节之间生成骨组织通常是有用的。
可以在多种再生动物模型中测试iTR因子。一方面，在鼠类物种中测试了iTR的调节子。例如，可以使小鼠受伤(例如通过切口、截肢、横切或组织碎片的去除)。将iTR因子应用于创口部位和/或去除的组织碎片，并评估其对再生的影响。可以在多种用于组织或器官再生的脊椎动物模型中测试脊椎动物TR调节子的作用。例如，如在(Mathew L K,Unraveling tissue regeneration pathways using chemical genetics.JBiolChem.282(48):35202-10(2007))中所述的，可以在斑马鱼中评估鳍的再生，并且可将其用作肢体再生的模型。啮齿动物、犬、马、山羊、鱼、两栖动物和其他可用于测试治疗对组织和器官(如心脏、肺、四肢、骨骼肌、骨骼等)再生作用的动物模型已被广泛使用。例如，在Tissue Eng Part B Rev.16(1)(2010)中讨论了用于肌肉骨骼再生的各种动物模型。用于研究肝再生的常用动物模型包括通过手术切除较大部分的啮齿动物肝脏。肝再生的其他模型包括急性或慢性肝损伤或由毒素(例如四氯化碳)引起的肝衰竭。在某些实施方式中，用于毛发再生或皮肤创口愈合的模型涉及例如从小鼠切下皮肤块。可以评估毛囊的再生、毛发生长、上皮再形成、腺体形成等。
可以通过任何合适的方式(例如口服、鼻内、皮下、肌肉内、静脉内、动脉内、肠胃外、腹膜内、鞘内、气管内、眼内、舌下、阴道、直肠、皮肤或通过吸入(例如作为气雾剂))施用本文公开的和/或使用本文描述的方法和/或测定系统鉴定的化合物和组合物。当然，所选择的特定模式将取决于所选择的特定化合物、所治疗的特定病症以及治疗功效所需的剂量。一般而言，本发明的方法可以使用医学上或兽医学上可接受的任何施用方式来实施，这是指产生可接受水平的功效而不会引起临床上不可接受的(例如，医学上或兽医学上不可接受的)副作用的任何方式。可以将一种或多种化合物的合适制剂，例如基本上纯的制剂与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂等组合，以产生适合于给予受试者的合适的药物组合物。这样的药学上可接受的组合物是本发明的一个方面。术语“药学上可接受的载体或赋形剂”是指不会明显干扰活性成分的生物学活性或有效性的载体(该术语包括载体、介质、稀释剂、溶剂、媒介物等)或赋形剂。在组合物的使用或施用浓度下，该组合物对宿主没有过度毒性。组合物中也可以存在其他药学上可接受的成分。合适的物质及其在制备药物活性化合物中的用途是本领域众所周知的(参见例如“Remington’s PharmaceuticalSciences”,E.W.Martin,第19版，1995，Mack Publishing Co.：Easton,Pa.,和更新的版本，例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy.第21版.Philadelphia,Pa.Lippincott Williams&Wilkins,2005，其为对药学上可接受的物质和制备各种类型药物组合物的方法的进一步探讨)。此外，本发明的化合物和组合物可以与本领域中用于治疗特定疾病或目的病症的任何化合物或组合物组合使用。通常将药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。例如，肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳剂。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液(包括盐水和缓冲介质，例如氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液)。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；防腐剂，例如抗菌剂(例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯)；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠)调节pH。这样的肠胃外制剂可以封装在安瓿(ampoule)、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
对于口服施用，可以通过将活性化合物与本领域众所周知的药学上可接受的载体混合来容易地配制化合物。这样的载体使本发明的化合物可以配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等。用于口服剂型的合适的赋形剂是例如填充剂，例如糖(包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇)；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
