JP2023528309A - 体軸幹細胞、その生成方法及び使用 - Google Patents

体軸幹細胞、その生成方法及び使用 Download PDF

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シャポシニコフ、ドミトリー
アリ、アイシャ・ハジ
ケリー－オズデミール、ドルナイ
ルシャ、エホナ
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ヘルムホルツ ツェントゥルム ミュンヘン ドイチェス フォルシュングスツェントゥルム フューア ゲズントハイト ウント ウムヴェルト （ゲーエムベーハー）
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Abstract

本発明は、体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）を生成する方法、並びにこのような方法によって生成される体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）及びその使用に関する。本発明はさらに、多能性細胞ではないが、例えば、自身を無制限に複製することができる領域特異的分化複能性幹細胞である体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）に関する。【選択図】図３Ａ

Description

本願は、コンピュータ可読形態の配列表を含み、この配列表は参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本発明は、体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）を生成する方法、並びに、例えばこのような方法によって生成される体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）及びその使用に関する。本発明はさらに、多能性細胞ではない；領域特異的分化複能性幹細胞；多能性幹細胞から得ることができる；胚のすべての組織の細胞型に分化することができるわけではない；胚発生中に中心体軸の領域から出現する細胞型（例えば、硬節、皮筋板及び末梢ニューロン）にのみ分化することができる；奇形腫を形成することができない；軸領域（例えば、運動ニューロン、末梢ニューロン、末梢神経系ニューロン、感覚ニューロン、骨、軟骨、腱、靭帯及び／又は骨格筋の細胞）を生じる前駆体の特性を模倣することができる；一過性細胞ではない；運動ニューロン、末梢ニューロン、筋肉、軟骨又は骨の前駆体に分化することができる；幹細胞を無制限に複製（更新）する；クローンとして増殖することができる、の特徴のうちの１つ以上を有する体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）に関する。
哺乳動物生物の発生の顕著な特徴は、胚細胞が規定の期間自己複製する能力であり、これは、幹細胞の別個のプールを維持しながら、様々な組織型への分化を受ける娘子孫を産生する。マウス胚盤胞における多能性細胞、栄養膜細胞及び胚体外内胚葉細胞の増殖を促進し、分化を阻害するメカニズムの特定は、それぞれＥＳＣ／ＰＳＣ、ＴＳＣ及びＸＥＮと命名される無制限に複製する幹細胞株の誘導を促進する細胞培養環境のインフォームドデザイン（情報を活用した設計）をもたらした（Ｍａｒｔｉｎ、１９８１；Ｅｖａｎｓ及びＫａｕｆｍａｎ、１９８１；Ｔａｎａｋａら、１９９８；Ｎｉａｋａｎら、２０１３）。さらには、それぞれナイーブ／基底状態及びプライミング状態と命名された移植前及び移植後の胚盤胞に対応する多能性株、並びに最近提案された形成的多能性状態（Ｓｍｉｔｈ、２０１７）が、それぞれの発生段階を調節するシグナル伝達カスケードを操作することによって（Ｎｉｃｈｏｌｓ及びＳｍｉｔｈ、２００９；Ｂｒｏｎｓら、２００７；Ｔｅｓａｒ、２００５）、作製されている。注目すべきことに、これらの段階の調節の原理的モードは進化的に保存されており、胚盤胞の系譜（分化系列）を表すヒト幹細胞株の誘導につながっている（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８；Ｇａｆｎｉら、２０１３；Ｇｕｏら、２０１６；Ｔａｋａｓｈｉｍａら、２０１４；Ｔｈｅｕｎｉｓｓｅｎら、２０１４）。ＰＳＣ及び異所性発現多能性転写因子を維持する培養条件の適用は、ヒトを含む多様な哺乳動物種から人工（ｉ）ＰＳＣの誘導をもたらした（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉ及びＹａｍａｎａｋａ、２００６；Ｙｕら、２００７；Ｌｉｕら、２００８）。これは、胚盤胞に存在する細胞型のレパートリーが幹細胞株として培養物中で無制限に再生及び維持されることが可能であろうという結論につながる。増殖及び分化の調節は胚発生の後期にも存在するので、これは、特定の胚領域を表すさらなるタイプの非多能性幹細胞を作製することが可能であるかどうかという疑問を提起する。
広範な増殖及び分化を伴う胚盤胞後発生段階の一例は、体軸伸長のプロセスである。それは、原始線条（原条）の後側領域から開始され、その後、軸伸長が完了するまで尾芽胚（尾芽）から継続する（Ｂｅｎａｚｅｒａｆ及びＰｏｕｒｑｕｉｅ、２０１３）。このプロセスは、初めに原始線条で形成され、軸の伸びの間にマウス胚の結節（ノード）－原始線条境界（ｎｏｄｅ－ｓｔｒｅａｋ ｂｏｒｄｅｒ、ＮＳＢ）、原条側方エピブラスト（ｃａｕｄａｌ ｌａｔｅｒａｌ ｅｐｉｂｌａｓｔ、ＣＬＥ）及び脊索－神経管尾端境界（ｃｈｏｒｄｏｎｅｕｒａｌ ｈｉｎｇｅ、ＣＮＨ）に存在する幹細胞様前駆体によって駆動される（Ｈｅｎｒｉｑｕｅら、２０１５）。これらのいわゆる体軸前駆体（ａｘｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）は、すべての末梢ニューロン、硬節系譜及び皮筋板（皮筋節細胞）系譜、例えば、運動ニューロン、末梢ニューロン、末梢神経系ニューロン、感覚ニューロン、骨、軟骨、腱、靭帯及び／又は骨格筋の細胞を生じると考えられ（Ｃａｍｂｒａｙ及びＷｉｌｓｏｎ、２００２、２００７；Ｇａｒｒｉｏｃｋら、２０１５；Ａｔｔａｒｄｉら、２０１８）、移植実験は、それらが高度の発生可塑性（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を有することを示した（Ｃａｍｂｒａｙ及びＷｉｌｓｏｎ、２００７；Ｔｚｏｕａｎａｃｏｕら、２００９；ＭｃＧｒｅｗら、２００８）。
体軸前駆体の特定化及び維持は、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達及びＦＧＦシグナル伝達の相互作用によって駆動（推進）される（Ｈｅｎｒｉｑｕｅら、２０１５）。それらの明確な特徴は、ＴＢＸＴ及びＳＯＸ２の共発現であり、これらは、他の点では、それぞれ中胚葉及び神経の発生の非重複の主要制御因子と概してみなされる（Ｄｅｌｆｉｎｏ－Ｍａｃｈｉｎら、２００５；Ｔｓａｋｉｒｉｄｉｓら、２０１４；Ｇｏｕｔｉら、２０１４；Ｋｏｃｈら、２０１７）。この発現パターン、並びにそれらが末梢ニューロン及び硬節系譜及び皮筋板系譜を生じる上に列挙されたその解剖学的位置から、それらは神経中胚葉前駆体（ｎｅｕｒｏｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ、ＮＭＰ）として分類された（Ｇｏｕｔｉら、２０１４、Ｔｕｒｎｅｒら、２０１４、Ｃａｍｂｒａｙ及びＷｉｌｓｏｎ、２００７；Ｔｚｏｕａｎａｃｏｕら、２００９；Ｂｒｏｗｎ及びＳｔｏｒｅｙ、２０００；Ｗｉｌｓｏｎら、２００９；Ｏｌｉｖｅｒａ－Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２０１２）。脊索前駆体（Ｗｉｌｓｏｎ及びＢｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、１９９６）並びに前側及び体幹の側板中胚葉前駆体（ｌａｔｅｒａｌ ｐｌａｔｅ ｍｅｓｏｄｅｒｍ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ、ＬＰＭＰ）（Ｋｉｎｄｅｒら、１９９９；Ｓｍｉｔｈら、１９９４；Ｔａｇｕｃｈｉら、２０１４）は、軸領域に存在するさらなる細胞型である。最近の世界的なトランスクリプトミクス研究は、３つの体軸前駆細胞型すべてが明確に区別可能であるが、それらは、非常に多くの遺伝子発現パターンを共有もし、標的化アプローチにおいて区別することを困難にすることを示した（Ｗｙｍｅｅｒｓｃｈら、２０１９）。今日まで、体軸前駆体の機能的発生の可能性及びそれらが幹細胞株に転換されることが可能かどうかは、依然として未解決の疑問である。
ＴＢＸＴ及びＳＯＸ２の発現を含む軸性ＮＭＰの転写表現型を模倣する前駆体は、Ｗｎｔ及びＦＧＦ経路の活性化によってマウス及びヒトのＥＳＣから誘導されている（Ｇｏｕｔｉら、２０１４；Ｔｕｒｎｅｒら、２０１４；Ｌｉｐｐｍａｎｎら、２０１５；Ｔｓａｋｉｒｉｄｉｓ及びＷｉｌｓｏｎ、２０１５；Ｇｏｕｔｉら、２０１７；Ｄｅｎｈａｍら、２０１５；Ｖｅｒｒｉｅｒら、２０１８）。しかしながら、それらの性状（同一性）、純度、及び分化能は議論されており（Ｅｄｒｉら、２０１８）、重要なことに、それらの長期自己複製は実証されていない。
ヒト軸性子孫を生成する公知の方法は、労力を要し、費用がかかり、かつ、結果として生じる一過性の体軸前駆体には、多数の他の細胞型が混入する。それゆえ、哺乳動物における胚軸伸長の詳細な理解にもかかわらず、体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）は誘導されておらず、この段階はヒト胚においてアクセス不可能である。
Ｍａｒｔｉｎ，Ｇ．Ｒ．（１９８１） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８、７６３４－７６３８ Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ．、及びＫａｕｆｍａｎ，Ｍ．Ｈ．（１９８１） Ｎａｔｕｒｅ ２９２、１５４－１５６ Ｔａｎａｋａ，Ｓ．、Ｋｕｎａｔｈ，Ｔ．、Ｈａｄｊａｎｔｏｎａｋｉｓ，Ａ．Ｋ．、Ｎａｇｙ，Ａ．、及びＲｏｓｓａｎｔ，Ｊ．（１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２、２０７２－２０７５ Ｎｉａｋａｎ，Ｋ．Ｋ．、Ｓｃｈｒｏｄｅ，Ｎ．、Ｃｈｏ，Ｌ．Ｔ．、及びＨａｄｊａｎｔｏｎａｋｉｓ，Ａ．Ｋ．（２０１３） Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ８、１０２８－１０４１ Ｓｍｉｔｈ，Ａ．（２０１７） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４４、３６５－３７３ Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．、及びＳｍｉｔｈ，Ａ．（２００９） Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４、４８７－４９２ Ｂｒｏｎｓ，Ｉ．Ｇ．、Ｓｍｉｔｈｅｒｓ，Ｌ．Ｅ．、Ｔｒｏｔｔｅｒ，Ｍ．Ｗ．、Ｒｕｇｇ－Ｇｕｎｎ，Ｐ．、Ｓｕｎ，Ｂ．、Ｃｈｕｖａ ｄｅ Ｓｏｕｓａ Ｌｏｐｅｓ，Ｓ．Ｍ．、Ｈｏｗｌｅｔｔ，Ｓ．Ｋ．、Ｃｌａｒｋｓｏｎ，Ａ．、Ａｈｒｌｕｎｄ－Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｌ．、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｒ．Ａ．、及びＶａｌｌｉｅｒ，Ｌ．（２００７） Ｎａｔｕｒｅ ４４８、１９１－１９５ Ｔｅｓａｒ，Ｐ．Ｊ．（２００５） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２、８２３９－８２４４ Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．、Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ－Ｅｌｄｏｒ，Ｊ．、Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｓ．Ｓ．、Ｗａｋｎｉｔｚ，Ｍ．Ａ．、Ｓｗｉｅｒｇｉｅｌ，Ｊ．Ｊ．、Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｖ．Ｓ．、及びＪｏｎｅｓ，Ｊ．Ｍ．（１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２、１１４５－１１４７ Ｇａｆｎｉ，Ｏ．、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｌ．、Ｍａｎｓｏｕｒ，Ａ．Ａ．、Ｍａｎｏｒ，Ｙ．Ｓ．、Ｃｈｏｍｓｋｙ，Ｅ．、Ｂｅｎ－Ｙｏｓｅｆ，Ｄ．、Ｋａｌｍａ，Ｙ．、Ｖｉｕｋｏｖ，Ｓ．、Ｍａｚａ，Ｉ．、Ｚｖｉｒａｎ，Ａ．、Ｒａｉｓ，Ｙ．、Ｓｈｉｐｏｎｙ，Ｚ．、Ｍｕｋａｍｅｌ，Ｚ．、Ｋｒｕｐａｌｎｉｋ，Ｖ．、Ｚｅｒｂｉｂ，Ｍ．、Ｇｅｕｌａ，Ｓ．、Ｃａｓｐｉ，Ｉ．、Ｓｃｈｎｅｉｒ，Ｄ．、Ｓｈｗａｒｔｚ，Ｔ．、Ｇｉｌａｄ，Ｓ．、Ａｍａｎｎ－Ｚａｌｃｅｎｓｔｅｉｎ，Ｄ．、Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｓ．、Ａｍｉｔ，Ｉ．、Ｔａｎａｙ，Ａ．、Ｍａｓｓａｒｗａ，Ｒ．、Ｎｏｖｅｒｓｈｔｅｒｎ，Ｎ．、及びＨａｎｎａ，Ｊ．Ｈ．（２０１３） Ｎａｔｕｒｅ ５０４、２８２－２８６ Ｇｕｏ，Ｇ．、ｖｏｎ Ｍｅｙｅｎｎ，Ｆ．、Ｓａｎｔｏｓ，Ｆ．、Ｃｈｅｎ，Ｙ．、Ｒｅｉｋ，Ｗ．、Ｂｅｒｔｏｎｅ，Ｐ．、Ｓｍｉｔｈ，Ａ．、及びＮｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．（２０１６） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ６、４３７－４４６ Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ｙ．、Ｇｕｏ，Ｇ．、Ｌｏｏｓ，Ｒ．、Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．、Ｆｉｃｚ，Ｇ．、Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｆ．、Ｏｘｌｅｙ，Ｄ．、Ｓａｎｔｏｓ，Ｆ．、Ｃｌａｒｋｅ，Ｊ．、Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｗ．、Ｒｅｉｋ，Ｗ．、Ｂｅｒｔｏｎｅ，Ｐ．、及びＳｍｉｔｈ，Ａ．（２０１４） Ｃｅｌｌ １５８、１２５４－１２６９ Ｔｈｅｕｎｉｓｓｅｎ，Ｔ．Ｗ．、Ｐｏｗｅｌｌ，Ｂ．Ｅ．、Ｗａｎｇ，Ｈ．、Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａ，Ｍ．、Ｆａｄｄａｈ，Ｄ．Ａ．、Ｒｅｄｄｙ，Ｊ．、Ｆａｎ，Ｚ．Ｐ．、Ｍａｅｔｚｅｌ，Ｄ．、Ｇａｎｚ，Ｋ．、Ｓｈｉ，Ｌ．、Ｌｕｎｇｊａｎｇｗａ，Ｔ．、Ｉｍｓｏｏｎｔｈｏｒｎｒｕｋｓａ，Ｓ．、Ｓｔｅｌｚｅｒ，Ｙ．、Ｒａｎｇａｒａｊａｎ，Ｓ．、Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏ，Ａ．、Ｚｈａｎｇ，Ｊ．、Ｇａｏ，Ｑ．、Ｄａｗｌａｔｙ，Ｍ．Ｍ．、Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．、Ｇｒａｙ，Ｎ．Ｓ．、及びＪａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（２０１４） Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １５、５２４－５２６ Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．、Ｔａｎａｂｅ，Ｋ．、Ｏｈｎｕｋｉ，Ｍ．、Ｎａｒｉｔａ，Ｍ．、Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．、Ｔｏｍｏｄａ，Ｋ．、及びＹａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００７） Ｃｅｌｌ １３１、８６１－８７２ Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．、及びＹａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００６） Ｃｅｌｌ １２６、６６３－６７６ Ｙｕ，Ｊ．、Ｖｏｄｙａｎｉｋ，Ｍ．Ａ．、Ｓｍｕｇａ－Ｏｔｔｏ，Ｋ．、Ａｎｔｏｓｉｅｗｉｃｚ－Ｂｏｕｒｇｅｔ，Ｊ．、Ｆｒａｎｅ，Ｊ．Ｌ．、Ｔｉａｎ，Ｓ．、Ｎｉｅ，Ｊ．、Ｊｏｎｓｄｏｔｔｉｒ，Ｇ．Ａ．、Ｒｕｏｔｔｉ，Ｖ．、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｒ．、Ｓｌｕｋｖｉｎ，ＩＩ、及びＴｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．（２００７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８、１９１７－１９２０ Ｌｉｕ，Ｈ．、Ｚｈｕ，Ｆ．、Ｙｏｎｇ，Ｊ．、Ｚｈａｎｇ，Ｐ．、Ｈｏｕ，Ｐ．、Ｌｉ，Ｈ．、Ｊｉａｎｇ，Ｗ．、Ｃａｉ，Ｊ．、Ｌｉｕ，Ｍ．、Ｃｕｉ，Ｋ．、Ｑｕ，Ｘ．、Ｘｉａｎｇ，Ｔ．、Ｌｕ，Ｄ．、Ｃｈｉ，Ｘ．、Ｇａｏ，Ｇ．、Ｊｉ，Ｗ．、Ｄｉｎｇ，Ｍ．、及びＤｅｎｇ，Ｈ．（２００８） Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ３、５８７－５９０ Ｂｅｎａｚｅｒａｆ，Ｂ．、及びＰｏｕｒｑｕｉｅ，Ｏ．（２０１３） Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２９、１－２６ Ｈｅｎｒｉｑｕｅ，Ｄ．、Ａｂｒａｎｃｈｅｓ，Ｅ．、Ｖｅｒｒｉｅｒ，Ｌ．、及びＳｔｏｒｅｙ，Ｋ．Ｇ．（２０１５） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４２、２８６４－２８７５ Ｃａｍｂｒａｙ，Ｎ．、及びＷｉｌｓｏｎ，Ｖ．（２００２） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２９、４８５５－４８６６ Ｃａｍｂｒａｙ，Ｎ．、及びＷｌｓｏｎ，Ｖ．（２００７） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３４、２８２９－２８４０ Ｇａｒｒｉｏｃｋ，Ｒ．Ｊ．、Ｃｈａｌａｍａｌａｓｅｔｔｙ，Ｒ．Ｂ．、Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．Ｗ．、Ｃａｎｉｚａｌｅｓ，Ｌ．Ｃ．、Ｌｅｗａｎｄｏｓｋｉ，Ｍ．、及びＹａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．Ｐ．（２０１５） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４２、１６２８－１６３８ Ａｔｔａｒｄｉ，Ａ．、Ｆｕｌｔｏｎ，Ｔ．、Ｆｌｏｒｅｓｃｕ，Ｍ．、Ｓｈａｈ，Ｇ．、Ｍｕｒｅｓａｎ，Ｌ．、Ｌｅｎｚ，Ｍ．Ｏ．、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｃ．、Ｈｕｉｓｋｅｎ，Ｊ．、ｖａｎ Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ，Ａ．、及びＳｔｅｖｅｎｔｏｎ，Ｂ．（２０１８） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４５ Ｔｚｏｕａｎａｃｏｕ，Ｅ．、Ｗｅｇｅｎｅｒ，Ａ．、Ｗｙｍｅｅｒｓｃｈ，Ｆ．Ｊ．、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｖ．、及びＮｉｃｏｌａｓ，Ｊ．Ｆ．（２００９） Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ １７、３６５－３７６ ＭｃＧｒｅｗ，Ｍ．Ｊ．、Ｓｈｅｒｍａｎ，Ａ．、Ｌｉｌｌｉｃｏ，Ｓ．Ｇ．、Ｅｌｌａｒｄ，Ｆ．Ｍ．、Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ，Ｐ．Ａ．、Ｇｉｌｈｏｏｌｅｙ，Ｈ．Ｊ．、Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ，Ｋ．Ａ．、Ｃａｍｂｒａｙ，Ｎ．、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｖ．、及びＳａｎｇ，Ｈ．（２００８） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３５、２２８９－２２９９ Ｄｅｌｆｉｎｏ－Ｍａｃｈｉｎ，Ｍ．、Ｌｕｎｎ，Ｊ．Ｓ．、Ｂｒｅｉｔｋｒｅｕｚ，Ｄ．Ｎ．、Ａｋａｉ，Ｊ．、及びＳｔｏｒｅｙ，Ｋ．Ｇ．（２００５） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３２、４２７３－４２８３ Ｔｓａｋｉｒｉｄｉｓ，Ａ．、Ｈｕａｎｇ，Ｙ．、Ｂｌｉｎ，Ｇ．、Ｓｋｙｌａｋｉ，Ｓ．、Ｗｙｍｅｅｒｓｃｈ，Ｆ．、Ｏｓｏｒｎｏ，Ｒ．、Ｅｃｏｎｏｍｏｕ，Ｃ．、Ｋａｒａｇｉａｎｎｉ，Ｅ．、Ｚｈａｏ，Ｓ．、Ｌｏｗｅｌｌ，Ｓ．、及びＷｉｌｓｏｎ，Ｖ．（２０１４） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４１、１２０９－１２２１ Ｇｏｕｔｉ，Ｍ．、Ｔｓａｋｉｒｉｄｉｓ，Ａ．、Ｗｙｍｅｅｒｓｃｈ，Ｆ．Ｊ．、Ｈｕａｎｇ，Ｙ．、Ｋｌｅｉｎｊｕｎｇ，Ｊ．、Ｗｌｓｏｎ，Ｖ．、及びＢｒｉｓｃｏｅ，Ｊ．（２０１４） ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ １２、ｅ１００１９３７ Ｋｏｃｈ，Ｆ．、Ｓｃｈｏｌｚｅ，Ｍ．、Ｗｉｔｔｌｅｒ，Ｌ．、Ｓｃｈｉｆｆｅｒｌ，Ｄ．、Ｓｕｄｈｅｅｒ，Ｓ．、Ｇｒｏｔｅ，Ｐ．、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｂ．、Ｍａｃｕｒａ，Ｋ．、及びＨｅｒｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｇ．（２０１７） Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ４２、５１４－５２６ ｅ５１７ Ｔｕｒｎｅｒ，Ｄ．Ａ．、Ｈａｙｗａｒｄ，Ｐ．Ｃ．、Ｂａｉｌｌｉｅ－Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．、Ｒｕｅ，Ｐ．、Ｂｒｏｏｍｅ，Ｒ．、Ｆａｕｎｅｓ，Ｆ．、及びＭａｒｔｉｎｅｚ Ａｒｉａｓ，Ａ．（２０１４） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４１、４２４３－４２５３ Ｗｌｓｏｎ，Ｖ．、及びＢｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．Ｓ．（１９９６） Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ ５５、７９－８９ Ｋｉｎｄｅｒ，Ｓ．Ｊ．、Ｔｓａｎｇ，Ｔ．Ｅ．、Ｑｕｉｎｌａｎ，Ｇ．Ａ．、Ｈａｄｊａｎｔｏｎａｋｉｓ，Ａ．Ｋ．、Ｎａｇｙ，Ａ．、及びＴａｍ，Ｐ．Ｐ．（１９９９） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６、４６９１－４７０１ Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｌ．、Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ，Ｋ．Ｍ．、及びＳｃｈｏｅｎｗｏｌｆ，Ｇ．Ｃ．（１９９４） Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２０１、２７９－２８９ Ｔａｇｕｃｈｉ，Ａ．、Ｋａｋｕ，Ｙ．、Ｏｈｍｏｒｉ，Ｔ．、Ｓｈａｒｍｉｎ，Ｓ．、Ｏｇａｗａ，Ｍ．、Ｓａｓａｋｉ，Ｈ．、及びＮｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａ，Ｒ．（２０１４） Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １４、５３－６７ Ｗｙｍｅｅｒｓｃｈ，Ｆ．Ｊ．、Ｓｋｙｌａｋｉ，Ｓ．、Ｈｕａｎｇ，Ｙ．、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ａ．、Ｅｃｏｎｏｍｏｕ，Ｃ．、Ｍａｒｅｋ－Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｃ．、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｓ．Ｒ．、及びＷｉｌｓｏｎ，Ｖ．（２０１９） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４６ Ｌｉｐｐｍａｎｎ，Ｅ．Ｓ．、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃ．Ｅ．、Ｒｕｈｌ，Ｄ．Ａ．、Ｅｓｔｅｖｅｚ－Ｓｉｌｖａ，Ｍ．Ｃ．、Ｃｈａｐｍａｎ，Ｅ．Ｒ．、Ｃｏｏｎ，Ｊ．Ｊ．、及びＡｓｈｔｏｎ，Ｒ．Ｓ．（２０１５） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ４、６３２－６４４ Ｔｓａｋｉｒｉｄｉｓ，Ａ．、及びＷｉｌｓｏｎ，Ｖ．（２０１５） Ｆ１０００Ｒｅｓ ４、１００ Ｇｏｕｔｉ，Ｍ．、Ｄｅｌｉｌｅ，Ｊ．、Ｓｔａｍａｔａｋｉ，Ｄ．、Ｗｙｍｅｅｒｓｃｈ，Ｆ．Ｊ．、Ｈｕａｎｇ，Ｙ．、Ｋｌｅｉｎｊｕｎｇ，Ｊ．、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｖ．、及びＢｒｉｓｃｏｅ，Ｊ．（２０１７） Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ４１、２４３－２６１ ｅ２４７ Ｄｅｎｈａｍ，Ｍ．、Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｋ．、Ｍｅｎｈｅｎｉｏｔｔ，Ｔ．、Ｒｏｌｌｏ，Ｂ．、Ｚｈａｎｇ，Ｄ．、Ｈｏｕｇｈ，Ｓ．、Ａｌｓｈａｗａｆ，Ａ．、Ｆｅｂｂｒａｒｏ，Ｆ．、Ｉｇｈａｎｉｙａｎ，Ｓ．、Ｌｅｕｎｇ，Ｊ．、Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｄ．Ａ．、Ｎｅｗｇｒｅｅｎ，Ｄ．Ｆ．、Ｐｅｒａ，Ｍ．Ｆ．、及びＤｏｔｔｏｒｉ，Ｍ．（２０１５） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３３、１７５９－１７７０ Ｖｅｒｒｉｅｒ，Ｌ．、Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｌ．、Ｇｉｅｒｌｉｎｓｋｉ，Ｍ．、Ｄａｄｙ，Ａ．、及びＳｔｏｒｅｙ，Ｋ．Ｇ．（２０１８） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４５ Ｅｄｒｉ，Ｓ．、Ｈａｙｗａｒｄ，Ｐ．、Ｂａｉｌｌｉｅ－Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．、Ｓｔｅｖｅｎｔｏｎ，Ｂ．、及びＭａｒｔｉｎｅｚ Ａｒｉａｓ，Ａ．（２０１８） ． Ｂｉｏａｒｘｉｖ
本発明は、体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）（若しくは神経筋骨格幹細胞）を生成（又は誘導）する方法であって、多能性幹細胞、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞（例えば、ヒトＰＳＣ及び／又はＥＳＣ及び／又はｉＰＳＣ、例えばヒトＥＳＣ株Ｈ９（ＷＡ０９）又はヒトｉＰＳＣ株ＨＭＧＵ＃１）を提供する工程であって、好ましくは上記誘導／生成の前に、上記多能性細胞は、適切な多能性細胞培地（例えば、Ｌｕｄｗｉｇ Ｔ、Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｊ．Ａ．、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００７年９月に記載されているｍＴＥＳＲ（商標）１、又はＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ｉＰＳ－Ｂｒｅｗ ＸＦ）中で維持され、さらに好ましくは上記適切な多能性細胞培地は、上記誘導／生成のために（すなわち上記誘導／生成の前に）ビタミンＡを含む又は含まないＢ２７サプリメントを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（例えば、Ｂｒｅｗｅｒ ＧＪ、Ｃｏｔｍａｎ ＣＷ．、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １９８９年８月７日；４９４（１）：６５－７４に記載されているとおり）で置き換えられる工程と、上記多能性幹細胞、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞においてＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路を活性化する工程であって（例えば、ＧＯ：００１６０５５；例えば、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路は、標的細胞の表面上のｆｒｉｚｚｌｅｄファミリー受容体へのＷｎｔタンパク質の結合によって開始され、細胞状態の変化で終わる一連の分子シグナルである（Ｈｕｅｌｓｋｅｎ Ｊ、Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ Ｗ．、Ｎｅｗ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． ２００１年１０月；１１（５）：５４７－５５３））、好ましくは上記活性化は、ＧＳＫ３－βタンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４９８４１）の阻害剤を使用することによって行われ、さらに好ましくは上記阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、さらに最も好ましくは上記ＣＨＩＲ９９０２１阻害剤は約５μＭ～約１０μＭの濃度で使用され、さらに最も好ましくは、上記ＣＨＩＲ９９０２１阻害剤は約２４時間使用される工程と、上記工程（ｂ）から誘導される細胞を、継代の間のその細胞におけるＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の連続活性化の条件下で継代する工程であって、好ましくは、上記継代は少なくとも約３～９回（例えば、３回、４回、５回、６回、７回、８回、又は９回）行われ、さらに好ましくは上記継代は連続継代であり、さらに最も好ましくは、上記継代は、工程（ｂ）から誘導される細胞を、新鮮な無血清培地（例えば、ビタミンＡを含む又は含まないＢ２７サプリメントを補充したＲＰＭＩ１６４０培地）中により低い密度で再播種すること（例えば、再播種は、単細胞又は細胞の塊へのコロニーの解離及びそれらのプレーティングである）を含み、好ましくは、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の上記連続活性化は、そのＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の阻害剤を使用することによって行われ、さらに好ましくは、上記阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、さらに最も好ましくは、上記ＣＨＩＲ９９０２１阻害剤は、少なくとも約５μＭ（例えば、約７．５μＭ）の濃度で使用され、工程（ｃ）から誘導される細胞は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１）を内因的に発現している工程とを含み、任意選択で、工程（ｃ）からのＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の上記連続活性化は、線維芽細胞増殖因子２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０９０３８）及び／又はＴＧＦ－β（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１３７）阻害剤の存在下で行われ、好ましくは、（ｄ１）工程（ｃ）からのＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の上記連続活性化は、約５μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１阻害剤を用いて、線維芽細胞増殖因子２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０９０３８）及びＴＧＦ－β（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１３７）阻害剤の存在下で行われ、さらに好ましくは、上記ＴＧＦ－β阻害剤はＳＢ－４３１５４２であり、さらに最も好ましくは上記ＳＢ－４３１５４２阻害剤は約１０μＭの濃度で使用され、さらにさらに最も好ましくは上記線維芽細胞増殖因子２は約２０～約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用され、工程（ｄ１）から誘導される細胞は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１）、Ｔ－ｂｏｘ転写因子（Ｔボックス転写因子）Ｔ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８）及びホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ２Ｗ２）を内因的に発現しているが、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７）を内因的に発現しておらず、任意選択で、ホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６２６）をさらに内因的に発現しているか、又は（ｄ２）工程（ｃ）からのＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の上記連続活性化は、約５μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１阻害剤を用いて、好ましくはＴＧＦ－β（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１３７）阻害剤の存在下で行われ、さらに好ましくは、上記ＴＧＦ－β阻害剤はＳＢ－４３１５４２であり、さらに最も好ましくは上記ＳＢ－４３１５４２阻害剤は約１０μＭの濃度で使用され、工程（ｄ２）から誘導される細胞は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１）及びペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７）を内因的に発現しているが、Ｔ－ｂｏｘ転写因子Ｔ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８）、ホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ２Ｗ２）及びホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６２６）を内因的に発現していないか、又は（ｄ３）工程（ｃ）からのＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の上記連続活性化は、約７．５μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１阻害剤を用いて、好ましくはＴＧＦ－β（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１３７）阻害剤の存在下で行われ、さらに好ましくは、上記ＴＧＦ－β阻害剤はＳＢ－４３１５４２であり、さらに最も好ましくは上記ＳＢ－４３１５４２阻害剤は約１０μＭの濃度で使用され、工程（ｄ３）から誘導される細胞は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１）、Ｔ－ｂｏｘ転写因子Ｔ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８）、ホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ２Ｗ２）及びペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７）を内因的に発現しており、任意選択で、ホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６２６）をさらに内因的に発現している方法に関する。
本願は、本明細書において以下に記載され、特許請求の範囲において特徴付けられ、添付の実施例及び図面によって例示される、体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）を生成する方法、並びに例えばそのような方法によって生成される体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）、及びその使用の提供によって、この要求を満たす。
配列表の概要
