JP2023070667A - 腎臓オルガノイド及びその製造方法 - Google Patents
腎臓オルガノイド及びその製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023070667A JP2023070667A JP2022178961A JP2022178961A JP2023070667A JP 2023070667 A JP2023070667 A JP 2023070667A JP 2022178961 A JP2022178961 A JP 2022178961A JP 2022178961 A JP2022178961 A JP 2022178961A JP 2023070667 A JP2023070667 A JP 2023070667A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- organoids
- kidney organoids
- kidney
- cells
- differentiating
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 title claims abstract description 138
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 title claims abstract description 100
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 58
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 12
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims description 38
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 claims description 35
- 102100037665 Fibroblast growth factor 9 Human genes 0.000 claims description 29
- 101001027380 Homo sapiens Fibroblast growth factor 9 Proteins 0.000 claims description 29
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 28
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 27
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 19
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 102000019058 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Human genes 0.000 claims description 11
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 claims description 11
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 claims description 9
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 claims description 8
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 claims description 7
- 101000762379 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 4 Proteins 0.000 claims description 7
- 210000000512 proximal kidney tubule Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 210000000210 loop of henle Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 49
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 32
- 210000000885 nephron Anatomy 0.000 description 20
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 11
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 9
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 9
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 9
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 8
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 7
- 102100021851 Calbindin Human genes 0.000 description 7
- 101000898082 Homo sapiens Calbindin Proteins 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 210000004926 tubular epithelial cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 210000000557 podocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 3
- 241000766026 Coregonus nasus Species 0.000 description 3
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 3
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 101000595198 Homo sapiens Podocalyxin Proteins 0.000 description 3
- 102100036031 Podocalyxin Human genes 0.000 description 3
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000003491 array Methods 0.000 description 3
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 210000001439 intercalated cell Anatomy 0.000 description 3
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 description 3
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 description 3
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001811 primitive streak Anatomy 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 4-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]-3-pyrazolo[1,5-a]pyrimidinyl]quinoline Chemical compound C1CNCCN1C1=CC=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C3=CC=CC=C3N=CC=2)C=C1 CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022992 Anoctamin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010036221 Aquaporin 2 Proteins 0.000 description 2
- 108010036280 Aquaporin 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100034414 Aquaporin-2 Human genes 0.000 description 2
- 102100037276 Aquaporin-4 Human genes 0.000 description 2
