CN116018401A - 驱动生肌性干细胞扩增的化学物混合物 - Google Patents

Abstract

我们已经发现了从容易获得的真皮细胞和从肌肉基质细胞选择性诱导生肌性干细胞的稳健扩增的化学物混合物(cocktail)。通过差异铺板和谱系追踪，我们显示了Pax7+细胞是化学物诱导的生肌性干细胞(CiMC)的主要来源。我们进一步进行了单细胞RNA测序(scRNA‑seq)分析以表征CiMC的转录组学概况并证明了从异质性真皮细胞群体特异性扩增生肌性细胞。当移植到损伤的肌肉中后，CiMC被有效地植入并改善了成年和老年小鼠的功能性肌肉再生。此外，通过将化学物混合物加载到可注射的纳米颗粒中开发了使用这种混合物的原位治疗方法，该纳米颗粒能够实现混合物在损伤的肌肉中的持续释放以及在成年和老年小鼠中用于肌肉再生的常驻卫星细胞的局部扩增。

Description

驱动生肌性干细胞扩增的化学物混合物

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C.Section 119(e)要求提交日为2020年7月29日，标题为“驱动生肌性干细胞扩增的化学物混合物”的共同未决的和共同转让的美国临时专利申请系列号63/058,254的权益，该申请通过引用并入本文。

技术领域

本发明的领域涉及驱动干细胞扩增的组合物和方法。

发明背景

骨骼肌是人体中最丰富的组织并具有许多生理学功能，这些功能超出了运动的范围，扩展到包括信号转导在内的其他不同的生命机能¹。在受伤后，骨骼肌具有依赖于常驻生肌性干细胞如卫星细胞进行再生的能力，这些细胞位于肌纤维的基底层下方并表达成对盒转录因子Pax7²。当肌肉受伤后，静止的卫星细胞被激活以进行分裂、分化并修复受损的组织³。然而，这种再生能力会因交通事故、爆炸损伤、战斗损伤和手术切除后严重的急性肌肉损失或因老化萎缩和遗传性遗传疾病如杜氏肌肉营养不良症(Duchenne musculardystrophy，DMD)^4-8导致的进行性肌肉损失而受到损害，导致残疾和生活质量低下。

基于肌肉干细胞的疗法为改善骨骼肌再生提供了有前景的策略^9-11。然而，肌肉再生的潜力受限于自体肌肉干细胞的缺乏以及对同种异体细胞的伴随的免疫抑制的需要。此外，已在体外扩增的肌肉干细胞群体是昂贵的、耗时的并且显示出显著减弱的植入功效¹⁰。因此，细胞来源的稀缺和扩增生肌性干细胞的有效方法的缺乏是使用这种方法进行骨骼肌再生的主要挑战。作为可选的方法，皮肤真皮细胞可以提供方便的细胞来源以经由直接的细胞重编程生成骨骼肌细胞，该细胞重编程通过用转录因子MyoD转染¹²或通过真皮干细胞分化^13,14进行。然而，真皮细胞的生肌性效率相对低下。小分子可以调节细胞信号传导，从而通过重编程和干细胞分化来操纵细胞命运¹⁵。虽然已经探索了几种小分子以维持肌肉干细胞的身份¹⁶、增强生肌性分化¹⁷和促进肌肉再生^18,19，但尚未发现能够从真皮细胞或肌肉基质细胞(MuSC)群体选择性诱导并扩增生肌性干细胞(例如，在肌肉再生中有用的生肌性干细胞)的小分子或小分子混合物。

发明概述

如下文详细讨论的，已经发现了能够从真皮成纤维细胞样细胞和骨骼MuSC选择性并有效地扩增生肌性细胞的特定的化学物混合物。可以通过额外的步骤(如通过预铺板进行原代细胞的选择)进一步提高这种扩增的生肌性效率。重要的是，可以将这些选择性扩增的生肌性细胞在体内成功地植入以在成年、老年小鼠以及杜氏肌肉营养不良症的mdx小鼠模型中修复预先受伤的胫骨前肌(TA)肌肉。此外，可以将这种化学物混合物加载到可注射的纳米颗粒中，然后这些颗粒能够实现在受伤的肌肉中混合物的持续释放以及在成年、老年小鼠以及mdx小鼠中用于肌肉再生的常驻卫星细胞的局部扩增。已显示此类化学物混合物的体内纳米颗粒递送能够诱导用于成年和老年的肌肉再生的卫星细胞的稳健的原位激活和扩增。

能够在体外有效地从真皮细胞和骨骼肌干细胞诱导并扩增生肌性细胞的化学物混合物(称为“FR混合物”)包含佛司可林(F，一种环腺苷一磷酸(cAMP)激活剂)和RepSox(R，一种转化生长因子-β(TGF-β)抑制剂)。如下文所述，使用这种组合物的方法证明了这种分子组合在体外从真皮细胞和骨骼肌干细胞扩增生肌性干细胞的协同能力。这种FR混合物展现出在体外从真皮细胞和骨骼肌干细胞扩增生肌性干细胞的剂量效应，对于F和R二者的最佳浓度均为20μM，其提供了最高的生肌性干细胞产量(63％)。在此背景下，FR混合物能够从新生儿(neonatal)和成年真皮细胞以及从成年和老年MuSC扩增生肌性干细胞。此外，在移植到受伤的肌肉中后，在许多体内系统中扩增的CiMC显示出被有效地植入并且显示改善的功能性肌肉再生。

本文公开的发明具有多个实施方案。本发明的实施方案包括物质的组合物，该组合物包含一定量的佛司可林和一定量的RepSox，该量足以在体外或体内从生长的真皮细胞和骨骼肌干细胞诱导并扩增生肌性干细胞。本发明的某些组合物经修改用于体外使用，例如在细胞培养系统中。本发明的其他组合物经设计用于体内使用，例如在治疗方法中。示例性的体外组合物包括培养基组合物，其包含一定量的佛司可林和一定量的RepSox，该量足以诱导真皮细胞和/或骨骼肌干细胞在体外培养中变成生肌性干细胞。示例性的体内组合物包括加载有一定量的佛司可林和一定量的RepSox的纳米颗粒，当被放置在包含真皮细胞和/或骨骼肌干细胞的体内环境中时，该量足以诱导真皮细胞和/或骨骼肌干细胞变成生肌性干细胞。

本发明的实施方案还包括制备和/或使用本文公开的组合物的方法。此类方法包括通过将真皮细胞和/或骨骼肌干细胞与一定量的佛司可林和一定量的RepSox组合而在体外从真皮细胞和/或骨骼肌干细胞诱导和/或扩增生肌性干细胞的方法，该量足以从真皮细胞和/或骨骼肌干细胞诱导和扩增生肌性干细胞。其他方法包括通过将佛司可林和RepSox组合物(例如，放置在纳米颗粒中)放置在体内部位(例如，外伤性肌肉损伤的部位)，引入一定量的佛司可林和一定量的RepSox，该量足以诱导真皮细胞和/或骨骼肌干细胞在体内变成生肌性干细胞。

根据下面的详细描述，本发明的其他目的、特征和优点对本领域技术人员将是显而易见的。然而，应当理解，详细的描述和具体的示例虽然指示了本发明的一些实施方案，但其是以说明而非限制的方式给出的。在不脱离本发明的精神的情况下，可以在本发明的范围内进行许多改变和修饰，并且本发明包括所有此类修饰。

附图简述

图1.小分子混合物从真皮细胞诱导生肌性细胞。(A)用VCRTF混合物处理6天的从真皮细胞形成的肌管的代表性明场图像。(B)用VCRTF混合物处理6天的真皮细胞的肌钙蛋白T(TnT)染色。(C-D)用各种混合物的组合处理后第10天诱导的TnT⁺细胞的量化分析。(E)FR混合物的剂量效应。(F)含有20μM F和R以及添加所列的候选物的基础培养基。(G)用最佳的FR培养基(含有20μM F和R、50μg/mL AA和50ng/mL bFGF的基础培养基)诱导10天的真皮细胞的TnT染色图像。*p<0.05，#p<0.0001(n＝3)，针对虚线水平的条件进行比较。

图2.化学物诱导的生肌性干细胞(CiMC)的表征。(A)用FR培养基处理的细胞的明场图像。DMSO用作阴性对照。(B)在第4天(D4)和第8天(D8)时CiMC中骨骼肌细胞标志物Pax7、MyoD、MyoG和Myh3的免疫荧光分析。(C)B中阳性细胞的百分比。(D)第8天时CiMC的指示的骨骼肌基因的qRT-PCR分析。*p<0.05，**p<0.01(对于C，n＝5，对于F，n＝3)。

图3.CiMC中生肌性基因表达的特异性上调。(A)CiMC中骨骼肌基因的qRT-PCR分析。(B)CiMC中多能性基因的qRT-PCR分析。(C)CiMC中SSEA1⁺细胞的流式细胞术。(D)CiMC中其他中胚层细胞类型的标志物的qRT-PCR分析。将成肌细胞包括在内用于比较。*p<0.05，#p<0.0001(n＝3)。

图4.富集的真皮生肌性细胞有助于化学物扩增的CiMC。(A)用FR培养基处理8天的RAC、SAC和HFC中Myh3的免疫荧光染色。(B)A中Myh3⁺细胞的百分比。(C)用FR培养基处理8天的SAC中Sox10和Myh3的免疫荧光染色。(D)用FR培养基处理8天的HFC中Sox10、Myh3和FSP1的免疫荧光染色。(E)在D8时从SAC诱导的CiMC中Pax7-FSP1、Pax7-Ki67、MyoD-Ki67和Myh3的免疫荧光染色。(F)在第4天(D4)和第8天(D8)时从SAC诱导的CiMC中Pax7⁺细胞的百分比(左)以及基于Ki67表达的增殖性Pax7⁺细胞的百分比(右)。(G)在第4天和第8天时从SAC诱导的CiMC中MyoD⁺细胞的百分比(左)以及基于Ki67表达的增殖性MyoD⁺细胞的百分比(右)。(H)自发收缩的长肌管。在Fb培养基中培养1周的CiMC的TnT染色，揭示了多核肌管中有条纹的样式。数值为平均值±SD，**p<0.01(n＝5)。