配列番号１：（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲのための）ＧＡＰＤＨ順方向プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号２：（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲのための）ＧＡＰＤＨ逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号３：（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲのための）ＭＮＸ１（ＨＢ９）順方向プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号４：（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲのための）ＭＮＸ１（ＨＢ９）逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号５：（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲのための）ＰＲＰＨ順方向プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号６：（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲのための）ＰＲＰＨ逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号７：（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲのための）ＰＯＵ４Ｆ１順方向プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号８：（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲのための）ＰＯＵ４Ｆ１逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号９：（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲのための）ＲＵＮＸ２順方向プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号１０：（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲのための）ＲＵＮＸ２逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号１１：（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲのための）ＢＧＬＡＰ順方向プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号１２：（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲのための）ＢＧＬＡＰ逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号１３：（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲのための）ＣＯＬ１Ａ１順方向プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号１４：（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲのための）ＣＯＬ１Ａ１逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号１５：（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲのための）ＮＫＸ３－２順方向プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号１６：（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲのための）ＮＫＸ３－２逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号１７：（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲのための）ＣＯＭＰ順方向プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号１８：（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲのための）ＣＯＭＰ逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号１９：（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲのための）ＡＣＡＮ順方向プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号２０：（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲのための）ＡＣＡＮ逆方向プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号２１は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｐ４８４３１に対応するヒトＳＯＸ－２タンパク質の例示的なアミノ酸配列である。
配列番号２２は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｑ０１８６０－１に対応するヒトＰＯＵ５Ｆ１タンパク質（ＯＣＴ４としても知られる）の例示的なアミノ酸配列である。
配列番号２３は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｑ９Ｈ９Ｓ０－１に対応するヒトＮＡＮＯＧタンパク質の例示的なアミノ酸配列である。
配列番号２４は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｏ１５１７８－１に対応するヒトＴＢＸＴタンパク質の例示的なアミノ酸配列である。
配列番号２５は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｑ９９６２６－１に対応するヒトＣＤＸ２タンパク質の例示的なアミノ酸配列である。
配列番号２６は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｑ９Ｈ２Ｗ２－１に対応するヒトＭＩＸＬ１タンパク質の例示的なアミノ酸配列である。
配列番号２７は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｐ２６３６７－１に対応するヒトＰＡＸ６タンパク質の例示的なアミノ酸配列である。
配列番号２８は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｐ４９８４１－１に対応するヒトＧＳＫ３Ｂタンパク質の例示的なアミノ酸配列である。
配列番号２９は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｐ０９０３８－４に対応するヒトＦＧＦ２タンパク質の例示的なアミノ酸配列である。
配列番号３０は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｐ０１１３７－１に対応するヒトＴＧＦＢ１タンパク質の例示的なアミノ酸配列である。
配列番号３１は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｑ６ＺＮ１７－１に対応するヒトＬＩＮ２８Ｂタンパク質の例示的なアミノ酸配列である。
配列番号３２は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｐ０４１９８－１に対応するヒトＭＹＣＮタンパク質の例示的なアミノ酸配列である。
配列番号３３は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｏ９５４０９－１に対応するヒトＺＩＣ２タンパク質の例示的なアミノ酸配列である。
配列番号３４は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｐ７８４１５－１に対応するヒトＩＲＸ３タンパク質の例示的なアミノ酸配列である。
配列番号３５は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｏ００５７０－１に対応する、ヒトＳＯＸ１タンパク質の例示的なアミノ酸配列である。
配列番号３６は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｐ３５７１６－１に対応する、ヒトＳＯＸ１１タンパク質の例示的なアミノ酸配列である。
配列番号３７は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｐ４３６９９－１に対応するヒトホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．１の例示的なアミノ酸配列である。
配列番号３８は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｑ２Ｑ１Ｗ２－１に対応するヒトＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ７１の例示的なアミノ酸配列である。
配列番号３９は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｑ９９８５３－１に対応するヒトフォークヘッドボックスタンパク質Ｂ１の例示的なアミノ酸配列である。
構成的Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達及び継代は、ｈＥＳＣ子孫におけるＴ及びＳＯＸ２の安定な発現を促進する。ＣＨＩＲ９９０２１によるｈＥＳＣの単回処理及び反復処理を比較するｑＰＣＲによるＴの時間経過分析（ｎ＝３、エラーバー － ＳＥＭ。以下の他のすべてのｑＰＣＲ分析も同様）。 構成的Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達及び継代は、ｈＥＳＣ子孫におけるＴ及びＳＯＸ２の安定な発現を促進する。ＣＨＩＲ９９０２１で構成的に処理されたｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおける過剰発現されたβ－カテニンの構成的に活性な形態の時間経過ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｎ＝２）。主成分分析。 構成的Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達及び継代は、ｈＥＳＣ子孫におけるＴ及びＳＯＸ２の安定な発現を促進する。ＣＨＩＲ９９０２１で構成的に処理されたｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおける過剰発現されたβ－カテニンの構成的に活性な形態の時間経過ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｎ＝２）。時間経過にわたる原始線条（Ｔ、ＭＩＸＬ１、ＥＶＸ１、ＣＤＸ２）結節（ＧＳＣ）、沿軸中胚葉（ＴＢＸ６）マーカー発現のパネル。 構成的Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達及び継代は、ｈＥＳＣ子孫におけるＴ及びＳＯＸ２の安定な発現を促進する。ＣＨＩＲ９９０２１で構成的に処理されたｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおける過剰発現されたβ－カテニンの構成的に活性な形態の時間経過ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｎ＝２）。未処理細胞（ＦＣ＞２、ｐａｄｊ≦０．０５）及び濃縮組織カテゴリーと比較した７２時間での上方制御された遺伝子のベン図。 構成的Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達及び継代は、ｈＥＳＣ子孫におけるＴ及びＳＯＸ２の安定な発現を促進する。ＣＨＩＲ９９０２１で構成的に処理されたｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおける過剰発現されたβ－カテニンの構成的に活性な形態の時間経過ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｎ＝２）。（Ｄ）からの最も濃縮された組織カテゴリーに割り当てられた上方制御された遺伝子のヒートマップ：外胚葉、中胚葉、神経管及び神経堤。 構成的Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達及び継代は、ｈＥＳＣ子孫におけるＴ及びＳＯＸ２の安定な発現を促進する。ＣＨＩＲ９９０２１で構成的に処理されたｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおける過剰発現されたβ－カテニンの構成的に活性な形態の時間経過ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｎ＝２）。時間経過における最も有意に濃縮されたシグナル伝達カスケード。 構成的Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達及び継代は、ｈＥＳＣ子孫におけるＴ及びＳＯＸ２の安定な発現を促進する。ＣＨＩＲ９９０２１で構成的に処理されたｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおける過剰発現されたβ－カテニンの構成的に活性な形態の時間経過ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｎ＝２）。時間経過におけるコア多能性遺伝子の発現の倍率変化。 構成的Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達及び継代は、ｈＥＳＣ子孫におけるＴ及びＳＯＸ２の安定な発現を促進する。ＣＨＩＲ９９０２１で構成的に処理されたｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおける過剰発現されたβ－カテニンの構成的に活性な形態の時間経過ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｎ＝２）。１０μＭ ＣＨＩＲ９９０２１処理の２４時間後並びに１、３及び５継代後のコア多能性遺伝子及びＴのｑＰＣＲによる分析。継代培地には、５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（５Ｃ）又は５μＭ ＣＨＩＲ＋１００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２（５ＣＦ）のいずれかを補充した（ｎ＝４）。 ＷＮＴ及びＷＮＴ／ＦＧＦ２は、無制限に複製する体軸様細胞株の樹立を促進する。ＣＨＩＲ９９０２１濃度の勾配並びにＦＧＦ２及びＴＧＦ－β経路阻害剤ＳＢ４３１５４２の存在を示す、体軸幹細胞株を樹立するために使用された処理スキーム。色付きセクターは、９継代以上の株の誘導の成功をもたらした条件を示す。完全な条件マトリクス（行列）が図Ｓ２に与えられている。Ｈ９ ｈＥＳＣ株を用いた３回を超える独立した誘導に基づく。 ＷＮＴ及びＷＮＴ／ＦＧＦ２は、無制限に複製する体軸様細胞株の樹立を促進する。ＣＨＩＲ９９０２１濃度の勾配並びにＦＧＦ２及びＴＧＦ－β経路阻害剤ＳＢ４３１５４２の存在を示す、体軸幹細胞株を樹立するために使用された処理スキーム。色付きセクターは、９継代以上の株の誘導の成功をもたらした条件を示す。完全な条件マトリクスが図Ｓ２に与えられている。Ｈ９ ｈＥＳＣ株を用いた３回を超える独立した誘導に基づく。 ＷＮＴ及びＷＮＴ／ＦＧＦ２は、無制限に複製する体軸様細胞株の樹立を促進する。上のパネルは、継代２５で示された処理によって樹立された細胞株の代表的な位相差顕微鏡写真（倍率１０倍）である（挿入図は、同じ継代のＣＨＩＲ９９０２１＋ＦＧＦ２＋ＴＧＦ－β阻害剤ＳＢ４３１５４２細胞株の高密度顕微鏡写真である）。下パネルは、対応する細胞株、継代２６～２８の代表的な免疫蛍光顕微鏡写真（倍率４０倍）である。それぞれ、ＳＯＸ２及びＴのダブル染色及びＣＤＸ２及びＰＡＸ６のシングル染色（スケールバー － ４０μｍ）。 ＷＮＴ及びＷＮＴ／ＦＧＦ２は、無制限に複製する体軸様細胞株の樹立を促進する。示される継代５、９における樹立細胞株の軸性遺伝子及び神経遺伝子のｑＰＣＲ分析。未分化Ｈ９ ｈＥＳＣに対する倍率変化が示されている（ｎ＝３、独立に誘導された細胞株；ＮＴ － 試験せず、ＮＤ － 検出されなかった）。 ＷＮＴ及びＷＮＴ／ＦＧＦ２は、無制限に複製する体軸様細胞株の樹立を促進する。示される継代２６における樹立細胞株の軸性遺伝子及び神経遺伝子のｑＰＣＲ分析。未分化Ｈ９ ｈＥＳＣに対する倍率変化が示されている（ｎ＝３、独立に誘導された細胞株；ＮＴ － 試験せず、ＮＤ － 検出されなかった）。 ＷＮＴ及びＷＮＴ／ＦＧＦ２は、無制限に複製する体軸様細胞株の樹立を促進する。継代２５の７．５μＭのＣＨＩＲ９９０２１又はＣＨＩＲ９９０２１＋ＴＧＦ－β阻害剤ＳＢ４３１５４２の存在下で樹立された細胞株の代表的な位相差顕微鏡写真（倍率１０倍）（高密度培養物が挿入図に示されている）、及び継代２８のＣＨＩＲ９９０２１＋ＳＢ４３１５４２試料の代表的な免疫蛍光顕微鏡写真。 ＷＮＴ及びＷＮＴ／ＦＧＦ２は、無制限に複製する体軸様細胞株の樹立を促進する。７．５μＭのＣＨＩＲ９９０２１又はＣＨＩＲ９９０２１＋ＴＧＦ－β阻害剤ＳＢ４３１５４２の存在下で樹立された細胞株のｑＰＣＲ分析。継代５及び２６の上記細胞株における中胚葉遺伝子及び神経遺伝子のｑＰＣＲ分析（ｎ＝３、独立に誘導された細胞株）。 体軸幹細胞の方向付けられた分化。特徴的な遺伝子発現パターン及びそれらの推測される分化バイアスを示す、成功裏に樹立された細胞株の要約。 体軸幹細胞の方向付けられた分化。ＣＨＩＲ９９０２１単独、ＣＨＩＲ９９０２１＋ＳＢ４３１５４及びＣＨＩＲ９９０２１＋ＳＢ４３１５４＋ＦＧＦ２処理で樹立された細胞株を、未分化Ｈ９親細胞株と比較して表す、ＲＮＡ配列決定データセットにおける上方制御及び下方制御された遺伝子（ｌｏｇ２ＦＣ≧２、ＦＤＲ＜０．０５、９～１２継代）のベン図。 体軸幹細胞の方向付けられた分化。各細胞株からの有意に上方調節された遺伝子の遺伝子オントロジー分析（分子機能）。ｐ値（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）検定）がすべてのカテゴリーについて示されている。 体軸幹細胞の方向付けられた分化。１週間、２週間、及び３週間の、基底状態（ＣＨＩＲ９９０２１＋ＳＢ４３１５４＋ＦＧＦ２）からプライミング状態（ＣＨＩＲ９９０２１＋ＳＢ４３１５４）への、及びその逆の培地交換の際の示された遺伝子のｑＰＣＲ分析。未分化親細胞株に対するＬｏｇ２倍率変化が示されている。ＮＤ － Ｃｔ値はｑＰＣＲ中に決定されなかった。 体軸幹細胞の方向付けられた分化。主経路に関する体軸幹細胞の予測される分化能力。 体軸幹細胞の方向付けられた分化。ＣＨＩＲ＋ＴＧＦｉ及びＣＨＩＲ＋ＦＧＦ２＋ＴＧＦｉ細胞は、１５日間及び２８日間、運動ニューロンに分化した。ＤＡＰＩ（青色）でオーバーレイされたＴｕｊ１、Ｉｓｌ１及びＨＢ９についての１０倍倍率での位相差画像及びシングル免疫蛍光染色を示す。倍率 － １５日間については４０倍、２８日間については６３倍、スケールバー － それぞれ２０及び５０μｍ。 体軸幹細胞の方向付けられた分化。ＣＨＩＲ＋ＦＧＦ２＋ＴＧＦｉ及びＣＨＩＲ＋ＴＧＦｉ株からの１５日及び２６日の分化の後のニューロンマーカーのｑＰＣＲ分析。未分化親細胞株に対するＬｏｇ２倍率変化が示されている（ｎ＝３、ＮＴ － 検定せず）。 体軸幹細胞の方向付けられた分化。１５日間の分化の後の示された条件に由来する骨細胞のｑＰＣＲ分析。未分化親細胞株に対するＬｏｇ２倍率変化が示されている（ｎ＝３）。 体軸幹細胞の方向付けられた分化。１５日間の分化の後の示された条件に由来する軟骨細胞のｑＰＣＲ分析。未分化親細胞株に対するＬｏｇ２倍率変化が示されている（ｎ＝３）。 体軸幹細胞の方向付けられた分化。１５日間の骨形成分化の後のＣＨＩＲ＋ＦＧＦ２＋ＴＧＦｉ及びＣＨＩＲ＋ＴＧＦｉ株のアリザリンレッド染色。未分化ＣＨＩＲ＋ＴＧＦｉ対照が並べて示されている。 体軸幹細胞の方向付けられた分化。１５日間の軟骨形成分化の後のＣＨＩＲ＋ＦＧＦ２＋ＴＧＦｉ及びＣＨＩＲ＋ＴＧＦｉ株のアルシアンブルー染色。未分化ＣＨＩＲ＋ＴＧＦｉ対照が並べて示されている。 Ａ）体軸幹細胞の誘導のための維持培地において使用されるリガンドの組み合わせの概略。最上行のμＭはＣＨＩＲ９９０２１濃度を示す。緑色の長方形は、細胞株の樹立の成功（９継代を超える）を示す。×が書かれた長方形は、細胞死、増殖の欠如の最終分化により終結した誘導の不成功を示す。灰色の長方形は、９継代を超えて維持されたが、継代にわたる不安定な増殖及び長期の自発的分化を示す細胞株を示す。 ＣＤＸ２発現において不均質性を示すＣＨＩＲ－ＦＧＦ２－ＳＢ４３１５４２株由来の１０個の個別に単離されたクローンにおける定量的ＰＣＲに基づく遺伝子発現。親株の継代２７からクローンが誘導され、単離後の継代４で分析された。遺伝子発現は、（ＧＡＰＤＨに対する）相対量として表示される。ｎ＝１。 Ｃｄｘ２及びＴＢＸＴの発現についてのＡ）からの８つのクローンの免疫蛍光分析。６３倍の倍率での代表的な写真。 ヒトｉＰＳ細胞株（ＨＭＧＵ＃１）からの体軸幹細胞誘導の概略。μＭ濃度は、ＣＨＩＲ９９０２１についてのものである。ＦＧＦ２及びＳＢ－４３１５４２の濃度は、Ｈ９ ｈＥＳ細胞株からの誘導と同じであり、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌ及び１０μＭであった。 継代９のｉＰＳ由来体軸幹細胞株におけるマーカー遺伝子発現の定量的ｑＰＣＲ分析。発現はＧＡＰＤＨに対して正規化され、未分化親ｉＰＳ細胞株に対するＬｏｇ２倍率変化としてプロットされている。エラーバーは、生物学的反復（誘導物）間の平均の標準誤差を表す。ｎ＝１～６。 時間経過ＣＨＩＲ９９０２１刺激及びβ－カテニン誘導の間のＨｏｘ遺伝子発現のＲＮＡ－ｓｅｑ分析。時間点は０（非刺激）、８時間、１６時間、２４時間、４８時間及び７２時間である。すべての（０時間と比較した任意の時間点で）差異的に発現されたＨｏｘ遺伝子がプロットされている（倍率変化＞１．５、ＦＤＲ＜０．０５）。ｚスコアは、正規化したカウントから計算された。 樹立された体軸幹細胞株におけるＨｏｘ遺伝子発現のＲＮＡ－ｓｅｑ分析（ｌｏｇ２倍率変化）。差異的に発現された（未分化親ｈＥＳに対する任意の株）Ｈｏｘ遺伝子のみがプロットされている（倍率変化＞１．５、ＦＤＲ＜０．０５）。 ＣＨＩＲ９９０２１刺激の７２時間と樹立されたＣＨＩＲ－ＦＧＦ２－ＳＢ４３１５４２体軸幹細胞株との間のＨｏｘ遺伝子発現の重複のベン図（差異的に発現されたＨｏｘ遺伝子のみが比較される）。樹立された株においてのみ発現される遺伝子が右側に列挙されている。 新規な無制限に自己複製する細胞の軸性性状（ａｘｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す遺伝子発現分析。継代１、３及び５でのＣＨＩＲ９９０２１により２４時間誘導された細胞及びＣＨＩＲ９９０２１＋ＦＧＦ２＋ＳＢ４３１５４２駆動細胞（ＣＦＳ）における多能性遺伝子、軸性遺伝子、神経遺伝子及び中胚葉遺伝子のｑＰＣＲ分析（未分化Ｈ９ ｈＥＳＣに対する倍率変化、ｎ＝３、独立に誘導された細胞株）。 継代１、２、３及び４でのＣＨＩＲ９９０２１により２４時間誘導された細胞及びＣＨＩＲ９９０２１＋ＳＢ４３１５４２駆動細胞（ＣＳ）における多能性遺伝子、軸性遺伝子、神経遺伝子及び中胚葉遺伝子のｑＰＣＲ分析（未分化Ｈ９ ｈＥＳＣに対する倍率変化、ｎ＝３、独立に誘導された細胞株）。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。 ｈＥＳＣ（Ｈ９及びＨＵＥＳ６）及びｈｉＰＳＣ（ＨＭＧＵ１）に由来するＣＦＳ株及びＣＳ株の単細胞配列決定のＵＭＡＰ可視化。 単細胞レベルでの軸性マーカーＳＯＸ２、ＴＢＸＴ、ＣＤＸ２及び神経マーカーＰＡＸ６の発現。 単細胞レベルでの軸性マーカーＳＯＸ２、ＴＢＸＴ、ＣＤＸ２及び神経マーカーＰＡＸ６の発現。 系譜特異的マーカーの平均発現を示すドットプロット。ドットサイズはそれぞれの遺伝子を発現する細胞のパーセンテージを表し、色強度は発現レベルを示す。 ＨＯＸ遺伝子の平均発現を示すドットプロット。ドットサイズはそれぞれの遺伝子を発現する細胞のパーセンテージを表し、色強度は発現レベルを示す。 軸伸長及び胚発生を通して調節されるシグナル伝達経路に関与する遺伝子、ＷＮＴ遺伝子及び受容体、の平均発現を示すドットプロット。ドットサイズはそれぞれの遺伝子を発現する細胞のパーセンテージを表し、色強度は発現レベルを示す。 軸伸長及び胚発生を通して調節されるシグナル伝達経路に関与する遺伝子、ＦＧＦ遺伝子及び受容体、の平均発現を示すドットプロット。ドットサイズはそれぞれの遺伝子を発現する細胞のパーセンテージを表し、色強度は発現レベルを示す。 軸伸長及び胚発生を通して調節されるシグナル伝達経路に関与する遺伝子、ＴＧＦｂ遺伝子及び受容体、の平均発現を示すドットプロット。ドットサイズはそれぞれの遺伝子を発現する細胞のパーセンテージを表し、色強度は発現レベルを示す。 軸伸長及び胚発生を通して調節されるシグナル伝達経路に関与する遺伝子、ＮＯＴＣＨリガンド及び受容体、の平均発現を示すドットプロット。ドットサイズはそれぞれの遺伝子を発現する細胞のパーセンテージを表し、色強度は発現レベルを示す。 軸伸長及び胚発生を通して調節されるシグナル伝達経路に関与する遺伝子、レチノイン酸受容体、の平均発現を示すドットプロット。ドットサイズはそれぞれの遺伝子を発現する細胞のパーセンテージを表し、色強度は発現レベルを示す。 軸伸長及び胚発生を通して調節されるシグナル伝達経路に関与する遺伝子、ＢＭＰ遺伝子及び受容体、の平均発現を示すドットプロット。ドットサイズはそれぞれの遺伝子を発現する細胞のパーセンテージを表し、色強度は発現レベルを示す。 ＣＳ株におけるＬｏｕｖａｉｎ（ルーヴァン）クラスタリングのＵＭＡＰ可視化。 ＣＳクラスターにおける系譜特異的マーカーの平均発現を示すドットプロット。ドットサイズはそれぞれの遺伝子を発現する細胞のパーセンテージを表し、色強度は発現レベルを示す。 ＣＳ株におけるＬｏｕｖａｉｎクラスタリングのＵＭＡＰ可視化。 ＣＳクラスターにおける系譜特異的マーカーの平均発現を示すドットプロット。ドットサイズはそれぞれの遺伝子を発現する細胞のパーセンテージを表し、色強度は発現レベルを示す。 体軸幹細胞の神経分化。分化培地中の神経分化プロセス及びサイトカインの概略図。 体軸幹細胞の神経分化。ＣＦＳ株（上パネル）及びＣＳ株（下パネル）の分化中の２日目及び１６日目での代表的な位相差顕微鏡写真（倍率２０倍）。 体軸幹細胞の神経分化。３つのＣＦＳ株からの分化の２８日目における神経マーカーのｑＰＣＲ分析（Ｐ：親細胞、Ｎ：神経分化）。それぞれのバー中の各記号は、技術的反復を表示する。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。倍率変化は、未分化Ｈ９ ｈＥＳＣに対して示されている。 体軸幹細胞の神経分化。３つのＣＳ株からの分化の２８日目における神経マーカーのｑＰＣＲ分析（Ｐ：親細胞、Ｎ：神経分化）。それぞれのバー中の各記号は、技術的反復を表示する。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。倍率変化は、未分化Ｈ９ ｈＥＳＣに対して示されている。 体軸幹細胞の神経分化。ＣＦＳ株からの分化の２８日目における、６３倍の倍率での運動ニューロンマーカー（ＭＮＸ１、緑色）、汎神経マーカー（ＴＵＪ１、赤色）及びＤＡＰＩ（青色）の免疫蛍光染色。 体軸幹細胞の神経分化。ＣＳ株からの分化の１４日目における、６３倍の倍率での運動ニューロンマーカー（ＭＮＸ１、緑色）、汎神経マーカー（ＴＵＪ１、赤色）及びＤＡＰＩ（青色）の免疫蛍光染色。 体軸幹細胞の骨格筋分化。分化培地中の骨格筋分化プロセス（＃１～４）及びサイトカインの概略図。 体軸幹細胞の骨格筋分化。ＣＦＳ株からの分化の４０日目における代表的な位相差顕微鏡写真（倍率２０倍）。スケールバーは２０μｍである。 体軸幹細胞の骨格筋分化。３つの独立に誘導されたＣＳ株からの分化の６日目における代表的な位相差顕微鏡写真（倍率２０倍）。スケールバーは２０μｍである。 体軸幹細胞の骨格筋分化。示されるプロセス（＃１）を使用することによるＣＦＳ株からの分化の４０日目におけるステージ特異的筋発生マーカーのｑＰＣＲ分析。それぞれのバー中の各記号は、技術的反復を示す（Ｐ：親細胞、Ｎ：神経分化）。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。倍率変化は、未分化Ｈ９ ｈＥＳＣに対して示されている。 体軸幹細胞の骨格筋分化。示されるプロセス（＃２）を使用することによるＣＦＳ株からの分化の４０日目におけるステージ特異的筋発生マーカーのｑＰＣＲ分析。それぞれのバー中の各記号は、技術的反復を示す（Ｐ：親細胞、Ｎ：神経分化）。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。倍率変化は、未分化Ｈ９ ｈＥＳＣに対して示されている。 体軸幹細胞の骨格筋分化。示されるプロセス（＃３）を使用することによるＣＦＳ株からの分化の４０日目におけるステージ特異的筋発生マーカーのｑＰＣＲ分析。それぞれのバー中の各記号は、技術的反復を示す（Ｐ：親細胞、Ｎ：神経分化）。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。倍率変化は、未分化Ｈ９ ｈＥＳＣに対して示されている。 体軸幹細胞の骨格筋分化。示されるプロセス（＃４）を使用することによるＣＦＳ株からの分化の４０日目におけるステージ特異的筋発生マーカーのｑＰＣＲ分析。それぞれのバー中の各記号は、技術的反復を示す（Ｐ：親細胞、Ｎ：神経分化）。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。倍率変化は、未分化Ｈ９ ｈＥＳＣに対して示されている。 体軸幹細胞の骨格筋分化。示されたプロセスを使用することによるＣＦＳ株からの分化の４０日目における筋マーカーＭｙｏＤ（赤）、Ｍ－カドヘリン（緑）、及びＤＡＰＩ（青）の免疫蛍光染色、スケールバー、倍率６３倍。 体軸幹細胞の骨格筋分化。示されたプロセスを使用することによるＣＦＳ株からの分化の４０日目における筋マーカーミオゲニン（赤）、Ｍ－カドヘリン（緑）、及びＤＡＰＩ（青）の免疫蛍光染色、スケールバー、倍率６３倍。 体軸幹細胞の骨格筋分化。示されたプロセスを使用することによるＣＦＳ株からの分化の４０日目における筋マーカーＭｙＨＣ（赤）及びＤＡＰＩ（青）の免疫蛍光染色、スケールバー、倍率６３倍。 ３Ｄ培養におけるＣＦＳ株の神経筋分化。分化培地中の３Ｄ分化プロセス及びサイトカインの概略図。 ３Ｄ培養におけるＣＦＳ株の神経筋分化。ＣＦＳ株から分化した４０日目オルガノイドの代表的な位相差顕微鏡写真（倍率５倍）。スケールバーは０．７５μｍである。 ３Ｄ培養におけるＣＦＳ株の神経筋分化。４０日目オルガノイドにおける神経マーカー（Ｃ）および筋肉マーカー（Ｄ）のｑＰＣＲ分析。 ３Ｄ培養におけるＣＦＳ株の神経筋分化。（Ｅ～Ｆ）ＣＦＳ株から分化した４０日目オルガノイドにおける運動ニューロンマーカー（ＭＮＸ１、赤色；ＯＬＩＧ２、紫色；ＩＳＬ１、緑色）及びＤＡＰＩ（青色）（Ｅ）並びに筋マーカー（ＭｙＨＣ、赤色；ＡＣＴＡ１、緑色）及びＤＡＰＩ（青色）の全オルガノイド免疫蛍光染色。スケールバー － １００μｍ。 ニワトリ胚へのｅＧＦＰタグ付きＣＦＳ株の注入。アスタリスクで示す、ＨＨ１７期の発育中のニワトリ胚の尾芽胚領域へのｅＧＦＰ＋ＣＦＳ細胞の注入。 ニワトリ胚へのｅＧＦＰタグ付きＣＦＳ株の注入。ＨＨ２３～２４期で停止したニワトリ胚におけるｅＧＦＰ＋ＣＦＳ細胞。 ニワトリ胚へのｅＧＦＰタグ付きＣＦＳ株の注入。ＧＦＰで染色されたＨＨ２３～２４期胚の断面における神経管（白矢印）及び体節（赤矢印）へのＣＦＳ細胞の寄与。 ｈＡｘＳＣでは発現されるが、ヒトＮＭＰ（Ｖｅｒｒｉｅｒら、２０１８ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；表Ｓ１による）又はマウスＮＭＰ（Ｇｏｕｔｉら、Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ． ２０１７）では発現されない遺伝子。図は、３つの供給源に由来するヒト体軸幹細胞（ＡｘＣＣ）の次世代単細胞グローバル転写物（すべての発現遺伝子）配列決定を示す：プライミング：ＣＳ＿Ｈ９：ヒトＥＳ細胞株ＷＡ０９（Ｈ９）に由来するＣＳ状態；プライミング：ＣＳ＿ＨＭＧＵ１：ヒトｉＰＳ細胞株ＨＭＧＵ１に由来するＣＳ状態；プライミング：ＣＳ＿ＨＵＥＳ６：ヒトＥＳ細胞株ＨＵＥＳ６に由来するＣＳ状態；基底：ＣＦＳ＿Ｈ９：ヒトＥＳ細胞株ＷＡ０９（Ｈ９）に由来するＣＳ状態；基底：ＣＦＳ＿ＨＭＧＵ１：ヒトｉＰＳ細胞株ＨＭＧＵ１に由来するＣＳ状態；基底：ＣＦＳ＿ＨＵＥＳ６：ヒトＥＳ細胞株ＨＵＥＳ６に由来するＣＳ状態。Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ（ＵＭＡＰ、一様多様体の近似と投影）プロットは、２８，７００個の個々の細胞間の類似性の程度を示す。 ｈＡｘＳＣでは発現されるが、ヒトＮＭＰ（Ｖｅｒｒｉｅｒら、２０１８ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；表Ｓ１による）又はマウスＮＭＰ（Ｇｏｕｔｉら、Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ． ２０１７）では発現されない遺伝子。図は、３つの供給源に由来するヒト体軸幹細胞（ＡｘＣＣ）の単細胞網羅的転写物次世代（すべての発現遺伝子）配列決定を示す：プライミング（プライミング）：ＣＳ＿Ｈ９：ヒトＥＳ細胞株ＷＡ０９（Ｈ９）に由来するＣＳ状態；プライミング：ＣＳ＿ＨＭＧＵ１：ヒトｉＰＳ細胞株ＨＭＧＵ１に由来するＣＳ状態；プライミング：ＣＳ＿ＨＵＥＳ６：ヒトＥＳ細胞株ＨＵＥＳ６に由来するＣＳ状態；基底：ＣＦＳ＿Ｈ９：ヒトＥＳ細胞株ＷＡ０９（Ｈ９）に由来するＣＳ状態；基底：ＣＦＳ＿ＨＭＧＵ１：ヒトｉＰＳ細胞株ＨＭＧＵ１に由来するＣＳ状態；基底：ＣＦＳ＿ＨＵＥＳ６：ヒトＥＳ細胞株ＨＵＥＳ６に由来するＣＳ状態。遺伝子、すなわちＭＹＣＮ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＩＲＸ３、ＳＯＸ１、ＺＩＣ２、ＳＯＸ１１のパネルであり、これらは、ＡｘＳＣによって顕著に発現される（基底状態のＡｘＳＣ（左のＣＳ）は、主にＭＹＣＮ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＺＩＣ２及びＳＯＸ１１を発現し、プライミング状態のＡｘＳＣ（右のＣＦＳ）は、主にＭＹＣＮ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＩＲＸ３、ＳＯＸ１、ＺＩＣ２及びＳＯＸ１１を発現する）が、ヒト及びヒトＥＳ細胞に由来するヒトＮＭＰ（Ｖｅｒｒｉｅｒら、２０１８ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）又は胚由来のマウスＮＭＰ（Ｇｏｕｔｉら、Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ． ２０１７）では発現されない。
哺乳動物における胚軸伸長の詳細な理解にもかかわらず、体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）は誘導されておらず、この段階はヒト胚においてアクセス不可能である。従って、本発明の根底にある技術的問題は、上記の必要性に適合するように定式化されてもよい。この技術的問題は、本明細書に記載され、特許請求の範囲に規定される手段及び方法によって解決された。
いくつかの態様では、本発明は、ヒト多能性幹細胞からの体軸幹細胞の誘導に関する。特に、本発明は、多能性幹細胞から領域特異的分化複能性幹細胞、すなわち体軸幹細胞を樹立するための手順に関する。好ましい実施形態では、本発明は、ヒト多能性幹細胞、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞（例えば、ＥＳＣ及びｉＰＳＣ）から、運動ニューロン、感覚ニューロン、骨、軟骨、及び骨格筋細胞を含む、軸領域を生じる前駆体の特性を模倣する娘幹細胞を誘導する手順を提供する。
好ましい実施形態では、本発明の体軸幹細胞は多能性ではなく、従って、細胞療法における重要な懸念である奇形腫を生じることができない。さらに好ましくは、本発明の体軸幹細胞は、身体のすべての細胞型を生じるヒト多能性幹細胞の分化と比較して、より高い純度の分化した子孫（例えば、運動ニューロン、感覚ニューロン、骨、軟骨、及び骨格筋細胞を含む軸領域の細胞）を生成することができる。さらに最も好ましくは、本発明の体軸幹細胞は、運動ニューロン、感覚ニューロン、骨、軟骨、及び骨格筋細胞を含む軸領域の細胞型のための分化プロトコルを劇的に短縮及び単純化することができよう。
有利には、本発明の方法は、例えば、無限量の上記のより純粋な子孫型（例えば、運動ニューロン、感覚ニューロン、骨、軟骨、及び骨格筋細胞を含む軸領域の細胞）の生成を可能にし、製造を実現可能にし、より低コストにし、移植による細胞の適用をより安全にする。
定義
本明細書に記載されるように、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／、例えば、２０２０年２月２６日に公開されたＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０２０＿０１において入手可能）が参照される。
本明細書に記載されるように、Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ ＧＯ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ＱｕｉｃｋＧＯ／）；ＧＯバージョン２０２０－０４－０９；２０２０－０４－０６に作成された注釈セットが参照される。