为了通过吸入施用，本发明的组合物可以以气溶胶喷雾的形式从压力容器或分配器中输送，所述压力容器或分配器包含合适的推进剂，例如诸如二氧化碳、碳氟化合物或喷雾器之类的气体。可以使用液体或干燥的气雾剂(例如干燥的粉末、大的多孔颗粒等)。本发明还考虑了使用鼻喷雾剂或其他形式的鼻腔施用来递送组合物。对于局部应用，可以将药物组合物配制成合适的软膏、洗剂、凝胶或乳膏，其中含有悬浮或溶解在一种或多种适用于该组合物的药学上可接受的载体中的活性成分。为了局部递送至眼睛，可将药学上可接受的组合物配制成在等渗的pH调节的无菌盐水中的溶液或微粉化的悬浮液，例如用于滴眼剂或软膏中，或用于眼内施用，例如通过注射。可以配制药物组合物用于经粘膜或经皮递送。对于透粘膜或透皮施用，在制剂中可以使用适合于要渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂是本领域公知的。本发明药物组合物可以配制成栓剂(例如，与常规的栓剂基质如可可脂和其他甘油酯一起)或配制成用于直肠递送的灌肠剂。
在某些实施方式中，组合物包含一种或多种旨在保护活性剂免于迅速从体内清除的试剂，例如控释制剂、植入物、微囊递送系统等。组合物可掺入试剂以改善稳定性(例如在胃肠道或血液中)和/或增强吸收。可以将化合物包封或掺入颗粒(例如微粒或纳米颗粒)中。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、PLGA、胶原蛋白、聚原酸酯、聚醚和聚乳酸。这类制剂的制备方法对本领域技术人员而言是显而易见的。例如但不限于，本领域已知许多基于颗粒、脂质和/或聚合物的递送系统用于递送siRNA。本发明考虑了此类组合物的用途。脂质体或其他基于脂质的颗粒也可以用作药学上可接受的载体。
可以在满足监管机构规定的标准、要求或指南的条件下制造药物组合物和用于此类组合物的化合物。例如，此类组合物和化合物可以根据良好操作规范(GMP)进行生产和/或遵循适用于向人施用的药剂的质量控制程序，并可以得到由负责管理药品、外科手术或其他具有有益治疗性的产品的政府监管机构批准的标签。
本发明的药物组合物，当出于治疗目的而施用于受试者时，优选地以足以治疗其所施用的疾病或病状的时间和量施用。活性剂的治疗功效和毒性可以通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序进行评估。从细胞培养测定法和动物研究中获得的数据可用于配制一系列适用于人或其他受试者的剂量。如本领域已知的，可以在人的临床试验中进一步测试用于人施用的不同剂量。使用的剂量可以是最大耐受剂量或较低剂量。药物组合物中活性剂的治疗有效剂量可以在约0.001mg/kg至约100mg/kg体重、约0.01至约25mg/kg体重、约0.1至约20mg/kg体重、约1至约10mg/kg的范围内。其他示例性剂量包括例如约1μg/kg至约500mg/kg、约100mg/kg至约5mg/kg。在某些实施方式中施用单剂，而在其他实施方式中施用多剂。本领域普通技术人员将理解，在任何特定情况下的适当剂量取决于所使用的药剂的效力，并且可以任选地针对特定接受者进行调整。受试者的具体剂量水平可能取决于多种因素，包括所用特定药剂的活性、特定的疾病或状况及其严重性、年龄、体重、受试者的总体健康状况等。为了易于施用和剂量均匀，可能需要以单位剂型配制药物组合物，特别是用于口服或肠胃外组合物的药物组合物。如本文所用，单位剂型是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单元均包含预定量的活性剂，该活性剂经计算可产生所需的治疗效果，并包含适当的药学上可接受的载体。将理解的是，治疗方案可以包括在一段时间内施用多种剂量，例如单位剂型，其可以持续数天、数周、数月或数年。受试者可以在治疗期内每天接受一剂或多剂，或者每隔一天或更不频繁地接受一剂。例如，可以每两周、每周等施用。例如，可以继续施用直到组织或器官的适当结构和/或功能已经至少部分恢复和/或直到继续施用该化合物似乎并未促进进一步的再生或改善为止。在某些实施方式中，受试者向他或她施用一剂或多剂本发明的组合物。
在某些实施方式中，例如为了增强再生的目的，组合施用两种或更多种化合物或组合物。组合施用的化合物或组合物可以在相同的组合物中一起施用或分开施用。在某些实施方式中，“组合”施用是指进行相对于第一和第二化合物或组合物的施用的以下施用：(i)在第一试剂的最近施用剂量的90％以上被代谢为无活性形式或从体内排出之前施用第二化合物剂量；或(ii)在彼此之间的48、72、96、120或168小时内施用第一剂和第二剂剂量，或(iii)在重叠的时间段内(例如连续或间歇输注)施用药物；(iv)上述各项的任何组合。在某些实施方式中，施用两个或更多个iTR因子或表达端粒酶和iTR因子的催化组分的载体。在某些实施方式中，将iTR因子与与一种或多种生长因子、生长因子受体配体(例如激动剂)、激素(例如类固醇或肽激素)或信号分子结合使用，以促进再生和极性。特别有用的是组织中心分子，其可用于组织再生感受态细胞(例如使用本发明的方法产生的感受态细胞)。在某些实施方式中，生长因子是表皮生长因子家族成员(例如EGF、神经调节蛋白)，成纤维细胞生长因子(例如FGF1-FGF23中的任何一种)，肝细胞生长因子(HGF)，神经生长因子，骨形态发生蛋白(例如BMP1-BMP7中的任何一种)，血管内皮生长因子(VEGF)，wnt配体，wnt拮抗剂，视黄酸，NOTUM，卵泡抑素，音猬因子(sonic hedgehog)或其他组织性中心因子。