图5.真皮Pax7+亚群主要有助于扩增的CiMC。(A)谱系追踪Pax7-creER:Rosa26-EYFP小鼠的繁殖示意图。(B)用或不用FR培养基和4-OHT处理12天的Pax7谱系追踪SAC的代表性图像。BF代表明场图像。(C)来自用FR培养基处理的转基因小鼠的SAC的选择性扩增。(D)来自用FR培养基处理12天的SAC的CiMC中Pax7和Myh3的免疫荧光图像。在细胞接种期间和在用FR培养基替换培养基之前24小时将4-OHT添加到Fb培养基中。(E)来自用FR培养基处理另外4天的转基因CiMC的FACS分选的第4天的EYFP^-和EYFP⁺细胞并对Pax7和Ki67染色。(F)E中Pax7⁺细胞的百分比。(G)第0天(D0，铺板后6小时)和第4天(D4)时Pax7⁺/EYFP⁺CiMC中增殖性Ki67⁺细胞的百分比。**p<0.01(n＝5)。

图6.化学物介导的从成年真皮细胞(DC)和MuSC的生肌性扩增。(A)用FR培养基处理8天的成年DC以及成年和老年MuSC中Pax7和FSP1的免疫染色图像。(B)A中Pax7⁺细胞的百分比。(C)用FR培养基处理8天的成年真皮细胞以及成年和老年MuSC中Myh3的免疫染色图像。(D)C中Myh3⁺细胞的百分比。**p<0.01(n＝3)。

图7.化学物处理的真皮细胞和内源性MuSC的scRNA-seq分析。(A)显示neo DC和neo DC/FR的整合的UMAP绘图。数字指示在总细胞中的细胞百分比。(B)来自neo DC、neoDC/FR、成年DC/FR和成年MuSC的生肌性细胞的拟时序分析。颜色梯度指示相应的基因沿拟时序轨迹的表达水平。(C)显示在分化、静止和增殖的生肌性细胞中上调的基因的热图。(D)拟时序轨迹分解为相应的样品。鉴定了来自早期拟时序的细胞，并测试了它们未归一化的基因表达数据以进行差异表达测试。(E)从Neo DC/FR和内源性成年MuSC中鉴定出的前20个上调和下调的基因。

图8.CiMC的体内植入促进肌肉再生。(A)真皮细胞(阴性对照)或CiMC移植4周后成年、老年和mdx小鼠中CTX损伤的TA肌肉的最大等长强直力(maximum isometric tetanicforce)。(B)第4周时对照和CiMC处理的老年TA肌肉的代表性等长强直力曲线。(C)第4周时对照和CiMC处理的成年、老年和mdx TA肌肉的肌肉湿重。(D)将DsRed标记的CiMC和对照细胞移植到CTX损伤的成年、老年和mdx TA肌肉中4周。(E)来自D的肌肉组织中DsRed肌纤维的数量。(F)用对照细胞或CiMC移植4周的成年、老年和mdx TA肌肉中中央成核肌纤维的平均横截面积(CSA)。(G)用对照细胞或CiMC移植4周的成年、老年和mdx TA肌肉的代表性肌纤维(I、IIA和IIB型)染色。(H)G中不同肌纤维类型的百分比。*p<0.05，**p<0.01(n＝5)。

图9.载药纳米颗粒促进肌肉再生。(A)显示用于原位生肌性细胞扩增和再生的载药颗粒的制备和注射的示意图。(B)FR-np的SEM图像和大小分布，如通过动态光散射所确定的。(C)通过HPLC质谱分析获得的F和R从FR-np的累积释放曲线。(D)用不同剂量的FR-np处理的SAC中Myh3⁺细胞的百分比。(E)CTX损伤、纳米颗粒(np)注射的实验方案，以及收获时间点样品用于分析。(F)载体处理的和FR-np处理的肌肉在第14天(D14)和第28天(D28)时的代表性CMAP曲线。载体是指不含药物的np并充当对照。(G)单独用FR-np或载体处理的损伤的TA肌肉的CMAP振幅。(H)对照处理的和FR-np处理的成年和老年TA肌肉在第4周时的最大等长强直力。(I)对照处理的和FR-np处理的成年TA肌肉在第4周时的代表性等长强直力曲线。(J)对照处理的和FR-np处理的成年和老年TA肌肉在第4周时的肌肉湿重。(K)TA肌肉切片中中央成核肌纤维的平均横截面积(CSA)。(L)对照处理的和FR-np处理的成年和老年TA肌肉在第4周时的代表性肌纤维染色。(M)L中不同肌纤维类型的百分比。*p<0.05，**p<0.01(n＝5)。

图10.载药颗粒经由促进原位卫星细胞扩增来增强肌肉修复。(A)用FR-np处理的或载体(不含药物的np作为对照)处理的CTX损伤肌肉中在第3天(D3)和第14天(D14)时的Pax7⁺细胞的免疫荧光分析。(B)在处理后不同时间点的Pax7⁺细胞量化。(C)用FR-np处理的或载体处理的CTX损伤肌肉中在第3天时的Pax7(绿色)和Ki67(红色)的免疫染色。(D)Pax7-creER:Rosa26-EYFP小鼠的CTX损伤肌肉中Pax7⁺细胞的谱系追踪。图像显示在第3天时FR-np处理的肌肉中肌纤维周围有大量的EYFP⁺细胞。*p<0.05，**p<0.001，n＝6。

发明详述

在对实施方案的说明中，可以参考构成其一部分的附图，并且在附图中以图解的方式示出了可以实践本发明的特定实施方案。应当理解，可以利用其他实施方案，并且可以在不脱离本发明的范围的情况下进行结构改变。除非另有定义，本文使用的所有技术术语、符号和其他科学术语或专有名词旨在具有本领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或便于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域的通常理解存在实质性差异。本文描述或引用的技术和步骤的许多方面为本领域技术人员所熟知和普遍采用。下文讨论了本发明的各种实施方案。

如下文详细讨论的，本文公开的发明具有许多实施方案。本发明的实施方案包括物质的组合物(例如，培养基组合物、培养基补充物组合物、微粒组合物等)，其包含一定量的佛司可林和一定量的RepSox或基本上由其组成，该量足以从体外或体内生长的真皮细胞和骨骼肌干细胞形成、诱导和/或扩增生肌性干细胞。此类实施方案包括物质的组合物，其包含一定量的佛司可林和一定量的RepSox，该量足以从体外生长的真皮细胞和骨骼肌干细胞诱导和扩增生肌性干细胞。通常，组合物是细胞培养基的形式；或添加到细胞培养基中的补充物的形式。例如，本发明的实施方案包括包含哺乳动物细胞培养基的物质的组合物，其中细胞培养基包含置于其中的补充物，该补充物基本上由佛司可林和RepSox组成。在本发明的某些实施方案中，佛司可林的量和RepSox的量足以在培养基中创建1μM至100μM(例如，从10μM到30μM)的佛司可林浓度和1μM至100μM(例如，从10μM到30μM)的RepSox浓度。在本发明的一些实施方案中，组合物包含一种或多种另外的试剂，如抗坏血酸、碱性成纤维细胞生长因子和/或药学上可接受的载体。在本发明的一些实施方案中，组合物还包含胎盘细胞、真皮细胞和骨骼肌干细胞；和/或生肌性干细胞。

本发明的实施方案还包括使用本文公开的组合物的方法。此类方法包括从胎盘细胞、真皮细胞和/或骨骼肌干细胞和/或其他细胞来源生长、诱导和/或扩增生肌性干细胞的方法，包括将胎盘细胞、真皮细胞和/或骨骼肌干细胞与一定量的佛司可林和一定量的RepSox组合，该量足以从胎盘细胞、真皮细胞和/或骨骼肌干细胞和其他细胞来源诱导和扩增生肌性干细胞群体。在这些方法的某些实施方案中，与对照(例如，缺乏佛司可林和RepSox的真皮细胞和/或骨骼肌干细胞的至少4天体外培养物)相比，佛司可林的量和RepSox的量足以生成生长于体外培养物至少4天的至少多10％的Pax7⁺生肌性干细胞和/或至少多10％的MyoD⁺生肌性干细胞(即，至少多10％的生长于细胞培养物内的所述细胞的分数)。任选地，在这些方法中，真皮细胞和/或骨骼肌干细胞进一步与足以增强生肌性干细胞的诱导和扩增的量的抗坏血酸和/或碱性成纤维细胞生长因子组合。在本发明的一些实施方案中，方法进一步包括将扩增的生肌性干细胞置于体内损伤的部位(例如，骨骼肌组织损伤的部位)。

本发明的另一个实施方案是制备哺乳动物细胞培养基的方法，该方法包括将用于培养哺乳动物细胞的典型组分(如水、胎牛血清、缓冲剂、抗生素剂)与另外的基本上由佛司可林和RepSox组成的补充物组合在一起；从而制备本文公开的细胞可以在其中生长的哺乳动物细胞培养基。在典型的方法中，细胞培养基补充物包含一定量的佛司可林和一定量的RepSox，该量足以诱导生长于细胞培养基的胎盘细胞、真皮细胞或骨骼肌干细胞形成生肌性干细胞。例如，在本发明的某些实施方案中，佛司可林的量和RepSox的量足以在放置佛司可林和RepSox组合物的环境中(例如，细胞培养基、接近释放佛司可林和RepSox的纳米颗粒的体内组织的1cm³区域等)创建1μM至100μM(例如，从10μM到30μM)的佛司可林浓度和1μM至100μM(例如，从10μM到30μM)的RepSox浓度。任选地，该方法包括向哺乳动物细胞培养基中添加额外的组分，如：抗坏血酸；碱性成纤维细胞生长因子；和/或药学上可接受的载体。