本明細書で使用する場合、用語「Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路」は、「Ｗｎｔシグナル伝達経路」という用語と互換的に使用することができる（例えば、ＧＯ：００１６０５５；例えば、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路は、標的細胞の表面上のｆｒｉｚｚｌｅｄファミリー受容体へのＷｎｔタンパク質の結合によって開始され、細胞状態の変化で終わる一連の分子シグナルである；Ｈｕｅｌｓｋｅｎ Ｊ、Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ Ｗ． Ｎｅｗ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． ２００１年１０月；１１（５）：５４７－５５３）。
本明細書で使用する場合、用語「体軸幹細胞」（又は「ＡｘＳＣ」）は、用語「神経筋骨格幹細胞」と互換的に使用されてもよく、本発明の方法によって生成された細胞、又は本明細書において以下に記載される本発明の方法によって生成された細胞の特徴を有する細胞を指してもよい。
本明細書で使用する場合、用語「多能性幹細胞」（又は「ＰＳＣ」）は、任意のタイプの組織の細胞に分化することができる細胞であって、例えば、胚（例えば、ヒト胚）の破壊以外の手段によって得ることができる（例えば、Ｙｕら、２００７、Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００７年１２月２１日；３１８（５８５８）：１９１７－２０）細胞を指してもよい。
本明細書で使用する場合、用語「胚性幹細胞」（又は「ＥＳＣ」）は、胚（例えば、ヒト胚）を破壊することなく生成されてもよい（例えば、Ｃｈｕｎｇら、Ｃｅｌｌ ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、２００８年２月、第２巻、１１３－１１７頁）胚性多能性幹細胞を指してもよい。
本明細書で使用する場合、用語「人工多能性幹細胞」（又は「ｉＰＳＣ」）は、成体細胞から直接生成することができる多能性幹細胞（例えば、Ｙｕら、２００７）を指してもよく、すなわち、それらは、胚を破壊することなく得ることができ、例えば、それらは体細胞（例えば、線維芽細胞）から得ることができる。
本明細書で使用する場合、用語「神経中胚葉前駆体」（又はＮＭｐ）は、脊髄及び沿軸中胚葉の両方の発生に寄与する胚細胞型（例えば、Ｔｚｏｕａｎａｃｏｕら、２００９）を指してもよい。しかしながら、ＮＭＰは、それら自体を無制限に複製することも、それら自体を異なる幹細胞サブタイプ（例えば、本発明で使用されるＣＦＳ及びＣＳ）に分化させることもできない。さらに、ＮＭＰは一過性細胞であり、これは、ＮＭＰが増殖できないことを意味する（例えば、２０回超の継代）。加えて、ＮＭＰは、本発明の体軸幹細胞と比較して異なる遺伝子のレパートリーを発現する。例えば、ＮＭＰは、本明細書で規定されるＭＹＣＮ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＩＲＸ３、ＳＯＸ１、ＺＩＣ２、ＳＯＸ１１タンパク質を発現していない。
本明細書で使用する場合、用語「人工神経幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」（又はｉＮＳＣ）は、ニューロン、星状細胞及びオリゴデンドロサイト（乏突起膠細胞）に分化することができる自己複製性分化複能性細胞である体細胞由来神経幹細胞を指してもよい。
本明細書で使用する場合、用語「実質的に発現していない」は、対照（例えば出発細胞、例えば未分化細胞、例えば未分化Ｈ９ ｈＥＳＣ）の発現レベルの１０％未満（例えば、７％未満、４％未満、１％未満、０．５％未満、又は０．１％未満）である発現レベルを指してもよい。
本発明の過程において、ＴＸＢＴ／ＢＲＡ及びＳＯＸ２が内因的に誘導される場合のヒトＥＳＣ及びｉＰＳＣの連続継代が、無制限に自己複製する形態学的にコンパクトな幹細胞株の２つの状態を樹立することを可能にすることが見出された。ＷＮＴ／ＦＧＦ下での樹立は、神経中胚葉前駆体に似たＳＯＸ２／ＴＢＸＴ株を生成したが、ＷＮＴ単独では、第１の状態からも誘導することができるＳＯＸ２／ＰＡＸ６株を生じたが、その逆は起こらなかった。ＴＧＦ－βの阻害は、誘導プロセス、クローン継代を改善し、自発的分化を減少させた。重要なことに、この２つの状態は、末梢特性及び運動特性を有する末梢ニューロンニューロン型に、並びに硬節及び皮筋板体節中胚葉（ｄｅｒｍｏｍｙｏｔｏｍｅｓｏｍｉｔｉｃ ｍｅｓｏｄｅｒｍ）に容易に分化するが、重要なことに、それらは機能的に類似しており、運動ニューロンに迅速かつ均一に分化し、奇形腫を形成しなかった。従って、基底状態及びプライミング状態のヒトＡｘＳＣは、多能性細胞から誘導することができ、末梢神経の変性及び損傷の治療の基礎となる潜在能力を有し、また、神経変性、軸発生、及び進化の研究のベンチマークとなる可能性がある。
本発明の過程において、体軸前駆体の既知の基準を満たすヒト幹細胞株を作製するためのプロセスが開発された。移植後及び原腸形成の開始後にヒト胚を操作することが許されないため、この誘導は、例えば、ヒトＥＳＣ及びｉＰＳＣに基づいた。ｈＰＳＣの子孫においてＴＢＸＴ及びＳＯＸ２の内因性発現を誘導する条件は、これらの遺伝子がＮＳＢ、ＣＬＥ及びＣＮＨにおける体軸前駆体を特徴付ける最も初期のマーカーのいくつかであるため、最初に規定された。驚くべきことに、連続継代が、多能性幹細胞及び神経幹細胞（ＮＳＣ）の自己複製に重要な転写因子であるＳＯＸ２の発現を維持することが見出されたため、細胞株を作製するために、連続継代を使用した。Ｗｎｔ／β－カテニン及びＦＧＦ誘導剤並びにＴＧＦ－β阻害剤が研究されたが、これは、これらの経路が、ＴＢＸＴを上方制御した細胞において活性化されたためである。細胞株の樹立は、例えば、３～５継代以内に明らかであり、重要な発生遺伝子のレベルは、多数の継代にわたって安定なままであった。さらに、ＴＧＦ－β阻害剤の使用は、細胞株の自発的分化を最小限にし、本発明者らが単細胞クローンを作製することを可能にした。注目すべきことに、ＰＳＣのレベルでＳＯＸ２を維持したが、ＦＧＦ２の存在下でＰＡＸ６及びＴＢＸＴの発現について相互排他的であったこれらの細胞株によって、２つの発生状態が捕捉された。本発明の過程において、新たに樹立された体軸細胞株を、インビトロで末梢ニューロン並びに中胚葉硬節及び皮筋板の子孫に分化させることが可能であった。それらの奇形腫形成能力を試験するために、すべての細胞株を免疫不全マウスに注射したが、そのマウスは、そのような腫瘍の徴候を示さなかった。ＥＳＣ及びＮＳＣ等の幹細胞株の以前の誘導の影響によれば、無制限に複製する幹細胞株の形態での培養におけるヒト体軸前駆体の提示は、新規の基礎的及び医学的な研究の進行の火付け役となりうることが企図される。これは、例えば、体軸発生、神経筋障害及び進化の調節、並びに薬物化合物及び細胞療法の開発による末梢神経系の疾患及び外傷の治療における新規適用を含んでもよい。
本発明の体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）は、神経中胚葉前駆体（ＮＭＰ）ではない。従って、ＮＭＰは一過性細胞であることが先行技術から公知であり、これは、それらを増殖させることができないことを意味するが、本発明の体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）は一過性のものではなく、増殖させることができる（例えば、２０回を超える継代）。
本発明を特徴付ける実施形態は、本明細書に記載され、図面に示され、実施例で例証され、特許請求の範囲に反映される。
なお、本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈と明らかに矛盾する場合でないかぎり、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「ａ ｒｅａｇｅｎｔ（試薬）」への言及は、そのような異なる試薬の１つ以上を含み、「ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ（方法）」への言及は、本明細書に記載される方法を改変又は置換することができる当業者に公知の同等の工程及び方法への言及を含む。
特段の記載がない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、その一連の要素のあらゆる要素を指すと理解されるべきである。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、又は確認することができるであろう。このような等価物は、本発明に包含されることが意図される。
本明細書で使用する場合、用語「及び／又は」は、「及び」、「又は」及び「その用語によって接続される要素のすべて又は任意の他の組合せ」の意味を含む。
本明細書で使用される用語「約」又は「およそ」は、所与の値又は範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲全体を通して、文脈と矛盾する場合を除いて、語句「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」、並びに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」等の変形は、記載された整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群の包含を含意し、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群の排除を含意しないと理解されるであろう。本明細書で使用する場合、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」は、用語「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」若しくは「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」で置き換えることができ、又は場合によっては、本明細書で使用する場合、用語「ｈａｖｉｎｇ（有する）」で置き換えることができる。
本明細書で使用する場合、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（からなる）」は、請求項の要素に特定されていない任意の要素、工程、又は成分を除外する。本明細書で使用する場合、「本質的に…からなる」は、請求項の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を排除しない。
本明細書の各場合において、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（本質的に…からなる）」及び「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（からなる）」はいずれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。
別の実施形態では、本発明は、体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）（若しくは神経筋骨格幹細胞）を生成（又は誘導）する方法であって、多能性幹細胞、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞（例えば、ヒトＰＳＣ及び／又はＥＳＣ及び／又はｉＰＳＣ、例えば、ヒトＥＳＣ株Ｈ９（ＷＡ０９）又はヒトｉＰＳＣ株ＨＭＧＵ＃１）を提供する工程であって、好ましくは上記誘導／生成の前に、上記多能性細胞は、適切な多能性細胞培地（例えば、ｍＴＥＳＲ１又はｉＰＳ－Ｂｒｅｗ等）中で維持され、さらに好ましくは上記適切な多能性細胞培地は、上記誘導／生成のために（すなわち上記誘導／生成の前に）ビタミンＡを含む又は含まないＢ２７サプリメントを補充したＲＰＭＩ１６４０培地で置き換えられる工程と、上記多能性幹細胞、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞においてＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路を活性化する工程であって（例えば、ＧＯ：００１６０５５；例えば、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路は、標的細胞の表面上のｆｒｉｚｚｌｅｄファミリー受容体へのＷｎｔタンパク質の結合によって開始され、細胞状態の変化で終わる一連の分子シグナルである（Ｈｕｅｌｓｋｅｎ Ｊ、Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ Ｗ．、Ｎｅｗ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． ２００１年１０月；１１（５）：５４７－５５３））、好ましくは上記活性化は、ＧＳＫ３ｂタンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４９８４１）の阻害剤を使用することによって行われ、さらに好ましくは上記阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、さらに最も好ましくは上記ＣＨＩＲ９９０２１阻害剤は約５μＭ～約１０μＭの濃度で使用され、さらに最も好ましくは、上記ＣＨＩＲ９９０２１阻害剤は約２４時間使用される工程と、上記工程（ｂ）から誘導される細胞を、継代の間のその細胞におけるＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の連続活性化の条件下で継代する工程であって、好ましくは、上記継代は少なくとも約３～９回（例えば、３回、４回、５回、６回、７回、８回、又は９回）行われ、さらに好ましくは、上記継代は連続継代であり、さらに最も好ましくは、上記継代は、工程（ｂ）から誘導される細胞を、新鮮な無血清培地（例えば、ビタミンＡを含む又は含まないＢ２７サプリメントを補充したＲＰＭＩ１６４０培地）中により低い密度で再播種すること（例えば、再播種は、単細胞又は細胞の塊へのコロニーの解離及びそれらのプレーティングである）を含み、好ましくは、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の上記連続活性化は、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の阻害剤を使用することによって行われ、さらに好ましくは、上記阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、さらに最も好ましくは、上記ＣＨＩＲ９９０２１阻害剤は、少なくとも約５μＭ（例えば、約７．５μＭ）の濃度で使用され、工程（ｃ）から誘導される細胞は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１）を内因的に発現している工程とを含み、任意選択で、
（ｄ）工程（ｃ）からのＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の上記連続活性化は、線維芽細胞増殖因子２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０９０３８）及び／又はＴＧＦ－β阻害剤（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１３７）の存在下で行われ、好ましくは、
（ｄ１）工程（ｃ）からのＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の上記連続活性化は、約５μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１阻害剤を用いて、線維芽細胞増殖因子２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０９０３８）及びＴＧＦ－β（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１３７）阻害剤の存在下で行われ、さらに好ましくは、上記ＴＧＦ－β阻害剤はＳＢ－４３１５４２であり、さらに最も好好ましくは、上記ＳＢ－４３１５４２阻害剤は約１０μＭの濃度で使用され、さらにさらに最も好ましくは、上記線維芽細胞増殖因子２は約２０～約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用され、工程（ｄ１）から誘導される細胞は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１）、Ｔ－ｂｏｘ転写因子Ｔ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８）及びホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ２Ｗ２）を内因的に発現しているが、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７）を内因的に発現しておらず、任意選択で、ホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６２６）をさらに内因的に発現しているか、又は
（ｄ２）工程（ｃ）からのＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の上記連続活性化は、約５μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１阻害剤を用いて、好ましくはＴＧＦ－β（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１３７）阻害剤の存在下で行われ、さらに好ましくは上記ＴＧＦ－β阻害剤はＳＢ－４３１５４２であり、さらに最も好ましくは上記ＳＢ－４３１５４２阻害剤は約１０μＭの濃度で使用され、工程（ｄ２）から誘導される細胞は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１）及びペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７）を内因的に発現しているが、Ｔ－ｂｏｘ転写因子Ｔ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８）、ホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ２Ｗ２）及びホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６２６）を内因的に発現していないか、又は
（ｄ３）工程（ｃ）からのＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の上記連続活性化は、約７．５μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１阻害剤を用いて、好ましくはＴＧＦ－β（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１３７）阻害剤の存在下で行われ、さらに好ましくは上記ＴＧＦ－β阻害剤はＳＢ－４３１５４２であり、さらに最も好ましくは、上記ＳＢ－４３１５４２阻害剤は約１０μＭの濃度で使用され、工程（ｄ３）から誘導される細胞は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１）、Ｔ－ｂｏｘ転写因子Ｔ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８）、ホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ２Ｗ２）及びペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７）を内因的に発現しており、任意選択で、ホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６２６）をさらに内因的に発現している
方法を提供する。
例示的なＲＰＭＩ－１６４０培地組成物
（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ－ｓｃｉｅｎｃｅ／ｃｅｌｌ－ｃｕｌｔｕｒｅ／ｌｅａｒｎｉｎｇ－ｃｅｎｔｅｒ／ｍｅｄｉａ－ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ／ｒｐｍｉ－１６４０．ｈｔｍｌに記載されるとおり）
Figure 2023528309000002
Figure 2023528309000003
例示的なＢ２７組成物及び調製プロトコル（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｈａｎｎａｌａｂｗｅｂ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／で入手可能なＷｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ワイツマン科学研究所）のＨａｎｎａ ＬａｂＰｒｏｔｏｃｏｌによって記載されるとおり）
成分のうちのいくつかについて将来の再使用のためのストックを作製する。
３）ヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ（シグマ）又はＰＲＯＳＰＥＣ ＢＩＯ（プロスペック・バイオ） ＣＹＴ）（８００ｍｌのＢ２７に対して１２５ｍｇが必要である）。２５０ｍｇのインスリンを１０ｍｌの０．００５Ｍ ＨＣｌに一晩又はさらに２日間４℃で溶解することによって２５ｍｇ／ｍｌのストック溶液を調製する。－８０℃で１ｍｌのアリコートに保存する（８００ｍｌのＢ２７あたり５個のバイアルを使用する）。
６）Ｔ３（Ｓｉｇｍａ）（８００ｍｌのＢ２７に対して８０μｇが必要である）。１００ｍｇのＴ３を１ｍｌのＤＭＳＯに溶解し、次いで４９ｍｌのエタノールに溶解することによって、２ｍｇ／ｍｌのストック溶液を調製する。－８０℃で４０μｌの個々のアリコートに保存する（８００ｍｌのＢ２７サプリメントあたり１バイアルを使用する）。
１１）亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、１ｍｇ）（８００ｍｌのＢ２７に対して５００μｇが必要である）。上記瓶を１ｍｌのｄＨ２Ｏに溶解することによって１ｍｇ／ｍｌのストックを調製する。８００ｍｌのＢ２７サプリメントあたり５００μｌを添加する。
１２）コルチコステロン（Ｓｉｇｍａ、１ｇ）（８００ｍｌのＢ２７に対して８００μｇが必要である）。０．１ｇのコルチコステロンを５０ｍｌのエタノールに溶解することによって２ｍｇ／ｍｌのストックを調製する。４００μｌの個々のアリコートを作製する（８００ｍｌのＢ２７あたり１バイアルを使用する）。－８０℃で保存する。
１３）リノール酸（Ｓｉｇｍａ、１００ＭＧ）（８００ｍｌのＢ２７に対して４０ｍｇが必要である）。０．９ｍｌのエタノールを添加することによって１００ｍｇ／ｍｌストックを調製する。４００μｌの個々のアリコートを作製する（８００ｍｌのＢ２７あたり１バイアルを使用する）。－８０℃で保存する。
１４）リノレン酸（Ｓｉｇｍａ、５００ＭＧ）（８００ｍｌのＢ２７に対して４０ｍｇが必要である）。４．５ｍｌのエタノールを添加することによって１００ｍｇ／ｍｌストックを調製する。４００μｌの個々のアリコートを作製する（８００ｍｌのＢ２７あたり１バイアルを使用する）。－８０℃で保存する。
１５）プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ、１ｇ）（８００ｍｌのＢ２７ストックあたり０．２５２ｍｇが必要である）。１０ｍｇのプロゲステロンを１０ｍｌのエタノールに溶解することによって１ｍｇ／ｍｌのストックを調製する。－８０℃で保存する。２５２μｌの個々のアリコートを作製する（８００ｍｌのＢ２７あたり１バイアルを使用する）。
１６）酢酸レチノール（Ｓｉｇｍａ、１ｇ）（８００ｍｌのＢ２７ストックあたり４ｍｇが必要である）。上記瓶を５０ｍｌのエタノールに溶解することによって２０ｍｇ／ｍｌストックを調製する。２００μｌの個々のアリコートを作製する（８００ｍｌのＢ２７あたり１バイアルを使用する）。－８０℃で保存する。
１７）ＤＬ－α－トコフェロール（ビタミンＥ）（Ｓｉｇｍａ、５Ｇ）（８００ｍｌのＢ２７ストックあたり４０ｍｇが必要である）。上記瓶を４５ｍｌのエタノールに溶解することによって１００ｍｇ／ｍｌのストックを調製する。４００μｌの個々のアリコートを作製する（８００ｍｌのＢ２７あたり１バイアルを使用する）。－８０℃で保存する。
１８）ＤＬ－α－トコフェロール酢酸エステル（Ｓｉｇｍａ、１０Ｇ）（８００ｍｌのＢ２７あたり４０ｍｇが必要である）。上記瓶を９０ｍｌのエタノールに溶解することによって１００ｍｇ／ｍｌのストックを調製する。４００μｌの個々のアリコートを作製する（８００ｍｌのＢ２７あたり１バイアルを使用する）。－８０℃で保存する。
１９）オレイン酸（Ｓｉｇｍａ、１Ｇ）（８００ｍｌのＢ２７ストックあたり４０ｍｇが必要である）。９ｍｌのエタノールを添加することによって１００ｍｇ／ｍｌストックを調製する。４００μｌの個々のアリコートを作製する（８００ｍｌのＢ２７あたり１バイアルを使用する）。－８０℃で保存する。
２０）ピペコリン酸（Ｓｉｇｍａ、１００ＭＧ）（８００ｍｌのＢ２７ストックあたり４０ｍｇが必要である）。２ｍｌの水を加えることによって５０ｍｇ／ｍｌストックを調製する。８００μｌの個々のアリコートを作製する（８００ｍｌのＢ２７あたり１バイアルを使用する）。－８０℃で保存する。
合計８００ｍｌのＢ２７サプリメントについて、ベースとしての５００ｍｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン））中に以下の２２種の成分（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（シグマ・アルドリッチ）製のもの）を集める：
１）空の滅菌した１Ｌガラス瓶に、合計１００ｇのＢＳＡ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ ＩｇＧ ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｐｏｏｒ粉末（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び５００ｍｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を挿入する（残りの３００ｍｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌを、以下に示す成分のいくつかを溶解するために使用する）。
２）ビオチン（１００ｍｇの１単位、例えばＳｉｇｍａ製）を１０ｍｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地に溶解し、添加して混合する。
３）カタラーゼ（１００ｍｇの１単位、例えばＳｉｇｍａ）を１０ｍｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地に溶解し、添加して混合する。
４）すべての４単位のスーパーオキシドジスムターゼを１０ｍｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地に溶解し、添加して混合する。
５）４０ｍｇのグルタチオンを秤量し、直接添加して混合する。
６）すべての２単位のホロトランスフェリニンを１０ｍｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地に溶解し、添加して混合する。
７）８０ｍｇのＬ－カルニチンを秤量し、直接添加して混合する。
８）６００ｍｇのＤ－ガラクトースを秤量し、直接添加して混合する。
９）６４４ｍｇのプトレシンを秤量し、直接添加して混合する。
１０）４０μＬのエタノールアミンを直接添加して混合する。
１１）１バイアルの（エタノールに溶解し、－８０で凍結した）プロゲステロンストックを直接添加して混合する。プロゲステロンストック調製：１０ｍｇのプロゲステロンを１０ｍｌのエタノールに溶解することによって１ｍｇ／ｍｌのストックを調製する。－８０℃で保存する。２５２μｌの個々のアリコートを作製する（８００ｍｌのＢ２７あたり１バイアルを使用する）。
１２）５バイアルのインスリンストック（溶解し、－８０で凍結した）を直接添加して混合する。
１３）１バイアルのＴ３（エタノールに溶解し、－８０で凍結した）を直接添加して混合する。
１４）１バイアルのピペコリン酸ストック（水に溶解し、－８０で凍結した）を直接添加して混合する。
１５）１バイアルのオレイン酸ストック（エタノールに溶解し、－８０で凍結した）を直接添加して混合する。
１６）１バイアルのリノール酸ストック（エタノールに溶解し、－８０で凍結した）を直接添加して混合する。
１７）１バイアルのリノレン酸ストック（エタノールに溶解し、－８０で凍結した）を直接添加して混合する。
１８）１バイアルの酢酸レチノールストック（エタノールに溶解し、－８０で凍結した）を直接添加して混合する。ビタミンＡを含まないＢ２７サプリメントの調製のために、酢酸レチノールを組成物から除外する。
１９）１バイアルのＤＬ－α－トコフェロール（ビタミンＥ）ストック（エタノールに溶解し、－８０で凍結した）を直接添加して混合する。
２０）１バイアルのＤＬ－α－トコフェロール酢酸エステルストック（エタノールに溶解し、－８０で凍結した）を直接添加して混合する。
２１）１バイアルのコルチコステロンストック（エタノールに溶解し、－８０で凍結した）を直接添加して混合する。
２２）１バイアルの亜セレン酸ナトリウムストック（エタノールに溶解し、－８０で凍結）を直接添加して混合する。
２３）３００ｍｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌの残っているもの（残り）を加える。瓶を穏やかに混合する（ピペッティング又は激しい振盪の必要はない）。１０回穏やかに揺らす。最適な溶解のために瓶を４℃で１２時間（一晩）放置する（いかなる振盪もなく、光から保護されたままにする）。翌日、５ｍｌアリコートを作製し、光から保護された状態で－２０で保存する。（－２０で１年間安定）。凍結及び解凍の繰り返しを回避する。混合物は、濾過するには粘性が高すぎるが、後で培地に添加すると濾過することができる。マウスＰＳＣについては、５００ｍｌの培地瓶あたり５ｍｌ（１アリコート）のＢ２７を使用することができる。ヒトＰＳＣについては、５００ｍｌの培地瓶あたり１０ｍｌ（２アリコート）のＢ２７を使用することができる。
さらなる実施形態では、本発明は、工程（ｃ）からのＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の連続活性化が、線維芽細胞増殖因子２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０９０３８）及び／又はＴＧＦ－β（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１３７）阻害剤の存在下で行われる本発明の方法に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、工程（ｃ）からのＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の連続活性化が、約５μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１阻害剤を用いて、線維芽細胞増殖因子２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０９０３８）及びＴＧＦ－β（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１３７）阻害剤の存在下で行われ、さらに好ましくは、上記ＴＧＦ－β阻害剤はＳＢ－４３１５４２であり、さらに最も好ましくは上記ＳＢ－４３１５４２阻害剤は約１０μＭの濃度で使用され、さらにさらに最も好ましくは上記線維芽細胞増殖因子２は約２０～約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用され、上記工程（ｄ１）から誘導される細胞は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１）、Ｔ－ｂｏｘ転写因子Ｔ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８）及びホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ２Ｗ２）を内因的に発現しているが、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７）を内因的に発現しておらず、任意選択で、ホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６２６）をさらに内因的に発現している本発明の方法に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、工程（ｃ）からのＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の連続活性化は、約５μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１阻害剤を用いて、好ましくはＴＧＦ－β（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１３７）阻害剤の存在下で行われ、さらに好ましくは上記ＴＧＦ－β阻害剤はＳＢ－４３１５４２であり、さらに最も好ましくは上記ＳＢ－４３１５４２阻害剤は約１０μＭの濃度で使用され、工程（ｄ２）から誘導される細胞は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１）及びペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７）を内因的に発現しているが、Ｔ－ｂｏｘ転写因子Ｔ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８）、ホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ２Ｗ２）及びホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６２６）を内因的に発現していない本発明の方法に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、工程（ｃ）からのＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の連続活性化は、約７．５μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１阻害剤を用いて、好ましくはＴＧＦ－β（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１３７）阻害剤の存在下で行われ、さらに好ましくは、上記ＴＧＦ－β阻害剤はＳＢ－４３１５４２であり、さらに最も好ましくは上記ＳＢ－４３１５４２阻害剤は約１０μＭの濃度で使用され、工程（ｄ３）から誘導される細胞は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１）、Ｔ－ｂｏｘ転写因子Ｔ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８）、ホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ２Ｗ２）及びペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７）を内因的に発現しており、任意選択で、ホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６２６）をさらに内因的に発現している本発明の方法に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、工程（ｄ）を含む本発明の方法に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、工程（ｄ）を含み、さらに工程（ｄ１）、（ｄ２）又は（ｄ３）を含む本発明の方法に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、工程（ｃ）及び／又は工程（ｄ）から誘導される細胞を継代することをさらに含む本発明の方法に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の体軸幹細胞が、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１）を発現する；ＯＣＴ４転写因子（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０１８６０）を実質的に発現しない；ホメオボックスタンパク質ＮＡＮＯＧ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ９Ｓ０）を実質的に発現しない；多能性ではない、領域特異的分化複能性幹細胞である；多能性幹細胞、胚性幹細胞若しくは人工多能性幹細胞（例えば、ヒトＰＳＣ及び／若しくはＥＳＣ及び／若しくはｉＰＳＣ、例えば、ヒトＥＳＣ株Ｈ９（ＷＡ０９）若しくはヒトｉＰＳＣ株ＨＭＧＵ＃１）から得ることができる；胚のすべての組織の細胞型に分化することができるわけではない；胚発生中に中心体軸の領域から出現する細胞型（例えば、硬節、皮筋板及び末梢ニューロン）にのみ分化することができる；奇形種（テラトーマ）を形成することができない；軸領域（例えば、運動ニューロン、末梢ニューロン、末梢神経系ニューロン、感覚ニューロン、骨、軟骨、腱、靱帯及び／若しくは骨格筋の細胞）を生じる前駆体の特性を模倣することができる；一過性細胞ではない；運動ニューロン、末梢ニューロン、筋肉、軟骨若しくは骨の前駆体に分化することができる；無制限に複製する幹細胞である；クローンとして増殖することができる；神経中胚葉前駆体（ＮＭｐ）ではなく、並びに／又は人工神経幹細胞（ｉＮＳＣ）ではない、の特徴のうちの１つ以上を有する本発明の方法に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の体軸幹細胞が、例えば、（ａ）基底体軸幹細胞（例えば、無制限に複製する基底体軸幹細胞は、本明細書では「ＣＦＳ」とも呼ばれてもよい）に無制限に複製及び分化することができ、この基底体軸幹細胞は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１）、Ｔ－ｂｏｘ転写因子Ｔ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８）、ホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６２６）、及びホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ２Ｗ２）を発現し、並びに／又は（ｂ）プライミング状態の体軸幹細胞（例えば、無制限に複製するプライミング状態の体軸幹細胞は、本明細書では「ＣＳ」とも呼ばれてもよい）に無制限に複製及び分化することができ、このプライミング状態の体軸幹細胞は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１）及びペアードボックスタンパク質ＰＡＸ－６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７）を発現する本発明の方法に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、体軸幹細胞がヒト体軸幹細胞である本発明の方法に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の方法によって生成される体軸幹細胞に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）（例えば、単離されたＡｘＳＣ）であって、この体軸幹細胞は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１）を発現する；ＯＣＴ４転写因子（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０１８６０）を実質的に発現しない；ホメオボックスタンパク質ＮＡＮＯＧ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ９Ｓ０）を実質的に発現しない；上記ＡｘＳＣは多能性ではなく、領域特異的分化複能性幹細胞である；多能性幹細胞、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞（例えば、ＥＳＣ及び／又はｉＰＳＣ、例えば、ヒトＥＳＣ株Ｈ９（ＷＡ０９）又はヒトｉＰＳＣ株ＨＭＧＵ＃１）から得ることができる；胚のすべての組織の細胞型に分化することができるわけではない；胚発生中に中心体軸の領域から出現する細胞型（例えば、硬節、皮筋板及び末梢ニューロン）にのみ分化することができる；奇形種を形成することができない；軸領域（例えば、運動ニューロン、末梢ニューロン、末梢神経系ニューロン、感覚ニューロン、骨、軟骨、腱、靱帯及び／又は骨格筋の細胞）を生じる前駆体の特性を模倣することができる；一過性細胞ではない；運動ニューロン、末梢ニューロン、筋肉、軟骨又は骨の前駆体に分化することができる；無制限に複製する幹細胞である；クローンとして増殖することができる；神経中胚葉前駆体（ＮＭｐ）ではない；人工神経幹細胞（ｉＮＳＣ）ではない、の特徴のうちの１つ以上を有する体軸幹細胞に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、上記ＡｘＳＣが、自身を無制限に複製することができ、例えば、（ａ）基底体軸幹細胞（例えば、無制限に複製する基底状態体軸幹細胞は、本明細書では「ＣＦＳ」とも呼ばれてもよい）に分化することができ、この基底体軸幹細胞は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１）；Ｔ－ｂｏｘ転写因子Ｔ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８）；ホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６２６）；及びホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ２Ｗ２）を発現し、並びに／又は（ｂ）プライミング状態体軸幹細胞（例えば、無制限に複製するプライミング状態体軸幹細胞は、本明細書では「ＣＳ」とも呼ばれてもよい）に分化することができ、このプライミングされた体軸幹細胞は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１）及びペアードボックスタンパク質ＰＡＸ－６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７）を発現する本発明の体軸幹細胞に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、上記ＡｘＳＣが、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１）、Ｔ－ｂｏｘ転写因子Ｔ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８）及びホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ２Ｗ２）を内因的に発現しており、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７）を内因的に発現しておらず、任意選択で、ホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６２６）をさらに内因的に発現している本発明の体軸幹細胞に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、上記ＡｘＳＣが、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１）及びペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７）を内因的に発現しており、Ｔ－ｂｏｘ転写因子Ｔ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８）、ホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ２Ｗ２）及びホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６２６）を内因的に発現していない本発明の体軸幹細胞に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、上記ＡｘＳＣが、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１）、Ｔ－ｂｏｘ転写因子Ｔ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８）、ホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｇ９Ｈ２Ｗ２）及びペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７）を内因的に発現しており、任意選択で、ホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｃ９９６２６）をさらに内因的に発現している本発明の体軸幹細胞に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、上記ＡｘＳＣが、ヒト体軸幹細胞（例えば、単離されたもの）である本発明の体軸幹細胞に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の体軸幹細胞を含む組成物、調製物及び／又はキットに関する。
さらなる実施形態では、本発明の組成物、調製物及び／又はキットは、医薬及び／又は診断用の組成物、調製物若しくはキットである。
さらなる実施形態では、本発明の体軸幹細胞、組成物、調製物及び／又はキットは、医薬として使用される。
さらなる実施形態では、本発明の体軸幹細胞、組成物、調製物及び／又はキットは、神経変性疾患の治療、低減、予防及び／又は診断の方法；骨及び／若しくは軟骨の障害の治療、低減、予防並びに／又は診断の方法；筋障害の治療、低減、予防及び／又は診断の方法；細胞、組織、器官及び／又は身体の再生治療の方法；疾患（例えば、末梢神経系の疾患若しくは体軸幹細胞に関連する疾患、例えば筋肉関連、運動ニューロン関連、末梢ニューロン関連、感覚ニューロン関連、軟骨関連、腱関連（例えば、変性）疾患）に対する活性について、及び／又は神経毒性スクリーニングについて、候補化合物をスクリーニングする方法；体軸幹細胞に関連する疾患、例えば筋肉関連、運動ニューロン関連、末梢ニューロン関連、感覚ニューロン関連、軟骨関連、腱関連（例えば、変性）疾患の治療、低減、予防及び／又は診断の方法、インビトロ、エキソビボ又はインビボでの方法である上述の方法のいずれか、のうちの１つ以上において使用される。
さらなる実施形態では、本発明は、例えば必要とする試料及び／又は対象の状態を改善する方法であって、好ましくは当該方法は、神経変性疾患の治療、低減、予防及び／又は診断の方法；骨及び／若しくは軟骨の障害の治療、低減、予防並びに／又は診断の方法；筋障害の治療、低減、予防及び／又は診断の方法；細胞、組織、器官及び／又は身体の再生治療の方法；疾患（例えば、末梢神経系の疾患）に対する活性について、及び／又は神経毒性スクリーニングについて、候補化合物をスクリーニングする方法のうちの１つ以上であり、当該方法は、本発明の体軸幹細胞、組成物、調製物及び／又はキットを上記試料及び／又は対象に提供する工程と、例えば、治療有効量の上記体軸幹細胞、組成物、調製物及び／又はキットを上記試料及び／又は対象に投与する工程とを含む方法に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、インビトロ、エキソビボ又はインビボでの方法である本発明の方法に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、例えば、神経変性疾患の治療、低減、予防及び／又は診断；骨及び／若しくは軟骨の障害の治療、低減、予防並びに／又は診断；筋障害の治療、低減、予防及び／又は診断；細胞、組織、器官及び／又は身体の再生治療；疾患（例えば、末梢神経系の疾患）に対する活性について、及び／又は神経毒性スクリーニングについて候補化合物をスクリーニングすること；インビトロ、エキソビボ又はインビボでの使用である上述の使用のいずれか、のうちの１つ以上のための本発明の体軸幹細胞、組成物、調製物及び／又はキットの使用に関する。
さらなる実施形態では、インビトロ、エキソビボ又はインビボでの使用又はこれらの組み合わせである本発明に係る使用に関する。
好ましい実施形態では、本発明の方法は、以下の出発細胞（すなわち、本発明の方法で提供される細胞）を用いて行われ、出発細胞は多能性細胞であり、それらは、胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のいずれかであることができ、好ましくは、出発細胞はヒト起源の多能性細胞であり（しかしながら、本発明は、霊長類細胞又はマウス等の非ヒト起源の多能性細胞も含む）、多能性細胞は文献に記載されており、例えば、古典的な多能性因子ＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ４）、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２の共発現、並びに細胞培養において無制限に自己複製する能力、並びに内胚葉、中胚葉、外胚葉及び胚外組織型に分化する能力を特徴とする。
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、最終細胞（体軸幹細胞）を得るために出発細胞に適用される以下の誘導工程を含み、第１及び第２の工程は、本明細書において以下に記載される。
分化複能性体軸幹細胞の誘導における第１の工程は、多能性細胞における初期原始線条様状態の誘導である（この工程は短く、例えば２４時間であり、細胞が原始線条前駆体に分化するインパルスを与えられることを確実にし、好ましくは、この工程は、多能性遺伝子ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ及び／又はＳＯＸ２を完全に下方制御するほど長くなく、さらに好ましくは、この工程は高密度で、例えば２Ｄ単層で増殖する細胞に対して、本発明の規定された無血清培地中で行われる。
第２の工程は、分化複能性体軸幹細胞の実際の生成である。この工程の理論的根拠は、上記工程で生成された原始様細胞において、ａ）自己複製する能力及びｂ）哺乳動物における後後頭軸伸長に寄与する分化複能性前駆体の特徴を維持することである。この工程は、例えば、特定のリガンドを含む規定の無血清培地中に、はるかに低い密度で誘導細胞を再播種することによって行われる。候補幹細胞株の生成の成功は、同じ（対応する）培地中でさらに増殖することができる小さな密なコロニーの形成において視覚的に明らかになることが可能である。この体軸幹細胞株は、例えば、最大９継代（例えば、３～９継代）の経験的樹立段階を受ける。この時間の間、マーカー遺伝子発現を一貫性について監視することができる。樹立期後、細胞は「誘導された」と考えられ、終末体細胞型、ａ）脊髄運動ニューロン及びｂ）硬節誘導体（軟骨細胞及び骨細胞）、へのさらなる分化のために使用することができる。これらの細胞は、皮筋板誘導体 － 骨格筋細胞及び脂肪細胞にも変換することができる。
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、以下の培地組成物及び／又はリガンドを使用する：最初の誘導工程では、細胞は、例えば、ビタミンＡを含む又は含まないＢ２７サプリメントを補充したＲＰＭＩ１６４０から構成される適切な培地に移すことができ、１０μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１を２４時間添加することができる。第２の工程では、誘導された細胞を、例えば、ビタミンＡを含む又は含まないＢ２７サプリメントを補充したＲＰＭＩ１６４０から構成される適切な培地に再播種することができ、以下のリガンドを添加することができる：細胞型Ａ（「基底」とも呼ばれてもよい）を生成するために、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２及び１０μＭのＴＧＦ経路阻害剤ＳＢ４３１５４２と共に５μＭのＣＨＩＲ９９０２１；又は、細胞型Ｂ（「プライミング（予備刺激）された」とも呼ばれてもよい）を生成するために、１０μＭのＳＢ４３１５４２を含む若しくは含まない５μＭのＣＨＩＲ９９０２１；又は、細胞型Ｃ（「中間」とも呼ばれてもよい）を生成するために、１０μＭのＳＢ４３１５４２を含む若しくは含まない７．５μＭのＣＨＩＲ９９０２１。好ましくは、これらの培地組成物は、樹立期（例えば、９継代）及びそれ以降を通して維持することができる。
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法及び体軸細胞は、最初の２４時間誘導期後の細胞は、初期原始線条のマーカー、例えばブラキウリ（ＴＢＸＴ）、ＭＩＸＬ１、ＧＳＣ、ＣＤＸ１、ＣＤＸ２、ＥＯＭＥＳ、及び／又はＥＶＸ１のすべて又はいくつかの細胞における誘導された発現によって特徴付けられる、という特徴のうちの１つ以上を有する。好ましくは、同時に、これらの細胞はＰａｘ６（神経外胚葉）又はＳｏｘ１７（内胚葉）を発現しない。さらに好ましくは、同時に、多能性遺伝子ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ２は、発現の有意な低下を示さない。さらに最も好ましくは、本発明の分化複能性体軸幹細胞は、継代９以降において、無制限の自己複製能力；上皮様形態を有する、小～中程度に密に形成されたコロニーとして増殖することができる；非催奇形性（すなわち、奇形腫を形成しない）、の特徴のうちの１つ以上を有する。
さらに好ましい実施形態では、Ａ型の本発明の体軸幹細胞は、ＴＢＸＴ（ブラキウリ）及びＳＯＸ２を共発現し、好ましくはＭＩＸＬ１も発現し、さらに好ましくはＣＤＸ２を発現し、さらに最も好ましくは、ＨＯＸクラスター遺伝子のほとんど（例えば、Ａ１～Ｄ１３）を発現してもよく、さらにさらに最も好ましくは、Ｐａｘ６又はＰＯＵ５Ｆ１を発現せず、ＮＡＮＯＧ発現は大きく下方制御されてもよい。
さらに好ましい実施形態では、Ｂ型の本発明の体軸幹細胞は、ＳＯＸ２及びＨＯＸクラスター遺伝子のほとんど（例えば、Ａ１～Ｄ９／Ａ１０）を発現し、好ましくはＰａｘ６を高レベルで発現し、さらに好ましくは、ＴＢＸＴ（ブラキウリ）、ＭＩＸＬ１及びＣＤＸ２を発現しない。
さらに好ましい実施形態では、Ｃ型の本発明の体軸幹細胞は、ＨＯＸクラスター遺伝子のほとんど（例えば、Ａ１～Ｄ９／Ａ１０）を発現し、好ましくはブラキウリ（ＴＢＸＴ）及びＳＯＸ２を共発現し、さらに好ましくは、中程度のレベルでＰａｘ６を発現する。
さらに好ましい実施形態では、本発明の３つの体軸細胞型（Ａ、Ｂ及びＣ）すべては、脊髄運動ニューロン、骨細胞及び軟骨細胞にさらに分化させることが可能である。このニューロン分化は均一であり、多能性細胞から開始する確立されたプロトコル（例えば、変換は４８～７２時間で観察することができる）と比較して有意に短い時間しか必要としない。
さらに好ましい実施形態では、本発明の体軸幹細胞は、神経中胚葉前駆体（ＮＭｐ）ではない。
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法及び使用は、神経中胚葉前駆体（ＮＭｐ）を生成しない。
さらに好ましい実施形態では、本発明の体軸幹細胞、組成物、調製物又はキットは、本発明の方法において使用される（例えば、当該方法は、インビボ、インビトロ又はエキソビボ方法である）。
さらに好ましい実施形態では、本発明の体軸幹細胞、組成物、調製物又はキット又は方法は、胚（例えば、ヒト胚）の破壊を含まず、例えば、胚（例えば、ヒト胚）の破壊なしで得ることができる。
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬等に限定されず、従って変動し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、特許請求の範囲によってのみ規定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書の本文を通して引用されるすべての刊行物及び特許（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書等を含む）は、上記又は下記にかかわらず、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明によってそのような開示に先行する権利がないということを認めるものとして解釈されるべきではない。参照により組み込まれる材料が本明細書と矛盾するか又は整合しない場合、本明細書はあらゆるそのような材料に優先する。
本発明は、以下の項目によっても特徴付けられる。
１． 体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）（若しくは神経筋骨格幹細胞）を生成（又は誘導）する方法であって、
ａ）多能性幹細胞、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞（例えば、ヒトＰＳＣ及び／又はＥＳＣ及び／又はｉＰＳＣ、例えば、ヒトＥＳＣ株Ｈ９（ＷＡ０９）又はヒトｉＰＳＣ株ＨＭＧＵ＃１）を提供する工程であって、好ましくは、上記誘導／生成の前に、上記多能性細胞は、適切な多能性細胞培地（例えば、ｍＴＥＳＲ１又はｉＰＳ－Ｂｒｅｗ等）中で維持され、さらに好ましくは、上記適切な多能性細胞培地は、上記誘導／生成のために（すなわち上記誘導／生成の前に）ビタミンＡを含む又は含まないＢ２７サプリメントを補充したＲＰＭＩ１６４０培地で置き換えられる工程と、
ｂ）上記多能性幹細胞、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞においてＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路を活性化する工程であって（例えば、ＧＯ：００１６０５５；例えば、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路は、標的細胞の表面上のｆｒｉｚｚｌｅｄファミリー受容体へのＷｎｔタンパク質の結合によって開始され、細胞状態の変化で終わる一連の分子シグナルである（Ｈｕｅｌｓｋｅｎ Ｊ、Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ Ｗ． Ｎｅｗ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． ２００１年１０月；１１（５）：５４７－５５３））、好ましくは上記活性化は、ＧＳＫ３ｂタンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４９８４１又は配列番号２８）の阻害剤を使用することによって行われ、さらに好ましくは上記阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、さらに最も好ましくは上記ＣＨＩＲ９９０２１阻害剤は約５μＭ～約１０μＭの濃度で使用され、さらに最も好ましくは、上記ＣＨＩＲ９９０２１阻害剤は約２４時間使用される工程と、
ｃ）工程（ｂ）から誘導される細胞を、継代の間の上記細胞におけるＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の連続活性化の条件下で継代する工程であって、好ましくは、上記継代は少なくとも約３～９回（例えば、３回、４回、５回、６回、７回、８回、又は９回）行われ、さらに好ましくは上記継代は連続継代であり、さらに最も好ましくは、上記継代は、工程（ｂ）から誘導される細胞を、新鮮な無血清培地（例えば、ビタミンＡを含む又は含まないＢ２７サプリメントを補充したＲＰＭＩ１６４０培地）中により低い密度で再播種すること（例えば、再播種は、単細胞又は細胞の塊へのコロニーの解離及びそれらのプレーティングである）を含み、好ましくは、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の上記連続活性化は、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の阻害剤を使用することによって行われ、さらに好ましくは、上記阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、さらに最も好ましくは、上記ＣＨＩＲ９９０２１阻害剤は、少なくとも約５μＭ（例えば、約７．５μＭ）の濃度で使用され、工程（ｃ）から誘導される細胞は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１又は配列番号２１）を内因的に発現している工程と
を含み、
ｄ）任意選択で、工程（ｃ）からのＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の上記連続活性化は、線維芽細胞増殖因子２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０９０３８又は配列番号２９）及び／又はＴＧＦ－β（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１３７又は配列番号３０）阻害剤の存在下で行われ、好ましくは、
（ｄ１）工程（ｃ）からのＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の上記連続活性化は、約５μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１阻害剤を用いて、線維芽細胞増殖因子２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０９０３８若しくは配列番号２９）及びＴＧＦ－β（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１３７若しくは配列番号３０）阻害剤の存在下で行われ、さらに好ましくは、上記ＴＧＦ－β阻害剤はＳＢ－４３１５４２であり、さらに最も好ましくは、上記ＳＢ－４３１５４２阻害剤は約１０μＭの濃度で使用され、さらにさらに最も好ましくは、上記線維芽細胞増殖因子２は約２０～約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用され、工程（ｄ１）から誘導される細胞は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１若しくは配列番号２１）、Ｔ－ｂｏｘ転写因子Ｔ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８若しくは配列番号２４）及びホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ２Ｗ２若しくは配列番号２６）を内因的に発現しているが、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７若しくは配列番号２７）を内因的に発現しておらず、任意選択で、ホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６２６若しくは配列番号２５）さらに内因的に発現しているか、又は
（ｄ２）工程（ｃ）からのＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の上記連続活性化は、約５μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１阻害剤を用いて、好ましくはＴＧＦ－β（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１３７若しくは配列番号３０）阻害剤の存在下で行われ、さらに好ましくは、上記ＴＧＦ－β阻害剤はＳＢ－４３１５４２であり、さらに最も好ましくは、上記ＳＢ－４３１５４２阻害剤は約１０μＭの濃度で使用され、工程（ｄ２）から誘導される細胞は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１若しくは配列番号２１）及びペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７若しくは配列番号２７）を内因的に発現しているが、Ｔボックス転写因子Ｔ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８若しくは配列番号２４）、ホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ２Ｗ２若しくは配列番号２６）及びホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６２６若しくは配列番号２５）を内因的に発現していないか、又は
（ｄ３）工程（ｃ）からのＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の上記連続活性化は、約７．５μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１阻害剤を用いて、好ましくはＴＧＦ－β（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１３７若しくは配列番号３０）阻害剤の存在下で行われ、さらに好ましくは上記ＴＧＦ－β阻害剤はＳＢ－４３１５４２であり、さらに最も好ましくは、上記ＳＢ－４３１５４２阻害剤は約１０μＭの濃度で使用され、工程（ｄ３）から誘導される細胞は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１若しくは配列番号２１）、Ｔボックス転写因子Ｔ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８若しくは配列番号２４）、ホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ２Ｗ２若しくは配列番号２６）及びペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７若しくは配列番号２７）を内因的に発現しており、任意選択で、ホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６２６若しくは配列番号２５）をさらに内因的に発現している
方法。
２． 工程（ｄ）を含む項目１に記載の体軸幹細胞（若しくは神経筋骨格幹細胞）を生成（又は誘導）する方法。
３． 工程（ｄ）を含み、工程（ｄ１）、（ｄ２）又は（ｄ３）をさらに含む項目１又は項目２に記載の体軸幹細胞（若しくは神経筋骨格幹細胞）を生成（又は誘導）する方法。
４． 工程（ｃ）及び／又は工程（ｄ）から誘導される細胞を継代する工程をさらに含む、項目１から項目３のいずれか１つに記載の体軸幹細胞（若しくは神経筋骨格幹細胞）を生成（又は誘導）する方法。
５． 上記体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）が、
ｉ）転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１若しくは配列番号２１）を発現する、
ｉｉ）ＯＣＴ４転写因子（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０１８６０若しくは配列番号２２）を実質的に発現しない、
ｉｉｉ）ホメオボックスタンパク質ＮＡＮＯＧ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ９Ｓ０若しくは配列番号２３）を実質的に発現しない、
ｉｖ）多能性ではない、
ｖ）領域特異的分化複能性幹細胞である、
ｖｉ）多能性幹細胞、胚性幹細胞若しくは人工多能性幹細胞（例えば、ヒトＰＳＣ及び／若しくはＥＳＣ及び／若しくはｉＰＳＣ、例えば、ヒトＥＳＣ株Ｈ９（ＷＡ０９）若しくはヒトｉＰＳＣ株ＨＭＧＵ＃１）から得ることができる、
ｖｉｉ）胚のすべての組織の細胞型に分化することができるわけではない、
ｖｉｉｉ）胚発生中に中心体軸の領域から出現する細胞型（例えば、硬節、皮筋板及び末梢ニューロン）にのみ分化することができる、
ｉｘ）奇形腫を形成することができない、
ｘ）軸領域（例えば、運動ニューロン、末梢ニューロン、末梢神経系ニューロン、感覚ニューロン、骨、軟骨、腱、靱帯及び／若しくは骨格筋の細胞）を生じる前駆体の特性を模倣することができる、
ｘｉ）一過性細胞ではない、
ｘｉｉ）運動ニューロン、末梢ニューロン、筋肉、軟骨若しくは骨の前駆体に分化することができる、
ｘｉｉｉ）無制限に複製する幹細胞である、
ｘｉｖ）クローンとして増殖することができる、
ｘｖ）神経中胚葉前駆体（ＮＭｐ）ではない、並びに／又は
ｘｖｉ）人工神経幹細胞（ｉＮＳＣ）ではない、
の特徴のうちの１つ以上を有する項目１から項目４のいずれか１つに記載の体軸幹細胞（若しくは神経筋骨格幹細胞）を生成（又は誘導）する方法。
６． 上記体軸幹細胞が、胚のすべての組織の細胞型に分化することができるわけではない項目１から項目５のいずれか１つに記載の体軸幹細胞を生成する方法。
７． 上記体軸幹細胞が、胚発生中に中心体軸の領域から出現する細胞型にのみ分化することができる項目１から項目６のいずれか１つに記載の体軸幹細胞を生成する方法。
８． 上記体軸幹細胞が奇形腫を形成することができない項目１から項目７のいずれか１つに記載の体軸幹細胞を生成する方法。
９． 上記体軸幹細胞が一過性細胞ではない項目１から項目８のいずれか１つに記載の体軸幹細胞を生成する方法。
１０． 上記体軸幹細胞が無制限に複製する幹細胞である項目１から項目９のいずれか１つに記載の体軸幹細胞を生成する方法。
１１． 上記体軸幹細胞がクローンとして増殖することができる項目１から項目１０のいずれか１つに記載の体軸幹細胞を生成する方法。
１２． 上記体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）が神経中胚葉前駆体（ＮＭｐ）ではない項目１から項目１１のいずれか１つに記載の体軸幹細胞（若しくは神経筋骨格幹細胞）を生成（又は誘導）する方法。
１３． 上記体軸幹細胞が神経中胚葉前駆体（ＮＭｐ）ではなく、上記体軸幹細胞が、以下のタンパク質、
ｉ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４１９８又は配列番号３２を有するＮ－ｍｙｃ癌原遺伝子タンパク質（ＭＹＣＮ）、
ｉｉ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ６ＺＮ１７又は配列番号３１を有するタンパク質ｌｉｎ－２８ホモログＢ（ＬＩＮ２８Ｂ）、
ｉｉｉ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ７８４１５又は配列番号３４を有するＩｒｏｑｕｏｉｓ（イロコイ）クラスホメオドメインタンパク質ＩＲＸ－３（ＩＲＸ３）、
ｉｖ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ００５７０又は配列番号３５を有する転写因子ＳＯＸ－１（ＳＯＸ１）、
ｖ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ９５４０９又は配列番号３３を有するジンクフィンガータンパク質ＺＩＣ２（ＺＩＣ２）、
ｖｉ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３５７１６又は配列番号３６を有する転写因子ＳＯＸ－１１（ＳＯＸ１１）、
のうちの１つ以上を発現し、
ｖｉｉ）好ましくは、上記ＡｘＳＣは、（ｉ）～（ｖｉ）に規定されるＭＹＣＮ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＺＩＣ２及びＳＯＸ１１を発現する基底状態ＡｘＳＣであり、
ｖｉｉｉ）好ましくは、上記ＡｘＳＣは、（ｉ）～（ｖｉ）に規定されるＭＹＣＮ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＩＲＸ３、ＳＯＸ１、ＺＩＣ２及びＳＯＸ１１を発現するプライミング状態ＡｘＳＣである項目１から項目１２のいずれか１つに記載の体軸幹細胞を生成する方法。
１４． 上記体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）が、
ｉ）基底体軸幹細胞（例えば、本明細書では「ＣＦＳ」とも呼ばれる、無制限に複製する基底体軸幹細胞）であって、この基底体軸幹細胞は、
ａ）転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１又は配列番号２１）、
ｂ）Ｔ－ｂｏｘ転写因子Ｔ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８又は配列番号２４）、
ｃ）ホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６２６又は配列番号２５）、及び
ｄ）ホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ２Ｗ２又は配列番号２６）
を発現し、
ｅ）好ましくは、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．１（ＮＫＸ２．１）、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４３６９９又は配列番号３７をさらに発現し、
ｆ）好ましくは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ６ＺＮ１７又は配列番号３１を有するタンパク質ｌｉｎ－２８ホモログＢ（ＬＩＮ２８Ｂ）をさらに発現し、
ｇ）好ましくは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４１９８又は配列番号３２を有するＮ－ｍｙｃ癌原遺伝子タンパク質（ＭＹＣＮ）をさらに発現し、
ｈ）好ましくは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ２Ｑ１Ｗ２又は配列番号３８を有するＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ７１（ＴＲＩＭ７１）をさらに発現し、
ｉ）好ましくは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９８５３又は配列番号３９を有するフォークヘッドボックスタンパク質Ｂ１（ＦＯＸＢ１）をさらに発現する
基底体軸幹細胞に、
ｉｉ）プライミング状態体軸幹細胞（例えば、本明細書において「ＣＳ」とも呼ばれる、無制限に複製するプライミング状態体軸幹細胞）であって、このプライミングされた体軸幹細胞は、
ｊ）転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１又は配列番号２１）、及び
ｋ）ペアードボックスタンパク質ＰＡＸ－６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７又は配列番号２７）
を発現し、
ｌ）好ましくは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ６ＺＮ１７又は配列番号３１を有するタンパク質ｌｉｎ－２８ホモログＢ（ＬＩＮ２８Ｂ）をさらに発現し、