- 102000016955 Erythrocyte Anion Exchange Protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 101000757261 Homo sapiens Anoctamin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000749634 Homo sapiens Uromodulin Proteins 0.000 description 2
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 102100035278 Pendrin Human genes 0.000 description 2
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006507 SLC26A4 Proteins 0.000 description 2
- 108091006318 SLC4A1 Proteins 0.000 description 2
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 description 2
- 102100040613 Uromodulin Human genes 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 description 2
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000003589 nefrotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000381 nephrotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000002620 ureteric effect Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGWLYQZDNFIFRX-UHFFFAOYSA-N 5-[3-[2-[3-(3,8-diamino-6-phenylphenanthridin-5-ium-5-yl)propylamino]ethylamino]propyl]-6-phenylphenanthridin-5-ium-3,8-diamine;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C=1C(N)=CC=C(C2=CC=C(N)C=C2[N+]=2CCCNCCNCCC[N+]=3C4=CC(N)=CC=C4C4=CC=C(N)C=C4C=3C=3C=CC=CC=3)C=1C=2C1=CC=CC=C1 BGWLYQZDNFIFRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033350 ATP-dependent translocase ABCB1 Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000004888 Aquaporin 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090001004 Aquaporin 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000012583 B-27 Supplement Substances 0.000 description 1
- 101150092532 CALB1 gene Proteins 0.000 description 1
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- -1 ECM molecules Substances 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 102000016970 Follistatin Human genes 0.000 description 1
- 108010014612 Follistatin Proteins 0.000 description 1
- 102100038367 Gremlin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100027332 Homeobox protein SIX2 Human genes 0.000 description 1
- 101001032872 Homo sapiens Gremlin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000651912 Homo sapiens Homeobox protein SIX2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 206010023435 Kidney small Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 108010047230 Member 1 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 1
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108091006574 SLC34A1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034201 Sclerostin Human genes 0.000 description 1
- 108050006698 Sclerostin Proteins 0.000 description 1
- 102100025262 Sodium-dependent phosphate transport protein 2A Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 102000006533 chordin Human genes 0.000 description 1
- 108010008846 chordin Proteins 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- XHBVYDAKJHETMP-UHFFFAOYSA-N dorsomorphin Chemical compound C=1C=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C=CN=CC=2)C=CC=1OCCN1CCCCC1 XHBVYDAKJHETMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001523 electrospinning Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 1
- 230000007045 gastrulation Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029795 kidney development Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007959 normoxia Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000005238 principal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000005234 proximal tubule cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 1
- QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N tacrolimus Natural products CO[C@H]1C[C@H](CC[C@@H]1O)C=C(C)[C@H]2OC(=O)[C@H]3CCCCN3C(=O)C(=O)[C@@]4(O)O[C@@H]([C@H](C[C@H]4C)OC)[C@@H](C[C@H](C)CC(=C[C@@H](CC=C)C(=O)C[C@H](O)[C@H]2C)C)OC QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N 0.000 description 1
- 229960001967 tacrolimus Drugs 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003856 thermoforming Methods 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
- C12N5/0686—Kidney cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2513/00—3D culture