可以使用多种不同的可生物降解的合成的和/或天然的聚合物来制备本发明的纳米颗粒实施方案。天然的聚合物包括多糖(壳聚糖、透明质酸、葡聚糖)和蛋白质(胶原蛋白、明胶、弹性蛋白)。可生物降解的合成的聚合物包括聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚己内酯(PCL)、聚羟基烷酸酯(PHA)及它们的共聚物、含有聚(乙二醇)(PEG)的聚酯(PLGA-mPEG、PLA-PEG-PLA)、聚氨酯(PU)、聚酰胺(聚赖氨酸、聚谷氨酸)、聚酐类等。微粒或支架也可以由可生物降解的聚合物制备，以用于携带治疗剂。本发明的实施方案还包括包含纳米颗粒的物质的组合物(例如基于可生物降解的聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)的混合纳米颗粒)，该纳米颗粒加载有一定量的佛司可林和一定量的RepSox，当其置于包含真皮细胞和/或骨骼肌干细胞的局部体内环境中(例如，1cm³的组织)时，该量足以诱导真皮细胞和/或骨骼肌干细胞变成生肌性干细胞。在本发明的某些实施方案中，这些纳米颗粒还包含额外的试剂，如药学上可接受的载体和/或足以增强生肌性干细胞的诱导和扩增的量的抗坏血酸和/或碱性成纤维细胞生长因子。

本发明的实施方案还包括引入一定量的佛司可林和一定量的RepSox的方法，该量足以在体内诱导真皮细胞和/或骨骼肌干细胞变成生肌性干细胞，该方法包括将包含佛司可林和RepSox的纳米颗粒组合物置于体内部位中(例如包含骨骼肌组织的部位)；从而在体内诱导真皮细胞和/或骨骼肌干细胞变成生肌性干细胞。

本发明进一步的方面和实施方案

通过小分子从真皮细胞体外诱导和扩增生肌性细胞

当我们使用各种化学物的组合²⁰对培养物中的小鼠新生儿真皮成纤维细胞进行重编程时，在丙戊酸、CHIR99021、RepSox、反苯环丙胺和佛司可林的混合物(VCRTF)处理后，我们意外地发现了一些肌管样细胞和收缩细胞簇(图1A)。免疫染色显示，这些肌管样细胞对骨骼肌肌钙蛋白T(TnT)呈阳性，但对心肌肌球蛋白重链呈阴性，证实了化学物处理后从真皮细胞生成了生肌性细胞(图1B)。在化学物处理之前，真皮细胞表达成纤维细胞标志物FSP1、CD90、PDGFR-α和神经嵴干细胞(NCSC)标志物P75。流式细胞术显示97.5％的成纤维细胞样细胞是PDGFR-α⁺细胞(Fang et al.,Nat Biomed Eng.2021Mar 18.doi:10.1038/s41551-021-00696-y)。

为了鉴定混合物中不可或缺的因子，分别省略了每种化合物，以生成其他四种化合物的不同组合，然后将这些组合用于处理真皮细胞。结果表明，当省略了F或R时，TnT⁺细胞的数量显著减少(图1C)。我们接下来筛选了包括F和R在内的不同组合。仅F和R的组合(称为“FR混合物”)使TnT⁺细胞的产量最大化，而添加原始混合物中的其他组分减少了TnT⁺细胞的数量或者没有提高效率(图1D)。

为了进行比较，我们测试了先前显示出诱导某些小鼠细胞系转分化为骨骼肌细胞的去甲基化剂5-aza-2甲基化条件²¹。然而，在这项研究中，用5-Aza处理未显示任何显著的TnT⁺细胞诱导(图1D)。FR的剂量优化研究确定了20μM的F和R二者的组合产生最高产量(～16％)的TnT⁺细胞(图1E)。

然后，我们尝试通过添加先前已经用于培养肌肉干细胞、促进骨骼肌细胞重编程和/或增强从多能性干细胞的生肌性分化的其他因子包括抗坏血酸(AA)、bFGF、BMP4、IGF1、胰岛素和PDGF^3,22,23来进一步提高诱导效率。单独地，bFGF(50ng/mL)以及AA(50μg/mL)显著增强了生肌性细胞的诱导(图1F)。当一起添加到FR时，bFGF和AA协同增强TnT⁺细胞的诱导至总细胞群体的约37％(图1F-G)。结果，用于在体外从真皮细胞诱导肌生成的最佳的培养基含有20μMF、20μM R、50μg/mL AA和50ng/mL bFGF，此后称为“FR培养基”。

化学物诱导的生肌性细胞(CiMC)的表征

化学物处理后细胞形态逐渐改变(图2A)。值得注意的是，用FR培养基处理的真皮成纤维细胞样细胞在第2天展现出细长的形态，并且早在第4天就开始出现具有短肌管的稀疏的自发收缩细胞。此后肌管的数量迅速增加并逐渐组织成跳动(beating)的三维集落或簇。显示了不同天数的收缩细胞簇。在未经化学物处理的对照培养物中未检测到收缩细胞或肌管。

为了进一步表征CiMC，通过免疫荧光和定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检查已知与不同阶段的肌生成相关的标志物的表达。卫星细胞标志物Pax7、肌肉祖细胞标志物MyoD以及分化标志物MyoG和Myh3在CiMC中高表达(图2B)。Pax7⁺、MyoD⁺、MyoG⁺和Myh3⁺细胞或肌管的数量从第4天到第8天都急剧增加(图2C)。这一观察结果提供证据表明化学物从真皮细胞中诱导并扩增了Pax7⁺卫星细胞和/或MyoD⁺祖细胞。继而，这些细胞有可能进一步分化为融合到成多核肌管中的成熟肌细胞。qRT-PCR分析证实了与单独用F或R处理的细胞相比，用FR处理的诱导的细胞显示出最高的骨骼肌基因的表达(图2D)。

通过qRT-PCR进一步研究了CiMC在不同时间点的骨骼肌基因的表达。数据揭示了生肌性基因(包括Pax7、Mrf5、MyoD、Mymk、MyoG和Myh3)在第2天均显著上调(图3A)。另一方面，在整个12天的实验中，CiMC的多能性基因Nanog和Oct4的表达仍然无法检测到(图3B)，这提供证据表明细胞没有经过多能性状态。通过流式细胞术在第3天和第6天分析细胞群体没有鉴定到任何SSEA1⁺细胞(图3C)。还研究了中胚层细胞类型的其他关键标志物，并且心肌细胞(Hand2)、软骨细胞(Aggrecan)和成骨细胞(Runx2)的标志物未显著上调(图3D)，表明只有骨骼生肌性细胞在FR培养基中被特异性诱导和扩增。

为了进一步研究化学物混合物对生肌性诱导的特异性，通过DNA微阵列分析了在基础培养基相对于FR培养基中培养2天的真皮成纤维细胞的全局基因表达。数据显示，与在基础培养基中培养的真皮细胞相比，在FR培养基中培养的真皮细胞存在385个上调的基因和378个下调的基因(>两倍，调整错误发现率[FDR]p<0.05)(Fang et al.,Nat BiomedEng.2021Mar 18.doi:10.1038/s41551-021-00696-y)。被FR培养基上调的那些基因显著富集在与发育相关的生物学过程，而那些下调的基因则富集在与细胞骨架组织和细胞粘附相关的过程(Fang et al.,Nat Biomed Eng.2021Mar 18.doi:10.1038/s41551-021-00696-y)。

从稀疏的真皮生肌性细胞中选择性扩增CiMC

当用FR培养基处理各代真皮细胞时，第1代和第2代的细胞明显生成肌管，而第3代或更高代的细胞几乎没有形成肌管(Fang et al.,Nat Biomed Eng.2021Mar 18.doi:10.1038/s41551-021-00696-y)。因此，我们假设微量的干细胞或前体细胞可能存在于异质的真皮细胞群体中，并有助于化学物诱导的肌生成。

接下来我们试图通过使用预铺板技术将真皮细胞分为快速粘附细胞群体(RAC)和缓慢粘附细胞群体(SAC)，来确定哪个原代(primary)细胞亚群可能有助于化学物诱导的肌生成。预铺板技术通过细胞与培养皿表面的差异粘附来选择细胞。干细胞微弱且缓慢地附着在培养皿表面，而成纤维细胞更牢固且迅速地附着。同时，在真皮细胞分离过程中，大毛囊细胞(HFC)簇很容易通过低速离心分离。过夜接种后，通过对骨骼肌标志物(Pax7、MyoD、Myh3)和皮肤NCSC或皮肤衍生的干细胞标志物Sox10染色来检查RAC、SAC和HFC三个细胞群体(Fang et al.,Nat Biomed Eng.2021Mar 18.doi:10.1038/s41551-021-00696-y)。在RAC或HFC培养物中没有或很少观察到Pax7⁺和MyoD⁺细胞。比较而言，在SAC中检测到Pax7⁺、MyoD⁺和Myh3⁺细胞，表明真皮生肌性细胞在SAC中富集。另一方面，HFC显示出比RAC和SAC更多的Sox10⁺细胞。