ｍ）好ましくは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４１９８又は配列番号３２を有するＮ－ｍｙｃ癌原遺伝子タンパク質（ＭＹＣＮ）をさらに発現し、
ｎ）好ましくは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ２Ｑ１Ｗ２又は配列番号３８を有するＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ７１（ＴＲＩＭ７１）をさらに発現し、
ｏ）好ましくは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９８５３又は配列番号３９を有するフォークヘッドボックスタンパク質Ｂ１（ＦＯＸＢ１）をさらに発現する
プライミング状態体軸幹細胞に
無制限に複製及び分化することができる項目１から項目１３のいずれか１つに記載の体軸幹細胞（若しくは神経筋骨格幹細胞）を生成（又は誘導）する方法。
１５． 上記体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）が、ヒト体軸幹細胞（又はヒト神経筋骨格幹細胞）である項目１から項目１４のいずれか１つに記載の体軸幹細胞（若しくは神経筋骨格幹細胞）を生成（又は誘導）する方法。
１６． 項目１から項目１５のいずれか１つに記載の体軸幹細胞（若しくは神経筋骨格幹細胞）を生成（若しくは誘導）する方法によって生成された体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）。
１７． 単離体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）（又は神経筋骨格幹細胞）であって、この単離体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）は、転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１又は配列番号２１）を発現し、ＯＣＴ４転写因子（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０１８６０又は配列番号２２）を実質的に発現せず、ホメオボックスタンパク質ＮＡＮＯＧ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ９Ｓ０又は配列番号２３）を実質的に発現せず、上記ＡｘＳＣ（又は神経筋骨格幹細胞）は多能性ではなく、上記ＡｘＳＣ（又は神経筋骨格幹細胞）は、以下の特徴、
ｉ）領域特異的分化複能性幹細胞である、
ｉｉ）多能性幹細胞、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞（例えば、ＥＳＣ及び／又はｉＰＳＣ、例えば、ヒトＥＳＣ株Ｈ９（ＷＡ０９）又はヒトｉＰＳＣ株ＨＭＧＵ＃１）から得ることができる、
ｉｉｉ）胚のすべての組織の細胞型に分化することができるわけではない、
ｉｖ）胚発生中に中心体軸の領域から出現する細胞型（例えば、硬節、皮筋板及び末梢ニューロン）にのみ分化することができる、
ｖ）奇形腫を形成することができない、
ｖｉ）軸領域（例えば、運動ニューロン、末梢ニューロン、末梢神経系ニューロン、感覚ニューロン、骨、軟骨、腱、靭帯及び／又は骨格筋の細胞）を生じる前駆体の特性を模倣することができる、
ｖｉｉ）一過性細胞ではない、
ｖｉｉｉ）運動ニューロン、末梢ニューロン、筋肉、軟骨又は骨の前駆体に分化することができる、
ｉｘ）無制限に複製する幹細胞である、
ｘ）クローンとして成長することができる、
ｘｉ）神経中胚葉前駆体（ＮＭｐ）ではない、
ｘｉｉ）人工神経幹細胞（ｉＮＳＣ）ではない、
のうちの１つ以上をさらに有する単離体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）（又は神経筋骨格幹細胞）。
１８． 上記体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）は、胚のすべての組織の細胞型に分化することができるわけではない項目１７に記載の体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）。
１９． 上記体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）は、胚発生中に中心体軸の領域から出現する細胞型にのみ分化することができる項目１７又は項目１８に記載の体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）。
２０． 上記体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）は奇形腫を形成することができない項目１７から項目１９のいずれか１つに記載の体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）。
２１． 上記体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）は一過性細胞ではない項目１から項目２０のいずれか１つに記載の体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）。
２２． 上記体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）は、無制限に複製する幹細胞である項目１７から項目２１のいずれか１つに記載の体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）。
２３． 上記体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）はクローンとして増殖することができる項目１７から項目２２のいずれか１つに記載の体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）。
２４． 上記体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）は神経中胚葉前駆体（ＮＭｐ）ではない項目１７から項目２３のいずれか１つに記載の体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）。
２５． 上記体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）は神経中胚葉前駆体（ＮＭｐ）ではなく、上記体軸幹細胞は、以下のタンパク質、
ｉ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４１９８又は配列番号３２を有するＮ－ｍｙｃ癌原遺伝子タンパク質（ＭＹＣＮ）、
ｉｉ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ６ＺＮ１７又は配列番号３１を有するタンパク質ｌｉｎ－２８ホモログＢ（ＬＩＮ２８Ｂ）、
ｉｉｉ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ７８４１５又は配列番号３４を有するＩｒｏｑｕｏｉｓクラスホメオドメインタンパク質ＩＲＸ－３（ＩＲＸ３）、
ｉｖ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ００５７０又は配列番号３５を有する転写因子ＳＯＸ－１（ＳＯＸ１）、
ｖ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ９５４０９又は配列番号３３を有するジンクフィンガータンパク質ＺＩＣ２（ＺＩＣ２）、
ｖｉ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３５７１６又は配列番号３６を有する転写因子ＳＯＸ－１１（ＳＯＸ１１）
のうちの１つ以上を発現し、
ｖｉｉ）好ましくは、上記ＡｘＳＣは、（ｉ）～（ｖｉ）に規定されるＭＹＣＮ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＺＩＣ２及びＳＯＸ１１を発現する基底状態ＡｘＳＣであり、
ｖｉｉｉ）好ましくは、上記ＡｘＳＣは、（ｉ）～（ｖｉ）に規定されるＭＹＣＮ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＩＲＸ３、ＳＯＸ１、ＺＩＣ２及びＳＯＸ１１を発現するプライミング状態ＡｘＳＣである
項目１７から項目２４のいずれか１つに記載の体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）。
２６． 上記体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）は、自身を無制限に複製することができ、
ｉ）基底体軸幹細胞（例えば、本明細書では「ＣＦＳ」とも呼ばれる、無制限に複製する基底体軸幹細胞）であって、この基底体軸幹細胞は、
ａ）転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１又は配列番号２１）、
ｂ）Ｔ－ｂｏｘ転写因子Ｔ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８又は配列番号２４）、
ｃ）ホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６２６又は配列番号２５）、及び
ｄ）ホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ２Ｗ２又は配列番号２６）
を発現し、
ｅ）好ましくは、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ－２．１（ＮＫＸ２．１）、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４３６９９又は配列番号３７をさらに発現し、
ｆ）好ましくは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ６ＺＮ１７又は配列番号３１を有するタンパク質ｌｉｎ－２８ホモログＢ（ＬＩＮ２８Ｂ）をさらに発現し、
ｇ）好ましくは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４１９８又は配列番号３２を有するＮ－ｍｙｃ癌原遺伝子タンパク質（ＭＹＣＮ）をさらに発現し、
ｈ）好ましくは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ２Ｑ１Ｗ２又は配列番号３８を有するＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ７１（ＴＲＩＭ７１）をさらに発現し、
ｉ）好ましくは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９８５３又は配列番号３９を有するフォークヘッドボックスタンパク質Ｂ１（ＦＯＸＢ１）をさらに発現する
基底体軸幹細胞に、
ｉｉ）プライミング状態体軸幹細胞（例えば、本明細書において「ＣＳ」とも呼ばれる、無制限に複製するプライミング状態体軸幹細胞）であって、このプライミングされた体軸幹細胞は、
ｊ）転写因子ＳＯＸ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１又は配列番号２１）、及び
ｋ）ペアードボックスタンパク質ＰＡＸ－６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７又は配列番号２７）
を発現し、
ｌ）好ましくは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ６ＺＮ１７又は配列番号３１を有するタンパク質ｌｉｎ－２８ホモログＢ（ＬＩＮ２８Ｂ）をさらに発現し、
ｍ）好ましくは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４１９８又は配列番号３２を有するＮ－ｍｙｃ癌原遺伝子タンパク質（ＭＹＣＮ）をさらに発現し、
ｎ）好ましくは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ２Ｑ１Ｗ２又は配列番号３８を有するＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ７１（ＴＲＩＭ７１）をさらに発現し、
ｏ）好ましくは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９８５３又は配列番号３９を有するフォークヘッドボックスタンパク質Ｂ１（ＦＯＸＢ１）をさらに発現する
プライミング状態体軸幹細胞に
分化することができる項目１７から項目２５のいずれか１つに記載の体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）。
２７． 上記体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）が、ヒト体軸幹細胞（又はヒト神経筋骨格幹細胞）である項目１７から項目２６のいずれか１つに記載の体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）。
２８． 上記体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）が、項目１から項目２７のいずれか１つに記載の体軸幹細胞（又は神経筋骨格幹細胞）である項目１から項目２７のいずれか１つに記載の体軸幹細胞（若しくは神経筋骨格幹細胞）を生成（又は誘導）する方法。
２９． 項目１６から項目２７のいずれか１つに記載の体軸幹細胞（若しくは神経筋骨格幹細胞）を含む組成物、調製物又はキット。
３０． 上記組成物、調製物又はキットは、医薬及び／又は診断用の組成物、調製物又はキットである項目２９に記載の組成物、調製物又はキット。
３１． 医薬として使用するための、項目１６から項目２７及び項目２９から項目３０のいずれか１つに記載の体軸幹細胞、組成物、調製物又はキット。
３２． ｉ）神経変性疾患の治療、低減、予防及び／又は診断の方法、
ｉｉ）骨及び／若しくは軟骨の障害の治療、低減、予防並びに／又は診断の方法、
ｉｉｉ）筋障害の治療、低減、予防及び／又は診断の方法、
ｉｖ）細胞、組織、器官及び／又は身体の再生治療の方法、
ｖ）疾患（例えば、末梢神経系の疾患若しくは体軸幹細胞に関連する疾患、例えば筋肉関連、運動ニューロン関連、末梢ニューロン関連、感覚ニューロン関連、軟骨関連、腱関連（例えば、変性）疾患）に対する活性について、及び／又は神経毒性スクリーニングについて候補化合物をスクリーニングする方法、
ｖｉ）体軸幹細胞に関連する疾患、例えば筋肉関連、運動ニューロン関連、末梢ニューロン関連、感覚ニューロン関連、軟骨関連、腱関連（例えば、変性）疾患の治療、低減、予防及び／又は診断の方法、
ｖｉｉ）インビトロ、エキソビボ又はインビボでの方法である（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか
のうちの１つ以上において使用するための項目１６から項目２７及び項目２９から項目３１のいずれか１つに記載の体軸幹細胞（若しくは神経筋骨格幹細胞）、組成物、調製物又はキット。
３３． 必要とする試料又は対象の状態を改善する方法であって、この方法は、以下の、
ｉ）神経変性疾患の治療、低減、予防及び／又は診断の方法、
ｉｉ）骨及び／若しくは軟骨の障害の治療、低減、予防並びに／又は診断の方法、
ｉｉｉ）筋障害の治療、低減、予防及び／又は診断の方法、
ｉｖ）細胞、組織、器官及び／又は身体の再生治療の方法、
ｖ）疾患（例えば、末梢神経系の疾患）に対する活性について、及び／又は神経毒性スクリーニングについて、候補化合物をスクリーニングする方法、
のうちの１つ以上であり、
当該方法は、
ａ）項目１６から項目２７及び項目２９から項目３２のいずれか１つに記載の体軸幹細胞、組成物、調製物又はキットを上記試料又は対象に提供する工程と、
ｂ）治療有効量の上記体軸幹細胞、組成物、調製物又はキットを上記試料又は対象に投与する工程と
を含む方法。
３４． 上記方法が、インビトロ、エキソビボ又はインビボでの方法である項目３３に記載の方法。
３５． 以下の、
ｉ）神経変性疾患の治療、低減、予防及び／又は診断、
ｉｉ）骨及び／若しくは軟骨の障害の治療、低減、予防並びに／又は診断、
ｉｉｉ）筋障害の治療、低減、予防及び／又は診断、
ｉｖ）細胞、組織、器官及び／又は身体の再生治療、
ｖ）疾患（例えば、末梢神経系の疾患）に対する活性について、及び／又は神経毒性スクリーニングについて候補化合物をスクリーニングすること、
ｖｉ）インビトロ、エキソビボ又はインビボでの使用である（ｉ）～（ｖ）のいずれか、
のうちの１つ以上のための項目１６から項目２７及び項目２９から項目３２のいずれか１つに記載の体軸幹細胞、組成物、調製物及び／又はキットの使用。
本発明は、以下の実施例によってさらに例証されるが、しかしながら、実施例に限定されず、又は実施例の任意の特定の実施形態によって限定されない。
本発明の実施例
材料及び方法
細胞培養
ヒトＥＳＣ株Ｈ９（ＷＡ０９）及びヒトｉＰＳＣ株ＨＭＧＵ＃１（Ｋｕｎｚｅら、２０１８）は、ｍＴｅｓＲ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ステムセル・テクノロジーズ））又はｉＰＳ Ｂｒｅｗ ＸＰ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ミルテニーバイオテク））培地のいずれかにおいて、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）コーティング（ＢＤ Ｃｏｒｎｉｎｇ（ビーディー・コーニング））プレート上で増殖させた。コンフルエンス＞７０％のときに、Ｐａｓｓａｇｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＸＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて１：１０の比で細胞を分割した。Ｈ９細胞は４２～６５継代、ＨＭＧＵ＃１は２１～３４継代で使用した。すべての実験において、新鮮な培地を毎日適用し、細胞を５％ＣＯ２で培養した。
時間経過実験では、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を用いて細胞を解離させ、１０μＭ Ｙ－２７６３２（Ｒ＆Ｄ）を補充したｍＴｅｓＲ１培地中、ウェルあたり２．５×１０５細胞で１２ウェルプレートに播種した。２４時間後、培地を分化培地、Ｌ－グルタミンを含み、１０μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｔｏｃｒｉｓ（トクリス））を含有するインスリンを含まない１×Ｂ－２７サプリメントを含むＲＰＭＩ－１６４０と交換した。β－カテニン過剰発現の場合、ＣＨＩＲ９９０２１を１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（クロンテック））に置き換えた以外は、手順は同じであった。すべての細胞培養培地成分は、特段の記載がない限り、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ライフ・テクノロジーズ）から入手した。
体軸幹細胞誘導
細胞を上記のように播種し、１０μＭ ＣＨＩＲで２４時間処理した。その後、細胞を、維持培地（Ｌ－グルタミン、１×非必須アミノ酸、ビタミンＡを含まない１×Ｂ－２７サプリメント、及びそれぞれのリガンド（表１参照）を補充したＲＰＭＩ－１６４０）を含有するマトリゲルコーティングした６ウェルプレートに１：２０～１：３０の比で分割し、培養物を、それらがコンフルエントになるまでインキュベートした。継代９で定義される樹立期の終わりまで、コンフルエントな培養物を１：１０～１：２０の比で常法により分割した。分割は、Ｐａｓｓａｇｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＸＦ又はＶｅｒｓｅｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかを用いて行った。ＦＧＦ２含有培地を毎週新たに調製し、ＦＧＦ２を含まない培地を少なくとも２週間毎に調製した。分化した細胞の手動のコロニー採取又は掻き取りは、細胞株の樹立中のいずれの段階でも採用しなかった。
Figure 2023528309000004
ΔＮ９０ β－カテニンｈＥＳＣ株
構成的に活性なβ－カテニン（Ｎ末端からの最初の９０アミノ酸の欠失を含む）のテトラサイクリン誘導性過剰発現を生成するために、Ｈ９細胞を、Ｐ３初代細胞４Ｄヌクレオフェクターキット（Ｌｏｎｚａ（ロンザ））を使用して、ＰＢ－ＧＦＰ－Ｐ２Ａ－ΔＮβＣＡＴプラスミド及びＰｉｇｇｙｂａｃトランスポザーゼコードプラスミドでヌクレオフェクト（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔ）した。４８時間後、細胞を１０ｃｍ皿に分割し、５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて２週間選択した。その後、２５μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢの存在下で親Ｈ９株と同じ方法でポリクローナル安定株を増殖させた。
方向づけられた分化
運動ニューロン分化：ＡｘＳＣ株をＡｃｃｕｔａｓｅで解離し、１．５×１０５細胞を、１０μＭ Ｙ－２７６３２を補充したそれぞれの維持培地を含有するマトリゲルでコーティングした１２ウェルプレートの１つのウェルに播種した。翌日、培地をニューロン分化培地、１×Ｂ－２７サプリメント、１×Ｎ２サプリメント、０．１μＭ レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）、１００ｎｇ／ｍｌ組換えソニックヘッジホッグ（Ｒ＆Ｄ）、１０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ）、１０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ）、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（ぺプロテック））、０．１μＭの化合物Ｅ（Ｍｅｒｃｋ（メルク））及び１００μＭのｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）を含む１：１比のＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地Ａ、に交換した。最初の５日間は培地を毎日交換し、その後隔日に交換した。
骨細胞分化：ＡｘＳＣ株を上記のように播種したが、より高い密度で、１２ウェルプレートの１ウェルあたり２．５×１０５細胞を播種した。翌日、培地を、Ｌ－グルタミンを含み、３００ｎＭ ＳＡＧ（Ｓｉｇｍａ）及び２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したビタミンＡを含まない１×Ｂ－２７サプリメントを含むＲＰＭＩ－１６４０に交換した。２日後、分化の残りのために培地をＯｓｔｅｏＤｉｆｆ ＳｔｅｍＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に交換した。最初の５日間は培地を毎日交換し、その後隔日に交換した。
軟骨細胞分化：軟骨細胞は、分化培地がＣｈｏｎｄｒｏＤｉｆｆ ＳｔｅｍＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）であったことを除き、骨細胞と同じ手順を用いてＡｘＣＳ株から分化させた。
定量的ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン））を用いて全ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡを、０．２～１μｇの全ＲＮＡ（各実験内の試料間で正規化した量）から、Ｖｅｒｓｏ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモ・サイエンティフィック））を製造業者の指示に従って使用して合成した。１μｌのｃＤＮＡ（１：５希釈物）を、１０μｌのｑＰＣＲ反応において鋳型として使用した。ＰＣＲは、Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘと共に予め設計されたＴａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（両方ともＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）、又はＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共にカスタム設計されたプライマーのいずれかを使用して設定した。すべてのプライマー及びＴａｑｍａｎプローブの詳細は、例えば、表２に列挙されている。反応におけるプライマー濃度は、すべてのプライマーについて２５０ｎＭであった。ＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、予め規定されたサイクリングパラメータを用いて行った。各反応について２つの技術的反復を実施した。使用したＴａｑｍａｎアッセイ及びプライマーを、例えば、表２に列挙する。ＧＡＰＤＨは、すべての実験においてハウスキーピング遺伝子として機能した。遺伝子発現における相対的倍率変化（ＦＣ）を、ΔΔＣｔ法（Ｌｉｖａｋ及びＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ、２００１）を用いて計算した。結果は、特段の記載がない限り、生物学的反復間の平均ΔΔＣｔ±平均の標準誤差として提示する。プロットは、Ｒバージョン３．５．１（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ、２０１８）を実行するＲＳｔｕｄｉｏソフトウェア中のｇｇｐｌｏｔ２パッケージ（Ｗｉｃｋｈａｍ、２００９）を使用して作成した。
Figure 2023528309000005
免疫蛍光分析
免疫蛍光分析のために、細胞を、マトリゲルコーティングガラスカバースリップ又はマトリゲルコーティング４ウェルμ－スライド（Ｉｂｉｄｉ（イビディ））のいずれかに播種した。分化した運動ニューロン上のＩＦについては、ＡｘＣＳ株をカバースリップ上で直接分化させた。ＰＢＳ中４％のメタノール不含ホルムアルデヒド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、室温（ＲＴ）で１５分間固定した後、細胞を０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０分間透過処理し、続いてＰＢＳ／０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００中の５％ヤギ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてＲＴで４０分間ブロックした。ブロッキング緩衝液中の一次抗体希釈物（例えば、表３）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳに希釈した二次抗体と共にＲＴで１時間インキュベートした。カバースリップを、ＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄマウント試薬を用いてマウントした。画像は、Ａｐｏｔｏｍｅ．２及びＺｅｎソフトウェアを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．ＺＩ落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ（ツァイス））を用いて６３倍の倍率で得た。
Figure 2023528309000006
骨細胞及び軟骨細胞の染色
分化した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％ホルムアルデヒドで、室温で３０分間固定した。蒸留水で３回洗浄した後、骨細胞を４０ｍＭアリザリンレッド溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で３０分間染色した。軟骨細胞は、３％酢酸、ｐＨ２．５中の１％アルシアンブルー溶液で、室温で１時間染色した。アルシアンブルーを３％酢酸で１回洗浄し、続いて蒸留水で３回洗浄し、各洗浄を１５分間行った。アリザリンレッド洗浄物を蒸留水で洗浄し、各洗浄を１５分間行った。Ｌｅｉｃａ ＩＣＣ５０ＨＤカラーカメラを用いて１０倍の倍率でウェルの画像を取得した。
ＲＮＡ配列決定
３μｇの全ＲＮＡをＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｅｌｕｔｅ ＲＮＡクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＲＮＡ品質を、ＲＮＡ Ｐｉｃｏ ６０００キット（Ａｇｉｌｅｎｔ（アジレント））を用いたＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒでのマイクロキャピラリー電気泳動を使用して評価し、ＲＩＮ値＞８のＲＮＡのみをさらに処理した。ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーごとに、１μｇのＤＮＡｓｅ処理ＲＮＡをＲｉｂｏＺｅｒｏ Ｇｏｌｄ（Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ）キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（イルミナ））で処理してｒＲＮＡを除去し、その後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｅｌｕｔｅ ＲＮＡクリーンアップキットを用いてＲＮＡクリーンアップを行った。配列決定ライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ＬＴキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を製造業者の指示に従って使用し、１１サイクルの濃縮ＰＣＲを使用して等量のｒＲＮＡ枯渇ＲＮＡから調製した。ライブラリーの品質は、ＤＮＡ １０００キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて評価した。Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてライブラリー濃度を測定した。製造業者の指示に従ってライブラリーの多重化を実施した。ＣＨＩＲ時間経過実験からの多重化ライブラリーを、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して配列決定して、７５ｎｔシングルエンドリード（読み取り）を生成した。配列決定の深さ（シークエンシング深度）は、ライブラリーあたり２０～４０Ｍｉｏリードであった。樹立されたＡｘＣＳ株由来のライブラリーをＨｉＳｅｑ２５００装置で配列決定して、５０ｂｐのシングルエンドリードを生成した。配列決定の深さは、試料あたり１２～１４Ｍｉｏリードであった。
ＲＮＡ配列決定データ分析
ＣＨＩＲ時間経過実験のために、リードを、ｋａｌｌｉｓｔｏ（バージョン０．４３．０＿３）（Ｂｒａｙら、２０１６）を使用して、ヒトトランスクリプトーム（ＥｎｓｅｍｂｌバージョンＧＲＣｈｇ３８．８６）に疑似整列させた。得られた推定転写物レベルの存在量を遺伝子あたりのカウントに集計し、Ｔｘｉｍｐｏｒｔ（バージョン１．１０．１）パイプライン（Ｓｏｎｅｓｏｎら、２０１５）を使用してエクスポートした。ＲのＤＥＳｅｑ２パッケージ（バージョン１．２２．２）（Ｌｏｖｅら、２０１４）を使用して、各刺激時間点における遺伝子発現を未分化親細胞株と比較することによって、差異的遺伝子発現分析を行った。正規化カウントをＤＥＳｅｑ２オブジェクトから抽出した。ＰＣＡプロットを、ｒｌｏｇ変換された生のカウントから構築した。
ＡｘＣＳ株ＲＮＡ配列決定のために、ゲノムアラインメント及びリードカウント工程を、Ｇａｌａｘｙプラットフォーム（Ａｆｇａｎら、２０１８）を使用して行った。簡潔には、リードを、デフォルトパラメーターを用いてＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（Ｂｏｌｇｅｒら、２０１４）を用いてトリミングし、ＨｉＳＡＴ２（Ｋｉｍら、２０１５）を使用してｈｇ３８ヒトゲノムにアラインメントした。リードを、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ（Ｌｉａｏら、２０１４）を使用してｂａｍファイルからカウントした。ＲのＤＥＳｅｑ２パッケージ（バージョン１．２２．２）を使用して、ＡｘＣＳ株を未分化親細胞株と比較することによって、差異的遺伝子発現分析を達成した。各株から差異的に発現された遺伝子を、「ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ（生物学的プロセス）」カテゴリーからのＧＯオントロジー項の過剰表現について、ｔｏｐＧＯパッケージ（Ａｌｅｘａ及びＲａｈｎｅｎｆｕｈｒｅｒ、２０１８）を使用して分析し、正規化された遺伝子カウントに対するフィッシャーの正確確率検定（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ Ｅｘａｃｔ Ｔｅｓｔ）からｐ値を報告した。
過剰発現経路の分析は、Ｇｅｎｏｍａｔｉｘソフトウェアスイート（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅ）からのＧｅｎｏｍａｔｉｘ Ｐａｔｈｗａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧｅＰＳ）ツールを使用して、各時間点からの有意に上方調節された遺伝子及び入力としての刺激を提供することによって実施した。
Ｅｎｒｉｃｈｒツール（Ｋｕｌｅｓｈｏｖら、２０１６）及びＪＥＮＳＥＮ組織発現データベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｔｉｓｓｕｅｓ．ｊｅｎｓｅｎｌａｂ．ｏｒｇ）を使用して、組織及び細胞型の関連性を分析した。選択した細胞型に関連する遺伝子リストを抽出し、それらの正規化された発現値（ＤＥＳｅｑ２分析から）を使用して、図１Ｅのヒートマップを構築した。
実施例１：ｈＥＳＣの継代された子孫におけるＴＢＸＴ及びＳＯＸ２の発現の維持
ヒト胚軸様前駆体をインビトロで永続的に捕捉するために、本発明者らはまず、ＳＯＸ２、ＴＢＸＴ／ＢＲＡ発現のそれらの特徴に似ている状態を樹立しようとした。ＳＯＸ２は未分化ｈＥＳＣにおいて既に高度に発現されているので、本発明者らは、初期原始線条においてこの遺伝子を調節するＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達（Ａｒｎｏｌｄら、２０００）の活性化によって、最も高い可能性のある内因性ＴＢＸＴ発現を誘導することに焦点を当てた。本発明者らは、この経路のアゴニストとしてＣＨＩＲ９９０２１を使用して、Ｗｎｔ／β－カテニンの連続活性化を、外側中胚葉の前駆体を作り出す２４時間（ｈ）の一過性活性化（Ｌｉａｎら、２０１２）と比較した。本発明者らは、連続的な１０μＭ処理が高レベルのＴＢＸＴを維持した（例えば、図１Ａ）ことに注目した。連続的なＷＮＴ活性化下での分化段階を特徴付けるために、本発明者らは、時系列ＲＮＡ配列決定を行った（例えば、図１Ｂ）。本発明者らは、原始線条において発現される遺伝子（ＴＢＸＴ、ＭＩＸＬ１、ＧＳＣ、ＥＶＸ１）並びに神経遺伝子（ＺＩＣ１、ＣＤＨ２、ＧＢＸ２）及び伸長軸に特徴的な遺伝子（ＨＯＸ遺伝子クラスターの初期及び中期のメンバー）の４８～７２時間以内にプラトーになった上方制御の急激な傾向（例えば、図１Ｃ～Ｅ）に注目した。遺伝子オントロジー分析により、トランスクリプトームと中胚葉、外胚葉及び神経の発生との関連性が、連続ＣＨＩＲ９９０２１処理の７２時間時点で確認された（例えば、図１Ｄ、Ｅ）。これは、体軸前駆体及びそれらの自律的調節が、ｈＥＳＣにおけるＧＳＫ－３βの連続的阻害によって形成し始めることを示す。
この軸性遺伝子シグネチャーがＷｎｔ／β－カテニンの直接活性化を表すことを確認するために、本発明者らは、テトラサイクリン制御転写活性化の調節下でβ－カテニンの構成的に活性な変異体をｈＥＳＣのゲノムに組み込んだ。構成的に活性なβ－カテニンは全体的により広い遺伝子コホートの誘導及びより高い発現をもたらすにもかかわらず、この株をドキシサイクリンで継続的に処理すると、軸性中胚葉遺伝子及び軸性神経遺伝子の上方制御の同様の傾向が明らかになり、この経路のより強い誘導が示唆された（例えば、図１Ｄ、Ｅ）。まとめると、これは、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の連続活性化が、軸様の性状を有する前駆体を生成することを示し、これは、沿軸中胚葉系譜及び末梢神経子孫を包含する発生可能性を有するとするのが妥当である。
本発明者らの次の目標は、継代時に培養物中の軸様細胞の複製を促進する条件を定義することであった。複製及び分化に重要でありうるシグナル伝達カスケードを調査するために、本発明者らは経路分析を行い、これにより、外部から活性化されたＷｎｔ／β－カテニン経路に加えて、内因性ＦＧＦ、ＴＧＦ－β、及びより少ない程度でＢＭＰシグナル伝達を明らかにした（例えば、図１Ｆ）。塩基性ＦＧＦ（ＦＧＦ２）は、神経前駆体（Ｋｉｔｃｈｅｎｓら、１９９４）、及び中胚葉の広がり（Ｗｉｌｓｏｎら、２００５）の強力なマイトジェンであるため、本発明者らは、ＦＧＦ２を用いた及び用いないＣＨＩＲ９９０２１処理による軸様前駆体の複製を促進しようとした。軸性マーカーの誘導が２４時間後にピークレベルに達しなかったとしても（例えば、図１Ｃ）、本発明者らは、ＳＯＸ２のレベルが未分化状態と同等であったため（例えば、図１Ｇ）、この時間点で細胞の継代を開始した。驚くべきことに、本発明者らは、ＣＨＩＲ９９０２１の存在下で２４時間で始まる継代キャンペーンが、多能性状態に排他的なマーカーであるＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４のそれぞれ軽度及び強力な下方制御に付随して、未分化ｈＥＳＣに匹敵するレベルでＳＯＸ２を安定的に発現する子孫を生成することを見出した（例えば、図１Ｈ）。驚くべきことに、ＴＢＸＴはβ－カテニンの直接的な標的であるが、これらの実験では、その持続的発現はＦＧＦ２の存在を必要とした（例えば、図１Ｈ）。まとめて解釈すると、これらの結果は、ｈＥＳＣにおけるＷｎｔ／β－カテニンの永続的な活性化及び２４時間で始まる継代が、軸性マーカーＴＢＸＴ及びＳＯＸ２を共発現するが、初期の発生段階に必須である重要な多能性再プログラミング因子ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４のいずれも発現しない細胞の複製を促進することを示す。驚くべきことに、定常的なＷｎｔ／β－カテニン活性化のみは、ＳＯＸ２のみを維持する細胞の状態を持続した。