iTM和iCM因子的来源
iTM和iCM因子可通过将缺乏EFT标志物的胚胎细胞(例如，作为非限制性示例，不表达COX7A1的基质细胞)暴露于多种试剂中并检测所述标志物(如COX7A1或报告基因构建体(例如用COX7A1基因启动子表达的GFP构建体))的诱导来鉴定。由于外泌体携带能够重编程细胞以赋予新的生长、迁移和分化特性的有效蛋白和RNA因子，因此我们检测了它们是否能够重编程细胞的发育状态，即iTM和iCM。因此，我们测试了成年细胞的外泌体在胚胎细胞中诱导成年基因的能力。我们通过对15种同系列的hESC衍生的克隆胚胎祖细胞系的Illumina微芯片分析评估了总RNA表达谱，并将它们与从各种解剖部位(未显示)获得的18种原代内皮细胞系(新生至成年)进行了比较。我们确定，来自已经通过EFT的细胞的外泌体能够诱导COX7A1在先前缺乏这种表达的胚胎细胞中表达，以及使用本文所述的其他标志物使细胞成熟。
仅通过常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施方式的许多等同方式。本发明的范围不旨在限于说明书或其中阐述的细节。除非有相反的指示或从上下文中可以明显看出，否则诸如“一个/种(a、an)”和“所述(the)”的冠词可以表示一个或多个。通常使用例如体外或体内细胞群来实践本发明的某些方法。因此，对“细胞”的提及应理解为包括其中细胞是细胞群的成员的实施方式，所述细胞群例如是包含遗传上基本相同的细胞的群或由其组成的群。然而，本发明包括将本发明的方法应用于单个细胞的实施方式。因此，对“细胞”的提及应理解为包括适用于细胞群内单个细胞的实施方式和适用于单个分离的细胞的实施方式。
除非另有说明或从上下文中显而易见，否则如果在给定的产品或方法中存在、使用组成员的一个、多于一个或全部，或组成员的一个、多于一个或全部与给定的产品或方法相关，则在组的一个或多个成员之间包含“或”的权利要求或说明将被认为是满足条件的。本发明包括给定产品或方法中存在、使用的组的正好一个成员或与给定产品或方法相关的组的正好一个成员的实施方式。本发明还包括组成员的一个或多个存在于、用于给定产品或方法中或组成员的一个或多个与给定产品或方法相关的实施方式。可以预期的是，本文所述的所有实施方式均适用于本发明的所有不同方面。还可以想到，任何实施方式都可以在适当的时候与一个或多个其他这样的实施方式自由地组合。此外，应理解，本发明涵盖所有的将来自一个或多个权利要求(无论是原始权利要求还是随后添加的权利要求)的一个或多个限制、要素、从句、描述性术语等引入另一个权利要求(无论是原始权利要求还是随后添加)的变化、组合和置换。例如，可以将从属于另一个权利要求的任何权利要求修改为包括在从属于同一基础权利要求的任何其他权利要求中找到的一个或多个要素或限制，并且可以将引用不同权利要求中存在的要素的任何权利要求修改为包括在与所述权利要求从属于相同基础权利要求的任何其他权利要求中发现的一个或多个要素或限制。此外，在权利要求中记载组合物的情况下，本发明提供了例如根据本文公开的方法制备该组合物的方法，以及例如出于本文公开的目的使用该组合物的方法。在权利要求书中记载方法的情况下，本发明提供了适于执行该方法的组合物以及制备该组合物的方法。同样地，除非另有说明或除非本领域的普通技术人员意识到矛盾或不一致之处的出现，否则在权利要求中记载了制备组合物的方法的情况下，本发明提供了根据本发明的方法制备的组合物和使用该组合物的方法。
在要素以列表(例如以马库什(Markush)组形式)表示的情况下，还公开了要素的每个子组，并且可以从组中删除任何要素。为了简洁起见，这里仅具体描述了这些实施方式中的某些，但是本发明包括所有这样的实施方式。还应该理解的是，通常，在将本发明或本发明的方面称为包含特定要素、特征等的情况下，本发明或本发明的方面的某些实施方式由或基本上由这样的要素、特征等组成。