此后，用FR培养基处理三个分离的细胞群体并表征以确定它们的生肌性性能。引人注目的是，约43％的诱导的SAC是Myh3⁺，显著高于诱导的RAC(4％)和HFC(0.9％)中的Myh3⁺(图4A-B)，这提供证据表明SAC中富集的生肌性细胞可能增强化学物诱导的肌管形成。为了确定稀疏的NCSC和HFC是否是化学物诱导的肌生成的额外的细胞来源，我们对化学物处理的SAC和HFC中的Sox10进行了染色(图4C-D)。结果显示，SAC衍生的细胞中的Sox10⁺细胞略有增加，但很少与Myh3⁺细胞共定位。此外，虽然HFC衍生的细胞群体中存在更多的Sox10⁺细胞，但Myh3⁺细胞稀疏。因此，这些结果提供证据表明CiMC与富集的生肌性细胞高度相关，但不是从成纤维细胞、真皮NCSC或HFC选择性扩增的。

进一步染色显示，经过FR处理的SAC显示出显著更多的Pax7⁺(第4天为24.3％，第8天为62.5％)和MyoD⁺细胞(第4天为16.2％，第8天为57.8％)。比较而言，在第8天时在对照中几乎没有检测到生肌性干细胞(图4E-G)。在第4天，大约40％的Pax7⁺细胞和25％的MyoD⁺细胞是Ki67⁺增殖性细胞。比较而言，对照制备物仅含有增殖性成纤维细胞。这证实了化学物在诱导生肌性干细胞增殖中的作用。随后，生肌性干细胞可以进一步分化并融合到具有横纹样式的多核肌管中(图4H)。此外，化学物诱导的肌管表达不同类型的肌球蛋白重链(MHC)，包括Myh1E(成年)、Myh2(成年，MHC-IIA)、Myh3(胚胎)、Myh4(成年，MHC-IIB)、Myh7(成年，MHC-I)、Myh8(新生儿)(Fang etal.,Nat Biomed Eng.2021Mar 18.doi:10.1038/s41551-021-00696-y)。此外，对CiMC每三天传代一次以确定是否可以在FR培养基中维持生肌性潜能。结果表明，生肌性潜能在培养物中持续存在至高达第5代，之后显著下降，这提供证据证明细胞可以扩增5代并可能用于基于细胞的疗法(Fang et al.,Nat BiomedEng.2021Mar 18.doi:10.1038/s41551-021-00696-y)。

从真皮Pax7⁺细胞扩增的CiMC

从他莫昔芬诱导的Pax7-CreER:Rosa26-EYFP转基因小鼠中分离真皮成纤维细胞样细胞，以确定Pax7⁺细胞响应化学物混合物的贡献和命运(图5A)。当用4-羟基他莫昔芬(4-OHT)和FR混合物处理真皮SAC细胞时，在CiMC中广泛检测到EYFP信号，但单独用4-OHT或FR处理时未检测到EYFP表达(图5B)。结果证实了EYFP报道分子的诱导能力和化学物扩增生肌性细胞的可靠性。特别地，EYFP信号在第4天首先在单个细胞中表达，此后逐渐出现在肌管/簇中，证实了化学物可以扩增Pax7⁺细胞，Pax7⁺细胞进一步分化并融合到肌管中(图5C)。

为了确定扩增的Pax7⁺细胞是否衍生自现存的Pax7⁺细胞或其他生肌性前体，将从Pax7转基因小鼠分离的真皮细胞接种在含有4-OHT的Fb培养基中1天，以用EYFP标记任何存在的表达Pax7的细胞，然后在Fb培养基中再培养2天，以去除任何残留的4-OHT并防止进一步标记。然后用FR培养基对细胞处理另外8天。结果显示，肌管为EYFP⁺(Fang et al.,NatBiomed Eng.2021Mar 18.doi:10.1038/s41551-021-00696-y)，表明化学物诱导的肌管主要衍生自原本存在的Pax7⁺细胞。一致地，从诱导的SAC形成的表达EYFP的肌管多于从RAC形成的(Fang et al.,Nat Biomed Eng.2021Mar 18.doi:10.1038/s41551-021-00696-y)。进一步染色证明，几乎所有扩增的生肌性细胞和分化的肌细胞/肌管都是EYFP⁺(图5D)。此外，通过FACS从转基因CiMC中分选EYFP⁺和EYFP^-细胞并用FR培养基进一步处理4天。免疫荧光分析显示，大约80％的EYFP⁺细胞是保留增殖能力的表达Pax7的细胞，如第0天和第4天的Ki67表达所示，而在化学物处理的EGFP^-细胞中未发现表达Pax7的细胞(图5E-G)。总之，这些结果提供证据证明可以经由化学物诱导而选择性并快速地扩增真皮组织衍生的Pax7⁺细胞。

从成年/老年真皮细胞和MuSC扩增的CiMC

由于在确定年龄对临床应用的自体干细胞的有效扩增的影响方面的兴趣和重要性。我们研究了FR培养基对成年真皮细胞以及对成年和老年MuSC的影响(图6)。与我们对新生儿真皮细胞的发现类似，用FR培养基处理成年真皮细胞也产生了一些生肌性细胞和肌管。与新生儿真皮细胞相比，成年真皮细胞具有较少的Pax7⁺细胞和较少数量的化学物诱导的生肌性细胞。然而，从成年和老年MuSC产生显著较高的数量的生肌性细胞(图6)。化学物处理诱导从成年MuSC的Pax7细胞的增殖(第4天为31.6％，并且第8天为15.7％)，在第8天产生了大约65％的Pax7⁺细胞(图6)。值得注意的是，衰老在一定程度上减少了化学物诱导的生肌性干细胞扩增，在第8天约有36％的Pax7⁺细胞。此外，与未处理的MuSC和化学物处理的真皮细胞相比，细胞簇的形成似乎在化学物处理的MuSC中发生得更快。

scRNA-seq分析

为了进一步表征CiMC和真皮细胞的异质性，我们对四个样品进行了scRNA-seq，包括新生儿真皮细胞(Neo DC)、用FR培养基处理3天的新生儿真皮细胞(Neo DC/FR)、用FR培养基处理3天的成年真皮细胞(成年DC/FR)和内源性成年MuSC(成年MuSC)。使用Seurat²⁴的无监督聚类揭示了在新生儿真皮细胞中用或不用化学物处理的八个亚群(图7A)。经过三天的化学物处理，骨骼肌细胞的百分比增加了十八倍，证实了化学物可以从异质性真皮细胞中选择性地扩增生肌性细胞。此外，化学物处理的成年真皮细胞和内源性MuSC均是异质性的，具有多个亚群，而两个样品中骨骼肌细胞的比例远低于Neo DC/FR(Fang et al.,NatBiomed Eng.2021Mar 18.doi:10.1038/s41551-021-00696-y)。通过差异标志物基因鉴定了所有样品中的不同细胞簇，并且表明成年真皮细胞与新生儿真皮细胞具有相似的基因表达概况(Fang et al.,Nat Biomed Eng.2021Mar 18.doi:10.1038/s41551-021-00696-y)。

为了鉴定新生儿真皮细胞中Pax7⁺增殖性细胞的其他标志物，以较高分辨率对细胞进行聚类以获得更多亚群，并且在Pax7⁺群体和所有其他群体之间进行了差异表达测试。尽管另外三个基因在Pax7⁺群体中显著上调(Spc24、Gnai1和G0s2)，但基因表达分布图表明Pax7是增殖性生肌性细胞的最具特异性标志物(Fang et al.,Nat Biomed Eng.2021Mar18.doi:10.1038/s41551-021-00696-y)。

然后我们使用了来自所有四个样品的骨骼肌细胞簇数据，并从计算上将它们整合并进行了拟时序分析²⁵。新生儿DC、成年DC和MuSC中的生肌性细胞具有相似的转录组学概况，并且共定位于拟时序图的各种位置，代表了处于不同分化阶段和细胞周期的生肌性细胞。有趣的是，我们鉴定了细胞的三个分支，并基于标记物表达将它们分类为静止(Pax7⁺/Cdkn1a^-)、增殖(Pax7⁺/Ki67⁺)和分化(Pax7^-/MyoG⁺)的生肌性细胞(图7B-C)。此外，通过分解原始样品的拟时序轨迹，我们观察到所有四个样品(Neo DC、Neo DC/FR、成年DC/FR和成年MuSC)在不同阶段都具有增殖和分化的生肌性细胞，而静止细胞仅存在于成年MuSC中(图7D)。此外，我们比较了来自Neo DC/FR和成年MuSC的增殖性骨骼肌细胞之间的基因表达，发现Neo DC/FR中存在164个上调的基因和132个下调的基因；20个上调和下调的基因如图7G所示。Neo DC/FR中上调的基因富集的基因本体(ontology)生物学过程术语是通用的(Fanget al.,Nat Biomed Eng.2021Mar 18.doi:10.1038/s41551-021-00696-y)，表明CiMC展现出与内源性肌肉细胞之间的一些转录组学差异，但这些差异并未指向任何特定的生物学途径。

CiMC植入改善了受伤的老年和mdx小鼠的肌肉功能

为了评估CiMC对肌肉再生的体内治疗效用，在FR培养基中体外扩增8天后收集CiMC并注射到成年、老年和mdx小鼠中通过CTX预先损伤的TA肌肉中。植入后4周，进行力测试以评估再生肌肉组织的功能(图8A和B)。我们发现，在所有三种小鼠模型中，CiMC处理的TA肌肉的平均等长强直力显著高于对照(几乎两倍)。一般而言，与成年小鼠相比，老年小鼠的体重和肌肉质量更大，并且收缩力更高，而mdx肌肉的收缩力最低。一致地，在力测试后切除所有肌肉并称重，显示在所有三种模型中，CiMC处理的TA肌肉的湿肌肉重量显著高于对照(图8C)。