実施例２：軸性状態の特徴を有する幹細胞株の誘導
次に、本発明者らは、２つの軸性状態を表す幹細胞様株の誘導を試験した。Ｗｎｔ／β－カテニン及びＦＧＦシグナル伝達によるＳＯＸ２及びＴＢＸＴ状態の維持、又はＷｎｔ／β－カテニン単独によるＳＯＸ２状態の維持に従って、本発明者らは、ＦＧＦ２、並びにＴＧＦ－β及びＢＭＰシグナル伝達のリガンド並びに阻害剤の添加を伴う又は伴わない、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度範囲をスクリーニングした（例えば、図４）。本発明者らは、２４時間のＣＨＩＲ９９０２１処理及び連続継代後にこれらの条件を適用することにより、数ヶ月の培養にわたって表現型的に安定な株を樹立することができるかどうかを調べた（例えば、図２Ａ）。
出発集団としてｈＥＳＣを用いた３つの独立した連続継代キャンペーンの結果は、５μＭ又は７．５μＭのＣＨＩＲ９９０２１での処理が、ＦＧＦ２の存在下又は不存在下でコンパクトな幹細胞コロニー形態を示す株の誘導を可能にすることを明らかにした（例えば、図２Ｃ、Ｆ）。さらに、ＴＧＦ－β阻害剤ＳＢ－４３１５４２の適用は、よりコンパクトな細胞及びより高密度のコロニーを生成した（例えば、図２Ｃ、Ｆの挿入図）。対照的に、ＢＭＰ４又はＴＧＦ－βの添加は、安定な系譜の逸脱を完全に禁止した（例えば、図４）。最後に、５μＭより低いＣＨＩＲ９９０２１の濃度は細胞株の形成を促進せず、１０μＭ処理は、ｈＥＳＣ変換に対して毒性であったが、ｉＰＳＣに対しては毒性ではなかった（例えば、図２Ｂ、図４及び図５）。本発明者らがｈＥＳＣから誘導した代表的な株は、増殖速度、生存率、又は上皮形態に明白な変化を示さず、少なくとも４０回継代され、合計８ヶ月以上の連続培養が行われた（例えば、図２Ｃ）。このように、本発明者らは、ＦＧＦ２を伴う又は伴わないＷｎｔ／β－カテニンの永続的な活性化によって自己複製細胞株を誘導することができた。
継代キャンペーンの継続期間中、軸性中胚葉及び神経マーカーの発現をモニターし、これにより集合的に、推定体軸幹細胞株の２つの主要な状態を定義した。ＦＧＦ２を伴う５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１の処理によって誘導された細胞株は、高レベルのＳＯＸ２、ＴＢＸＴ、ＣＤＸ２、ＭＩＸＬ１、ＥＯＭＥＳ及び非常に低いレベルのＰＡＸ６又はＰＡＸ６なしを示した（例えば、図２Ｃ～Ｅ）。逆に、５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１単独での処理は、ＰＡＸ６と共に高レベルのＳＯＸ２を示すが、Ｔ、ＣＤＸ２、ＭＩＸＬ１又はＥＯＭＥＳを示さない細胞株の形成をもたらした（例えば、図２Ｃ～Ｅ）。免疫細胞化学の使用により、本発明者らは、ＳＯＸ２／ＴＢＸＴ／ＣＤＸ２及びＳＯＸ２／ＰＡＸ６が、それぞれＦＧＦ２あり又はなしで樹立された細胞株において共発現されることを確認した（例えば、図２Ｃ）。特に、ＦＧＦ２なしで生成された細胞株におけるＴＢＸＴの初期発現を除いて、ＴＧＦ－βが阻害された場合に非常に類似した表現型を有する細胞株が形成され（例えば、図２Ｄ、Ｅ）、中間軸性状態細胞株も誘導することができるということが示された。実際、本発明者らが７．５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１による処理によって細胞株を誘導した場合、本発明者らは、中間レベルのＴＸＢＴ及びＰＡＸ６を特徴とする安定な表現型を認めた（例えば、図２Ｆ、Ｇ）。まとめると、これは、本発明者らがインビトロで再生した体軸幹細胞状態の末端が、ＴＢＸＴ及びＰＡＸ６の相互排他的発現によって特徴付けられることを示す。重要なことに、同じ条件下でヒトｉＰＳＣに由来する細胞株状態の最初の特徴付けは、同様の表現型を明らかにした。これは、１０μＭ ＣＨＩＲ９９０２１におけるＴＧＦ－βの阻害がＳＯＸ２／ＴＸＢＴ体軸細胞株の誘導に許容されたにもかかわらず、である（例えば、図６）。最後に、ＮＡＮＯＧの下方制御及びＯＣＴ４の遮断がすべてのクローンにおいて観察され、これはそれらの発現の線条前の段階への制限と一致している。さらに、本発明者らは、長期の継代にわたるＳＯＸ２の増加に注目した（例えば、図２Ｅ）。
重要なことに、本発明者らは、ＳＯＸ２／ＴＸＢＴ体軸細胞株のいくつかがＣＤＸ２の異種発現を示し、いくつかのコロニーは一様に陽性であり、他のコロニーは陰性であることに注目した。ＣＤＸ２陽性及び陰性細胞の特徴をさらに定義するために、本発明者らは、単細胞からクローンを作製した。本発明者らは、このクローンがＣＤＸ２陰性であるか、又は混合集団を含有したかのいずれかであること、並びに高いＣＤＸ２発現が高いＴＢＸＴ及びＭＩＸＬ１発現と相関すること（例えば、図５）に注目した。興味深いことに、１つのクローンがＰＡＸ６のみを発現した。まとめて解釈すると、これらの結果は、細胞株によって捕捉された軸性状態の階層における初期段階がＳＯＸ２、ＴＢＸＴ、ＣＤＸ２及びＭＩＸＬ１の発現を示すが、最後期の段階はＳＯＸ２及びＰＡＸ６の発現によって特徴付けられることを示す。本発明者らは、これらのそれぞれの状態を、それぞれ基底状態及びプライミング状態と名付けた。注目すべきことに、両方の状態は、基底状態の最後期のＨＯＸ遺伝子のいくつかを含んだＨＯＸクラスター由来の遺伝子の広いレパートリーを発現した。
実施例３：体軸幹細胞は階層的であり、末梢ニューロン、硬節及び皮筋板に分化する
推定体軸幹細胞株を特徴付けるために、本発明者らはまず、ＦＧＦ２処理をするしないで切り替えることによってそれらの階層を分析した。本発明者らは、ＦＧＦ２の不存在下で、基底様体軸細胞株がＴＢＸＴ／ＣＤＸ２を下方制御し、ＰＡＸ６を上方制御したが、ＳＯＸ２及びＰＡＸ６の発現は、ＳＯＸ２／ＰＡＸ６体軸細胞株へのＦＧＦ２の添加後に変化しなかったこと（例えば、図３Ａ）に注目した。これは、ＳＯＸ２／ＴＢＸＴ体軸細胞株がＳＯＸ２／ＰＡＸ６段階の前駆体を表すという前提を実証した。次に、本発明者らは、網羅的トランスクリプトームによって基底の、中間の及びプライミングされた体軸幹細胞状態を分析した。興味深いことに、それぞれ基底状態及びプライミング状態でのＴ／ＣＤＸ２及びＰＡＸ６の相互排他的発現にもかかわらず、本発明者らは、プライミング状態の上方制御された遺伝子のコホートが、ほぼ完全に（約９０％）基底状態に含まれることを見出した（例えば、図３Ｂ）。これは、初期軸性状態の調節が、おそらくＴＢＸＴ／ＣＤＸ２／ＭＩＸＬ１及び／又はＦＧＦシグナル伝達によって媒介される遺伝子のより大きいコホートの発現を伴うことを示す。さらに、本発明者らは、中間状態が、他の状態と重複しなかった遺伝子の約１０％を含むユニークなコホートの上方制御を示すことを見出した。これらの相違にもかかわらず、濃縮された組織カテゴリーの分析は、基底状態、プライミング状態、及び中間状態の発生上の対応が類似しており、ニューロン系及び骨格系に分化する潜在能力を有することを示した（例えば、図３Ｃ）。
体軸幹細胞は原始線条の誘導を過ぎた発生段階を表すので、基底細胞株及びプライミング細胞株のニューロン潜在能力にアクセスするために、本発明者らは、デュアルＳｍａｄ阻害を含む多能性の段階からニューロン分化を誘導するために通常使用されるシグナルの第１のセットをスキップした。注目すべきことに、ＲＡ、ＳＨＨ、ＢＤＮＦ及びＧＤＮＦを含む運動ニューロン成熟培地によってこれらの細胞株を直接処理した場合、形態学的形質転換は急速であり、細胞は、基底状態の場合に４日以内に、プライミング状態の場合に２日以内にニューロン細胞形態を発生した。１５日以内に、ＴＵＪ１陽性ニューロンの精巧なネットワークが容易に明らかになり（例えば、図３Ｄ）、運動ニューロン前駆体マーカーＯＬＩＧ２が高度に発現された（例えば、図３Ｅ）。その後、ＯＬＩＧ２は下方制御され、ＩＳＬ１及びＨＢ９並びにコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）及びペリフェリン（ＰＲＰＨ）を含む最終分化（高分化）した運動ニューロンによって発現される転写因子は上方制御された（例えば、図３Ｅ）。加えて、感覚ニューロンの共通マーカーであるＢＲＮ３Ａ（ＰＯＵ４Ｆ１）は、基底体軸細胞株及びプライミングされた体軸細胞株の両方に由来する分化したニューロンにおいて、分析の最後期の時点で上方制御された（例えば、図３Ｅ）。全体として、これらのデータは、体軸幹細胞株の状態に依らず、体軸幹細胞株が成熟末梢ニューロンに分化すること、並びに基底状態及びプライミング状態が、それぞれ感覚ニューロン及び運動ニューロンに分化する異なる傾向を有しうることを示す。これは、形成されたニューロンネットワークの異なる形態によって支持された。
同じ前提によれば、多能性状態からの誘導の初期段階をスキップすることは、体軸幹細胞株が硬節系譜に分化することを可能にするはずである。実際、本発明者らは、ソニックヘッジホッグ経路の活性化因子並びに骨細胞及び軟骨細胞の成熟を促進する培地によって基底状態及びプライミング状態の体軸幹細胞を処理したところ、両方の状態に由来する分化細胞がそれぞれの細胞型の決定的特徴を示すことを見出した。これは、骨芽細胞系譜の特定化に必要とされる主要な転写因子であるＲＵＮＸ２（Ｋｏｍｏｒｉ、２０１０）、並びに骨細胞に特異的なその標的遺伝子 － オステオカルシン（ＢＧＬＡＰ）、オステオポンチン（ＳＰＰ１）及びコラーゲン１ａ１（ＣＯＬ１Ａ１） － の上方制御を含んでいた（例えば、図３Ｆ）。同様に、本発明者らは、軟骨組織において発現される遺伝子を活性化する転写因子であるＮＫＸ３－２（オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）及びアグリカン（ＡＣＡＮ）を含む）を含む軟骨細胞マーカーの上方制御（例えば、図３Ｇ）に注目した。注目すべきことに、この上方制御は、基底状態株から分化した細胞についてより強く、軟骨を産生する傾向が基底状態体軸幹細胞株においてより高いことを示す。最後に、アリザリンレッドによるカルシウム沈着物の染色及びアルシアンブルーによる硫酸プロテオグリカンの染色は、骨細胞及び軟骨細胞の分化を確認した（例えば、図３Ｈ～Ｉ）。それゆえ、本発明者らは、体軸幹細胞の上記２つの状態は、硬節を産生することができるが、分化の傾向は発生段階に応じて異なると結論付ける。
皮筋板分化骨格筋を誘導するために、本発明者らは、最近開発された感覚運動オルガノイドのプロトコル（Ｐｅｒｅｉｒａら、２０１９、ＣｅｌｌＰｒｅｓｓ ＳｎｅａｋＰｅｅｋ）を適用し、基底及びプライミング状態の体軸細胞株を用いてプロセスを開始した。１６日目に、本発明者らは、骨格筋形成を示すＰＡＸ３、ＰＡＸ７及びＭＹＯＤ１の有意な上方制御を認めた。
最後に、本発明者らは、基底状態及びプライミング状態の体軸幹細胞株を免疫不全マウスに移植し、未分化ｈＥＳＣとは対照的に、移植事例の１００％において、本発明者らはいかなる奇形腫形成も検出しなかった。合わせて考慮すると、奇形腫へではなく、末梢ニューロン、硬節及び皮筋板への分化の証拠が、軸様の基底細胞株及びプライミング状態細胞株の、ヒト胚軸領域前駆体との等価物としての分類を支持する。
考察
ＳＯＸ２は、胚性幹細胞及び神経幹細胞（ＮＳＣ）の維持において重要な役割を有し（Ｂｏｙｅｒら、２００５；Ａｖｉｌｉｏｎら、２００３；Ｇｒａｈａｍら、２００３；Ｐｅｖｎｙ及びＮｉｃｏｌｉｓ、２０１０）、ＮＳＢ、ＣＬＥ及びＣＮＨに存在する末梢神経系の分化複能性前駆体、例えば、体軸前駆体において（Ｈｅｎｒｉｑｕｅら、２０１５）、又は神経堤由来感覚ニューロン前駆体において（Ｃｉｍａｄａｍｏｒｅら、２０１１）も発現される。本発明者らは、本実施例で、経路の活性化の２４時間後に始まる細胞継代と併せてＷｎｔ／β－カテニン経路を絶えず活性化することによって、ヒトＥＳＣにおけるようにＳＯＸ２の発現を高く保つことができることを示す。これにより、体軸前駆体分化におけるＳＯＸ２、ＰＡＸ６及びＴＢＸＴの調節におけるＷｎｔ／β－カテニン及びＦＧＦの役割を解くことが可能になった。ＴＢＸＴは、体軸前駆体を樹立及び維持するために必要であるＷｎｔ／β－カテニンとＦＧＦシグナル伝達との間の正のフィードバックループを形成すると考えられている（Ｇａｒｒｉｏｃｋら、２０１５；Ｇｏｕｔｉら、２０１４；Ｋｏｃｈら、２０１７；Ｔｕｒｎｅｒら、２０１４；Ｍａｒｔｉｎ及びＫｉｍｅｌｍａｎ、２０１０）にもかかわらず、本発明者らの結果は、Ｗｎｔ／β－カテニン単独で、体軸前駆体におけるＳＯＸ２の発現を維持するのに充分であることを示す。代わりに、ＦＧＦ及びＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達はともに、ＴＢＸＴ及びＳＯＸ２を共発現する体軸前駆体の状態を樹立及び維持するために必要である。それにもかかわらず、ＴＢＸＴは、Ｗｎｔ／β－カテニンの活性化及び継代後に一過性に発現され、ＦＧＦは、内因的に産生されることが可能であるようであり（例えば、図１Ｆ）、これは、ＴＢＸＴ及びＦＧＦが、すべての形態の体軸前駆体の樹立に一過性に関与することを示す。これは、Ｗｎｔ／β－カテニン単独によるＳＯＸ２、ＴＢＸＴ→ＳＯＸ２、ＰＡＸ６軸性状態の一方向変換によって支持される。重要なことに、ｈＰＳＣがＷｎｔ／β－カテニン刺激後に継代されない場合、ＳＯＸ２は急速に下方制御され、これは体軸前駆体の誘導を完全に妨げる。従って、本発明者らは、Ｗｎｔ／β－カテニン及び継代が、ｂＦＧＦの存在下でＴＢＸＴ及びＳＯＸ２の軸性基底状態を、又はＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達のみが活性であるときにＳＯＸ２及びＰＡＸ６を共発現するプライミング状態（例えば、図３Ｋ）を促進すると結論付ける。
ＰＡＸ６は、Ｓｏｘ１が最も初期のマーカーであるマウス神経外胚葉（Ｚｈａｎｇら、２０１０）と並置されるように、ヒト胎児及びヒトＰＳＣの神経外胚葉分化に必須であることが以前に示されている。体軸前駆体分化に基づいて、本発明者らの結果は、ＰＡＸ６がヒト末梢神経系分化の前駆体における最も初期の神経因子であることを示す。重要なことに、ＦＧＦ２は、ヒトＰＳＣのニューロンへの分化中にＰＡＸ６を抑制することが以前に示されている（Ｇｒｅｂｅｒら、２０１１）。さらに、ＭＥＫ－ＥＲＫシグナル伝達は、中胚葉分化及びＴＢＸＴの発現に関与している（Ｙａｏら、２００３）。これは、ＦＧＦ２が、プライミング状態へのヒト体軸前駆体分化の阻害において二重の役割を有することを示す（例えば、図３Ｋ）。この機構の一部は、ＳＯＸ２において調節されるエンハンサーを、未分化ＥＳＣにおけるＮ１から、軸性状態におけるＷｎｔ／ＦＧＦ依存性Ｎ２エンハンサーに切り替えることを含んでもよい（Ｔａｋｅｍｏｔｏら、２００６；Ｋｏｎｄｏｈ及びＴａｋｅｍｏｔｏ、２０１２）。
初期分化のメカニズム以外に、本発明者らは、初めて、ｈＥＳＣ及びｉＰＳＣ株の両方から、それぞれの段階の体軸前駆体、つまり基底状態及びプライミング状態、に対応する自己複製性幹細胞株を誘導した。これらの幹細胞株は、多数の継代について安定な未分化表現型を示し、本発明者らは、ＳＢ－４３１５４２によるＴＧＦ－β阻害が自発的分化を減少させ、よりコンパクトなコロニーとして株を維持したことに注目した。重要なことに、ＳＢ－４３１５４２によって処理された基底状態ＡｘＳＣ株の単細胞クローニングは、混合クローン又はＣＤＸ２クローンを生成し、これは、根状態において、ＡｘＳＣがＣＤＸ２を発現することを示す。ＣＤＸ２のクローンパターンは、ＣＤＸ２を負に調節することが公知である（Ｙｏｕｎｇら、２００９；Ａｍｉｎら、２０１６）後期ＨＯＸ遺伝子ＨＯＸＤ１３の発現における不均質性に起因するという可能性がある。最後に、ＦＧＦ８がＡｘＳＣ株の誘導においてＦＧＦ２に置き換わる可能性がある（Ｌｉｐｐｍａｎｎら、２０１５）。まとめて解釈すると、ＳＯＸ２の発現がＦＧＦ２を伴う又は伴わないＷｎｔ／β－カテニンの活性化後にＴＢＸＴと一致する場合にヒト体軸前駆細胞を継代することによって、ヒト体軸前駆細胞の分化を調節する経路を利用して、基底状態及びプライミング状態のＡｘＳＣ株を作製することができる。
基底状態及びプライミング状態のＡｘＳＣ株の分化能の今回の評価は、両方のタイプが、わずか４８時間以内に、ニューロンの複雑なネットワークに急速に分化することを示した。それゆえ、ＡｘＳＣが高レベルの末梢ニューロンマーカー及び運動ニューロンマーカーを発現するために約１０日を要したにもかかわらず、神経関与はＡｘＳＣについての分化のデフォルト経路を表し、これは、末梢ニューロンの成熟及び多様化がさらなるシグナルを伴いうることを示す。興味深いことに、ニューラルネットワーク（神経回路網）の形態は、基底状態ＡｘＳＣ株とプライミング状態ＡｘＳＣ株とで異なっていた。基底状態ＡｘＳＣに由来するニューロンにおけるＰＲＰＨのより高い発現は、同じくより速く高密度ニューロンネットワークを生じたプライミング状態ＡｘＳＣと比較して感覚ニューロンを生成するより高い傾向を示している可能性がある。ニューロン分化がＡｘＳＣのデフォルト経路であるという考えは、その細胞が、それぞれ、硬節細胞、すなわち軟骨細胞及び骨細胞、並びに皮筋板、すなわち筋線維になるために、１５日及び１５～３０日のプロトコルが必要とされるという事実によって支持される。運動ニューロンへのヒトＮＭＰ前駆体の分化について以前に報告された他の研究（Ｇｏｕｔｉら、２０１４；Ｌｉｐｐｍａｎｎら、２０１５；Ｄｅｎｈａｍら、２０１５；Ｖｅｒｒｉｅｒら、２０１８）及び初期筋細胞の分化を報告した１つの研究（Ｇｏｕｔｉら、２０１４）にもかかわらず、本発明者らの知る限り、ＡｘＳＣは、硬節、皮筋板及び末梢ニューロンを生じることができる最初で唯一のタイプの分化複能性クローン細胞株を表す。
マウス胚における体軸に沿ったＨＯＸ遺伝子の発現の順序付け及び無脊椎動物の体分節における特定のＨＯＸ遺伝子の領域的活性化は、同様に哺乳動物におけるＨＯＸ遺伝子活性化の決定論的様式を反映すると考えられている。注目すべきことに、本発明者らは、ＡｘＳＣ株によって発現されるＨＯＸ遺伝子のレパートリーが非常に広く、基底状態において最後期の後側ＨＯＸ遺伝子のいくつかを含むことを見出した。これは、最初にＡｘＳＣにおけるＨＯＸパラログ遺伝子のすべて又は大部分を並行して活性化し、後に二次シグナルによってそれらの位置的同一性を固定することによって作用する、哺乳動物における体軸に沿ったＨＯＸ遺伝子の順序付けの許容モードを示す可能性がある。この説明に沿って、マウス胚由来の一過性ＮＭＰにおける後側ＨＯＸ遺伝子の進行性活性化に注目したＧｏｕｔｉら、及びレチノイン酸がＮＭＰの子孫の位置的同一性を固定することを示したＬｉｐｐｍａｎｎらによって最近なされた知見がある。基底状態ＡｘＳＣから単一クローンを作製する能力、及び後期ＨＯＸ遺伝子を発現しないプライミング状態ＡｘＳＣへのそれらの分化は、哺乳動物におけるＨＯＸ遺伝子パターンの位置精度の根底にある機構を調べるための重要なプラットフォームを提供する。
ヒトＡｘＳＣ株の生成は、研究及び医学における適用に非常に有利である可能性がある。第一に、そのような株又はそれらの子孫の適用は、細胞不純物のリスクを回避することによって、末梢神経系、骨格筋又は骨格組織における細胞療法の安全性を増加させる可能性がある。これらは、奇形腫腫瘍（Ｄｒｕｋｋｅｒ、２０１２）又は他の組織の分化細胞型及び中間細胞型を形成するリスクを有する残留未分化ＰＳＣでありうる。重要なことに、本発明者らは、基底状態又はプライミング状態のＡｘＳＣが奇形腫を生じることができるという証拠を発見しなかった。第二に、ＡｘＳＣの先験的な発生制限は、運動ニューロン等の関心対象の特定のタイプの細胞の誘導を、よりコヒーレント（理路整然としたもの）で、均一かつより速いものにし、その結果、治療用細胞の製造用にあまり費用がかからず、より単純にすることができよう。それゆえ、ＡｘＳＣは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の末梢神経系に影響を及ぼす疾患の細胞モデルを作成するため、並びにＡｘＳＣの子孫を用いた薬物開発及び毒性試験のための扱いやすいツールとなることもできる。第三に、ＡｘＳＣは、ヒト末梢神経系及び軸領域で生まれるさらなる細胞型の発達、機能及び進化の調節を理解するためのベンチマークとなることもできよう。これに関して、本発明者らは、誘導された（人工）ＡｘＳＣ（ｉＡｘＳＣ）が、誘導された（人工）ニューロン及びｉＰＳＣの場合とまったく同様に、本明細書に記載される重要な転写因子の過剰発現によって体細胞から直接誘導されることが可能であろうと予想する。
結び
胚及びＥＳＣからのＮＳＣの誘導は、中枢神経系の研究及び治療における新しい時代の開始を告げた。ＡｘＳＣ株の誘導は、ＡＬＳ及び筋ジストロフィーを含む、感覚及び運動末梢神経系並びに骨格筋に影響を及ぼす疾患及び外傷のための治療を研究及び創出するためのシステムを提供することによって、これらの重要な知見を補完する。
実施例４：軸性状態の特徴を有する幹細胞株の誘導
ＣＨＩＲ＋ＴＧＦｉ及びＣＨＩＲ＋ＦＧＦ２＋ＴＧＦｉ処理は、安定な細胞株の誘導を可能にしたので、それゆえ、樹立プロセスの間の最初の継代において上述のマーカー遺伝子の発現傾向をチェックするためにこれらの条件を使用することによって、さらなる誘導を実施した。継代５、９及び２６についての以前の結果と同様に、体軸前駆体マーカー（ＳＯＸ２、ＴＢＸＴ及びＣＤＸ２）は、ＣＨＩＲ＋ＦＧＦ２＋ＴＧＦｉ（ＣＦＳ）処理によって最初の継代において高レベルで検出されたが（図８Ａ）、ＣＨＩＲ＋ＴＧＦｉ（ＣＳ）処理は、徐々に増加したＰＡＸ６とは逆に、体軸前駆体マーカーの段階的な減少をもたらした（図８Ｂ）。いずれの株も、中胚葉マーカーを発現しなかったか、又は非常に低いレベルで発現した。
体軸幹細胞株を正確に転写的に特徴付けるために、本発明者らは、Ｈ９、ＨＵＥＳ６及びＨＭＧＵ１由来の体軸幹細胞の単細胞配列決定を実施した（図９Ａ）。体軸前駆体マーカーは、Ｈ９に由来する株を除き、ＣＦＳ株において異種発現されるものとして検出された（図９Ｂ）。ＣＦＳ＿ＨＭＧＵ株では、ＳＯＸ２の発現はＣＤＸ２と重複する。しかしながら、ＣＦＳ＿ＨＵＥＳ６株では、ＣＤＸ２－細胞及びＣＤＸ２＋細胞の両方がＳＯＸ２を発現する。低いＴＢＸＴ発現の検出は、その発現が配列決定された試料においてｑＰＣＲによって検出されるため、技術的限界に関連している可能性がある。いずれのＣＳ株においても、ＴＢＸＴ及びＣＤＸ２は発現されず、これは以前の結果を確認し、ＳＯＸ２はＰＡＸ６と重複する。次に、本発明者らは、多能性マーカー、神経中胚葉（体軸前駆体）マーカー及び系譜特異的マーカーの発現を分析し（図９Ｄ）、ＣＦＳ株が実質的に神経中胚葉遺伝子を発現するが、ＣＳ株は神経外胚葉遺伝子を発現することを見出した。
ＲＮＡ配列決定からの結果（図１４Ｂ）に加えて、本発明者らは、単細胞レベルでＨＯＸ遺伝子の発現を分析し、ＣＦＳ株が前側から後側までＨＯＸ遺伝子の広範囲の発現を有するが、ＣＳ株はＨＯＸ１－４等の前側ＨＯＸ遺伝子によって区切られること（図９Ｄ）に注目した。本発明者らは、すべての株において、軸伸長に重要な鍵となるシグナル伝達経路を調べた（図９Ｅ～Ｊ）。ＷＮＴ遺伝子及びＷＮＴ受容体遺伝子の発現は細胞株において異なるが、ＷＮＴシグナル伝達経路の下流遺伝子であるＣＴＮＮＢ１（Β－カテニン）は、すべての株において高度に発現される（図９Ｅ）。ＣＦＳ株は、主にＦＧＦ１７及びＦＧＦＲ１を発現するものとして検出されるが、ＣＳ株も、ＦＧＦ１３及びＦＧＦＲ１の低い発現を有する（図９Ｆ）。本発明者らは、ＴＧＦｂ（図９Ｇ）及びＮＯＴＣＨ（図９Ｈ）シグナル伝達経路のメンバーは、ＣＳ株においてより高いことが見出されたＮＯＴＣＨリガンド（図９Ｈ）を除いて、同様の様式ですべての株において活性化されるが、レチノイン酸（図９Ｉ）及びＢＭＰ（図９Ｊ）シグナル伝達は、ＣＦＳ株にとってより重要である可能性があることに注目した。
次に、本発明者らは、ＣＦＳ及びＣＳ株の両方のクラスターを分析して（図１０、図１１）、ＳＯＸ２、ＣＤＸ２及びＰＡＸ６における不均質性が、体軸幹細胞の系列決定（ｌｉｎｅａｇｅ－ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）細胞への分化の結果であるかどうかを評価した。８つのＣＳクラスターのうち、ＳＯＸ２発現が比較的低い（図９、図１０Ｂ）ＣＳ、４（図１０Ａ）は、未成熟ニューロンマーカーであるＤＣＸを高度に発現し、神経系譜への分化の指標となり得る。ＣＦＳクラスター（図１１Ａ）において、本発明者らは、中間中胚葉マーカーのいくつかがわずかに上方制御されるＳＯＸ２＋ＣＤＸ２－（ＣＦＳ、５）として１つのクラスターを見出した。本発明者らは、神経堤マーカーが上方制御されるＣＦＳ、９を除いて、ＳＯＸ２＋ＣＤＸ２＋クラスターとＳＯＸ２－ＣＤＸ２－クラスターとの間の系譜特異的マーカーのいかなる明確なパターンも検出しなかった（図１１Ｂ）。
実施例５：体軸幹細胞は階層的であり、末梢ニューロン、硬節及び皮筋板に分化する
本発明者らは、体軸幹細胞が末梢ニューロンを生成する能力を調査しようとし、それゆえ、本発明者らは、文献に基づいて脊髄発生及び脊髄ニューロン特定化を模倣するためのサイトカイン群を含む培地を用いて（図１２Ａ）運動ニューロン分化を実施した。分化の際の細胞形態に基づいて、本発明者らは、体軸幹細胞の２つの状態がＣＳについては２日及び少なくともＣＦＳ細胞については７日と、神経形態を発生させる異なる速度を示すということを認めた（図１２Ｂ）。本発明者らは、１６日目以降のＣＦＳ分化における細胞不均質性に注目した。遺伝子発現分析に基づいて、ペリフェリン（末梢ニューロンマーカー）、ＩＳＬ１及びＣＨＡＴ（成熟ニューロンマーカー）は、すべての実験において上方調節されたが、ＯＬＩＧ２（運動ニューロン前駆体マーカー）は、いかなるものにおいても検出されなかった（図１２Ｃ～Ｄ）。驚くべきことに、ＣＦＳ及びＣＳ分化は、それぞれ運動ニューロンマーカー及び感覚ニューロンマーカーであるＭＮＸ１及びＰＯＵ４Ｆ１の発現について異なるパターンを示した。両方の転写因子は、ＣＦＳ誘導物由来の２８日目分化細胞において検出されたが（図１２Ｃ～Ｅ）、ＣＳ由来細胞は、１４日目でＭＮＸ１を発現するが（図１２Ｆ）、ＣＦＳ分化物と同様に両方の転写因子の発現を示すＣＳ－１誘導物由来の分化細胞（図１２Ｄ）を除き、後の時間点（２８日目）ではＭＮＸ１又はＰＯＵ４Ｆ１のいずれかを発現する。
本発明者らは、骨格筋分化を誘導することによって体軸幹細胞の皮筋板子孫を調べた。本発明者らは、Ｃｈｏｉら、２０１９のプロトコルを改変し、４つの分化様式を適用して（図１３Ａ）効率を比較した。ＣＦＳ由来細胞を４０日目で収集したが（図１３Ｂ）、ＣＳ由来細胞は厳密な神経形態を示し（図１３Ｃ）、８日目まで安定に維持することができなかった。分化した子孫の分析のために、本発明者らは、文献に公開されたステージ特異的マーカーを使用した。これらのマーカーは、沿軸中胚葉に由来する骨格筋細胞の生成中に発現される。ＴＢＸＴは初期中胚葉前駆体において発現され、その下方制御に続いて、ＴＢＸ６及びＭＳＧＮ１は上方制御されて前体節中胚葉形成を示す。その後、ＰＡＸ３は皮筋板前駆体の出現を示し、その後ＭＹＯＤが続く。後者は、筋芽細胞前駆体及び筋芽細胞の両方において発現される。ＰＡＸ７の発現は、筋芽細胞及び衛星様細胞の状態を識別するのに役立つ。ＰＡＸ７とＭＹＯＤとの共発現は筋芽細胞に特徴的であるが、ＰＡＸ７のみは衛星様細胞において発現される。ＭＹＯＧは、筋細胞の指標として使用されるが、ＭＹＨ３及びＴＴＮは、成熟／融合筋線維において発現される。ＣＤＨ１５は、筋芽細胞、筋細胞及び成熟筋線維において発現される。遺伝子発現分析（図１３Ｄ～Ｇ）及び免疫染色結果（図１３Ｈ～Ｊ）に基づくと、ＭＹＯＤ及びＭＹＯＧ転写因子並びに筋肉特異的ＭｙＨＣ及びＭ－カドヘリン細胞骨格タンパク質の高い上方制御が検出されたので、ＣＦＳ細胞は、筋芽細胞及び筋細胞様細胞を生成することができる。
本発明者らはさらに、オルガノイドを生成することによってＣＦＳ株の骨格筋子孫を分析した。本発明者らは、２Ｄ分化の同様のプロトコルを３Ｄ培養物に適用し（図１４Ａ）、オルガノイドを４０日目に分析した（図１４Ｂ）。ＭｙＨＣ及びＡＣＴＡ１（筋肉特異的アクチン）の免疫染色により、骨格筋子孫が確認された（図１４Ｄ）。本発明者らは、ＭＮＸ１、ＩＳＬ１及びＯＬＩＧ２の免疫染色によって神経子孫もチェックした。本発明者らはそれらの発現を検出した（図１４Ｆ）ので、それゆえ、本発明者らは上記オルガノイドを神経筋オルガノイドと命名した。
本発明者らは、最後に、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）タグ付きＣＦＳ細胞をＨＨ１７ニワトリ胚の脊索－神経管尾端境界に注入することによって、後で皮筋板及び硬節を形成する神経管及び体節へのＣＦＳ株の寄与を調べた（図１５Ａ）。胚発生をＨＨ２３～２４期で停止させた（図１５Ｂ）。ＧＦＰ染色は、ＣＦＳ細胞が神経管及び体節に位置することを示した（図１５Ｃ）。
実施例４～５の考察
ＳＯＸ２は、多能性幹細胞（Ａｖｉｌｉｏｎら、２００３、Ｂｏｙｅｒら、２００５）だけでなく系譜特異的幹細胞（Ｇｒａｈａｍら、２００３、Ｆａｖａｒｏら、２００９）においても自己複製の主要制御因子（マスターレギュレーター）として公知である。Ｔ発現は、初期中胚葉前駆体の顕著な特徴である（Ｓｈｏｗｅｌｌら、２００４、Ｔｏｓｉｃら、２０１９）。これらの２つの重要な転写因子の共発現は、神経中胚葉前駆体（ＮＭＰ）を特定するために使用されている。ＮＭＰは、マウス、ニワトリ及びヒトの胚において特定されている。初期発生の現在の科学的理解により、ＷＮＴ及びＦＧＦシグナル伝達経路を操作して、インビトロで一過性にＮＭＰを生成することが可能である。これまでのところ、ＮＭＰの長期インビトロ維持が実証されている研究はない。一般に記載されるＮＭＰ集団（Ｈｅｎｒｉｑｕｅら、２０１５、Ｗｙｍｅｅｒｓｃｈら、２０１９）は一過性かつ不等質であり、これは、疾患モデリング又は細胞療法産物の製造のためのこの発生前駆体の使用に課題を提起する。
本発明者らは、本明細書において、Ｗｎｔ／β－カテニンの活性化及びＦＧＦシグナル伝達の活性化を伴う又は伴わないＴＧＦｂシグナル伝達経路の阻害によってｈＥＳＣ又はｈｉＰＳＣから誘導することができる新規タイプの局所幹細胞、すなわち体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）を導入する。ＦＧＦシグナル伝達経路の活性化に基づいて、本発明者らは、２つの発生状態を表し、ＳＯＸ２／Ｔ又はＳＯＸ２／ＰＡＸ６の発現によって特定することができた２つのＡｘＳＣ型を誘導した。本発明者らは、ＳＯＸ２／Ｔ発現細胞をＣＦＳと名付け、ＳＯＸ２／ＰＡＸ６発現細胞をＣＳと名付けた。ＰＡＸ６発現は、最も初期の特定可能なマーカーの１つとして、神経外胚葉系譜形成の重要な決定因子であることが示されている（Ｚｈａｎｇら、２０１０）。単細胞配列決定分析によって、本発明者らは、神経外胚葉細胞をマークするための重要な転写因子でもあるＳＯＸ１に加えて、ＣＳ細胞において高いＰＡＸ６発現を検出したが（Ｚｈａｎｇら、２０１０）、ＮＭＰマーカーの発現は、ＳＯＸ２を除いて検出されなかった。その結果、本発明者らは、ＣＳ細胞の転写プロファイルが神経バイアスを示すと結論付けることができる。さらには、ＣＳ細胞の群におけるＤＣＸの発現は、この集団内の自発的分化が未成熟ニューロンとして特定されることが可能であることを示した。他方で、ＣＦＳ細胞は、ＳＯＸ２＋ＣＤＸ２－細胞を除いて、いかなる系譜への関与（決定）も示さなかった。ＣＦＳ細胞のこのサブグループは、中間中胚葉マーカーの明らかな上方制御及び神経中胚葉マーカーの下方制御を示し、このサブグループにおける自発的分化を示した。その結果、本発明者らは、ＣＤＸ２発現がＣＦＳ細胞におけるあまりプライミングされていない状態の維持に必須であると結論付けることができる。特に、ＣＤＸ２の下方制御は、ＳＯＸ２発現とは無関係にＳＡＬＬ４の下方制御と同時に起こり、ＳＡＬＬ４がＡｘＳＣの自己複製において役割を有することができるということをうかがわせる。ＳＡＬＬ４がヒト多能性幹細胞の自己複製に必須の遺伝子であることが文献に示されている（Ｙｉｌｍａｚら、２０１８）。ＣＦＳ細胞の大部分はＳＯＸ２＋ＣＤＸ２＋細胞にクラスター化され、これは、系譜特異的マーカーが検出されなかったので、ＣＦＳ細胞の非関与状態を表す。これらの結果に基づいて、ＣＦＳ細胞は、ＡｘＳＣのより不均質で偏りのない状態を表すと結論付けることができる。それゆえ、本発明者らは、それぞれの転写プロファイルに基づいて、ＣＳ細胞をプライミングされたＡｘＳＣ状態として、ＣＦＳ細胞をＡｘＳＣの基底状態として記述することができる。本発明者らは、神経系譜及び皮筋板系譜に対するＡｘＳＣの発生潜在能力を調査した。まず、本発明者らは、ＡｘＳＣからの運動ニューロン分化を行うことによって神経系譜を調査することに着手した。文献に基づいて、本発明者らは、脊髄発生及び付随する運動ニューロン特定化に関与する経路（Ｓｔｉｆａｎｉ、２０１４）を調節した。驚くべきことに、神経形態は、ＣＦＳ細胞よりも速くＣＳ細胞において観察された。形態の急速な変化は、強い神経バイアスがＣＳ細胞に存在するという本発明者らの仮説を支持する。ＣＦＳ細胞は感覚ニューロンと運動ニューロンとの混合物を生成することができるが、ＣＳ細胞は、感覚ニューロンバイアス又は運動ニューロンバイアスのいずれかを有する均質な分化培養物を生成するためのより高い傾向を有するので、分化した培養物における不均質性は、神経子孫に関してＣＦＳ細胞のより大きい発生傾向を示していた。加えて、本発明者らは、ＡｘＳＣがヒト多能性幹細胞よりもはるかに速く成熟ニューロンに分化することができることを実証し、これは、ＡｘＳＣを細胞療法に基づく治療のためのかなりの進歩として可能にする。ＣＦＳ細胞の皮筋板子孫を確認するために、本発明者らは、ＡｘＳＣを骨格筋細胞に分化させることに成功した。本発明者らが行った分化プロトコルとは無関係に、筋芽細胞前駆体又は筋芽細胞の生成に関して明らかな差異はなかったが、筋細胞様形態に基づいて、本発明者らは、ｃＡＭＰ及びビタミンＣが筋芽細胞の成熟を促進すると結論付けた。本発明者らが同じ実験条件をＣＳ細胞に適用した場合、ＣＳ細胞は明確な神経形態を示し、安定な培養物を生成しなかった。
結論として、本発明者らは、ＣＦＳ株がインビトロで神経子孫及び皮筋板子孫の両方を生成する能力、並びにインビボでの神経管及び体節へのその潜在的寄与を実証した。本発明者らは、ＣＳ細胞が子孫に関して神経系譜に制限され、いかなる皮筋板子孫も生じ得ないことを確認した。これにより、上述の結論に基づいて、ＡｘＳＣの基底／プライミング状態の仮定されたＡｘＳＣ階層は、それらの転写状態に基づいてだけでなく、各ＡｘＳＣ集団から得られた子孫にも基づいて証明される。本発明者らのＡｘＳＣの発生潜在能力に基づくと、本研究は、インビボＮＭＰを代表する幹細胞集団のインビトロ単離を示す、その種類の最初の研究である。本発明者らは、ＡｘＳＣが、脊髄性筋萎縮症及び筋萎縮性側索硬化症等の末梢神経系変性疾患の幹細胞補充療法のための潜在能力のある細胞療法産物の開発研究及び製造のための有望なツールとして役立ちうると考える。
実施例６：体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）は神経中胚葉前駆体（ＮＭＰ）ではない
本発明の体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）は神経中胚葉前駆体（ＮＭＰ）ではない。これは、ＮＭＰは一過性であり、これはＮＭＰは増殖できないということを意味するが、ＡｘＳＣは一過性細胞ではなく、増殖することができ無制限に複製されることが可能であるというのが主たる理由である。
しかしながら、本発明のＡｘＳＣと公知のＮＭＰとの間の差異にさらに対処するために、本発明者らは、ＮＭＰによって発現されないが、ＡｘＳＣによって発現される「幹細胞性」遺伝子を調べた。自己複製性幹細胞（例えば、胚において見出すことができるもの）は、特定の遺伝子を発現する傾向を有し、それら遺伝子のうちのいくつかは、いわゆる「山中因子」である。それゆえ、遺伝子発現レベルにおけるＡｘＳＣとＮＭＰとの間の差異に対処するために、本発明者らは、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、まとめて多能性幹細胞（ＰＳＣ）に必須である遺伝子を分析した。本発明者らのデータは、山中遺伝子のうち３つ（それらはｈＰＳＣに必須である）、すなわちＬＩＮ２８Ｂ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ６ＺＮ１７又は配列番号３１を有するタンパク質ｌｉｎ－２８ホモログＢ）、ＭＹＣＮ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４１９８又は配列番号３２を有するＮ－ｍｙｃ癌原遺伝子タンパク質）及びＳＯＸ２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１又は配列番号２１を有する転写因子ＳＯＸ－２）、がＡｘＳＣによって一緒に発現されることを示す。注目すべきことに、ＬＩＮ２８及びＭＹＣは、インビボでのＮＭＰの文脈においては以前に言及されていない。典型的には、山中遺伝子は、ＬＩＮ２８Ａ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ９Ｚ２を有するタンパク質ｌｉｎ－２８ホモログＡ）及びｃ－ＭＹＣ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１１０６を有するＭｙｃ癌原遺伝子タンパク質）を含むのに対して、本発明者らは、ＡｘＳＣにおけるＬＩＮ２８Ｂ及びＭＹＣＮの発現を見出したが、それらは、ＬＩＮ２８Ａ及びｃ－ＭＹＣと機能的に非常に類似している。従って、この知見は、本発明のＡｘＳＣが公知のＮＭＰとは非常に異なるという考えを強く支持する（図１６、Ａ～Ｂ）。