在本文提到数值范围的情况下，本发明包括包括端点的实施方式，两个端点都被排除的实施方式，和其中一个端点被包括而另一端点被排除的实施方式。除非另有说明，否则应假定包括两个端点。此外，除非另有指示或从上下文和本领域普通技术人员的理解中显而易见，否则在本发明的不同实施方式中，表示为范围的值可以采用所述范围内的任何特定值或子范围，直至范围下限单位的十分之一。在使用诸如“小于X”、“大于X”或“至少X”之类的短语(其中X是数字或百分比)时，应理解可以选择任何合理的值作为范围的下限或上限。还应理解，在本文中列出数值列表的情况下(无论是否以“至少”开头)，本发明包括与列表中的任何两个值所限定的任何中间值或范围有关的实施方式，并且最小值可以取为最小值，最大值可以取为最大值。此外，在数字列表(例如百分比)以“至少”作为前缀的情况下，该术语适用于列表中的每个数字。对于本发明的其中数值以“约”或“近似”开头的任何实施方式，本发明包括其中记载了精确值的实施方式。对于其中数值不以“约”或“近似”开头的本发明的任何实施方式，本发明包括其中数值以“约”或“近似”开头的实施方式。除非另外说明或从上下文中可以明显看出(例如该数字不允许超过可能值的100％)，否则“约”或“大约”通常包括落在任一方向上的数字的1％范围内的数字，在某些实施方式中为5％，在某些实施方式中为10％(大于或小于该数字)。除非另有说明，否则本文所用的“组合物”可以包括一种或多种组分。例如，“包含激活因子或TR激活因子的组合物”可以由TR激活因子的激活因子组成或基本由其组成，或者可以包含一种或多种另外的组分。应当理解的是，除非另有说明，否则本发明的任何实施方式中的抑制因子或TR抑制因子(或本文中提及的其他化合物)可以以包含一种或多种另外的组分的组合物的形式使用或施用，所述另外的组分包括TR激活因子的激活因子。
实施例
实施例1.对成年人皮肤成纤维细胞进行关于iTR因子的低通量筛选，所述筛选使用PCR来测定作为iTR标志物的COX7A1表达的减少。
在低通量条件下筛选本文所述的候选iTR因子的约200种组合，作为第一个测定，通过qPCR测定COX7A1表达。将显示COX7A1表达明显降低的条件用于制备用于基于Illumina珠阵列或RNA测序的转录组学分析的RNA。在维持存活细胞的同时，导致COX7A1水平最大降低的最佳条件是在前17天给予0.5mM的丙戊酸、10uM的CHIR99021、10uM的RepSox、10uM的反苯环丙胺(Tranylpromine)(Parnate)、50uM的Forskolin、5uM的TTNPB，然后在另外的14天将100nM的3-Deazaneplanocin A(DZNep)添加至上述混合物中，然后在最后7天仅使用1.0uM的PD0325901和10uM的CHIR99021。所有因子均用于细胞生长培养基(含10％胎牛血清(FBS)的高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM))。
从在该iTR条件(称为AgeXl547)下的细胞制备RNA，然后进行Illumina珠阵列分析。RFU值<100被认为没有表达。如图1所示，Illumina珠阵列分析显示hES细胞或其衍生的hEP细胞系中没有COX7A1表达。然而，在早期传代的真皮皮肤成纤维细胞培养物中，COX7A1表达从最早的体内试验日期(妊娠发育8周)开始逐渐增加，甚至在PPT后至成年也逐渐增加。在iPS细胞重编程后，COX7A1的水平又恢复到基本为hES细胞水平(无表达)，并且上述iTR混合物AgeXl547导致COX7A1的水平重编程回到大约8周(胎儿前)发育的水平。如图2所示，ADIRF提供了PPT的标志物，AgeXl547再次将59岁的成年真皮成纤维细胞还原为胎儿前的ADIRF基因表达模式。如图3所示，TNFRSF11B也提供了PPT的标志物，AgeXl547再次将59岁的成年真皮成纤维细胞还原为胎儿前的TNFRSF11B基因表达模式。由于TNFRSF11B表达与阻止成骨有关，因此TNFRSF11B表达的逆转与能够形成新骨的细胞中成骨潜能的恢复是一致的。
如图4所示，胚胎标志物AMH在hEP细胞系中表达，但在胎儿或成年皮肤成纤维细胞中不表达，但是在如上所述的AgeXl547处理之后，AMH表达恢复为胚胎的表达模式。
为了确定由iTR因子AgeXl547重新编程的59岁的真皮成纤维细胞是否已回复到多能性(这是不期望的，因为iTR的目的是诱导再生的衰老细胞裂解的表型而不改变细胞分化状态)，我们检测了COL1A1的表达。如图5所示，虽然hES细胞显示出比胎儿和成人皮肤成纤维细胞低得多的COL1A1表达，而虽然59岁的皮肤成纤维细胞在重编程为其iPSC对应物时确实将COL1A1表达抑制回hES细胞水平，但使用AgeXl547处理的59岁皮肤成纤维细胞未将COL1A1抑制至hES细胞水平。相反，细胞保留了成纤维细胞形态，没有明显的毒性迹象，COL1A1水平与体外培养的正常真皮成纤维细胞相当。
如图6所示，iPS细胞重编程将OCT4表达恢复至hES细胞水平，而AgeX1547没有诱导多能性标志物OCT4或多能性细胞特有的其他标志物(未显示)。因此，我们得出的结论是，AgeXl547在治疗期间似乎受到人细胞的耐受，并且似乎能够将成年来源的细胞恢复至基因表达的出生前模式，甚至是胎儿前模式，而无需改变其分化状态(iTR)。
实施例2.筛选能够在衰老的细胞或CSC中诱导衰老细胞的裂解的iTR因子。