为了确定CiMC植入的效率，将DsRed标记的CiMC移植到损伤的肌肉中。在细胞移植到所有三种动物模型(成年、老年和mdx小鼠)中4周后，CiMC被整合并形成具有中央细胞核的各种纤维大小的新再生的肌纤维(图8D-E)。相反，移植有DsRed标记的真皮细胞的对侧TA肌肉不具有DsRed阳性的肌纤维。值得注意的是，在移植了CiMC的mdx肌肉中检测到大量肌营养不良蛋白阳性的肌纤维，而在对照中未发现肌营养不良蛋白阳性的肌纤维(Fang etal.,Nat Biomed Eng.2021Mar 18.doi:10.1038/s41551-021-00696-y)。这些结果证明，移植的CiMC保持了它们的生肌性能力并植入到再生的肌肉中，特别是促进老年和DMD肌肉的再生。

另一方面，对成年、老年和mdx肌肉的组织学分析揭示，CiMC处理的TA肌肉的肌纤维的平均横截面积(CSA)与相应的对照相比显著增加，尤其是对于老年和DMD肌肉(图8F)。此外，与损伤的成年肌肉相比，老年和mdx肌肉的对照组的纤维化明显更严重，而CiMC处理的骨骼肌在所有三种模型中展现出显著低于对照组的肌肉纤维化(Fang et al.,NatBiomed Eng.2021Mar18.doi:10.1038/s41551-021-00696-y)。此外，在所有三种模型中，CiMC处理的肌肉展现出显著少于对照组的巨噬细胞(Fang et al.,Nat BiomedEng.2021Mar 18.doi:10.1038/s41551-021-00696-y)。总而言之，这些结果提供了CiMC对纤维化和炎症反应的改善作用也有助于肌肉再生的证据。

骨骼肌纤维大致分为四种肌纤维类型，包括I型慢肌纤维以及IIA、IIB和IIX型快肌纤维，并且纤维组分在决定肌肉功能方面起到关键作用²⁶。因此，我们分析了细胞注射4周后再生的成年、老年和DMD TA肌肉中的肌纤维类型组成。值得注意的是，除I型纤维外，所有TA肌肉中都存在三种类型的纤维(IIA型、IIB型和IIX型纤维(未被任何标志物染色，通过排除确定))。IIB型肌纤维是所有再生TA肌肉中最丰富的肌纤维类型，但在CiMC处理组和对照组之间没有显著差异。然而，与对照组相比，所有CiMC处理的TA肌肉中的IIA型肌纤维显著较少(图8G-H)，这提供了证据表明较好的再生TA肌肉具有较少的IIA型纤维。

用于原位肌肉再生的载药纳米颗粒

然后，我们探索了递送化学物混合物以在损伤的肌肉中诱导生肌性细胞的原位方法。开发了控制化学物混合物局部释放的递送平台以实现损伤的肌肉中常驻生肌性细胞的原位扩增(图9A)。将两种药物(F和R)负载到基于可生物降解的聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)的混合纳米颗粒中，以下称为“FR-np”。扫描电子显微镜(SEM)显示，FR-np是均匀的圆形球体，平均直径为427nm，并且多分散性指数(PDI)为0.24(图9B)。如通过高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)测定的，两种化学物在两周的时间段内均逐渐释放(图9C)。为了进一步验证药物释放性颗粒是否可以选择性地扩增生肌性干细胞以进行肌生成，我们用不同剂量的FR-np处理SAC并发现第10天Myh3⁺细胞显著增加，更高剂量的FR-np产生更多的肌细胞或肌管，从而概括了释放的化学物的生肌性诱导作用(图9D)。

为了验证载药纳米颗粒对肌肉再生的体内效果，如前文所述对成年和老年小鼠的TA肌肉进行CTX损伤，但随后注射FR-np而不是细胞(图9E)。从一开始，为了可视化注射的纳米颗粒在损伤的肌肉中的分布，注射了绿色荧光标记的纳米颗粒并且显示注射两天后纳米颗粒局部且均匀地分布在TA肌肉内(Fang et al.,Nat Biomed Eng.2021Mar 18.doi:10.1038/s41551-021-00696-y)，但一个月后逐渐降解并变得不可检测到。我们注射了1mgFR-np用于每个TA肌肉修复，基于几个考虑因素，包括在体外条件下实现高生肌性诱导的FR-np的量、估计的TA肌肉体积、长期释放期(3-4周)和肌肉组织中耐受良好的纳米颗粒的量²⁷。注射载药纳米颗粒后，监测肌肉功能并显示在第2周和第4周FR-np处理的成年TA肌肉的坐骨神经复合肌肉动作电位(CMAP)振幅显著高于载体处理(即，单独的np作为对照)(图9F和G)。与CiMC移植的有益效果相似，FR-np处理的TA肌肉在第4周时的平均等长强直力也显著高于成年和老年小鼠中的对照(图9H和I)，肌肉重量(图9J)和平均肌纤维CSA(图9K)也是如此，IIA型纤维存在的比例显著低于对照(图9L和M)。因此，这些结果证明药物释放性纳米颗粒增强了原位TA肌肉再生和修复。

我们接下来确定了载药纳米颗粒是否像FR在体外那样原位特异性扩增Pax7⁺卫星细胞并加速肌肉再生。与对照相比，免疫荧光染色显示了在FR-np处理的肌肉中退化或再生肌纤维周围显著较多的外周定位的Pax7⁺细胞(图10A)。通过量化再生肌纤维区域中Pax7⁺细胞的数量(图10B)，我们发现在FR-np处理的肌肉和载体处理的肌肉中，Pax7⁺卫星细胞的数量迅速增加并在第3天达到峰值，到第28天逐渐恢复到基础水平。然而，FR-np处理的肌肉在第3天和第7天的卫星细胞明显多于对照，与单独的载体相比增加了超过两倍。进一步分析显示几乎所有Pax7⁺细胞在第3天都在增殖(图10C)。为了直接确定这些扩增的Pax7⁺细胞是否衍生自现存的Pax7⁺卫星细胞，在Pax7-CreER:Rosa26-EYFP小鼠中进行肌肉损伤和FR-np递送实验，该小鼠容许用EYFP对Pax7⁺进行谱系追踪。FR-np处理的肌肉在第3天含有更多的EYFP+细胞(图10D)，这提供证据表明FR-np增加了损伤的肌肉中现存的Pax7⁺细胞的增殖和扩增以增强肌肉再生。此外，经FR-np处理的成年和老年小鼠的肌肉二者展现出比载体处理组显著较少的肌肉纤维化和较少的巨噬细胞(Fang et al.,Nat Biomed Eng.2021Mar18.doi:10.1038/s41551-021-00696-y)，证明施用FR混合物可以调节纤维化和炎症以改善肌肉再生，类似于我们在CiMC移植中的发现。

讨论

在这项研究中，我们已经证明了选择性并稳健地从真皮细胞和MuSC扩增生肌性干细胞用于损伤的成年、老年和营养不良的肌肉再生的化学物混合物。此外，通过使用纳米颗粒系统实现了将这些化学物原位递送至CTX损伤的成年和老年肌肉，这利用了身体的先天再生潜力来促进肌肉再生。这种使用小分子的方法在易于扩展、较高的可重复性以及临床安全性方面优于遗传方法。细胞移植和药物递送方法都具有转化为临床应用的巨大潜力。

先前已经探索了几种方法来解决骨骼肌再生中未满足的需求，包括生物材料^4,5、基因编辑^28,29和基于干细胞的策略⁹。卫星细胞在这些实现肌肉再生的方法中是必不可少的，然而，它们的扩增和自我更新潜力在成年肌肉中受到限制，尤其是在老年^7,30,31和DMD肌肉³²中降低或耗竭。此外，生肌性干细胞可衍生自成体干细胞，成体干细胞包括骨髓间充质干细胞³³、脐带血间充质干细胞³⁴和成血管细胞(mesoangioblast)，但分化效率仍然有待提高。包括胚胎干细胞(ESC)和诱导性多能干细胞(iPSC)在内的多能干细胞可以为生肌性细胞提供无限的来源^36-38，特别地，可以使用iPSC生成生肌性细胞而不存在使用ESC的伦理争议。然而，这种方法仍然受到冗长且昂贵的重编程和分化过程的限制，并且iPSC衍生的生肌性细胞对于有效植入而言还不成熟^37,38。我们对CiMC和FR混合物的发现有助于应对这些挑战。

皮肤真皮细胞通常已经被选为用于细胞重编程和治疗的细胞来源，因为它们可以经由微创规程方便地被分离。在这里，我们鉴定了基于与bFGF和抗坏血酸结合的佛司可林(F；一种cAMP激活剂)和RepSox(R；一种TGF-β1抑制剂)的化学物混合物，可以在体外从真皮细胞和MuSC选择性地诱导和稳健地扩增生肌性干细胞。先前的工作证明了F或R对从ESC和iPSC的生肌性增殖和分化的其他相关的影响^37,39。此外，F和R作为化学物混合物的一部分或与转录因子结合可以增强或诱导细胞重编程，如将人成纤维细胞转化为神经元⁴⁰、心脏⁴¹、骨骼肌⁴²和iPSC^20,43。然而，与其他研究不同的是，我们发现F和R的组合从真皮细胞稳健地扩增CiMC，而单独使用F或R时效率几乎是忽略不计的。另一方面，真皮细胞群体具有高度异质性，并展现出解剖和发育变化⁴⁴。因此，真皮细胞中的不同细胞亚群可以对化学物诱导的生肌性诱导和扩增有不同的贡献。为了阐明这个问题，将皮肤真皮细胞分成SAC、RAC和HFC亚群，我们发现SAC中富集的生肌性细胞与化学物介导的诱导高度相关。然后我们进行了谱系追踪和FACS分选，表明CiMC主要是通过FR培养基从真皮Pax7⁺细胞扩增的。此外，scRNA-seq分析揭示了真皮细胞的异质性和CiMC的选择性扩增。这些发现为使用化学物扩增的干细胞和基于药物递送的方法进行骨骼肌再生提供了合理的基础。