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【課題】 腎臓オルガノイドとその製造方法を提供すること。【解決手段】 幹細胞を後腎間葉（ｍｅｔａｎｅｐｈｒｉｃ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ）細胞に分化させる第１ステップと、後腎間葉細胞を培養して細胞凝集体を形成する第２ステップと、後腎間葉細胞凝集体を腎臓オルガノイドに分化させる第３ステップと、を含む。【選択図】 図５
Description
本発明は、腎臓オルガノイド及びそれを製造する方法に係り、より詳細には、透過性多孔質ウェル及び新しいプロトコルを適用して、より向上したネフロン構造を有する腎臓オルガノイドを形成する方法を提供する。
胚性幹細胞（ＥＳＣ：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ：ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）を含む多能性幹細胞（ＰＳＣ：Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）分化は、腎臓を含む様々な組織のオルガノイドモデルの生成を可能にした。
腎臓オルガノイドは、腎臓の発達過程を模して形成される三次元細胞凝集体であり、様々な腎臓細胞で構成されており、腎臓に似ている構造を具現化することにより、薬物の腎毒性評価及び腎疾患治療剤の研究などのためのｉｎ ｖｉｔｒｏ腎臓モデルへの潜在性を示している。そこで、腎臓オルガノイド形成のために多くの研究が行われており、様々な腎臓オルガノイド形成方法が提案されてきた。
一般に、三次元腎臓オルガノイドを形成するには、細胞を三次元凝集体にすることができるウェルプレートやマイクロウェルアレイ（ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ａｒｒａｙ）などのウェル型プラットフォームが用いられる。しかしながら、従来の不透過性ウェルの場合、栄養素及び成長因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）の供給と代謝物（ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ）の除去が円滑に行われないため、腎臓オルガノイドの生存率が低下し、未成熟の原因となる可能性がある。
一方、最近、幹細胞分野の進歩に伴い、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から腎臓オルガノイドを生成するためのいくつかの異なるプロトコルが確立されている。ｈＰＳＣ由来の腎臓オルガノイドは、ネフロン様配列（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）として足細胞（ｐｏｄｏｃｙｔｅ）、近位尿細管上皮細胞（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｕｂｕｌｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）及び遠位尿細管上皮細胞（ｄｉｓｔａｌ ｔｕｂｕｌｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）を含む分節構造を持っている。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｈＰＳＣ－腎臓オルガノイドとｉｎ ｖｉｖｏでの腎臓組織の比較分析は、腎臓オルガノイドがヒト腎臓の発達を再現することを示した。しかしながら、ネフロン様構造の限られた血管化（ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）及び未成熟問題は、依然として克服すべき課題である。
したがって、本発明の一態様は、透過性多孔質ウェル及び新しいプロトコルを適用して、より向上したネフロン構造を有する腎臓オルガノイドの製造方法を提供することである。
本発明の一態様によれば、幹細胞を後腎間葉細胞に分化させる第１ステップと、前記後腎間葉細胞を培養して細胞凝集体を形成する第２ステップと、前記後腎間葉細胞凝集体を腎臓オルガノイドに分化させる第３ステップと、を含む、腎臓オルガノイドの製造方法を提供する。
また、本発明による腎臓オルガノイドの製造方法において、前記後腎間葉細胞に分化させＲ第１ステップは、酸素濃度１０％未満の低酸素環境下で行われてもよい。
さらに、本発明による腎臓オルガノイドの製造方法において、前記後腎間葉細胞に分化させる第１ステップは、ｉ）ＧＳＫ－３β阻害剤及びＢＭＰ４阻害剤を含む培地、ｉｉ）アクチビンＡを含む培地、ｉｉｉ）ＦＧＦ９を含む培地、及びこれらのうちの少なくとも２つを混合した培地、のうちの少なくとも１つの培地で培養するステップを含み、８～９日間行われてもよい。
さらにまた、本発明による腎臓オルガノイドの製造方法において、前記細胞凝集体を形成する第２ステップは、ＧＳＫ－３β阻害剤及びＦＧＦ９を含む培地で２～３日間行われてもよい。
さらにまた、本発明による腎臓オルガノイドの製造方法において、前記腎臓オルガノイドに分化させる第３ステップは、ＦＢＳを含む培地で７～１００日間行われてもよい。
さらにまた、本発明による腎臓オルガノイドの製造方法において、前記第２ステップ及び第３ステップはマイクロウェルで行われてもよい。
さらにまた、本発明による腎臓オルガノイドの製造方法において、前記マイクロウェルは１つ以上の凹部を含んでいてもよい。
さらにまた、本発明による腎臓オルガノイドの製造方法において、前記マイクロウェルは多孔質マイクロウェルであってもよい。
さらにまた、本発明による腎臓オルガノイドは、低酸素条件下で形成された後腎間葉細胞凝集体から分化した腎臓オルガノイドであって、前記腎臓オルガノイドは、正常酸素条件下で形成された後腎間葉細胞凝集体から分化した腎臓オルガノイドに比べて、近位尿細管に対応するｍＲＮＡ、ヘンレループに対応するｍＲＮＡ、及び遠位尿細管に対応するｍＲＮＡのうちの少なくとも一つの発現量が相対的に高いことを特徴とし、前記低酸素条件は、酸素濃度１％超過～１０％未満であり、前記正常酸素条件は、酸素濃度１０％以上であってもよい。
本発明によれば、新しいプロトコルの適用により分化成功率が向上し、より明瞭な尿細管構造が形成でき、さらに透過性ウェルを活用することにより、より向上したネフロン機能を発現する腎臓オルガノイドを形成することができる。したがって、本発明により得られる腎臓オルガノイドを用いる場合、腎臓関連疾患の研究や腎毒性薬物の評価などのｉｎ ｖｉｔｒｏ腎臓モデルが用いられる分野において、実際のｉｎ ｖｉｖｏ腎臓の疾患や薬物の吸収などの現象をｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣することができるので、製薬分野や組織工学分野で広く活用できる。
以下、添付図面を参照して本発明の好適な実施形態について説明する。しかし、本発明の実施形態は種々の他の形態に変形でき、本発明の範囲は以下で説明する実施形態に限定されるものではない。
本発明の腎臓オルガノイドの製造方法は、幹細胞を後腎間葉（ｍｅｔａｎｅｐｈｒｉｃ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ）細胞に分化させる第１ステップと、後腎間葉細胞を培養して細胞凝集体を形成する第２ステップと、後腎間葉細胞凝集体を腎臓オルガノイドに分化させる第３ステップと、を含む。
本発明で使用可能な前記幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）及び胚性幹細胞（ＥＳＣ）のうちの少なくとも一つであり得、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。
本発明で使用できる基本培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地であり、例えば、ＩＭＤＭ培地、メディウム（Ｍｅｄｉｕｍ）１９９培地、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ：Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、アルファ最小必須培地（αＭＥＭ：ａｌｐｈａ－ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１２（Ｈａｍ’ｓＦ１２）培地、ロズウェル・パーク・メモリアル・インスティテュート（ＲＰＭＩ）１６４０培地、高度ＲＰＭＩ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ）１６４０培地、フィッシャー培地（Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ）、基本培地イーグル（ＢＭＥ：Ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ’ｓ）、ＭＣＤＢ培地（ＭＣＤＢ ｍｅｄｉａ）及びこれらの混合培地などが含まれる。例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０は、ＲＰＭＩ １６４０よりもＦＢＳの含有量が少ないため、、細胞の成長率や細胞の形態及び機能の変化なしに、より再現性の高い実験を行うことができ、好ましい。