确定了最佳条件，以区分具有胎儿前基因表达模式的细胞所预期的细胞凋亡的增加。胚胎和成人来源的间充质(分别为4D20.8和MSC)和血管内皮细胞(分别为30MV2-6和HAEC)受到不同的细胞凋亡的刺激，包括两种浓度的喜树碱(CPT)、H2O2和毒胡萝卜素(TG)以及载剂对照。分析前将化合物施用24小时。处理后，按照制造商的说明使用原位细胞死亡检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection kit)(Roche，目录号12156792910)通过TUNEL染色监测细胞凋亡。如图7所示，毒胡萝卜素在3.7nM时在胚胎间充质和内皮细胞中均提供了与成人对应物相比统计学上显著的细胞凋亡的增加。因此，该测定可用于确定iTR因子在衰老细胞和CSC中诱导衰老细胞的裂解的有效性。
实施例3.制备用于高通量iTR筛选中的COX7A1表达的EGFP报告子的方法。
将IRES-EGFP插入TERT永生化的人包皮成纤维细胞中COX7A1基因座的下游。为实现此目的，设计并克隆了两个候选指导RNA(gRNA)来靶向COX7A1基因座。gRNA介导的CRISPR/Cas9修饰导致了靶向双链断裂(DSB)。基于具有活性的gRNA的位置构建了携带IRES-EGFP盒的供体质粒以用作DNA修复模板。将gRNA和供体质粒共转染到TERT永生化的人包皮成纤维细胞中介导同源性定向修复(HDR)，从而使IRES-EGFP敲入COX7A1的目标区域(图7)。
实施例4.
在第一组样品中，将第5-8代的人真皮成纤维细胞(MDW1)以每孔约50,000个细胞接种在6孔Corning组织培养板中的生长培养基DMEM+10％FBS中。
第二天，将细胞用以下所示的各种混合物处理各种持续时间(如图所示为27-42天)。
混合物(在媒介物中：补充有10％的KSR、10％的FBS、2mM的GlutaMAX、1％的NEAA、0.055mM的2-巯基乙醇、10,000U/ml的青霉素-链霉素的KnockOut DMEM)和以下描述。
1.MDW-1P8 D41 CHIR99021 10uM+RepSox(l0 uM)+反苯环丙胺(Parnate)10uM+Forskolin 50uM+TTNPB 5uM+DZNep 100nM+PD0325901 1uM+FGF2 50ng/ml+EPZ004777 5uM+SGC0946 5uM+RSC133 10uM+CI994 1uM
2.MDW-1P5 D39 CHIR99021 10uM+RepSox(10uM)+反苯环丙胺(Parnate)10uM+Forskolin 50uM+TTNPB 5uM+DZNep 100nM+PD0325901 1uM+FGF2 50ng/ml+OAC3 1uM+EPZ004777 5uM+SGC094 5uM+RSC133 10uM+CI994 1uM+SB216763 20uM+SAHA 1uM+OCT4250ng/ml+AM580 50nM
3.MDW-1P5 D39 CHIR99021 10uM+RepSox(10uM)+反苯环丙胺(Parnate)10uM+Forskolin 50uM+TTNPB 5uM+DZNep 100nM+PD0325901 1uM+FGF2 50ng/ml+OAC3 1uM+EPZ004777 5uM+SGC094 5uM+RSC133 10uM+CI994 1uM+SB216763 20uM+SAHA 1uM+OCT4250ng/ml+AM580 50nM+PP1 10uM
4.MDW-1P5 D42 CHIR99021 10uM+RepSox(10uM)+反苯环丙胺(Parnate)10uM+Forskolin 50uM+TTNPB 5uM+DZNep 100nM+PD0325901 1uM+FGF2 50ng/ml+EPZ004777 5uM+SGC094 5uM+RSC133 10uM+CI994 1uM+SB216763 20uM+SAHA 1uM+AM580 50nM+PP1 10uM
5.MDW-1P8 D42 MS-275 1uM+CHIR99021 10uM+RepSox(10uM)+反苯环丙胺(parnate)10uM+Forskolin 50uM+TTNPB 5uM+DZNep 100nM+PD0325901 1uM+FGF2 50ng/ml+OAC3 1uM+EPZ004 5uM+SGC094 5uM+RSC133 10uM+CI994 1uM
6.MDW-1P8 D27 MS-275 1uM+CHIR99021 10uM+RepSox(10uM)+反苯环丙胺(Parnate)10uM+Forskolin 50uM+TTNPB 5uM+DZNep 100nM+PD0325901 1uM+FGF 50ng/ml+OAC3 1uM+EPZ004777 5uM
使用“禁食培养基”(含0.5％FBS的DMEM)(无混合物)进行两个对照。使接种的细胞生长至汇合，然后向禁食培养基提供3天养料，然后再向禁食培养基提供2天养料，然后裂解获得RNA。
在第二组样品中，将第6-7代的人真皮成纤维细胞(MDW1)以每孔约50,000个细胞接种在6孔Corning组织培养板中的生长培养基DMEM+10％FBS中。