由于微环境中卫星细胞的失调，老年和DMD患者经常患有进行性肌肉无力和再生失败⁴⁵。最近的研究证明了生肌性干细胞移植在恢复老年和mdx小鼠的肌肉功能方面的功效^9,46,47。据我们所知，这项研究是第一次使用来自真皮细胞的化学物诱导的生肌性干细胞进行损伤的老年和营养不良的肌肉再生。在优化的条件下，通过化学物诱导和扩增可以从真皮细胞获得大量的生肌性干细胞。这些体外扩增的CiMC可以有效地植入老年和mdx肌肉中，并且在移植4周后显著改善肌肉功能和再生。因此，CiMC移植与基因编辑技术相结合，可以为患有与年龄相关的肌肉功能障碍和遗传性肌肉疾病的患者提供巨大的治疗潜力。在临床应用之前，需要进一步研究，例如ciMC生产的可扩展性和肌管存活和肌肉功能的长期评估。

本工作的另一个亮点是用于原位卫星细胞扩增和肌肉再生的载药纳米颗粒的开发。值得注意的是，可以方便地将FR-np注射到损伤的TA肌肉中，由此化学物的受控释放可以有效调节局部卫星细胞的数量和功能，以促进受损肌肉的再生，尤其是对老年肌肉的再生。先前的研究显示，病理性肌肉纤维化可以显著延缓肌肉再生^9,46,47。我们发现FR-np治疗通过减少纤维化对肌肉再生具有额外的有益作用，可能是由于RepSox引起的TGF-β抑制的作用^48,49。

值得注意的是，除了卫星细胞及其后代，免疫系统通过免疫细胞和细胞因子分泌的时空调节在介导肌肉修复中起着至关重要的作用⁵⁰。例如，促炎性M1巨噬细胞在损伤后很快出现，其可以清除凋亡的细胞和坏死的纤维并刺激卫星细胞增殖，而抗炎性M2巨噬细胞则在再生阶段发挥作用并促进成肌细胞分化和肌肉修复⁵¹。事实上，将巨噬细胞整合到工程改造的组织中以及巨噬细胞表型的调节可以增强肌生成和肌肉再生^52,53。在老年和DMD小鼠中，免疫细胞可以导致再生范式失调，而调整巨噬细胞表型可改善肌肉功能⁵⁴。在我们的研究中，CiMC或FR混合物处理的肌肉在4周后在成年、老年和DMD小鼠中显示出更快和更好的再生，同时巨噬细胞数量减少。此外，FR混合物可以对免疫调节有额外的有益作用，这得到了升高的cAMP信号传导和TGF-β抑制可以调节巨噬细胞以及其他先天性和适应性免疫细胞以进行肌肉再生这一发现的支持^55,56。FR混合物的免疫调节作用和免疫细胞在肌肉再生期间生肌性细胞扩增和分化中的作用需要进一步的机制研究。总而言之，我们开发的方法利用并最大化常驻细胞的再生潜力来加速和促进肌肉再生，这对临床治疗具有巨大的转化潜力。

材料和方法

材料

聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)聚合物(50:50，IV 0.4dl/g)和聚(乙烯醇)(PVA，MW25000，88％水解的)购买自Polysciences Inc。聚(乙二醇)甲醚-嵌段-聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA-b-PEG，PEG平均Mn 5,000，PLGA Mn 55,000)和二氯甲烷购买自Sigma。小分子购买自Cayman Chemical。

小鼠

本研究中使用的小鼠品系获得自杰克逊实验室，包括C57BL/6J小鼠(货号000664，8周龄成年小鼠和18个月龄老年小鼠)、mdx小鼠(C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J，货号：001801)、Rosa26-tdTomato(货号7909)、Pax7-cre/ERT2(货号017763)和Rosa26-EYFP(货号006148)。Pax7-cre/ERT2和Rosa26-EYFP杂交产生Pax7-CreER:Rosa26-EYFP后代。根据制造商的说明书，通过基因分型分析确认所有转基因小鼠的基因型。所有小鼠均在无特定病原体的条件下繁殖和饲养。所有动物工作均根据加州大学伯克利分校或加州大学洛杉矶分校动物研究委员会批准的方案进行。

细胞分离和培养

如前所述，从C57BL/6J和Pax7-CreER:Rosa26-EYFP小鼠中分离原代鼠新生儿真皮成纤维细胞样细胞⁵⁷。简言之，从处死的新生儿小鼠(1-3天)中取出四肢和尾巴，然后轻柔地将皮肤从身体上拉开。然后使将皮肤平整并漂浮在新鲜解冻的胰蛋白酶(0.25％不含EDTA，Thermo Fisher Scientific)上过夜，第二天将真皮与表皮分离。将真皮切成小块，用0.35％胶原蛋白酶II在37℃水浴中消化1小时。经消化的混合物通过100μm筛网过滤，以1000rpm离心5分钟，然后用杜氏改良Eagle培养基(DMEM)洗涤两次。将真皮细胞沉淀物铺板并在加湿的5％ CO₂培养箱中于37℃下在成纤维细胞培养基(Fb培养基，含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的高葡萄糖DMEM)中孵育过夜。第二天，将所得的混合的真皮细胞群体冷冻成等分试样。

使用改进的预铺板技术选择混合的真皮细胞群体并分成快速贴壁细胞(RAC)和慢速贴壁细胞(SAC)亚群⁵⁸。简言之，将真皮细胞铺到组织培养物处理的烧瓶上40分钟。附着的细胞代表RAC部分，而将上清液中的非附着细胞转移到另一个烧瓶中并作为SAC部分培养。如前所述，从C57BL/6J小鼠中分离出新生儿HFC⁵⁷、成年真皮成纤维细胞⁵⁹以及成年和老年MuSC⁶⁰。用于细胞分离的成年小鼠为4-8周龄，所有这些细胞在用于实验之前都在Fb培养基中培养。

筛选用于生肌性诱导的小分子

使用来自C57BL/6J小鼠的新生儿真皮成纤维细胞样细胞筛选选择性扩增骨骼肌细胞的小分子，将该成纤维细胞样细胞以10,000细胞/cm²的密度接种在含有Fb培养基的24孔板中。第二天，将原始培养基替换为含有小分子混合物的筛选培养基：KnockOut DMEM(Thermo Fisher Scientific)、10％knockout血清替代物(Thermo Fisher Scientific)、10％ FBS(Hyclone,Inc.)、2mM GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific)、1％非必需氨基酸(Thermo Fisher Scientific)、1％青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific)和含有各种小分子的20ng/mL bFGF(Stemgent)，其中小分子包括丙戊酸(V,500μM)、CHIR99021(C,20μM)、RepSox(R,10μM)、反苯环丙胺(T,5μM)、佛司可林(F,10μM)和5-氮杂-2'脱氧胞苷(5-Aza)(5-aza，5μM)。每2-3天更换一次培养基。在优化小分子混合物和浓度后，将筛选培养基更换为Fb培养基，以进一步筛选可能提高生肌性效率的额外的候选物，包括抗坏血酸(50μg/mL,Sigma)、BMP4(20ng/mL,Stemgent)、胰岛素(10μg/mL,Stemgent)、IGF-1(50ng/mL,R&DSystems)、PDGF(50ng/mL,R&D Systems)和bFGF(50ng/mL,Stemgent Inc.)。

基于筛选实验的结果，获得了优化的配方，其由具有20μM F、20μMR、50μg/mL AA和50ng/mL bFGF的Fb培养基组成，称为“FR培养基”。为了确定哪些真皮细胞亚群参与了化学物诱导的肌生成，在FR培养基中测试了各种亚群的肌生成潜力。对于这些实验，将细胞以10000个细胞/cm²的密度接种并在Fb培养基中培养。第二天，将培养基更换为FR培养基。每2-3天更换一次培养基。为了研究传代对CiMC的生肌性扩增潜力的影响，将CiMC在FR培养基中每3天传代一次。同时，通过冷冻储存来自所有传代的一部分细胞。然后将传代的CiMC用FR培养基处理8天，此时对Pax7和骨骼肌标志物进行免疫荧光分析以评估生肌性细胞的生成。对于衍生自Pax7-CreER:Rosa26-EYFP小鼠的真皮细胞，将1μM 4-OHT添加到Fb培养基中以在细胞接种期间诱导Cre重组酶表达，然后在第二天将培养基更换为FR培养基。

真皮细胞的流式细胞术分析

悬浮液中的真皮细胞用抗体染色，如FITC缀合的CD 90.2(大鼠mAb，ThermoFisher Scientific，11-0903-81)、P75(兔pAb，Abcam，ab8874)和PDGFR-α(大鼠mAb，ThermoFisher Scientific，13-1401-82)(以及根据需要的适当的二抗)，然后进行流式细胞术分析。

EYFP报告细胞的荧光激活细胞分选(FACS)

将分离自Pax7-CreER:Rosa26-EYFP小鼠的新生儿真皮细胞以2x 10⁴细胞/cm²的细胞密度接种在10厘米Corning组织培养皿中。在细胞接种期间将1μM 4-OHT添加到Fb培养基中以诱导Pax7⁺细胞的EYFP表达。一天后，将细胞用PBS洗涤两次并添加FR培养基，并且在第2天更换一次。第4天，将细胞用Accutase解离并用含有FBS的培养基中和。将分离的细胞以1000rpm离心5分钟，然后将细胞通过40μm过滤器以去除细胞簇和碎片后，以5x 10⁶细胞/mL的细胞浓度将细胞重悬在分选溶液(含有25mM HEPES、2％ FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM)。将单细胞悬浮液保存在冰上直至分选，将不存在4-OHT和FR的情况下的真皮细胞用作阴性对照。在添加DAPI后，将EYFP⁺和EYFP^-细胞在FACS Aria II仪器(Becton-Dickinson)上进行分选以排除死细胞并将细胞收集在分选溶液中。将分选的细胞重新铺板于Fb培养基中并在第0天(即6小时)固定，或在FR培养基中培养4天，然后对Pax7和肌肉标志物表达进行免疫荧光分析。