必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、ノックアウト血清交換（ＫＳＲ：ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（ＥＳ細胞培養時の血清代替物）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ビタミン、成長因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類及びこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有してもよい。ＲｅｐｒｏＦＦ２（リプロセル）、ＳｔｅｍＦｉｔ Ｂａｓｉｃ ｍｅｄｉｕｍ（味の素株式会社）など予め幹細胞培養用に最適化した培地を用いてもよい。
一方、前記後腎間葉細胞に分化させる第１ステップは、酸素濃度が１％超～１０％未満の低酸素雰囲気下で行うことが好ましく、例えば、１％超～５％以下の酸素分圧であることが好ましい。前記第１ステップにおいて酸素濃度が１０％以上である場合、分化の初期ステップである第１ステップで好ましくは約４日目に現れるべきドーム様の形状の安定した誘導に問題があった。また、前記第１ステップにおいて酸素濃度が１％である場合、９日目までの分化の結果、腎臓オルガノイドが比較的小さく形成され、ネフロン構造の観察が困難であり、形成されたオルガノイドの個数も、酸素濃度５％の条件での分化に比べて著しく減少する様子を示したので、酸素濃度が１％以下である条件では、分化が不安定であるという問題があることが確認された。
実際のヒト胚の発達過程の初期には血管化がされておらず、低酸素環境で発達が進行し、このような低酸素条件下での腎臓の発達が、低酸素誘導因子であるＨＩＦの活性化を通じて尿細管形成を向上させるという点に基づいて、本発明では、腎臓オルガノイド分化の際、初期ステップである第１ステップでの雰囲気を、胚発達環境である低酸素条件にした。一方、第２ステップ及び第３ステップでは、正常酸素分圧で分化を行った。このように、前記第１ステップで低酸素条件が導入された新しいプロトコルで分化した腎臓オルガノイドは、第３ステップ完了後、例えば、２１日目で、低酸素条件が導入されていない条件で分化した腎臓オルガノイドに比べて、再現率の高い明瞭な尿細管構造を表すことができる。
一方、前記後腎間葉細胞に分化させる第１ステップは、ｉ）ＧＳＫ－３β阻害剤及びＢＭＰ４阻害剤を含む培地、ｉｉ）アクチビンＡを含む培地、ｉｉｉ）ＦＧＦ９を含む培地、及びこれらのうちの少なくとも２つを混合した培地、のうちの少なくとも１つの培地で培養するステップを含み、８～１０日間行われてもよい。
例えば、前記後腎間葉細胞に分化させる第１ステップは、ｉ）ＧＳＫ－３β阻害剤及びＢＭＰ４阻害剤を含む培地、ｉｉ）アクチビンＡを含む培地、及びｉｉｉ）ＦＧＦ９を含む培地で順次、培地当たり１～４日間培養するステップを含むことが好ましい。例えば、ｉ）ＧＳＫ－３β阻害剤及びＢＭＰ４阻害剤を含む培地で約４日間、ｉｉ）アクチビンＡを含む培地で約３日間、及びｉｉｉ）ＦＧＦ９を含む培地で約２日間、順次培養してもよい。
前記ＢＭＰ４阻害剤としては、コーディン（Ｃｈｏｒｄｉｎｄ）、ノギン（ＮＯＧＧＩＮ）、フォリスタチン（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）等のタンパク質性阻害剤、ドルソモルフィン（６－［４－（２－ピペリジン－１－イル－エトキシ）フェニル］－３－ピリジン－４－イル－ピラゾロ［１，５］－ａ］ピリミジン）、ＬＤＮ１９３１８９（４－（６－（４－（ピペラジン－１－イル）フェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル）キノリン）、グレムリン（Ｇｒｅｍ１），スクレロスチン，ねじれ原腸形成（Ｔｗｉｓｔｅｄ ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ）（Ｔｓｇ）タンパク質などが挙げられる。好ましいＢＭＰ４阻害剤は、ＮＯＧＧＩＮであり、その濃度は、例えば、１～１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５～２０ｎｇ／ｍｌであってもよい。
前記ＧＳＫ－３β阻害剤としては、例えば、ＣＨＩＲ、ＣＨＩＲ９９０２１などが挙げられる。ＧＳＫ－３β阻害剤の濃度は、使用するＧＳＫ－３β阻害剤に応じて当業者が適宜選択可能であるが、例えば、０．０１～１００μＭ、好ましくは０．１～１０μＭである。
前記細胞凝集体を形成する第２ステップは、ＧＳＫ－３β阻害剤及びＦＧＦ９を含む培地で２～３日間行われることが好ましい。
一方、前記第１ステップ及び第２ステップで使用する培地のＦＧＦ９濃度は、５ｎｇ／ｍｌ以上２５ｎｇ／ｍｌ未満の濃度であり、ＦＧＦ９濃度が５ｎｇ／ｍｌ未満の場合、ネフロン幹細胞の発達と維持に問題があり、２５ｎｇ／ｍｌ以上の場合、腎臓オルガノイドへの分化効率が不安定であるという問題がある。
前記腎臓オルガノイドに分化させる第３ステップは、ＦＢＳを含む培地で７～１００日間、例えば、１０～５０日間、または１５～３０日間、例えば、１６～２１日間行われることが好ましい。例えば、前記腎臓オルガノイドに分化させる第３ステップは、培地組成物の全体積に対して０．５～５体積％のＦＢＳを含む培地で７～１００日間行われる。ＦＢＳ濃度が０．５体積％未満の場合、形成される腎臓オルガノイドのネフロン構造の観察に問題があり、５体積％超過の場合、細胞の成長率や遺伝子及びタンパク質発現に影響を与え、細胞の表現型が変わることがあるため、腎臓オルガノイドに分化させるのに問題がある。
前述のように、ＦＢＳ成分を含む場合、三次元構造の腎臓オルガノイドに、ＦＢＳ内に含まれる成長因子、ＥＣＭ分子、ホルモン等を供給することにより、分化が完了するまで細胞の生存率を維持しつつ分化を正常に行うことができる。
一方、前記腎臓オルガノイドに分化させる第３ステップは、２５～５０ｎｇ／ｍｌ、例えば、２５～４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９をさらに含んで２～５日間培養するステップを含むもので、前記第１ステップ及び第２ステップにおける低濃度のＦＧＦ９とは異なり、高濃度のＦＧＦ９を含んで行われることが好ましい。前記第３ステップにおけるＦＧＦ９濃度が２５ｎｇ／ｍｌ未満の場合、腎臓オルガノイドが発達した尿細管構造を有することに問題があり、５０ｎｇ／ｍｌ超過の場合、細胞増殖率に影響を与え、腎臓オルガノイドを安定して分化させることに問題がある。
一方、前記２５～５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９をさらに含んで２～５日間培養するステップは、前記第３ステップの開始時点または初期に含まれるものであってもよく、好ましくは、第３ステップの開始から２～５日間、２５～５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９をさらに含む培地を用いて培養を行う。
第２ステップで細胞凝集体に分化する場合、成長因子が細胞凝集体に十分に伝達されないため、第３ステップでネフロン幹細胞の成長と維持に必要なＦＧＦ９の濃度を２５～５０ｎｇ／ｍｌに向上させて、尿細管構造への分化をより良く向上させることができる。
一方、本発明において、前記第２ステップ及び第３ステップは、マイクロウェルで行われることが好ましく、このとき、前記マイクロウェルは、１つ以上の凹部を含み得、前記１つ以上の凹部は、マイクロウェルの下部に形成されることが好ましい。一方、前記マイクロウェルは多孔質マイクロウェルであることが好ましく、多孔質マイクロウェルは多孔質膜で形成されていてもよい。例えば、韓国登録特許第１０－２２２４０６５Ｂ１号公報に記載の多孔質マイクロウェルに関する技術を採用してもよい。
上記のような本発明のプロトコルを用いて腎臓オルガノイドを分化させる場合、分化成功率が均一で安定しており、再現性のある腎臓オルガノイドを形成することができる。
本発明の腎臓オルガノイドの製造方法により提供されるプロトコルによれば、分化成功率が向上し、さらに尿細管の構造を円滑に形成することができる。
以下、具体的な実施例により本発明をより具体的に説明する。下記実施例は、本発明の理解を助けるための例示に過ぎず、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
実施例
１．腎臓オルガノイドの製造
実施例１
ゲルトレックス（Ｇｅｌｔｒｅｘ）１％でコーティングされた２４ウェルプレートに、２５，０００～３０，０００細胞／ウェル濃度の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（ＩＭＲ９０－４、ＷｉＣｅｌｌまたはＷＴＣ－１１、コリエル研究所（ＣＯＲＩＥＬＬ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ））を播種し、このとき、培地としては、Ｙ－２７６３２ １０μＭを含むｍＴｅＳＲＴＭ１を使用した。一日後、新しいｍＴｅＳＲＴＭ１培地に交換したところ、この時点から前記幹細胞（ｉＰＳＣ）がコロニー（ｃｏｌｏｎｙ、細胞群）を形成することが確認された。
１．腎臓オルガノイドの製造
実施例１