第二天，将细胞用含有BIX01294 2mM的混合物处理，然后在7天后，将Repsox10uM、Dastinib 0.5uM和Kenpaullone 5uM添加至生长培养基中，总共14天。
另外，使用“禁食培养基”(含0.5％FBS的DMEM)(无混合物)进行对照。使接种的细胞生长至汇合，然后向禁食培养基提供养料3天，然后再向禁食培养基提供养料2天，然后裂解获得RNA。
对于第一组和第二组样品两者，将细胞用RLT(Qiagen,Valencia CA目录号79216)裂解，并使用Qiagen RNeasy mini试剂盒(Qiagen，目录号74104)提取总RNA。使用SuperScript III第一链试剂盒和随机六聚体(Invitrogen,Carlsbad CA,目录号18080-051)，按照制造商的说明制备cDNA。按照制造商的说明使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Valencia CA目录号28104)进行cDNA纯化，以去除核苷酸、引物、盐和聚合酶。
在标准的光学96孔反应板(Applied Biosystems Carlsbad，CA，PN 4306737)中制备测试样品(模板)，该板由30ng RNA当量的cDNA、0.8uM每个基因特异性定制寡核苷酸引物组(Invitrogen)、超纯蒸馏水(Invitrogen目录号10977015)组成，在25ul的总反应体积中用12.5ul加入AmpliTaq Gold DNA聚合酶的Power SYBR Green PCR Master Mix(AppliedBiosystems Carlsbad，CA，目录号4367659)以1：1的比例稀释。使用采用SDSv2.3软件的Applied Biosystems 7500实时PCR系统进行实时qPCR(Real-Time qPCR)。将扩增条件设定为在50℃持续2分钟(阶段1)，在95℃下持续10分钟(阶段2)，在95℃下进行15秒的40次循环，然后在60℃下持续1分钟(阶段3)，在95℃下进行15秒的解离阶段(阶段4)，在60℃下持续1分钟，在95℃下持续15秒。将扩增子的Ct值标准化为GAPDH的平均Ct值。
第一组样品的结果显示在图9中。第二组样品的结果显示在图10中。图9和10中显示的iTR因子的所有组合均显著降低了COX7A1和其他EFT标志物。最佳组合是上面的#5。
实施例5.混合物处理后的组织再生和细胞增殖的划伤测定
将第8代的BJ-TERT成纤维细胞以50,000个细胞/孔接种在6孔板的DMEM 10％FBS。第二天，将细胞用下列各种混合物处理2周：
对照：仅生长培养基
A：LIN28A-11R(LD Biopharma HTF 0046)4ug/ml
B：丙戊酸(Cayman 13033)0.5mM
C：LIN28A-11R 4ug/ml+丙戊酸0.5mM
D：MS-275(Cayman 13284)1uM+CHIR99021(Cayman 13122)10uM+RepSox(SigmaR0158)10uM+反苯环丙胺(Parnate)(Sigma 616431)10uM+Forskolin(Cayman 11018)50uM+TTNPB(Cayman 16144N)5uM+DZNep(Cayman 13128)100nM+PD0325901(Cayman 13034)1uM+FGF2(Peprotech AF-100-18B)50ng/ml+OAC3(Cayman 14104)1uM+EPZ004777(Cayman16173)5uM+SGC0946(Cayman 13967)5uM+RSC133(Cayman 90018139)10uM
E：在hES培养基(DMEM/F12 10％KSR、10％FBS、1％谷氨酰胺、1％NEAA、0.055mM 2-巯基乙醇、bFGF 50ng/ml)中，LIN28A 4ug/ml+VPA 0.5mM、CHIR99021 10uM、RepSox 10uM、Parnate 10uM、Forskolin 50uM、TTNPB 5uM+DZNep 100nM+PD0325901 1uM
处理后，在汇合处划出800um的划痕，并在16小时后评估填充百分比。将处理过的细胞的划痕填充与对照组进行比较。数据如下所示。
Figure BDA0002820404500000771
Figure BDA0002820404500000781
这项研究表明，此处包括的重编程因子有助于细胞迁移，并且可能在愈合损伤或受损哺乳动物组织相关细胞增殖的再生和诱导中有用。特别地，条件C、D和E显示出比对照组多出50％或更多的填充。
实施例6.用重编程剂处理的成纤维细胞显示出对晚期传代细胞的衰老细胞裂解活性和减少的细胞数。
将Xgene成纤维细胞(从Xgene,Sausilito CA获得的人包皮)以20,000个细胞/孔(0.1％明胶包被的24孔板)的早期(P9)和晚期(P33)传代接种在生长培养基(DMEM+10％FBS)中。第二天，将它们重新添加含有以下所列添加剂的培养基持续1周，隔两天添加一次，然后计数。