本発明者らはさらに、本発明者らのＲＮＡｓｅｑデータをインビボでマウスＮＭＰと比較することによって、ＡｘＳＣを独自に定義する遺伝子を調べた。図１６から分かるように、本発明者らは、ＡｘＳＣによって顕著に発現されるが、ヒトＥＳ細胞由来のヒトＮＭＰ（Ｖｅｒｒｉｅｒら、２０１８ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）又は胚由来のマウスＮＭＰ（Ｇｏｕｔｉら、Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ． ２０１７）によっては発現しない遺伝子を含む遺伝子のパネル、すなわち、ＭＹＣＮ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４１９８又は配列番号３２を有するＮ－ｍｙｃ癌原遺伝子タンパク質）、ＬＩＮ２８Ｂ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ６ＺＮ１７又は配列番号３１を有するタンパク質ｌｉｎ－２８ホモログＢ）、ＩＲＸ３（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ７８４１５又は配列番号３４を有するＩｒｏｑｕｏｉｓクラスホメオドメインタンパク質ＩＲＸ－３）、ＳＯＸ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ００５７０又は配列番号３５を有する転写因子ＳＯＸ－１）、ＺＩＣ２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ９５４０９又は配列番号３３を有するジンクフィンガータンパク質ＺＩＣ２）、ＳＯＸ１１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３５７１６又は配列番号３６を有する転写因子ＳＯＸ－１１）を特定した（図１６。基底状態のＡｘＳＣ（右のＣＦＳ）は、主にＭＹＣＮ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＺＩＣ２及びＳＯＸ１１を発現し、プライミング状態のＡｘＳＣ（左のＣＳ）は、主にＭＹＣＮ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＩＲＸ３、ＳＯＸ１、ＺＩＣ２及びＳＯＸ１１を発現する）。
最後に、本発明者らは、本発明のＡｘＳＣがｉＰＳＣからも生成することができ、従ってヒト胚の破壊の方法を伴わないことを示した。これは、ヒトｉＰＳＣ株ＨＭＧＵ＃１に関する本発明者らの最初のファイリングをさらに確認する。
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１２． Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ｙ．、Ｇｕｏ，Ｇ．、Ｌｏｏｓ，Ｒ．、Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．、Ｆｉｃｚ，Ｇ．、Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｆ．、Ｏｘｌｅｙ，Ｄ．、Ｓａｎｔｏｓ，Ｆ．、Ｃｌａｒｋｅ，Ｊ．、Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｗ．、Ｒｅｉｋ，Ｗ．、Ｂｅｒｔｏｎｅ，Ｐ．、及びＳｍｉｔｈ，Ａ．（２０１４）． Ｒｅｓｅｔｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ ｔｏｗａｒｄ ｇｒｏｕｎｄ－ｓｔａｔｅ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ． Ｃｅｌｌ １５８、１２５４－１２６９．
１３． Ｔｈｅｕｎｉｓｓｅｎ，Ｔ．Ｗ．、Ｐｏｗｅｌｌ，Ｂ．Ｅ．、Ｗａｎｇ，Ｈ．、Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａ，Ｍ．、Ｆａｄｄａｈ，Ｄ．Ａ．、Ｒｅｄｄｙ，Ｊ．、Ｆａｎ，Ｚ．Ｐ．、Ｍａｅｔｚｅｌ，Ｄ．、Ｇａｎｚ，Ｋ．、Ｓｈｉ，Ｌ．、Ｌｕｎｇｊａｎｇｗａ，Ｔ．、Ｉｍｓｏｏｎｔｈｏｒｎｒｕｋｓａ，Ｓ．、Ｓｔｅｌｚｅｒ，Ｙ．、Ｒａｎｇａｒａｊａｎ，Ｓ．、Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏ，Ａ．、Ｚｈａｎｇ，Ｊ．、Ｇａｏ，Ｑ．、Ｄａｗｌａｔｙ，Ｍ．Ｍ．、Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．、Ｇｒａｙ，Ｎ．Ｓ．、及びＪａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（２０１４）． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ Ｎａｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １５、５２４－５２６．
１４． Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．、Ｔａｎａｂｅ，Ｋ．、Ｏｈｎｕｋｉ，Ｍ．、Ｎａｒｉｔａ，Ｍ．、Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．、Ｔｏｍｏｄａ，Ｋ．、及びＹａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００７）． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｃｅｌｌ １３１、８６１－８７２．
１５． Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．、及びＹａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００６）． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｃｅｌｌ １２６、６６３－６７６．
１６． Ｙｕ，Ｊ．、Ｖｏｄｙａｎｉｋ，Ｍ．Ａ．、Ｓｍｕｇａ－Ｏｔｔｏ，Ｋ．、Ａｎｔｏｓｉｅｗｉｃｚ－Ｂｏｕｒｇｅｔ，Ｊ．、Ｆｒａｎｅ，Ｊ．Ｌ．、Ｔｉａｎ，Ｓ．、Ｎｉｅ，Ｊ．、Ｊｏｎｓｄｏｔｔｉｒ，Ｇ．Ａ．、Ｒｕｏｔｔｉ，Ｖ．、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｒ．、Ｓｌｕｋｖｉｎ，ＩＩ、及びＴｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．（２００７）． Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８、１９１７－１９２０．
１７． Ｌｉｕ，Ｈ．、Ｚｈｕ，Ｆ．、Ｙｏｎｇ，Ｊ．、Ｚｈａｎｇ，Ｐ．、Ｈｏｕ，Ｐ．、Ｌｉ，Ｈ．、Ｊｉａｎｇ，Ｗ．、Ｃａｉ，Ｊ．、Ｌｉｕ，Ｍ．、Ｃｕｉ，Ｋ．、Ｑｕ，Ｘ．、Ｘｉａｎｇ，Ｔ．、Ｌｕ，Ｄ．、Ｃｈｉ，Ｘ．、Ｇａｏ，Ｇ．、Ｊｉ，Ｗ．、Ｄｉｎｇ，Ｍ．、及びＤｅｎｇ，Ｈ．（２００８）． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ３、５８７－５９０．
１８． Ｂｅｎａｚｅｒａｆ，Ｂ．、及びＰｏｕｒｑｕｉｅ，Ｏ．（２０１３）． Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｂｏｄｙ ａｘｉｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２９、１－２６．
１９． Ｈｅｎｒｉｑｕｅ，Ｄ．、Ａｂｒａｎｃｈｅｓ，Ｅ．、Ｖｅｒｒｉｅｒ，Ｌ．、及びＳｔｏｒｅｙ，Ｋ．Ｇ．（２０１５）． Ｎｅｕｒｏｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４２、２８６４－２８７５．
２０． Ｃａｍｂｒａｙ，Ｎ．、及びＷｉｌｓｏｎ，Ｖ．（２００２）． Ａｘｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｐｏｔｅｎｃｙ ａｒｅ ｌｏｃａｌｉｓｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｃｈｏｒｄｏｎｅｕｒａｌ ｈｉｎｇｅ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２９、４８５５－４８６６．
２１． Ｃａｍｂｒａｙ，Ｎ．、及びＷｌｓｏｎ，Ｖ．（２００７）． Ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｏｕｒｃｅｓ ｆｏｒ ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｕｒｉｎｇ ａｘｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３４、２８２９－２８４０．
２２． Ｇａｒｒｉｏｃｋ，Ｒ．Ｊ．、Ｃｈａｌａｍａｌａｓｅｔｔｙ，Ｒ．Ｂ．、Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．Ｗ．、Ｃａｎｉｚａｌｅｓ，Ｌ．Ｃ．、Ｌｅｗａｎｄｏｓｋｉ，Ｍ．、及びＹａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．Ｐ．（２０１５）． Ｌｉｎｅａｇｅ ｔｒａｃｉｎｇ ｏｆ ｎｅｕｒｏｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｎｏｖｅｌ Ｗｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｔｒｕｎｋ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４２、１６２８－１６３８．
２３． Ａｔｔａｒｄｉ，Ａ．、Ｆｕｌｔｏｎ，Ｔ．、Ｆｌｏｒｅｓｃｕ，Ｍ．、Ｓｈａｈ，Ｇ．、Ｍｕｒｅｓａｎ，Ｌ．、Ｌｅｎｚ，Ｍ．Ｏ．、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｃ．、Ｈｕｉｓｋｅｎ，Ｊ．、ｖａｎ Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ，Ａ．、及びＳｔｅｖｅｎｔｏｎ，Ｂ．（２０１８）． Ｎｅｕｒｏｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ａｒｅ ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｗｉｔｈ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｄｙｎａｍｉｃｓ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４５．
２４． Ｔｚｏｕａｎａｃｏｕ，Ｅ．、Ｗｅｇｅｎｅｒ，Ａ．、Ｗｙｍｅｅｒｓｃｈ，Ｆ．Ｊ．、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｖ．、及びＮｉｃｏｌａｓ，Ｊ．Ｆ．（２００９）． Ｒｅｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｉｎｅａｇｅ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｃｌｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ １７、３６５－３７６．
２５． ＭｃＧｒｅｗ，Ｍ．Ｊ．、Ｓｈｅｒｍａｎ，Ａ．、Ｌｉｌｌｉｃｏ，Ｓ．Ｇ．、Ｅｌｌａｒｄ，Ｆ．Ｍ．、Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ，Ｐ．Ａ．、Ｇｉｌｈｏｏｌｅｙ，Ｈ．Ｊ．、Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ，Ｋ．Ａ．、Ｃａｍｂｒａｙ，Ｎ．、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｖ．、及びＳａｎｇ，Ｈ．（２００８）． Ｌｏｃａｌｉｓｅｄ ａｘｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｖｉａｎ ｔａｉｌ ｂｕｄ ａｒｅ ｎｏｔ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｔｏ ａ ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ Ｈｏｘ ｉｄｅｎｔｉｔｙ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３５、２２８９－２２９９．
２６． Ｄｅｌｆｉｎｏ－Ｍａｃｈｉｎ，Ｍ．、Ｌｕｎｎ，Ｊ．Ｓ．、Ｂｒｅｉｔｋｒｅｕｚ，Ｄ．Ｎ．、Ａｋａｉ，Ｊ．、及びＳｔｏｒｅｙ，Ｋ．Ｇ．（２００５）． Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｓｔｅｍ ｚｏｎｅ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３２、４２７３－４２８３．
２７． Ｔｓａｋｉｒｉｄｉｓ，Ａ．、Ｈｕａｎｇ，Ｙ．、Ｂｌｉｎ，Ｇ．、Ｓｋｙｌａｋｉ，Ｓ．、Ｗｙｍｅｅｒｓｃｈ，Ｆ．、Ｏｓｏｒｎｏ，Ｒ．、Ｅｃｏｎｏｍｏｕ，Ｃ．、Ｋａｒａｇｉａｎｎｉ，Ｅ．、Ｚｈａｏ，Ｓ．、Ｌｏｗｅｌｌ，Ｓ．、及びＷｉｌｓｏｎ，Ｖ．（２０１４）． Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｗｎｔ－ｄｒｉｖｅｎ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｓｔｒｅａｋ－ｌｉｋｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｒｅｆｌｅｃｔ ｉｎ ｖｉｖｏ ｌｉｎｅａｇｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４１、１２０９－１２２１．
２８． Ｇｏｕｔｉ，Ｍ．、Ｔｓａｋｉｒｉｄｉｓ，Ａ．、Ｗｙｍｅｅｒｓｃｈ，Ｆ．Ｊ．、Ｈｕａｎｇ，Ｙ．、Ｋｌｅｉｎｊｕｎｇ，Ｊ．、Ｗｌｓｏｎ，Ｖ．、及びＢｒｉｓｃｏｅ，Ｊ．（２０１４）． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ａｎｄ ｐａｒａｘｉａｌ ｍｅｓｏｄｅｒｍ ｉｄｅｎｔｉｔｙ． ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ １２、ｅ１００１９３７．
２９． Ｋｏｃｈ，Ｆ．、Ｓｃｈｏｌｚｅ，Ｍ．、Ｗｉｔｔｌｅｒ，Ｌ．、Ｓｃｈｉｆｆｅｒｌ，Ｄ．、Ｓｕｄｈｅｅｒ，Ｓ．、Ｇｒｏｔｅ，Ｐ．、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｂ．、Ｍａｃｕｒａ，Ｋ．、及びＨｅｒｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｇ．（２０１７）． Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｓｏｘ２ ａｎｄ Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ Ｆａｔｅ Ｃｈｏｉｃｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏ－Ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ． Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ４２、５１４－５２６ ｅ５１７．
３０． Ｗｌｓｏｎ，Ｖ．、及びＢｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．Ｓ．（１９９６）． Ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｔｅ ｍｏｕｓｅ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｓｔｒｅａｋ． Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ ５５、７９－８９．
３１． Ｋｉｎｄｅｒ，Ｓ．Ｊ．、Ｔｓａｎｇ，Ｔ．Ｅ．、Ｑｕｉｎｌａｎ，Ｇ．Ａ．、Ｈａｄｊａｎｔｏｎａｋｉｓ，Ａ．Ｋ．、Ｎａｇｙ，Ａ．、及びＴａｍ，Ｐ．Ｐ．（１９９９）． Ｔｈｅ ｏｒｄｅｒｌｙ ａｌｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｅｒｏｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ａｘｉｓ ｄｕｒｉｎｇ ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６、４６９１－４７０１．
３２． Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｌ．、Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ，Ｋ．Ｍ．、及びＳｃｈｏｅｎｗｏｌｆ，Ｇ．Ｃ．（１９９４）． Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｆａｔｅ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｓｔｒｅａｋ ａｔ ７．５ ｄａｙｓ ｏｆ ｇｅｓｔａｔｉｏｎ． Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２０１、２７９－２８９．
３３． Ｔａｇｕｃｈｉ，Ａ．、Ｋａｋｕ，Ｙ．、Ｏｈｍｏｒｉ，Ｔ．、Ｓｈａｒｍｉｎ，Ｓ．、Ｏｇａｗａ，Ｍ．、Ｓａｓａｋｉ，Ｈ．、及びＮｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａ，Ｒ．（２０１４）． Ｒｅｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｍｅｔａｎｅｐｈｒｉｃ ｎｅｐｈｒｏｎ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｋｉｄｎｅｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｒｏｍ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １４、５３－６７．
３４． Ｗｙｍｅｅｒｓｃｈ，Ｆ．Ｊ．、Ｓｋｙｌａｋｉ，Ｓ．、Ｈｕａｎｇ，Ｙ．、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ａ．、Ｅｃｏｎｏｍｏｕ，Ｃ．、Ｍａｒｅｋ－Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｃ．、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｓ．Ｒ．、及びＷｉｌｓｏｎ，Ｖ．（２０１９）． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｙｎａｍｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｒｇａｎｉｓｅｄ ａｒｏｕｎｄ ａ ｓｔａｂｌｅ ｎｉｃｈｅ ｄｒｉｖｅ ａｘｉａｌ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４６．
３５． Ｔｕｒｎｅｒ，Ｄ．Ａ．、Ｈａｙｗａｒｄ，Ｐ．Ｃ．、Ｂａｉｌｌｉｅ－Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．、Ｒｕｅ，Ｐ．、Ｂｒｏｏｍｅ，Ｒ．、Ｆａｕｎｅｓ，Ｆ．、及びＭａｒｔｉｎｅｚ Ａｒｉａｓ，Ａ．（２０１４）． Ｗｎｔ／ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ ａｎｄ ＦＧＦ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｄｉｒｅｃｔ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ａ ｎｅｕｒｏｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ ａｘｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｉｎ ｅｎｓｅｍｂｌｅｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４１、４２４３－４２５３．
３６． Ｌｉｐｐｍａｎｎ，Ｅ．Ｓ．、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃ．Ｅ．、Ｒｕｈｌ，Ｄ．Ａ．、Ｅｓｔｅｖｅｚ－Ｓｉｌｖａ，Ｍ．Ｃ．、Ｃｈａｐｍａｎ，Ｅ．Ｒ．、Ｃｏｏｎ，Ｊ．Ｊ．、及びＡｓｈｔｏｎ，Ｒ．Ｓ．（２０１５）． Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ ＨＯＸ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ４、６３２－６４４．
３７． Ｔｓａｋｉｒｉｄｉｓ，Ａ．、及びＷｉｌｓｏｎ，Ｖ．（２０１５）． Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ． Ｆ１０００Ｒｅｓ ４、１００．
３８． Ｇｏｕｔｉ，Ｍ．、Ｄｅｌｉｌｅ，Ｊ．、Ｓｔａｍａｔａｋｉ，Ｄ．、Ｗｙｍｅｅｒｓｃｈ，Ｆ．Ｊ．、Ｈｕａｎｇ，Ｙ．、Ｋｌｅｉｎｊｕｎｇ，Ｊ．、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｖ．、及びＢｒｉｓｃｏｅ，Ｊ．（２０１７）． Ａ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｂａｌａｎｃｅｓ Ｎｅｕｒａｌ ａｎｄ Ｍｅｓｏｄｅｒｍ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｔｒｕｎｋ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ４１、２４３－２６１ ｅ２４７．
３９． Ｄｅｎｈａｍ，Ｍ．、Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｋ．、Ｍｅｎｈｅｎｉｏｔｔ，Ｔ．、Ｒｏｌｌｏ，Ｂ．、Ｚｈａｎｇ，Ｄ．、Ｈｏｕｇｈ，Ｓ．、Ａｌｓｈａｗａｆ，Ａ．、Ｆｅｂｂｒａｒｏ，Ｆ．、Ｉｇｈａｎｉｙａｎ，Ｓ．、Ｌｅｕｎｇ，Ｊ．、Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｄ．Ａ．、Ｎｅｗｇｒｅｅｎ，Ｄ．Ｆ．、Ｐｅｒａ，Ｍ．Ｆ．、及びＤｏｔｔｏｒｉ，Ｍ．（２０１５）． Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｃａｕｄａｌ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｇｉｖｅ ｒｉｓｅ ｔｏ ｌｉｎｅａｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３３、１７５９－１７７０．
４０． Ｖｅｒｒｉｅｒ，Ｌ．、Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｌ．、Ｇｉｅｒｌｉｎｓｋｉ，Ｍ．、Ｄａｄｙ，Ａ．、及びＳｔｏｒｅｙ，Ｋ．Ｇ．（２０１８）． Ｎｅｕｒａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４５．
４１． Ｅｄｒｉ，Ｓ．、Ｈａｙｗａｒｄ，Ｐ．、Ｂａｉｌｌｉｅ－Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．、Ｓｔｅｖｅｎｔｏｎ，Ｂ．、及びＭａｒｔｉｎｅｚ Ａｒｉａｓ，Ａ．（２０１８）． Ａｎ Ｅｐｉｂｌａｓｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｘｉａｌ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ． Ｂｉｏａｒｘｉｖ．
４２． Ａｒｎｏｌｄ，Ｓ．Ｊ．、Ｓｔａｐｐｅｒｔ，Ｊ．、Ｂａｕｅｒ，Ａ．、Ｋｉｓｐｅｒｔ，Ａ．、Ｈｅｒｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｇ．、及びＫｅｍｌｅｒ，Ｒ．（２０００）． Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ ｉｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｎｔ／ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ． Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ ９１、２４９－２５８．
４３． Ｌｉａｎ，Ｘ．、Ｈｓｉａｏ，Ｃ．、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．、Ｚｈｕ，Ｋ．、Ｈａｚｅｌｔｉｎｅ，Ｌ．Ｂ．、Ａｚａｒｉｎ，Ｓ．Ｍ．、Ｒａｖａｌ，Ｋ．Ｋ．、Ｚｈａｎｇ，Ｊ．、Ｋａｍｐ，Ｔ．Ｊ．、及びＰａｌｅｃｅｋ，Ｓ．Ｐ．（２０１２）． Ｒｏｂｕｓｔ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９、Ｅ１８４８－１８５７．
４４． Ｋｉｔｃｈｅｎｓ，Ｄ．Ｌ．、Ｓｎｙｄｅｒ，Ｅ．Ｙ．、及びＧｏｔｔｌｉｅｂ，Ｄ．Ｉ．（１９９４）． ＦＧＦ ａｎｄ ＥＧＦ ａｒｅ ｍｉｔｏｇｅｎｓ ｆｏｒ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２５、７９７－８０７．
４５． Ｗｉｌｓｏｎ，Ｒ．、Ｖｏｇｅｌｓａｎｇ，Ｅ．、及びＬｅｐｔｉｎ，Ｍ．（２００５）． ＦＧＦ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｍｅｓｏｄｅｒｍ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｅｍｂｒｙｏｓ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３２、４９１－５０１．
４６． Ｋｏｍｏｒｉ，Ｔ．（２０１０）． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｕｎｘ２． Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ６５８、４３－４９．
４７． Ｂｏｙｅｒ，Ｌ．Ａ．、Ｌｅｅ，Ｔ．Ｉ．、Ｃｏｌｅ，Ｍ．Ｆ．、Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｓ．Ｅ．、Ｌｅｖｉｎｅ，Ｓ．Ｓ．、Ｚｕｃｋｅｒ，Ｊ．Ｐ．、Ｇｕｅｎｔｈｅｒ，Ｍ．Ｇ．、Ｋｕｍａｒ，Ｒ．Ｍ．、Ｍｕｒｒａｙ，Ｈ．Ｌ．、Ｊｅｎｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．、Ｇｉｆｆｏｒｄ，Ｄ．Ｋ．、Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．、Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．、及びＹｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．（２００５）． Ｃｏｒｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ １２２、９４７－９５６．
４８． Ａｖｉｌｉｏｎ，Ａ． Ａ．、Ｎｉｃｏｌｉｓ，Ｓ．Ｋ．、Ｐｅｖｎｙ，Ｌ．Ｈ．、Ｐｅｒｅｚ，Ｌ、Ｖｉｖｉａｎ，Ｎ．、及びＬｏｖｅｌｌ－Ｂａｄｇｅ，Ｒ．（２００３）． Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅｓ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄ ｏｎ ＳＯＸ２ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １７、１２６－１４０．
４９． Ｇｒａｈａｍ，Ｖ．、Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ，Ｊ．、Ｅｌｌｉｓ，Ｐ．、及びＰｅｖｎｙ，Ｌ．（２００３）． ＳＯＸ２ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｔｏ ｍａｉｎｔａｉｎ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｉｄｅｎｔｉｔｙ． Ｎｅｕｒｏｎ ３９、７４９－７６５．
５０． Ｐｅｖｎｙ，Ｌ．Ｈ．、及びＮｉｃｏｌｉｓ，Ｓ．Ｋ．（２０１０）． Ｓｏｘ２ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４２、４２１－４２４．
５１． Ｃｉｍａｄａｍｏｒｅ，Ｆ．、Ｆｉｓｈｗｉｃｋ，Ｋ．、Ｇｉｕｓｔｏ，Ｅ．、Ｇｎｅｄｅｖａ，Ｋ．、Ｃａｔｔａｒｏｓｓｉ，Ｇ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．、Ｐｌｕｃｈｉｎｏ，Ｓ．、Ｂｒｉｌｌ，Ｌ．Ｍ．、Ｂｒｏｎｎｅｒ－Ｆｒａｓｅｒ，Ｍ．、及びＴｅｒｓｋｉｋｈ，Ａ．Ｖ．（２０１１）． Ｈｕｍａｎ ＥＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ ｍｏｄｅｌ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｋｅｙ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＳＯＸ２ ｉｎ ｓｅｎｓｏｒｙ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８、５３８－５５１．
５２． Ｍａｒｔｉｎ，Ｂ．Ｌ．、及びＫｉｍｅｌｍａｎ，Ｄ．（２０１０）． Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｓ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｎｉｃｈｅ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２４、２７７８－２７８３．
５３． Ｚｈａｎｇ，Ｘ．、Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｔ．、Ｃｈｅｎ，Ｊ．、Ｐａｎｋｒａｔｚ，Ｍ．Ｔ．、Ｘｉ，Ｊ．、Ｌｉ，Ｊ．、Ｙａｎｇ，Ｙ．、Ｌａｖａｕｔｅ，Ｔ．Ｍ．、Ｌｉ，Ｘ．Ｊ．、Ａｙａｌａ，Ｍ．、Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏ，Ｇ．Ｉ．、Ｄｕ，Ｚ．Ｗ．、Ｊｉｎ，Ｙ．、Ｇｏｌｏｓ，Ｔ．Ｇ．、及びＺｈａｎｇ，Ｓ．Ｃ．（２０１０）． Ｐａｘ６ ｉｓ ａ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ７、９０－１００．
５４． Ｇｒｅｂｅｒ，Ｂ．、Ｃｏｕｌｏｎ，Ｐ．、Ｚｈａｎｇ，Ｍ．、Ｍｏｒｉｔｚ，Ｓ．、Ｆｒａｎｋ，Ｓ．、Ｍｕｌｌｅｒ－Ｍｏｌｉｎａ，Ａ．Ｊ．、Ａｒａｕｚｏ－Ｂｒａｖｏ，Ｍ．Ｊ．、Ｈａｎ，Ｄ．Ｗ．、Ｐａｐｅ，Ｈ．Ｃ．、及びＳｃｈｏｌｅｒ，Ｈ．Ｒ．（２０１１）． ＦＧＦ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｎｅｕｒａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． ＥＭＢＯ Ｊ ３０、４８７４－４８８４．
５５． Ｙａｏ，Ｙ．、Ｌｉ，Ｗ．、Ｗｕ，Ｊ．、Ｇｅｒｍａｎｎ，Ｕ．Ａ．、Ｓｕ，Ｍ．Ｓ．、Ｋｕｉｄａ，Ｋ．、及びＢｏｕｃｈｅｒ，Ｄ．Ｍ．（２００３）． Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ２ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｍｅｓｏｄｅｒｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００、１２７５９－１２７６４．
５６． Ｔａｋｅｍｏｔｏ，Ｔ．、Ｕｃｈｉｋａｗａ，Ｍ．、Ｋａｍａｃｈｉ，Ｙ．、及びＫｏｎｄｏｈ，Ｈ．（２００６）． Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ｗｎｔ ａｎｄ ＦＧＦ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｎｅｕｒａｌ ｐｌａｔｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｘ２ ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｎ－１． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３３、２９７－３０６．
５７． Ｋｏｎｄｏｈ，Ｈ．、及びＴａｋｅｍｏｔｏ，Ｔ．（２０１２）． Ａｘｉａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｉｎｇ ｂｏｔｈ ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｎｅｕｒａｌ ａｎｄ ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２２、３７４－３８０．
５８． Ｙｏｕｎｇ，Ｔ．、Ｒｏｗｌａｎｄ，Ｊ．Ｅ．、ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｎ，Ｃ．、Ｂｉａｌｅｃｋａ，Ｍ．、Ｎｏｖｏａ，Ａ．、Ｃａｒａｐｕｃｏ，Ｍ．、ｖａｎ Ｎｅｓ，Ｊ．、ｄｅ Ｇｒａａｆｆ，Ｗ．、Ｄｕｌｕｃ，Ｉ．、Ｆｒｅｕｎｄ，Ｊ．Ｎ．、Ｂｅｃｋ，Ｆ．、Ｍａｌｌｏ，Ｍ．、及びＤｅｓｃｈａｍｐｓ，Ｊ．（２００９）． Ｃｄｘ ａｎｄ Ｈｏｘ ｇｅｎｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ａｘｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｍｂｒｙｏｓ． Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ １７、５１６－５２６．
５９． Ａｍｉｎ，Ｓ．、Ｎｅｉｊｔｓ，Ｒ．、Ｓｉｍｍｉｎｉ，Ｓ．、ｖａｎ Ｒｏｏｉｊｅｎ，Ｃ．、Ｔａｎ，Ｓ．Ｃ．、Ｋｅｓｔｅｒ，Ｌ．、ｖａｎ Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ，Ａ．、Ｃｒｅｙｇｈｔｏｎ，Ｍ．Ｐ．、及びＤｅｓｃｈａｍｐｓ，Ｊ．（２０１６）． Ｃｄｘ ａｎｄ Ｔ Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ Ｃｏ－ａｃｔｉｖａｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｘｉａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｎｉｃｈｅ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １７、３１６５－３１７７．
６０． Ｋｕｎｚｅ，Ｃ．、Ｂｏｒｎｅｒ，Ｋ．、Ｋｉｅｎｌｅ，Ｅ．、Ｏｒｓｃｈｍａｎｎ，Ｔ．、Ｒｕｓｈａ，Ｅ．、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｍ．、Ｒａｄｉｖｏｊｋｏｖ－Ｂｌａｇｏｊｅｖｉｃ，Ｍ．、Ｄｒｕｋｋｅｒ，Ｍ．、Ｄｅｓｂｏｒｄｅｓ，Ｓ．、Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．、及びＢｒａｃｋ－Ｗｅｒｎｅｒ，Ｒ．（２０１８）． Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＡＡＶ／ＣＲＩＳＰＲ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＨＩＶ－１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ． Ｇｌｉａ ６６、４１３－４２７．
６１． Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．、及びＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，Ｔ．Ｄ．（２００１）． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ２（－Ｄｅｌｔａ Ｄｅｌｔａ Ｃ（Ｔ））Ｍｅｔｈｏｄ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５、４０２－４０８．
６２． Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｈ．（２００９）． ｇｇｐｌｏｔ２： Ｅｌｅｇａｎｔ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ｆｏｒ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）．
６３． Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ（２０１８）． Ｒ： Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ （ウィーン、オーストリア：Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ（統計コンピューティングのためのＲ財団））．
６４． Ｂｒａｙ，Ｎ．Ｌ．、Ｐｉｍｅｎｔｅｌ，Ｈ．、Ｍｅｌｓｔｅｄ，Ｐ．、及びＰａｃｈｔｅｒ，Ｌ．（２０１６）． Ｎｅａｒ－ｏｐｔｉｍａｌ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４、５２５－５２７．