ゲルトレックス（Ｇｅｌｔｒｅｘ）１％でコーティングされた２４ウェルプレートに、２５，０００～３０，０００細胞／ウェル濃度の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（ＩＭＲ９０－４、ＷｉＣｅｌｌまたはＷＴＣ－１１、コリエル研究所（ＣＯＲＩＥＬＬ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ））を播種し、このとき、培地としては、Ｙ－２７６３２ １０μＭを含むｍＴｅＳＲＴＭ１を使用した。一日後、新しいｍＴｅＳＲＴＭ１培地に交換したところ、この時点から前記幹細胞（ｉＰＳＣ）がコロニー（ｃｏｌｏｎｙ、細胞群）を形成することが確認された。
前記幹細胞（ｉＰＳＣ）コロニーがウェルを約３５～４０％満たした時点から、酸素分圧５％の分化培地で分化させるステップを実施し始めた（Ｄ０）。このとき、分化培地としては、ＣＨＩＲ１０μＭ、グルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）１００×（すなわち、全培地組成物の全体積に対して１体積％）及びノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）１０ｎｇ／ｍｌを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０の混合培地（ＲＰＭＩ １６４０よりもＦＢＳ含有量が低い培地）を使用し、低酸素環境（５％Ｏ２）で行った。２日目（Ｄ２）に新しい分化培地に交換し、４日目（Ｄ４）に細胞のモルフォロジー（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）がドーム様の形状（ｄｏｍｅ ｌｉｋｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）になったときにアクチビンＡ培地で処理した。このとき、アクチビンＡ培地としては、アクチビンＡ１０ｎｇ／ｍｌ及びＧｌｕｔａｍａｘ１００×（全培地組成物の全体積に対して１体積％）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０の混合培地を用いた。７日目（Ｄ７）に低濃度ＦＧＦ９培地で処理し、このとき、低濃度ＦＧＦ９培地としては、ＦＧＦ９ １０ｎｇ／ｍｌ及びＧｌｕｔａｍａｘ１００×（全培地組成物の全体積に対して１体積％）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０の混合培地を用いた。
このとき使用する透過性ウェルは、図１に示すように作製することができ、まず、図１の（ａ）に示すように、透過性膜を、ヘキサフルオロ－２－プロパノール（Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏ－２－ｐｒｏｐａｎｏｌ）溶液にポリカプロラクトン（Ｐｏｌｙｃａｒｐｒｏｌａｃｔｏｎ）とプルロニック（登録商標）（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ１０８を５：５で混合した濃度５～２５％の溶液を用いてエレクトロスピニング（電気紡糸）工程により作製し、その後、図１の（ｂ）に示すように、ネガティブモールド及びポジティブモールドを用いて熱成形工程を経て透過性ウェルを製造することができる。このようにして製造された透過性ウェルは、多孔質構造を有していることが分かる（図１の（ｃ））。本発明で使用する透過性ウェルの断面を図２に示した。
９日目（Ｄ９）に、ウェルプレートで分化した後腎間葉（ｍｅｔａｎｅｐｈｒｉｃ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ）細胞をアキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）で処理をして分離した後、透過性ウェルに８００μＭウェル基準２０，０００細胞／ウェルで播種した。この際、使用培地としては、ＣＨＩＲ ３μＭ及びＦＧＦ９ １０ｎｇ／ｍｌを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０及びＧｌｕｔａｍａｘ１００×（全培地組成物の全体積に対して１体積％）の混合培地を用い、９日目から酸素分圧２１％で培養して細胞凝集体を形成した。
１１日目（Ｄ１１）に高濃度ＦＧＦ９培地に交換し、このとき、高濃度ＦＧＦ９培地としては、ＦＧＦ９ ３０ｎｇ／ｍｌ、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０及びＧｌｕｔａｍａｘ１００×（全培地組成物の全体積に対して１体積％）の混合培地を用い、酸素分圧２１％で培養して腎小胞（Ｒｅｎａｌ Ｖｅｓｉｃｌｅ）ステップに分化した。
１４日目（Ｄ１４）に、基本分化培地として、全培地体積に対してＦＢＳ１．５体積％を含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０及びＧｌｕｔａｍａｘ１００×（全培地組成物の全体積に対して１体積％）の混合培地を用いて２１日まで培養した。その結果、図３に示すように、透過性ウェル上に形成された腎臓オルガノイドが確認された。
比較例１
実施例１と同様の手順により腎臓オルガノイドを製造したが、透過性ウェルではなく不透過性ウェルとしてＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）を用いて腎臓オルガノイドを製造した。
実施例１と同様の手順により腎臓オルガノイドを製造したが、透過性ウェルではなく不透過性ウェルとしてＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）を用いて腎臓オルガノイドを製造した。
２．ウェルタイプによる腎臓オルガノイドの違いの確認
（１）分化の均一性の確認
分化した腎臓オルガノイドを分化２１日目（Ｄ２１）にＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ）で５分間洗浄（Ｗａｓｈｉｎｇ）した後、２時間全溶液体積に対して４体積％ＰＦＡで常温にて処理して腎臓オルガノイドを固定した。２時間後、ＤＰＢＳで１０分間３回ずつ洗浄し、全緩衝溶液体積に対して０．３体積％のトリトンＸ－１００と５体積％ロバ血清（ｄｏｎｋｅｙ ｓｅｒｕｍ）で処理して常温でブロッキングした。２時間処理した後、全緩衝溶液体積に対して０．３体積％のトリトンＸ－１００と0.5体積％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）（０．５％ＢＳＡ（質量／体積））を含有する緩衝溶液で一次抗体を希釈し、４℃で５日間処理した。全緩衝溶液体積に対して０．３体積％のトリトンＸ－１００のＰＢＳＴで常温にて１０分間３回ずつ洗浄し、全緩衝溶液体積に対して０．３体積％のトリトンＸ－１００と0.5体積％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む緩衝液で二次抗体を希釈し、４℃で一晩処理した。翌日、全緩衝溶液体積に対して０．３体積％のトリトンＸ－１００のＰＢＳＴで常温にて２０分間３回洗浄し、ＤＰＢＳで１μｇ／ｍｌの濃度にＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）を希釈して４℃で一晩処理し、その後、ＤＰＢＳで１０分間３回洗浄した。この手順により、上記実施例１及び比較例１で製造した腎臓オルガノイドに対して免疫蛍光染色実験を行った。
（１）分化の均一性の確認
分化した腎臓オルガノイドを分化２１日目（Ｄ２１）にＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ）で５分間洗浄（Ｗａｓｈｉｎｇ）した後、２時間全溶液体積に対して４体積％ＰＦＡで常温にて処理して腎臓オルガノイドを固定した。２時間後、ＤＰＢＳで１０分間３回ずつ洗浄し、全緩衝溶液体積に対して０．３体積％のトリトンＸ－１００と５体積％ロバ血清（ｄｏｎｋｅｙ ｓｅｒｕｍ）で処理して常温でブロッキングした。２時間処理した後、全緩衝溶液体積に対して０．３体積％のトリトンＸ－１００と0.5体積％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）（０．５％ＢＳＡ（質量／体積））を含有する緩衝溶液で一次抗体を希釈し、４℃で５日間処理した。全緩衝溶液体積に対して０．３体積％のトリトンＸ－１００のＰＢＳＴで常温にて１０分間３回ずつ洗浄し、全緩衝溶液体積に対して０．３体積％のトリトンＸ－１００と0.5体積％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む緩衝液で二次抗体を希釈し、４℃で一晩処理した。翌日、全緩衝溶液体積に対して０．３体積％のトリトンＸ－１００のＰＢＳＴで常温にて２０分間３回洗浄し、ＤＰＢＳで１μｇ／ｍｌの濃度にＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）を希釈して４℃で一晩処理し、その後、ＤＰＢＳで１０分間３回洗浄した。この手順により、上記実施例１及び比較例１で製造した腎臓オルガノイドに対して免疫蛍光染色実験を行った。