对照无添加剂，
A.LIN28A-11R(LD Biopharma HTF 0046)4ug/ml，
B.丙戊酸(Cayman 13033)0.5mM，
C.LIN28A 4ug/ml+丙戊酸0.5mM
D.LIN28A 4ug/ml+VPA 0.5mM、CHIR99021 10uM(Cayman 13122)、Repsox 10uM(Sigma R0158)、Parnate 10uM(Sigma 616431)、Forskolin 50uM(Cayman 11018)、TTNPB5uM(Cayman 16144)、DZNep 100nM(Cayman 13128)和PD032590l 1uM(Cayman 13034)。
数据如下所示：
Figure BDA0002820404500000782
Figure BDA0002820404500000791
不出所料，仅在生长培养基中，早期传代成纤维细胞(P9)的群倍增时间比晚期传代(P33)快近四倍。与对照(仅生长培养基)相比，晚期传代细胞在暴露于条件A(LIN28A)和条件C(LIN28A+VPA)中的因子后在1周内显示出了细胞数量的减少。这种在暴露于含和不含丙戊酸的LIN28A后晚期传代细胞的减少至少部分是由于衰老的特异性细胞死亡(衰老细胞裂解)。相反，在早期传代时暴露于这些试剂导致细胞数量增加。用条件D(由更全面的药物混合物组成)处理细胞导致细胞数量的大幅减少，所述减少在晚期传代时更大，部分原因是由于衰老细胞裂解。在这里，我们显示早期传代细胞的细胞数比接种的细胞数增加了2.8倍，而晚期传代细胞的细胞数仅比接种的细胞数增加了1.1倍。
单独和组合使用的重编程添加剂丙戊酸和LIN28A-11R由于它们的衰老细胞裂解的作用而对晚期传代细胞具有不同的作用。同样地，使用包含LIN28A 4ug/ml+VPA 0.5mM、CHIR99021 10uM，Repsox 10uM、Parnate 10uM、Forskolin 50uM、TTNPB、DZNep 100nM和PD0325901 1uM的包容性(inclusive)重编程混合物的处理由于上述物质衰老细胞裂解的特性而导致了晚期传代的细胞的显著减少。
实施例7.使用1mM的丙戊酸进行iTR
将成年衍生的真皮成纤维细胞在6孔板的孔中的DMEM 10％FBS中培养，并用0.5mM和1mM的丙戊酸处理所述细胞28天。在第28天，除去培养基，将细胞用PBS洗涤，然后使用RLT与β-巯基乙醇(Qiagen目录号79216)进行裂解。按照制造商的说明使用Qiagen RNeasymini-kit(Qiagen目录号74106)提取总RNA。然后使用ThermoFisher superscript III(目录号18080044)制备cDNA。在使用SDSv2.3软件的Applied Biosystems 7500Real-Time PCRSystem上运行qPCR以评估与未处理的细胞系相比的经处理的细胞系中相对于GAPDH的COPD7A1表达(其为成年表型的明确指示)。
出乎意料的是，与对照组(未处理的)相比，0.5mM浓度的丙戊酸对COX7A1表达(标准化为GAPDH)的影响可忽略不计，但在l mM浓度的丙戊酸下观察到其表达显著降低至接近零(0.001)。

Claims (19)

1.一组适于改变出生后哺乳动物细胞的基因图谱的组合物，其包含：
a.第一组合物，其包含：0.5-5.0mM的丙戊酸、7-10uM的6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈(CHIR99021)、4.0-10uM的2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(RepSox)、2.0-10uM的反苯环丙胺(Parnate)、0.5-50uM的Forskolin和1.0-5uM的4-[(E)-2-(5,5,8,8-四甲基-6,7-二氢萘-2-基)丙-1-烯基]苯甲酸(TTNPB)；
b.第二组合物，其包含：0.5-5.0mM的丙戊酸、7-10uM的CHIR99021、4.0-10uM的RepSox、2.0-10uM的反苯环丙胺(Parnate)、0.5-50uM的Forskolin、1.0-5uM的TTNPB和50nM-240nM的3-Deazaneplanocin A(DZNep)；和
c.第三组合物，其包含：0.1-1.0uM的N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯胺)苯甲酰胺(PD0325901)和7.0-10uM的6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈(CHIR99021)，
d.第四组合物，其包含用于在哺乳动物细胞中表达TERT基因的合适的表达载体。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述第一组合物、所述第二组合物和所述第三组合物在细胞培养基中。