６５． Ｓｏｎｅｓｏｎ，Ｃ．、Ｌｏｖｅ，Ｍ．Ｉ．、及びＲｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｄ．（２０１５）． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ ｆｏｒ ＲＮＡ－ｓｅｑ： ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ－ｌｅｖｅｌ ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｇｅｎｅ－ｌｅｖｅｌ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅｓ． Ｆ１０００Ｒｅｓ ４、１５２１．
６６． Ｌｏｖｅ，Ｍ．Ｉ．、Ｈｕｂｅｒ，Ｗ．、及びＡｎｄｅｒｓ，Ｓ．（２０１４）． Ｍｏｄｅｒａｔｅｄ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ａｎｄ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｆｏｒ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａ ｗｉｔｈ ＤＥＳｅｑ２． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １５、５５０．
６７． Ａｆｇａｎ，Ｅ．、Ｂａｋｅｒ，Ｄ．、Ｂａｔｕｔ，Ｂ．、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｅｋ，Ｍ．、Ｂｏｕｖｉｅｒ，Ｄ．、Ｃｅｃｈ，Ｍ．、Ｃｈｉｌｔｏｎ，Ｊ．、Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，Ｄ．、Ｃｏｒａｏｒ，Ｎ．、Ｇｒｕｎｉｎｇ，Ｂ．Ａ．、Ｇｕｅｒｌｅｒ，Ａ．、Ｈｉｌｌｍａｎ－Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｊ．、Ｈｉｌｔｅｍａｎｎ，Ｓ．、Ｊａｌｉｌｉ，Ｖ．、Ｒａｓｃｈｅ，Ｈ．、Ｓｏｒａｎｚｏ，Ｎ．、Ｇｏｅｃｋｓ，Ｊ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．、Ｎｅｋｒｕｔｅｎｋｏ，Ａ．、及びＢｌａｎｋｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．（２０１８）． Ｔｈｅ Ｇａｌａｘｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ａｎｄ ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ： ２０１８ ｕｐｄａｔｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４６、Ｗ５３７－Ｗ５４４．
６８． Ｂｏｌｇｅｒ，Ａ．Ｍ．、Ｌｏｈｓｅ，Ｍ．、及びＵｓａｄｅｌ，Ｂ．（２０１４）． Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ： ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｔｒｉｍｍｅｒ ｆｏｒ ｌｌｌｕｍｉｎａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０、２１１４－２１２０．
６９． Ｋｉｍ，Ｄ．、Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．、及びＳａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．（２０１５）． ＨＩＳＡＴ： ａ ｆａｓｔ ｓｐｌｉｃｅｄ ａｌｉｇｎｅｒ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｍｅｍｏｒｙ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２、３５７－３６０．
７０． Ｌｉａｏ，Ｙ．、Ｓｍｙｔｈ，Ｇ．Ｋ．、及びＳｈｉ，Ｗ．（２０１４）． ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ： ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｕｒｐｏｓｅ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ａｓｓｉｇｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄｓ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０、９２３－９３０．
７１． Ａｌｅｘａ，Ａ．、及びＲａｈｎｅｎｆｕｈｒｅｒ，Ｊ．（２０１８）． ｔｏｐＧＯ： Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ．
７２． Ｋｕｌｅｓｈｏｖ，Ｍ．Ｖ．、Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．Ｒ．、Ｒｏｕｉｌｌａｒｄ，Ａ．Ｄ．、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｎ．Ｆ．、Ｄｕａｎ，Ｑ．、Ｗａｎｇ，Ｚ．、Ｋｏｐｌｅｖ，Ｓ．、Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｓ．Ｌ．、Ｊａｇｏｄｎｉｋ，Ｋ．Ｍ．、Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ａ．、ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｍ．Ｇ．、Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｃ．Ｄ．、Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎ，Ｇ．Ｗ．、及びＭａ’ａｙａｎ，Ａ．（２０１６）． Ｅｎｒｉｃｈｒ： ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅ ｓｅｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ２０１６ ｕｐｄａｔｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４、Ｗ９０－９７．
７３． Ａｖｉｌｉｏｎ ＡＡ、Ｎｉｃｏｌｉｓ ＳＫ、Ｐｅｖｎｙ ＬＨ、Ｐｅｒｅｚ Ｌ、Ｖｉｖｉａｎ Ｎ、Ｌｏｖｅｌｌ－Ｂａｄｇｅ Ｒ． Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅｓ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄ ｏｎ ＳＯＸ２ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２００３年１月１日；１７（１）：１２６－４０． ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇａｄ．２２４５０３． ＰＭＩＤ：１２５１４１０５；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ１９５９７０．
７４． Ｂｏｙｅｒ ＬＡ、Ｌｅｅ ＴＩ、Ｃｏｌｅ ＭＦ、Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ ＳＥ、Ｌｅｖｉｎｅ ＳＳ、Ｚｕｃｋｅｒ ＪＰ、Ｇｕｅｎｔｈｅｒ ＭＧ、Ｋｕｍａｒ ＲＭ、Ｍｕｒｒａｙ ＨＬ、Ｊｅｎｎｅｒ ＲＧ、Ｇｉｆｆｏｒｄ ＤＫ、Ｍｅｌｔｏｎ ＤＡ、Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ、Ｙｏｕｎｇ ＲＡ． Ｃｏｒｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ． ２００５年９月２３日；１２２（６）：９４７－５６． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２００５．０８．０２０． ＰＭＩＤ：１６１５３７０２；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３００６４４２．
７５． Ｆａｖａｒｏ Ｒ、Ｖａｌｏｔｔａ Ｍ、Ｆｅｒｒｉ ＡＬ、Ｌａｔｏｒｒｅ Ｅ、Ｍａｒｉａｎｉ Ｊ、Ｇｉａｃｈｉｎｏ Ｃ、Ｌａｎｃｉｎｉ Ｃ、Ｔｏｓｅｔｔｉ Ｖ、Ｏｔｔｏｌｅｎｇｈｉ Ｓ、Ｔａｙｌｏｒ Ｖ、Ｎｉｃｏｌｉｓ ＳＫ． Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｒｅｑｕｉｒｅ Ｓｏｘ２－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｈｈ． Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２００９年１０月；１２（１０）：１２４８－５６． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎ．２３９７． ２００９年９月６日電子公開． ＰＭＩＤ：１９７３４８９１．
７６． Ｇｒａｈａｍ Ｖ、Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ Ｊ、Ｅｌｌｉｓ Ｐ、Ｐｅｖｎｙ Ｌ． ＳＯＸ２ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｔｏ ｍａｉｎｔａｉｎ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｉｄｅｎｔｉｔｙ． Ｎｅｕｒｏｎ． ２００３年８月２８日；３９（５）：７４９－６５． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ０８９６－６２７３（０３）００４９７－５． ＰＭＩＤ：１２９４８４４３．
７７． Ｈｅｎｒｉｑｕｅ Ｄ、Ａｂｒａｎｃｈｅｓ Ｅ、Ｖｅｒｒｉｅｒ Ｌ、Ｓｔｏｒｅｙ ＫＧ． Ｎｅｕｒｏｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． ２０１５年９月１日；１４２（１７）：２８６４－７５． ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．１１９７６８． ＰＭＩＤ：２６３２９５９７；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４９５８４５６．
７８． Ｓｈｏｗｅｌｌ Ｃ、Ｂｉｎｄｅｒ Ｏ、Ｃｏｎｌｏｎ ＦＬ． Ｔ－ｂｏｘ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｄｅｖ Ｄｙｎ． ２００４年１月；２２９（１）：２０１－１８． ｄｏｉ：１０．１００２／ｄｖｄｙ．１０４８０． ＰＭＩＤ：１４６９９５９０；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ１６３５８０９．
７９． Ｓｔｉｆａｎｉ Ｎ． Ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｉｎａｌ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ． Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０１４年１０月９日；８：２９３． ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｎｃｅｌ．２０１４．００２９３． ＰＭＩＤ：２５３４６６５９；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４１９１２９８．
８０． Ｔｏｓｉｃ Ｊ、Ｋｉｍ ＧＪ、Ｐａｖｌｏｖｉｃ Ｍ、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ＣＭ、Ｍｅｒｓｉｏｗｓｋｙ ＳＬ、Ｂａｒｇ Ｍ、Ｈｏｆｈｅｒｒ Ａ、Ｐｒｏｂｓｔ Ｓ、Ｋｏｅｔｔｇｅｎ Ｍ、Ｈｅｉｎ Ｌ、Ａｒｎｏｌｄ ＳＪ． Ｅｏｍｅｓ ａｎｄ Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｅｘｉｔ ａｎｄ ｇｅｒｍｌａｙｅｒ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｓｔａｔｅ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２０１９年１２月；２１（１２）：１５１８－１５３１． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５５６－０１９－０４２３－１． ２０１９年１２月２日電子公開． 正誤表：Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２０２０年１月；２２（１）：１３５． ＰＭＩＤ：３１７９２３８３．
８１． Ｗｙｍｅｅｒｓｃｈ ＦＪ、Ｓｋｙｌａｋｉ Ｓ、Ｈｕａｎｇ Ｙ、Ｗａｔｓｏｎ ＪＡ、Ｅｃｏｎｏｍｏｕ Ｃ、Ｍａｒｅｋ－Ｊｏｈｎｓｔｏｎ Ｃ、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ＳＲ、Ｗｉｌｓｏｎ Ｖ． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｙｎａｍｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｒｇａｎｉｓｅｄ ａｒｏｕｎｄ ａ ｓｔａｂｌｅ ｎｉｃｈｅ ｄｒｉｖｅ ａｘｉａｌ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． ２０１９年１月２日；１４６（１）：ｄｅｖ１６８１６１． ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．１６８１６１． ＰＭＩＤ：３０５５９２７７；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ６３４０１４８．
８２． Ｚｈａｎｇ Ｘ、Ｈｕａｎｇ ＣＴ、Ｃｈｅｎ Ｊ、Ｐａｎｋｒａｔｚ ＭＴ、Ｘｉ Ｊ、Ｌｉ Ｊ、Ｙａｎｇ Ｙ、Ｌａｖａｕｔｅ ＴＭ、Ｌｉ ＸＪ、Ａｙａｌａ Ｍ、Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏ Ｇｌ、Ｄｕ ＺＷ、Ｊｉｎ Ｙ、Ｇｏｌｏｓ ＴＧ、Ｚｈａｎｇ ＳＣ． Ｐａｘ６ ｉｓ ａ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． ２０１０年７月２日；７（１）：９０－１００． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１０．０４．０１７． ＰＭＩＤ：２０６２１０５３；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２９０４３４６．
８３． Ｙｉｌｍａｚ Ａ、Ｐｅｒｅｔｚ Ｍ、Ａｈａｒｏｎｙ Ａ、Ｓａｇｉ Ｉ、Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ Ｎ． Ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｈａｐｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２０１８年５月；２０（５）：６１０－６１９． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５５６－０１８－００８８－１． ２０１８年４月１６日電子公開． ＰＭＩＤ：２９６６２１７８．

Claims (20)

  1. 体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）を生成する方法であって、
    ａ）多能性幹細胞、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞を提供する工程であって、好ましくは前記生成の前に、前記多能性細胞は、適切な多能性細胞培地中で維持され、さらに好ましくは、前記適切な多能性細胞培地は、前記生成のためにビタミンＡを含む又は含まないＢ２７サプリメントを補充したＲＰＭＩ１６４０培地で置き換えられる工程と、
    ｂ）前記多能性幹細胞、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞においてＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路を活性化する工程であって、好ましくは、前記活性化は、ＧＳＫ３ｂタンパク質の阻害剤を使用することによって行われ、さらに好ましくは、前記阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、さらに最も好ましくは前記ＣＨＩＲ９９０２１阻害剤は約５μＭ～約１０μＭの濃度で使用され、さらに最も好ましくは前記ＣＨＩＲ９９０２１阻害剤は約２４時間使用される工程と、
    ｃ）工程（ｂ）から誘導される細胞を、継代の間の前記細胞における前記Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の連続活性化の条件下で継代する工程であって、好ましくは、前記継代は少なくとも約３～９回行われ、さらに好ましくは前記継代は連続継代であり、さらに最も好ましくは前記継代は、工程（ｂ）から誘導される細胞を、新鮮な無血清培地中により低い密度で再播種することを含み、好ましくは、前記Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の前記連続活性化は、前記Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の阻害剤を使用することによって行われ、さらに好ましくは、前記阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、さらに最も好ましくは前記ＣＨＩＲ９９０２１阻害剤は少なくとも約５μＭの濃度で使用され、工程（ｃ）から誘導される細胞は、転写因子ＳＯＸ－２を内因的に発現している工程と
    を含み、
    ｄ）任意選択で、工程（ｃ）からの前記Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の前記連続活性化は、線維芽細胞増殖因子２及び／又はＴＧＦ－β阻害剤の存在下で行われ、好ましくは、
    ｄ１）工程（ｃ）からの前記Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の前記連続活性化は、約５μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１阻害剤を用いて、線維芽細胞増殖因子２及びＴＧＦ－β阻害剤の存在下で行われ、さらに好ましくは、前記ＴＧＦ－β阻害剤はＳＢ－４３１５４２であり、さらに最も好ましくは、前記ＳＢ－４３１５４２阻害剤は約１０μＭの濃度で使用され、さらにさらに最も好ましくは前記線維芽細胞増殖因子２は約２０～約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用され、工程（ｄ１）から誘導される細胞は、転写因子ＳＯＸ－２、Ｔ－ｂｏｘ転写因子Ｔ及びホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１を内因的に発現しているが、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－６内因的に発現しておらず、任意選択で、ホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２をさらに内因的に発現しているか、又は
    ｄ２）工程（ｃ）からの前記Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の前記連続活性化は、約５μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１阻害剤を用いて、好ましくはＴＧＦ－β阻害剤の存在下で行われ、さらに好ましくは、前記ＴＧＦ－β阻害剤はＳＢ－４３１５４２であり、さらに最も好ましくは前記ＳＢ－４３１５４２阻害剤は約１０μＭの濃度で使用され、工程（ｄ２）から誘導される細胞は、転写因子ＳＯＸ－２及びペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－６を内因的に発現しているが、Ｔ－ｂｏｘ転写因子Ｔ、ホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１及びホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２を内因的に発現していないか、又は
    ｄ３）工程（ｃ）からの前記Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の前記連続活性化は、約７．５μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１阻害剤を用いて、好ましくはＴＧＦ－β阻害剤の存在下で行われ、さらに好ましくは、前記ＴＧＦ－β阻害剤はＳＢ－４３１５４２であり、さらに最も好ましくは前記ＳＢ－４３１５４２阻害剤は約１０μＭの濃度で使用され、工程（ｄ３）から誘導される細胞は、転写因子ＳＯＸ－２、Ｔ－ｂｏｘ転写因子Ｔ、ホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１及びペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－６を内因的に発現しており、任意選択で、ホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２をさらに内因的に発現している、体軸幹細胞を生成する方法。
  2. 前記工程（ｃ）及び／又は工程（ｄ）に由来する前記細胞を継代する工程をさらに含む請求項１に記載の体軸幹細胞を生成する方法。
  3. 工程（ｄ）を含み、工程（ｄ１）、（ｄ２）又は（ｄ３）をさらに含む請求項１又は請求項２に記載の体軸幹細胞を生成する方法。
  4. 前記体軸幹細胞が、以下の特徴、
    ｉ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１若しくは配列番号２１を有する転写因子ＳＯＸ－２を発現する、
    ｉｉ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０１８６０若しくは配列番号２２を有するＯＣＴ４転写因子を実質的に発現しない、
    ｉｉｉ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ９Ｓ０若しくは配列番号２３を有するホメオボックスタンパク質ＮＡＮＯＧを実質的に発現しない、
    ｉｖ）多能性ではない、
    ｖ）領域特異的分化複能性幹細胞である、
    ｖｉ）多能性幹細胞、胚性幹細胞若しくは人工多能性幹細胞から得ることができる、
    ｖｉｉ）胚のすべての組織の細胞型に分化することができるわけではない、
    ｖｉｉｉ）胚発生中に中心体軸の領域から出現する細胞型、好ましくは硬節、皮筋板及び末梢ニューロンにのみ分化することができる、
    ｉｘ）奇形種を形成することができない、
    ｘ）軸領域、好ましくは運動ニューロン、末梢ニューロン、末梢神経系ニューロン、感覚ニューロン、骨、軟骨、腱、靱帯及び／若しくは骨格筋の細胞を生じる前駆体の特性を模倣することができる、
    ｘｉ）一過性細胞ではない、
    ｘｉｉ）運動ニューロン、末梢ニューロン、筋肉、軟骨若しくは骨の前駆体に分化することができる、
    ｘｉｉｉ）無制限に複製する幹細胞である、
    ｘｉｖ）クローンとして増殖することができる、
    ｘｖ）神経中胚葉前駆体（ＮＭｐ）ではない、並びに／又は
    ｘｖｉ）人工神経幹細胞（ｉＮＳＣ）ではない
    のうちの１つ以上を有する請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の体軸幹細胞を生成する方法。
  5. 前記体軸幹細胞が神経中胚葉前駆体（ＮＭｐ）ではなく、前記体軸幹細胞が、以下のタンパク質、
    ｉ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４１９８又は配列番号３２を有するＮ－ｍｙｃ癌原遺伝子タンパク質（ＭＹＣＮ）、
    ｉｉ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ６ＺＮ１７又は配列番号３１を有するタンパク質ｌｉｎ－２８ホモログＢ（ＬＩＮ２８Ｂ）、
    ｉｉｉ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ７８４１５又は配列番号３４を有するＩｒｏｑｕｏｉｓクラスホメオドメインタンパク質ＩＲＸ－３（ＩＲＸ３）、
    ｉｖ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ００５７０又は配列番号３５を有する転写因子ＳＯＸ－１（ＳＯＸ１）、
    ｖ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ９５４０９又は配列番号３３を有するジンクフィンガータンパク質ＺＩＣ２（ＺＩＣ２）、
    ｖｉ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３５７１６又は配列番号３６を有する転写因子ＳＯＸ－１１（ＳＯＸ１１）、
    のうちの１つ以上を発現し、
    ｖｉｉ）好ましくは、前記ＡｘＳＣは、ＭＹＣＮ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＺＩＣ２及びＳＯＸ１１を発現する基底状態ＡｘＳＣであり、
    ｖｉｉｉ）好ましくは、前記ＡｘＳＣは、ＭＹＣＮ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＩＲＸ３、ＳＯＸ１、ＺＩＣ２及びＳＯＸ１１を発現するであるプライミング状態ＡｘＳＣである
    請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の体軸幹細胞を生成する方法。
  6. 前記体軸幹細胞が、
    ｉ）基底体軸幹細胞であって、好ましくは、前記基底体軸幹細胞は無制限に複製する基底体軸幹細胞であり、前記基底体軸幹細胞は、
    ａ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１又は配列番号２１を有する転写因子ＳＯＸ－２、
    ｂ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８又は配列番号２４を有するＴ－ｂｏｘ転写因子Ｔ、
    ｃ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６２６又は配列番号２５を有するホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２、及び
    ｄ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ２Ｗ２又は配列番号２６を有するホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１
    を発現する基底体軸幹細胞に、
    ｉｉ）プライミング状態体軸幹細胞であって、好ましくは、前記プライミング状態体軸幹細胞は無制限に複製するプライミング状態体軸幹細胞であり、前記プライミングされた体軸幹細胞は、
    ｅ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１又は配列番号２１を有する転写因子ＳＯＸ－２、及び
    ｆ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７又は配列番号２７を有するペアードボックスタンパク質ＰＡＸ－６
    を発現するプライミング状態体軸幹細胞に
    無制限に複製及び分化することができる請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の体軸幹細胞を生成する方法。
  7. 前記体軸幹細胞がヒト体軸幹細胞である請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の体軸幹細胞を生成する方法。
  8. 請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の体軸幹細胞を生成する方法によって生成される体軸幹細胞。
  9. 単離された体軸幹細胞（ＡｘＳＣ）であって、前記体軸幹細胞は、転写因子ＳＯＸ－２を発現し、ＯＣＴ４転写因子を実質的に発現せず、ホメオボックスタンパク質ＮＡＮＯＧを実質的に発現せず、前記ＡｘＳＣは多能性ではなく、前記ＡｘＳＣは、以下の特徴、
    ｉ）領域特異的分化複能性幹細胞である、
    ｉｉ）多能性幹細胞、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞から得ることができる、
    ｉｉｉ）胚のすべての組織の細胞型に分化することができるわけではない、
    ｉｖ）胚発生中に中心体軸の領域から出現する細胞型、好ましくは硬節、皮筋板及び末梢ニューロンにのみ分化することができる、
    ｖ）奇形種を形成することができない、
    ｖｉ）軸領域、好ましくは運動ニューロン、末梢ニューロン、末梢神経系ニューロン、感覚ニューロン、骨、軟骨、腱、靱帯及び／又は骨格筋の細胞を生じる前駆体の特性を模倣することができる、
    ｖｉｉ）一過性細胞ではない、
    ｖｉｉｉ）運動ニューロン、末梢ニューロン、筋肉、軟骨又は骨の前駆体に分化することができる、
    ｉｘ）無制限に複製する幹細胞である、
    ｘ）クローンとして増殖することができる、
    ｘｉ）神経中胚葉前駆体（ＮＭｐ）ではない、
    ｘｉｉ）人工神経幹細胞（ｉＮＳＣ）ではない
    のうちの１つ以上さらに有する体軸幹細胞。
  10. 前記体軸幹細胞が神経中胚葉前駆体（ＮＭｐ）ではなく、前記体軸幹細胞が、以下のタンパク質、
    ｉ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４１９８又は配列番号３２を有するＮ－ｍｙｃ癌原遺伝子タンパク質（ＭＹＣＮ）、
    ｉｉ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ６ＺＮ１７又は配列番号３１を有するタンパク質ｌｉｎ－２８ホモログＢ（ＬＩＮ２８Ｂ）、
    ｉｉｉ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ７８４１５又は配列番号３４を有するＩｒｏｑｕｏｉｓクラスホメオドメインタンパク質ＩＲＸ－３（ＩＲＸ３）、
    ｉｖ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ００５７０又は配列番号３５を有する転写因子ＳＯＸ－１（ＳＯＸ１）、
    ｖ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ９５４０９又は配列番号３３を有するジンクフィンガータンパク質ＺＩＣ２（ＺＩＣ２）、
    ｖｉ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３５７１６又は配列番号３６を有する転写因子ＳＯＸ－１１（ＳＯＸ１１）
    のうちの１つ以上を発現し、
    ｖｉｉ）好ましくは、前記ＡｘＳＣは、ＭＹＣＮ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＺＩＣ２及びＳＯＸ１１を発現する基底状態ＡｘＳＣであり、
    ｖｉｉｉ）好ましくは、前記ＡｘＳＣは、ＭＹＣＮ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＩＲＸ３、ＳＯＸ１、ＺＩＣ２及びＳＯＸ１１を発現するプライミング状態ＡｘＳＣである
    請求項９に記載の体軸幹細胞。
  11. 前記体軸幹細胞が、自身を無制限に複製することができ、
    ｉ）基底体軸幹細胞であって、前記基底体軸幹細胞は、
    ａ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１又は配列番号２１を有する転写因子ＳＯＸ－２、
    ｂ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１５１７８又は配列番号２４を有するＴ－ｂｏｘ転写因子Ｔ、
    ｃ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６２６又は配列番号２５を有するホメオボックスタンパク質ＣＤＸ－２、及び
    ｄ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｈ２Ｗ２又は配列番号２６を有するホメオボックスタンパク質ＭＩＸＬ１
    を発現する基底体軸幹細胞に、
    ｉｉ）プライミング状態体軸幹細胞であって、前記プライミングされた体軸幹細胞は、
    ｅ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４８４３１又は配列番号２１を有する転写因子ＳＯＸ－２、及び
    ｆ）好ましくはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６３６７又は配列番号２７を有するペアードボックスタンパク質ＰＡＸ－６
    を発現するプライミング状態体軸幹細胞に
    分化することができる請求項９又は請求項１０に記載の体軸幹細胞。
  12. 前記体軸幹細胞がヒト体軸幹細胞である請求項９から請求項１１のいずれか１項に記載の体軸幹細胞。
  13. 前記体軸幹細胞が、請求項９から請求項１２のいずれか１項に記載の体軸幹細胞である請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の体軸幹細胞を生成する方法。
  14. 請求項８から請求項１２のいずれか１項に記載の体軸幹細胞を含む組成物、調製物又はキット。
  15. 前記組成物、調製物又はキットが、医薬及び／又は診断用の組成物、調製物又はキットである請求項１４に記載の組成物、調製物又はキット。
  16. 医薬として使用するための、請求項８から請求項１２及び請求項１４から請求項１５のいずれか１項に記載の体軸幹細胞、組成物、調製物又はキット。
  17. ｉ）神経変性疾患の治療、低減、予防及び／又は診断の方法、
    ｉｉ）骨及び／若しくは軟骨の障害の治療、低減、予防並びに／又は診断の方法、
    ｉｉｉ）筋障害の治療、低減、予防及び／又は診断の方法、
    ｉｖ）細胞、組織、器官及び／又は身体の再生治療の方法、
    ｖ）疾患、好ましくは末梢神経系の疾患、又は体軸幹細胞に関連する疾患、好ましくは筋肉関連、運動ニューロン関連、末梢ニューロン関連、感覚ニューロン関連、軟骨関連、腱関連の疾患に対する活性について、及び／又は神経毒性スクリーニングについて候補化合物をスクリーニングする方法、
    ｖｉ）体軸幹細胞に関連する疾患、好ましくは筋肉関連、運動ニューロン関連、末梢ニューロン関連、感覚ニューロン関連、軟骨関連、腱関連の疾患の治療、低減、予防及び／又は診断の方法、
    ｖｉｉ）インビトロ、エキソビボ又はインビボでの方法である（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか
    のうちの１つ以上において使用するための請求項８から請求項１２及び請求項１４から請求項１６のいずれか１項に記載の体軸幹細胞、組成物、調製物又はキット。
  18. 必要とする試料又は対象の状態を改善する方法であって、前記方法は、以下の、
    ｉ）神経変性疾患の治療、低減、予防及び／又は診断の方法、
    ｉｉ）骨及び／若しくは軟骨の障害の治療、低減、予防並びに／又は診断の方法、
    ｉｉｉ）筋障害の治療、低減、予防及び／又は診断の方法、
    ｉｖ）細胞、組織、器官及び／又は身体の再生治療の方法、
    ｖ）疾患、好ましくは末梢神経系の疾患に対する活性について、及び／又は神経毒性スクリーニングについて、候補化合物をスクリーニングする方法
    のうちの１つ以上であり、
    前記方法は、
    ａ）請求項８から請求項１２及び請求項１４から請求項１７のいずれか１項に記載の体軸幹細胞、組成物、調製物又はキットを前記試料又は対象に提供する工程と、
    ｂ）治療有効量の前記体軸幹細胞、組成物、調製物又はキットを前記試料又は対象に投与する工程と
    を含む方法。
  19. 前記方法が、インビトロ、エキソビボ又はインビボでの方法である請求項１８に記載の方法。
  20. ｉ）神経変性疾患の治療、低減、予防及び／又は診断、
    ｉｉ）骨及び／若しくは軟骨の障害の治療、低減、予防並びに／又は診断、
    ｉｉｉ）筋障害の治療、低減、予防及び／又は診断、
    ｉｖ）細胞、組織、器官及び／又は身体の再生治療、
    ｖ）疾患、好ましくは末梢神経系の疾患に対する活性について、及び／又は神経毒性スクリーニングについて、候補化合物をスクリーニングすること、
    ｖｉ）インビトロ、エキソビボ又はインビボでの使用である（ｉ）～（ｖ）のいずれか、
    のうちの１つ以上のための、請求項８から請求項１２及び請求項１４から請求項１７のいずれか１項に記載の体軸幹細胞、組成物、調製物及び／又はキットの使用。
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