微阵列分析

用基础培养基(含50μg/mL AA和50ng/mL bFGF的Fb培养基)和FR培养基处理真皮成纤维细胞样细胞2天。在使用Ovation Pico WTA System V2(NuGEN)进行线性扩增之前，用RNeasy Micro Kit(Qiagen)提取mRNA并用Bioanalyzer 2100(Agilent)检查RNA质量(RIN>7.5)。生物学重复一式三份分别与Affymetrix小鼠基因1.0ST阵列杂交并用

Scanner 3000进行分析。将CEL文件加载到R中，并使用oligo包用RMA方法进行归一化。每个基因都拟合了线性模型并用limma包计算了经验贝叶斯统计。通过Benjamini-Hochberg方法调整多重检验的P值。认为表达水平差异超过2倍且调整后的P值小于0.05的基因是差异表达的。将差异表达的基因提交给DAVID进行基因本体富集分析。

基因表达分析

在指定的时间点，用Trizol(Thermo Fisher Scientific)裂解细胞，并按照制造商的说明书提取RNA。通过280nm处的吸收(Nanodrop 1000，Thermo Fisher Scientific)量化RNA浓度，并使用Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo FisherScientific)加载等量的RNA进行cDNA合成。然后将cDNA加载到带具有引物和Maxima SYBRGreen qPCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific)的96孔PCR板中。B2M用作管家基因用于归一化。在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)上进行热循环和数据采集。用ΔΔCt方法分析数据。使用了用于RT-qPCR的引物。

单细胞测序和数据处理

使用Cell Ranger版本3.1.0将转录本映射到mm10参考基因组。通过选择具有超过1000个特征和少于50000UMI计数的细胞来进行质量控制。质量控制后，新鲜分离的新生儿真皮细胞(Neo DC)、用FR培养基处理3天的新生儿真皮细胞(Neo DC/FR)、用FR培养基处理3天的成年真皮细胞(成年DC/FR)和新鲜分离的内源性成年MuSC(成年MuSC)分别保留了9433、8034、10326和6729个细胞。

使用Seurat²⁴对来自每个样品的细胞进行聚类。简言之，对数据进行对数归一化，并基于方差稳定性变换鉴定高度可变的基因。在对前2000个最高度可变的基因进行主成分分析(PCA)之前，对数据进行缩放和居中。前30个PC使用基于共享最近邻模块化优化的聚类算法进行聚类，分辨率设置为0.5。基于MAST包中执行的障碍模型进行差异基因表达测试⁶¹。通过典型相关分析将表达数据投射到较低的维度，鉴定具有相似生物学状态的细胞，然后计算转换向量并将其应用于所有细胞，从而将来自不同样品的数据用Seurat整合。将非整合的数据用于来自成年后肢和来自用FR处理的真皮细胞的骨骼肌细胞之间的差异表达测试。认为经调整的p值(Benjamini和Hochberg校正)小于0.01且对数倍数变化大于0.5的基因是差异表达的。

对于拟时序分析，整合了来自4个样品的骨骼肌细胞并用Seurat聚类。通过鉴定这些聚类之间差异表达的基因，鉴定了一组高度可变的基因。使用DDRTree对这些基因进行了降维并且使用Monocle 2.12绘制了拟时序轨迹²⁵。

细胞移植

细胞移植前24小时，用异氟烷/氧气吸入对成年C57BL/6小鼠(8周)、老年C57BL/6小鼠(18个月)和mdx小鼠(8周)进行麻醉，将30μL溶于PBS的20μM Naja mossambica心脏毒素注射到经麻醉的小鼠的TA肌肉中以诱导损伤。然后将CiMC(1x10⁵个细胞)悬浮在30μL基质胶(Matrigel)溶液中，并直接注射到预先损伤的TA肌肉中。作为对照，受体小鼠的对侧肌肉同样受到损伤，但用在Fb培养基中培养8天的真皮细胞注射。所有移植的细胞都用DsRed逆转录病毒转导，以便在用FR培养基进行化学物诱导之前进行追踪。每个时间点每组使用五只动物。

载药纳米颗粒(FR-np)的制备和表征

通过乳化溶剂蒸发技术制备载药纳米颗粒(FR-np)⁶²。简言之，将PLGA/PLGA-b-PEG(50/50wt/wt)溶解在二氯甲烷中制成10％w/v溶液，然后将聚合物重量的5％(wt/wt)的化学物(F和R具有相同的摩尔比)共溶解在聚合物溶液中。使用涡旋混合器以2000rpm将所得溶液添加到搅拌的1％(w/v)PVA溶液中2分钟，然后以20％的振幅(Sonic Dismembrator500，Thermo Fisher Scientific)超声处理40秒。超声处理后，将乳液逐滴添加到1％ PVA中并在室温下搅拌3小时以去除残留的有机溶剂。通过在4℃下以10,000xg离心5分钟，收集纳米颗粒并用蒸馏水洗涤三次。通过动态光散射(DLS)测量粒径，并通过带金电喷射的SEM观察表面形态。

药物释放概况的表征

简言之，在37℃下将2mg的FR-np分散在插入带有1mL PBS(pH 7.4)的离心管(Corning^TMCostar^TMSpin-X^TM离心管，Thermo Fisher Scientific)中的0.22μm过滤器中，连续摇晃。在离散的时间间隔(16小时、1、2、4、6、8、12和16天)，从试管中收集0.5mL样品溶液并冷冻用于后续分析。通过反相分离和检测分析溶液的等分试样，该方法使用先前优化的母离子产生和碎片离子检测条件，在三重四极质谱仪(Agilent 6460)上进行多重反应监测。用两种分析物的外标实现量化。所有实验样品一式三份进行分析，所有结果均报告为平均值±平均值的标准误差。

载药颗粒的体外肌生成

对于使用FR-np选择性诱导真皮细胞或MuSC中的生肌性细胞，将真皮细胞以10000个细胞/cm²接种在具有Fb培养基的24孔板中。第二天，将培养基更换为含有50μg/mL AA和50ng/mL bFGF的Fb培养基。同时，将不同剂量(1mg、2mg和4mg)的FR-np添加到共培养系统的插入的小室(Transwell)(0.4μm孔径，Thermo Fisher Scientific)中。每隔一天更换一半的Fb培养基。

载药颗粒的原位再生

对于原位再生，使用成年C57BL/6小鼠(8周)和老年C57BL/6小鼠(18个月)并如上文所述注射CTX使其受到损伤，并将悬浮于30μL PBS的1mg载药颗粒(FR-np)注射到损伤的TA肌肉中。作为对照，受体小鼠的对侧肌肉类似地受到损伤，但用无药物的np注射。每个时间点每组使用六只动物。Pax7-CreER:Rosa26-EYFP转基因小鼠用于Pax7⁺卫星细胞的谱系追踪。在进行相同的程序之前，将100μL的稀释于玉米油(Sigma，C8267)中的10mg/mL他莫昔芬(Sigma，T5648)连续5天腹膜内注射。最后一次注射后7天，进行麻醉、CTX损伤和FR-np注射。每个时间点每组使用三只动物。

为了使注射后纳米颗粒在损伤肌肉中的分布可视化，根据与制备FR-np相同的方案(仅稍作修改)制备了绿色荧光标记的纳米颗粒(绿色-np)，该修改涉及在用于绿色-np制造的聚合物溶液中添加0.02％(wt)香豆素-6(绿色荧光，Sigma)。类似于用于肌肉治疗的FR-np注射，将1mg绿色-np注射到成年C57BL/6小鼠(8周)的损伤的TA肌肉中。在2天和1个月后收集肌肉样品，并在进行免疫荧光分析和成像之前进行横向和纵向冷冻切片。

电生理学分析

在收获肌肉样品之前，在如前所述使用针状电极刺激后肢坐骨神经后测量每个TA肌肉的CMAP⁶³。简言之，使小鼠坐骨神经暴露于电刺激(单脉冲冲击，1mA，0.1ms)，并且从1V开始记录腓肠肌腹部的CMAP。还记录了来自坐骨神经对侧的正常CMAP以用于比较。GrassTech S88X刺激器(Astro-Med,Inc.)用于测试，并且PolyVIEW16数据采集软件(Astro-Med,Inc.)用于记录。

力测量

如前所述，用商业设备(Grass Tech,Astro-Med Inc)测量所有小鼠TA肌肉的等长强直力⁶⁴。简言之，在整个过程中用异氟烷麻醉小鼠并用加热灯加热小鼠，使肌腱暴露并附着于力传感器(Grass FT03传感器，Astro-Med Inc)，并且用不锈钢针固定膝盖。经由双极电极和Grass刺激器对坐骨神经进行电刺激。通过在最佳肌肉长度下(以0.5mm的增量进行调整)应用单脉冲刺激(电压＝12V，持续时间＝0.2ms，脉冲频率＝100Hz)实现了最大等长强直力。用PolyVIEW16软件(Grass Tech,Astro-Med Inc.)获取和记录数据。等长力测试完成后，使小鼠安乐死，并且对整个TA肌肉仔细解剖和称重。

肌肉样品收集

在不同时间点收获TA肌肉，并通过液氮冷却的异戊烷(Sigma)新鲜冷冻1分钟。将来自植入DsRed标记的细胞的小鼠和Pax7-CreER:Rosa26-EYFP小鼠的肌肉在室温下在1％多聚甲醛中固定2小时，并用20％蔗糖在4℃下脱水过夜，然后进行OCT包埋和在液氮冷却的异戊烷中冷冻。将样品冷冻切片以获得12μm厚的截面，并收集在预热、带正电的显微镜载玻片上。