3.权利要求1所述的组合物，其中所述第一组合物、所述第二组合物和所述第三组合物在包含透明质酸的水凝胶中。
4.一组适于改变出生后哺乳动物细胞的基因图谱的组合物，其包含：
a.第一组合物，其包含：0.5-5.0mM的丙戊酸、7-10uM的6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈(CHIR99021)、4.0-10uM的2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(RepSox)、2.0-10uM的反苯环丙胺(Parnate)、0.5-50uM的Forskolin和1.0-5uM的4-[(E)-2-(5,5,8,8-四甲基-6,7-二氢萘-2-基)丙-1-烯基]苯甲酸(TTNPB)；
b.第二组合物，其包含：0.5-5.0mM的丙戊酸、7-10uM的CHIR99021、4.0-10uM的RepSox、2.0-10uM的反苯环丙胺(Parnate)、0.5-50uM的Forskolin、1.0-5uM的TTNPB和50nM-240nM的3-Deazaneplanocin A(DZNep)；和
c.第三组合物，其包含：0.1-1.0uM的N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯胺)苯甲酰胺(PD0325901)和7.0-10uM的6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈(CHIR99021)。
5.权利要求4所述的组合物，其中所述第一组合物、所述第二组合物和所述第三组合物在细胞培养基中。
6.权利要求5所述的组合物，其中所述第一组合物、所述第二组合物和所述第三组合物在包含透明质酸的水凝胶中。
7.一种鉴定能够诱导组织再生(iTR)的试剂的方法，所述方法包括：1)以促进出生后哺乳动物细胞对疑似诱导组织再生的一种或多种外源性试剂的暴露的形式培养所述细胞，2)使所述细胞与所述一种或多种外源性试剂接触，和3)测量胚胎-胎儿过渡(EFT)的基因标志物在所述细胞中的表达，其中所述表达的改变表明所述试剂导致iTR的能力。
8.权利要求7所述的方法，其中胚胎-胎儿过渡(EFT)的基因标志物选自COX7A1、ADIRF中的一个或多个。
9.权利要求7所述的方法，其中所述基因标志物为COX7A1。
10.权利要求7所述的方法，其中所述出生后哺乳动物细胞为携带信号传导所述EFT的报告基因的TERT永生化的成年人真皮成纤维细胞。
11.一种鉴定能够诱导组织再生(iTR)的试剂的方法，所述方法包括：1)以促进出生后哺乳动物细胞对疑似诱导组织再生的一种或多种外源性试剂的暴露的形式培养所述细胞，2)使所述细胞与所述一种或多种外源性试剂接触，和3)从所述细胞制备RNA并测量所述细胞中胚胎-胎儿过渡(EFT)转录本的水平，以确定所述一种或多种试剂是否导致iTR。
12.权利要求11所述的方法，其中胚胎-胎儿过渡(EFT)的基因标志物选自COX7A1、ADIRF中的一个或多个。
13.权利要求11所述的方法，其中所述基因标志物为COX7A1。
14.权利要求11所述的方法，其中所述出生后哺乳动物细胞为携带信号传导所述EFT的报告基因的TERT永生化的成年人真皮成纤维细胞。
15.一种改变出生后细胞的基因图谱的方法，所述方法包括：
a.使一种或多种出生后哺乳动物细胞与包含0.5-5.0mM的丙戊酸、7-10uM的CHIR99021、4.0-10uM的RepSox、2.0-10uM的反苯环丙胺(Parnate)、0.5-50uM的Forskolin和1.0-5uM的TTNPB的第一组合物接触约17天；
b.使步骤(a)的一种或多种细胞与包含0.5-5.0mM的丙戊酸、7-10uM的CHIR99021、4.0-10uM的RepSox、2.0-10uM的反苯环丙胺(Parnate)、0.5-50uM的Forskolin、1.0-5uM的TTNPB和50-240nM的3-Deazaneplanocin A(DZNep)的第二组合物接触约14天；和
c.使步骤(b)的一种或多种细胞与包含0.1-1.0uM的PD0325901和7.0-10uM的CHIR99021的第三组合物接触约7天。
16.权利要求15所述的方法，其中所述一种或多种细胞在COX7A1、ADIRF和TNFRSF11B中的一个或多个的表达被降低至与胚胎干细胞相关的表达水平时被认为具有改变的基因图谱。
17.权利要求15所述的方法，其中所述一种或多种细胞在COX7A1的表达被降低至与胚胎干细胞相关的表达水平时被认为具有改变的基因图谱。
18.权利要求15所述的方法，其中所述第一组合物、所述第二组合物和所述第三组合物在细胞培养基中。
19.权利要求15所述的方法，其中所述第一组合物、所述第二组合物和所述第三组合物在包含透明质酸的水凝胶中。
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