図４の（ａ）に示す、不透過性ウェルアレイで形成された腎臓オルガノイド免疫蛍光染色と透過性ウェルアレイで形成された腎臓オルガノイド免疫蛍光染色とを比較した結果から分かるように、腎臓のネフロンに存在するＰＯＤＸＬ（ポドサイト：ｐｏｄｏｃｙｔｅ）、ＬＴＬ（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｕｂｕｌｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ：近位尿細管上皮細胞）、ＥＣＡＤ（ｄｉｓｔａｌ ｔｕｂｕｌｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ：遠位尿細管上皮細胞）マーカーを比較した場合、本発明による実施例１の透過性ウェルで形成された腎臓オルガノイドは均一によく分化しているのに対し、比較例１の不透過性ウェルアレイで形成された腎臓オルガノイドでは均一性が低下することが確認された。また、均一性を定量的に見ると、図４の（ｂ）に示すように、不透過性ウェルアレイで形成された腎臓オルガノイドの直径は１００～４００μｍであり、透過性ウェルアレイで形成された腎臓オーガノイドの直径は２００～３５０μｍであることが確認された。すなわち、不透過性ウェルアレイで形成された腎臓オルガノイドは、異なる直径値を持つ腎臓オルガノイドに不均一に分化したのに対し、透過性ウェルアレイで形成された腎臓オルガノイドは、比較的類似した直径値を持つ腎臓オルガノイドに均一に分化したことがわかる。
（２）腎臓オルガノイド成熟度の確認
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ：Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）
法により、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）を対照群として使用して、腎臓オルガノイドで発現するマーカーを定量化することにより、分化した腎臓オルガノイドの成熟度を分析した。実験条件において、９５℃で１分間処理した後、９５℃で１５秒、５６℃または６２．７℃で１５秒、７２℃で４５秒を１サイクルとして４０回繰り返した。この手順により、上記実施例１及び比較例１で製造した腎臓オルガノイドの成熟度を確認する実験を行った。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ：Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）
法により、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）を対照群として使用して、腎臓オルガノイドで発現するマーカーを定量化することにより、分化した腎臓オルガノイドの成熟度を分析した。実験条件において、９５℃で１分間処理した後、９５℃で１５秒、５６℃または６２．７℃で１５秒、７２℃で４５秒を１サイクルとして４０回繰り返した。この手順により、上記実施例１及び比較例１で製造した腎臓オルガノイドの成熟度を確認する実験を行った。
その結果、図５に示すように、腎臓のネフロンに存在するＰＯＤＸＬ（ポドサイト）、ＬＴＬ（近位尿細管上皮細胞）、ＥＣＡＤ（遠位尿細管上皮細胞）マーカーを比較した場合、本発明による実施例１の透過性ウェルアレイで形成された腎臓オルガノイドは、全てのマーカーにおいて、比較例１の不透過性ウェルアレイで形成された腎臓オルガノイドよりも向上した結果を示すことが確認できた。具体的に、透過性ウェルで形成された腎臓オルガノイドは、不透過性ウェルで形成された腎臓オルガノイドと比較すると、ＰＯＤＸＬ（ポドサイト；足細胞）に対応するｍＲＮＡ、ＬＴＬ（近位尿細管細胞）に対応するｍＲＮＡ、ＥＣＡＤ（遠位尿細管細胞）に対応するｍＲＮＡは、いずれも１倍超２倍以内の範囲でより高い発現量を示した。
３．プロトコルによる腎臓オルガノイドの違いの確認
（１）細胞に分化させる第１ステップにおける酸素濃度による違い
実施例１と同様の手順により腎臓オルガノイドを製造するが、第１ステップにおいて低酸素条件ではなく酸素濃度２１％で分化させた場合、図６に示すように、分化４日目になっても細胞のモルフォロジーがドーム様の形状に密集していないが（右写真）、５％低酸素条件で分化させた場合、３日でドーム様の形状が見られ、４日目までその形状を維持し、分化４日目では各バッチともドーム様の形状が安定して見られることが確認された（左写真）。
（１）細胞に分化させる第１ステップにおける酸素濃度による違い
実施例１と同様の手順により腎臓オルガノイドを製造するが、第１ステップにおいて低酸素条件ではなく酸素濃度２１％で分化させた場合、図６に示すように、分化４日目になっても細胞のモルフォロジーがドーム様の形状に密集していないが（右写真）、５％低酸素条件で分化させた場合、３日でドーム様の形状が見られ、４日目までその形状を維持し、分化４日目では各バッチともドーム様の形状が安定して見られることが確認された（左写真）。
より明確に確認するために、後期原始線条（ｌａｔｅ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｓｔｒｅａｋ）マーカーであるブラキウリ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）（Ｔ）の発現量を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により分析した結果、図７の（ａ）に示すように、後期原始線条マーカーであるブラキウリ（Ｔ）の発現量は、酸素環境２１％よりも低酸素環境５％で分化した腎臓オルガノイドでさらに向上することが確認された。
さらに、分化２１日目に免疫蛍光染色で分析した結果においても、低酸素条件５％でネフロン構造がより明瞭に観察された（図７の（ｂ））。
また、５％低酸素条件下で９日目まで分化させた腎臓オルガノイドと、従来のプロトコルによる正常酸素条件（例えば、酸素環境２１％）下で９日目まで分化させた腎臓オルガノイドとを、免疫蛍光染色実験により比較した際にも有意差があることが確認できた。具体的に、図８の（ａ）に示すように、近位尿細管（ＬＴＬ）マーカーと遠位尿細管（ＥＣＡＤ）マーカーにより染色された管構造は、低酸素条件下で分化した腎臓オルガノイドで観察されたものが、正常酸素条件下で分化した腎臓オルガノイドで観察されたものよりも長いことが確認できた。また、これを定量的に分析した結果においても、低酸素条件下で分化したオルガノイドの「オルガノイド当たりの尿細管マーカーの染色率」が、正常酸素条件下で分化したオルガノイドよりも高いことが確認できた。図８の（ｂ）は、各尿細管マーカーのｍＲＮＡ発現量を比較したグラフであり、低酸素条件下で分化したオルガノイド内の近位尿細管に対応するｍＲＮＡ（ＡＢＣＢ１、ＡＱＰ１、ＳＬＣ３４Ａ１）、ヘンレループに対応するｍＲＮＡ（ＵＭＯＤ）、遠位尿細管に対応するｍＲＮＡ（ＥＣＡＤ）の発現量は、正常酸素条件下で分化したオルガノイドでのものに比べて、相対的に高い値を有することが確認できた。より正確には、低酸素条件下で分化したオルガノイドの場合、正常酸素条件下で分化したものと比較して、ＡＢＣＢ１ ｍＲＮＡは３倍以上、ＡＱＰ１ ｍＲＮＡは２倍以上、ＳＬＣ３４Ａ１ ｍＲＮＡは２倍以上、ＵＭＯＤ ｍＲＮＡは１．５倍以上、ＥＣＡＤ ｍＲＮＡは２倍以上の発現量を示した。
一方、５％低酸素条件下で形成された腎臓オルガノイドは、上記のように正常酸素条件下で形成された腎臓オルガノイドよりも長い管状構造を有するだけでなく、管状構造が長くなることにより隣接するオルガノイド同士が接続される様相も見られた。ヒトのネフロン構造は、皮質の深いところでは尿細管が接続してネフロン同士が接続する構造をしていることが知られている。このように低酸素条件下で隣接するオルガノイド同士が長い管状構造によって接続されているという観察結果は、低酸素条件下で形成された腎臓オルガノイドが実際のヒトネフロンと構造が類似していることを示唆している。
図９は、正常酸素条件（酸素環境２１％）で形成された腎臓オルガノイド内での接続構造と、低酸素条件（酸素環境５％）で形成された腎臓オルガノイド内での接続構造とを比較観察した別の結果を示す。図９の（ａ）を参照すると、正常酸素条件下では、写真の隣接するオルガノイド間に特別な接続構造が見られないのに対し、低酸素条件では、隣接するオルガノイド間に管状構造が形成されていることがわかる。また、図９の（ｂ）は、遠位尿細管と集合管の両方で染色されるＥＣＡＤマーカーと、集合管で染色されるＣＡＬＢ１マーカーとの染色結果を示したものであり、左側の正常酸素条件とは異なり、右側の低酸素環境では、隣接するオルガノイド間を接続する長い管状構造でＣＡＬＢ１マーカーが鮮明に見えるという点から、低酸素条件下で分化したオルガノイド内で隣接するオルガノイド間に構造的に集合管が形成されていることがわかる。参考までに、（ｂ）の左写真は１：５０μｍ、右写真は１：１００μｍのスケールで示したものである。また、図９の（ｃ）は、集合管を構成する３種類の細胞とそのマーカーである主細胞（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｅｌｌ）（ＡＱＰ２、ＡＱＰ４）、α型介在細胞（ｔｙｐｅ ａｌｐｈａ ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ）（ＳＬＣ４Ａ１）、及びβ型介在細胞（ｔｙｐｅ ｂｅｔａ ｉｎｔｅｒｃａｌａｃｔｅｄ ｃｅｌｌ）（ＳＬＣ２６Ａ４）のマーカーを含む合計４種類の遺伝子発現量を相対的に比較したグラフである。低酸素条件下で分化したオルガノイドの場合、正常酸素条件下で分化したものに比べて、ＡＱＰ２ ｍＲＮＡは２倍以上、ＡＱＰ４ ｍＲＮＡは２倍以上、ＳＬＣ４Ａ１ ｍＲＮＡは１．５倍以上、ＳＬＣ２６Ａ４ ｍＲＮＡは２倍以上の発現量を示した。一方、低酸素条件下で分化した腎臓オルガノイドを２１日目に観察した結果、（ｄ）に示すように、集合管の主細胞マーカーであるＣＡＬＢ１遺伝子発現量が、正常酸素条件下で分化した腎臓オルガノイドに比べて１５倍以上高いことが確認された。