组织学分析

对肌肉冷冻切片进行H&E染色，以使用明场显微镜确定组织的组织学。基于H&E染色的载玻片，通过ImageJ测量肌肉样品的中腹部切片中肌纤维的横截面积(CSA)。使用标准方案进行Masson三色染色，用ImageJ的阈值强度程序对切片内的总纤维化区域进行量化。纤维化指数计算为纤维化面积除以肌肉总面积。

免疫荧光染色

对于细胞免疫染色，将细胞在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后用溶于PBS的0.5％Triton-X 100透化15分钟。然后用5％驴血清封闭细胞1小时，并在4℃下与一抗(稀释于5％驴血清中)孵育过夜，这些一抗包括TnT(小鼠mAb，DSHB)、Myh1E(MF 20，小鼠mAb，DSHB)、Myh2(SC-71，小鼠mAb，DSHB)、Myh3(F1.652，小鼠mAb，DSHB)、Myh4(BF-F3，小鼠mAb，DSHB)、Myh7(BA-D5，小鼠mAb，DSHB)、Myh8(兔pAb，Thermo Fisher Scientific，PA5-72846)、MANEX1011B(1C7)(肌营养不良蛋白，小鼠mAb，DSHB)、MyoD(小鼠mAb，DSHB)、MyoG(小鼠mAb，DSHB)、Pax7(小鼠mAb，DSHB)、Sox 10(山羊pAb，R&D Systems，AF2864)、Ki 67(兔mAb，Abcam，ab16667)、FSP1(兔mAb，Sigma，07-2274)、CD 90.2-FITC(大鼠mAb，Thermo FisherScientific，11-0903-81)、P75(兔pAb、Abcam、ab8874)和PDGFR-α(大鼠mAb，Thermo FisherScientific，13-1401-82)。然后在室温下使用适当的Alexa Fluor488-或Alexa Fluor546-或Alexa Fluor 647-缀合的二抗(Thermo Fisher Scientific)1小时。此后，在黑暗中用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma)对细胞核染色10分钟。

对于免疫组织学染色，使用相同的方案并稍作修改。将中腹部横向切片(10μm厚)在4％(vol/vol)多聚甲醛中固定10分钟，并用PBS洗涤5分钟(3次)，然后用0.5％(vol/vol)Triton X-100(Sigma)透化10分钟。然后用溶于0.1％(vol/vol)Triton X-100中的5％驴血清封闭载玻片1小时，并在4℃下与一抗(稀释于5％驴血清中)孵育过夜，这些一抗包括抗层粘连蛋白(兔mAb，Sigma，L9393)、抗Pax7(小鼠mAb，DSHB)、抗Ki67(兔mAb，Abcam，ab16667)和F4/80(兔mAb，Abcam，ab6640)。对于Pax7染色，通过将多聚甲醛固定的样品置于95℃的柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中20分钟并将载玻片在室温下冷却20分钟进行热激活抗原修复，然后在与上文提及的其他抗体共染色之前进行透化和封闭。对于肌纤维染色，将新鲜冷冻切片用于使用一抗的染色，一抗包括BA-D5浓缩物(I型肌球蛋白重链，小鼠mAb，DSHB)，SC-71浓缩物(IIA型肌球蛋白重链，小鼠mAb，DSHB)、BF-F3浓缩物(IIB型肌球蛋白重链、小鼠mAb、DSHB)和层粘连蛋白(兔mAb，Sigma，L9393)，然后用二抗染色，二抗包括DyLight^TM405AffiniPure山羊抗小鼠IgG2b、Alexa

488AffiniPure山羊抗小鼠IgG1、Alexa

594AffiniPure山羊抗小鼠IgM(均来自Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号分别为115-475-207、115-545-205和115-585-075)和Alexa

647驴抗大鼠IgG(Thermo Fisher Scientific，ab150155))。所有荧光图像均使用Zeiss Axio ObserverZ1倒置显微镜和共聚焦倒置Leica TCS-SP8-SMD共聚焦显微镜拍摄。

统计学分析

除非另有说明，否则值表示为根据至少三个生物学重复的平均值计算的平均值±SD。使用Origin 8软件，通过单因素方差分析(one-way ANOVA)和t检验估计差异的统计学显著性。认为P值<0.05是显著的。

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以合适的药物组合物施用FR混合物可以经由任何公认的用于类似用途的试剂施用模式来进行。对本文有用的药物组合物还含有药学上可接受的载体，包括任何合适的稀释剂或赋形剂，其包括本身不诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体的任何试剂，并且可以在没有过度毒性的情况下施用。药学上可接受的载体包括但不限于液体，如水、盐水、甘油和乙醇等。Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，NJ当前版本)中对药学上可接受的载体、稀释剂和其他赋形剂进行了全面讨论。

相关领域的技术人员将熟悉任何数量的诊断、手术和其他临床标准，本文所述的药物组合物的施用可以适应于这些标准。参见，例如，Humar et al.,Atlas of OrganTransplantation,2006,Springer；Kuo et al.,Comprehensive Atlas ofTransplantation,2004Lippincott,Williams&Wilkins；Gruessner et al.,Living DonorOrgan Transplantation,2007McGraw-Hill Professional；Antin et al.,Manual ofStem Cell and Bone Marrow Transplantation,2009Cambridge University Press；Wingard et al.(Ed.),Hematopoietic Stem Cell Transplantation:A Handbook forClinicians,2009American Association of Blood Banks；Sabiston,Textbook ofSurgery,2012Saunders&Co.；Mulholland,Greenfield's Surgery,2010Lippincott,Williams&Wilkins；Schwartz's Principles of Surgery,2009McGraw-Hill；Lawrence,Essentials of General Surgery 2012Lippincott,Williams&Wilkins。

本文提及的所有出版物(例如，Fang et al.,Nat Biomed Eng.2021Mar 18.doi:10.1038/s41551-021-00696-y)通过引用并入本文以公开和描述与引用的出版物相关的方面、方法和/或材料。

Claims (20)

1.物质的组合物，其包含哺乳动物细胞培养基，其中所述细胞培养基包含置于其中的补充物，所述补充物基本上由佛司可林和RepSox组成。

2.权利要求1的组合物，其中所述细胞培养基补充物包含一定量的佛司可林和一定量的RepSox，所述量足以诱导生长于所述细胞培养基的胎盘细胞、真皮细胞、骨骼肌干细胞或生肌性细胞扩增出生肌性干细胞的群体。

3.权利要求2的组合物，其中佛司可林的量和RepSox的量足以在放置所述组合物的环境中创建1μM至100μM的佛司可林浓度和1μM至100μM的RepSox浓度。

4.权利要求1-3的组合物，其还包含：

抗坏血酸；

碱性成纤维细胞生长因子；和/或

药学上可接受的载体。

5.权利要求1的组合物，其还包含：

胎盘细胞；

真皮细胞；

骨骼肌干细胞；和/或

生肌性干细胞。

6.从胎盘细胞、真皮细胞和/或骨骼肌干细胞生长生肌性干细胞的方法，其包括将胎盘细胞、真皮细胞和/或骨骼肌干细胞与一定量的佛司可林和一定量的RepSox组合，所述量足以从所述胎盘细胞、真皮细胞、骨骼肌干细胞诱导和扩增生肌性干细胞的群体。

7.权利要求6的方法，其中与包含缺乏佛司可林和RepSox的胎盘细胞、真皮细胞、骨骼肌干细胞的至少4天体外培养物的对照相比，佛司可林的量和RepSox的量足以生成生长于体外培养物至少4天的至少多10％的Pax7⁺生肌性干细胞和/或至少多10％的MyoD⁺生肌性干细胞。

8.权利要求6的方法，其中胎盘细胞、真皮细胞、骨骼肌干细胞进一步与足以增强所述生肌性干细胞的诱导和扩增的量的抗坏血酸和/或碱性成纤维细胞生长因子组合。

9.权利要求6-8的方法，其进一步包括将所述扩增的生肌性干细胞置于体内损伤的部位。

10.权利要求9的方法，其中所述部位包含骨骼肌组织。

11.制备哺乳动物细胞培养基的方法，所述方法包括将水、血清或生长因子、缓冲剂、抗菌剂和基本上由佛司可林和RepSox组成的补充物组合在一起从而制备所述哺乳动物细胞培养基。

12.权利要求11的方法，其中所述细胞培养基补充物包含一定量的佛司可林和一定量的RepSox，所述量足以诱导生长于所述细胞培养基中的胎盘细胞、真皮细胞或骨骼肌干细胞形成生肌性干细胞。

13.权利要求12所述的方法，其中佛司可林的量和RepSox的量足以在放置所述组合物的环境中创建1μM至100μM的佛司可林浓度和1μM至100μM的RepSox浓度。

14.权利要求11所述的方法，其进一步包括向所述哺乳动物细胞培养基中添加：

抗坏血酸；

碱性成纤维细胞生长因子；和/或

药学上可接受的载体。

15.物质的组合物，其包含负载有一定量的佛司可林和一定量的RepSox的纳米颗粒，当其被放置在包含真皮细胞和/或骨骼肌干细胞的体内环境中时，所述量足以诱导所述真皮细胞和/或所述骨骼肌干细胞成为生肌性干细胞。

16.权利要求15的组合物，其还包含药学上可接受的载体。

17.权利要求15的组合物，其还包含足以增强所述生肌性干细胞的诱导和扩增的量的抗坏血酸和/或碱性成纤维细胞生长因子。

18.权利要求15的组合物，其中所述纳米颗粒包含可生物降解的聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)。

19.引入一定量的佛司可林和一定量的RepSox的方法，所述量足以在体内诱导真皮细胞和/或骨骼肌干细胞成为生肌性干细胞，所述方法包括将权利要求15-18中任一项所述的组合物放置在体内部位中。

20.权利要求19的方法，其中所述体内部位包含骨骼肌组织。

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