図１０の（ａ）は、正常酸素条件（酸素濃度２１％）及び低酸素条件（酸素濃度５％）で分化した腎臓オルガノイドの細胞表面を、ＳＥＭ画像で比較したものである。ヒトの腎臓において、近位尿細管上皮細胞は、１本の長い一次繊毛とその周りに存在する微細絨毛とを有し、遠位尿細管上皮細胞は、微細絨毛なしに１本の長い一次繊毛のみを有するということが知られている。このとき、一次繊毛が腎臓でのネフロンの構造と機能を維持する役割を果たしていることも知られている。図１０の（ａ）を参照すると、写真画像から、正常酸素条件下で分化したオルガノイドに比べて、低酸素条件下で分化したオルガノイドは、より高密度に形成された近位尿細管上皮細胞の微細絨毛を有し、近位尿細管上皮細胞及び遠位尿細管上皮細胞の一次繊毛もより長く形成され、実際のヒトの繊毛の長さに似ていることが確認できた。図１０の（ｂ）は、一次繊毛に発現して繊毛の発達に影響を与えるタンパク質ＡＮＯ１の遺伝子発現量を比較したもので、低酸素条件下でのＡＮＯ１ ｍＲＮＡ発現量が、正常酸素条件下でのＡＮＯ１ ｍＲＮＡ発現量に比べて１．５倍以上高いことが観察された。これにより、低酸素条件下では繊毛が長く形成されることが推論できる。
図１１は、集合管幹細胞である尿管芽（ＵＢ）の形状と分化様相を比較観察した結果を示したものである。集合管が形成されることでネフロン幹細胞が形成される時期が９日目であるが、このとき、正常酸素条件（酸素濃度２１％）と低酸素条件（酸素濃度５％）での尿管芽（ＵＢ）形成及び分化様相を比較した結果、両条件で大きく異なる様相が現れることが確認された。図１１の（ａ）を参照すると、集合管マーカー及びＵＢマーカーとして使用されるＣＡＬＢ１が両方の条件で発現することが分かるが、その発現様相は、正常酸素条件下では特定の構造を形成しないのに対し、低酸素条件下では、ＣＡＬＢ１が、ＳＩＸ２が発現している腎小胞（ｒｅｎａｌ ｖｅｓｉｃｌｅ）の周辺に沿って構造的に発現していることが確認できる。また、低酸素環境下で蓄積することが知られている低酸素誘導因子（ＨＩＦ１Ａ）を染色して比較した結果、低酸素条件での発現量が、正常酸素条件での発現量よりも著しく高いことが確認でき、ＣＡＬＢ１の発現部位に蓄積して集合管の発達に影響を与えたことを推論できた。一方、遺伝子レベルでは、ＭＭ（Ｍｅｔａｎｅｐｈｒｉｃ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ；後腎間葉）細胞とＵＢ細胞のｍＲＮＡ発現量を比較してみた結果、低酸素条件下で、ＭＭマーカーであるＳＩＸ２は、正常酸素条件に比べて相対的に減少したものに対し、ＵＢマーカーであるＣＡＬＢ１は、正常酸素条件に比べて１．５倍以上に増加したことが確認でき、この点から、分化過程でＵＢ細胞が発達することにより、低酸素条件下で集合管が形成できたことが分かる。
（２）オルガノイドに分化させる第３ステップにおけるＦＧＦ９濃度による違い
実施例１と同様の手順により腎臓オルガノイドを製造するが、第３ステップにおいて、ＦＧＦ９をそれぞれ１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌの濃度で含む培地で処理した場合には、全ての培地で安定したネフロン構造を持たないという問題があった。
実施例１と同様の手順により腎臓オルガノイドを製造するが、第３ステップにおいて、ＦＧＦ９をそれぞれ１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌの濃度で含む培地で処理した場合には、全ての培地で安定したネフロン構造を持たないという問題があった。
一方、実施例１のように３０ｎｇ／ｍｌ濃度で混合した培地で腎臓オルガノイドを分化させると、細胞がより安定してネフロン構造に発達し、特に尿細管構造に明確に分化することを観察し、分化第３ステップでは、３０ｎｇ／ｍｌのより高い濃度のＦＧＦ９で処理することが好ましいことを確認した。図１２は、第３ステップにおけるＦＧＦ９濃度によるネフロン構造への発達を示すものである。
（３）オルガノイドに分化させる第３ステップにおけるＦＢＳ有無による違い
オルガノイドに分化させる第３ステップにおけるＦＢＳ有無による分化度を免疫蛍光染色法で分析し、その結果を図１３に示した。図１３に示すように、ＦＢＳなしの培地組成で分化した腎臓オルガノイドでは、内部にネフロン構造が観察できなかったが、全培地組成の１．５体積％でＦＢＳを添加した培地組成で分化した腎臓オルガノイドでは、内部にネフロンと類似の構造を有することが確認された。
オルガノイドに分化させる第３ステップにおけるＦＢＳ有無による分化度を免疫蛍光染色法で分析し、その結果を図１３に示した。図１３に示すように、ＦＢＳなしの培地組成で分化した腎臓オルガノイドでは、内部にネフロン構造が観察できなかったが、全培地組成の１．５体積％でＦＢＳを添加した培地組成で分化した腎臓オルガノイドでは、内部にネフロンと類似の構造を有することが確認された。
４．腎臓オルガノイドの薬物毒性の評価
Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０に０、３０、６０μＭでタクロリムスを濃度別に３７℃で２４時間処理し、２４時間後にＤＰＢＳで３回洗浄した後、カルセイン－ＡＭ（ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ）とエチジウムホモダイマー－１（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ－１）でそれぞれ生細胞と四細胞を染色した。この手順により、前記実施例１で得られた腎臓オルガノイドの薬物毒性を評価した。
Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０に０、３０、６０μＭでタクロリムスを濃度別に３７℃で２４時間処理し、２４時間後にＤＰＢＳで３回洗浄した後、カルセイン－ＡＭ（ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ）とエチジウムホモダイマー－１（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ－１）でそれぞれ生細胞と四細胞を染色した。この手順により、前記実施例１で得られた腎臓オルガノイドの薬物毒性を評価した。
その結果、図１４に示すように、腎毒性があると知られているタクロリムス（ＦＫ５０６）を濃度別に処理すると、濃度が高くなるほど細胞が多く死滅することが観察され、これにより本発明による腎臓オルガノイドが製造されたことが確認できた。
以上、本発明の実施例について詳細に説明したが、本発明の権利範囲はこれに限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の技術的思想から逸脱しない範囲内で種々の修正及び変形が可能であることは、当技術分野で通常の知識を有する者には自明である。
Claims (10)
- 幹細胞を後腎間葉（ｍｅｔａｎｅｐｈｒｉｃ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ）細胞に分化させる第１ステップと、
前記後腎間葉細胞を培養して細胞凝集体を形成する第２ステップと、
前記後腎間葉細胞凝集体を腎臓オルガノイドに分化させる第３ステップと、を含む
ことを特徴とする腎臓オルガノイドの製造方法。 - 前記後腎間葉細胞に分化させＲ第１ステップは、酸素濃度１０％未満の低酸素環境下で行われる
請求項１に記載の腎臓オルガノイドの製造方法。 - 前記後腎間葉細胞に分化させる第１ステップは、ｉ）ＧＳＫ－３β阻害剤及びＢＭＰ４阻害剤を含む培地、ｉｉ）アクチビンＡを含む培地、ｉｉｉ）ＦＧＦ９を含む培地、及びこれらのうちの少なくとも２つを混合した培地、のうちの少なくとも１つの培地で培養するステップを含み、８～９日間行われる
請求項１に記載の腎臓オルガノイドの製造方法。 - 前記細胞凝集体を形成する第２ステップは、ＧＳＫ－３β阻害剤及びＦＧＦ９を含む培地で２～３日間行われる
請求項１に記載の腎臓オルガノイドの製造方法。 - 前記腎臓オルガノイドに分化させる第３ステップは、ＦＢＳを含む培地で７～１００日間行われる
請求項１に記載の腎臓オルガノイドの製造方法。 - 前記腎臓オルガノイドに分化させる第３ステップは、２５～５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９をさらに含んで２～５日間培養するステップを含む
請求項１に記載の腎臓オルガノイド製造方法。 - 前記第２ステップ及び第３ステップはマイクロウェルで行われる
請求項１に記載の腎臓オルガノイドの製造方法。 - 前記マイクロウェルは１つ以上の凹部を含む
請求項７に記載の腎臓オルガノイドの製造方法。 - 前記マイクロウェルは多孔質マイクロウェルである
請求項８に記載の腎臓オルガノイドの製造方法。 - 低酸素条件下で形成された後腎間葉細胞凝集体から分化した腎臓オルガノイドであって、
前記腎臓オルガノイドは、
正常酸素条件下で形成された後腎間葉細胞凝集体から分化した腎臓オルガノイドに比べて、近位尿細管に対応するｍＲＮＡ、ヘンレループに対応するｍＲＮＡ、及び遠位尿細管に対応するｍＲＮＡのうちの少なくとも一つの発現量が相対的に高いことを特徴とし、
前記低酸素条件は、酸素濃度１％超過～１０％未満であり、
前記正常酸素条件は、酸素濃度１０％以上である
ことを特徴とする腎臓オルガノイド。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210153107A KR20230067232A (ko) | 2021-11-09 | 2021-11-09 | 신장 오가노이드의 제조방법 |
| KR10-2021-0153107 | 2021-11-09 | ||
| KR10-2022-0120733 | 2022-09-23 | ||
| KR1020220120733A KR20240041569A (ko) | 2022-09-23 | 2022-09-23 | 신장 오가노이드 및 이를 제조하는 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023070667A true JP2023070667A (ja) | 2023-05-19 |
Family
ID=84329888
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022178961A Pending JP2023070667A (ja) | 2021-11-09 | 2022-11-08 | 腎臓オルガノイド及びその製造方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230142476A1 (ja) |
| EP (1) | EP4177338A1 (ja) |
| JP (1) | JP2023070667A (ja) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2014277667B2 (en) * | 2014-12-15 | 2022-07-14 | The University Of Queensland | Differentiation of pluripotent stem cells to form renal organoids |
| WO2017049243A1 (en) * | 2015-09-17 | 2017-03-23 | Bonventre Joseph V | Methods of generating nephrons from human pluripotent stem cells |
| KR20230150412A (ko) | 2017-05-25 | 2023-10-30 | 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 | 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구 세포로의 분화 유도 방법 및 다능성 줄기세포로부터 신장 전구 세포로의 분화 유도 방법 |
| WO2020019023A1 (en) * | 2018-07-23 | 2020-01-30 | Murdoch Childrens Research Institute | Composition and method |
| KR102224065B1 (ko) | 2018-12-28 | 2021-03-05 | 포항공과대학교 산학협력단 | 다공성 마이크로웰 및 이를 구비한 멤브레인과 그 제조 방법 |
-
2022
- 2022-11-04 US US17/980,820 patent/US20230142476A1/en active Pending
- 2022-11-07 EP EP22205804.2A patent/EP4177338A1/en active Pending
- 2022-11-08 JP JP2022178961A patent/JP2023070667A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4177338A1 (en) | 2023-05-10 |
| US20230142476A1 (en) | 2023-05-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210371826A1 (en) | Renal Progenitor Cells | |
| Little et al. | Kidney organoids: accurate models or fortunate accidents | |
| Batchelder et al. | Natural scaffolds for renal differentiation of human embryonic stem cells for kidney tissue engineering | |
| AU2014277667B2 (en) | Differentiation of pluripotent stem cells to form renal organoids | |
| JP7356658B2 (ja) | ドーパミン産生神経前駆細胞の製造方法 | |
| Takasato et al. | Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney | |
| JP7029144B2 (ja) | 腺性下垂体又はその前駆組織の製造方法 | |
| Nasu et al. | Robust formation and maintenance of continuous stratified cortical neuroepithelium by laminin-containing matrix in mouse ES cell culture | |
| CN102597218B (zh) | 用于诱导多能干细胞分化成神经前体细胞的方法 | |
| DK2694644T3 (en) | Priming of pluripotent stem cells for neural differentiation | |
| Takasato et al. | A strategy for generating kidney organoids: recapitulating the development in human pluripotent stem cells | |
| Miranda et al. | Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment | |
| US20220372443A1 (en) | Lbm, cpc, opc, production and quality control methods therefor, kit, graft material, and disease model | |
| Hewitt et al. | Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells | |
| US20220202872A1 (en) | Method for generating a three-dimensional neuromuscular organoid in vitro | |
| Jiang et al. | Generation of cardiac spheres from primate pluripotent stem cells in a small molecule-based 3D system | |
| CN104450618B (zh) | 一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法 | |
| CN110392735A (zh) | 胰腺祖细胞的维持和扩增 | |
| He et al. | Murine pluripotent stem cells derived scaffold-free cartilage grafts from a micro-cavitary hydrogel platform | |
| KR101559481B1 (ko) | 인간 다능성 줄기세포를 네프론 전구세포로 분화시키는 방법 | |
| JP2005333904A (ja) | 羊膜由来因子による胚性幹細胞の培養方法 | |
| JP2023070667A (ja) | 腎臓オルガノイド及びその製造方法 | |
| KR20240041569A (ko) | 신장 오가노이드 및 이를 제조하는 방법 | |
| KR20230067232A (ko) | 신장 오가노이드의 제조방법 | |
| KR102218303B1 (ko) | 혈관 조직을 포함하는 오가노이드의 제조 방법 및 이의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20221108 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221116 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231128 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240228 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20240514 |