KR20240041569A - 신장 오가노이드 및 이를 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신장 오가노이드의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 줄 기세포를 후신간엽(metanephric mesenchyme) 세포로 분화시키는 제1 단계; 후신간엽 세포를 배양하여 세포 응집체를 형성하는 제2 단계; 및 후신간엽 세포 응집체를 신장 오가노이드로 분화시키는 제3 단계를 포함하는, 신장 오가노이드의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신장 오가노이드 및 이를 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하 게는 투과성 다공성 웰 및 새로운 프로토콜을 적용하여 보다 향상된 네프론 구조를 갖는 신장 오가노이드를 형성하는 방법을 제공하는 것이다.
배아 줄기 세포(ESC: embryonic stem cell) 및 유도 만능 줄기 세포 (iPSC: induced pluripotent stem cell)를 포함한 만능성 줄기 세포(PSC: pluripotent stem cell)의 분화는 신장을 포함한 다양한 조직의 오가노이드 모델의 생성을 가능하게 하였다.
신장 오가노이드는 신장 발달 과정을 모사하며 형성된 3차원 세포 응집체로, 다양한 신장 세포로 구성되어 있으며 신장과 유사한 구조를 구현함으로 써 약물의 신독성 평가 및 신장 질환 치료제 연구 등을 위한 체외 신장 모델로의 잠재성을 보여주고 있다. 이에, 신장 오가노이드 형성을 위해 많은 연구들이 수행되고 있으며, 다양한 신장 오가노이드 형성 방법이 제시되었다.
일반적으로 3차원 신장 오가노이드를 형성하기 위해서는 세포를 3차원 응집체로 만들어줄 수 있는 웰 플레이트, 마이크로웰 어레이 (microwell array) 등과 같은 웰(well) 타입의 플랫폼을 사용한다. 그러나, 종래의 비투과성 웰의 경우 영양분 및 성장인자(growth factor)의 공급과 대사산물(metabolites)의 제거가 원활하지 않아 신장 오가노이드의 생존력이 낮아지고, 미성숙의 원인이 될 수 있다.
한편, 최근 줄기세포 분야의 진보에 따라, 인간 만능성줄기세포 (human pluripotent stem cell; hPSC)로부터 신장 오가노이드를 생성하기 위한 몇 가지 다른 프로토콜이 확립되었다. hPSC-유래 신장 오가노이드는 네프론-유사 배열 (arrangement)로서 족세포(podocyte), 근위세뇨관 상피세포(proximal tubule epithelial cell) 및 원위세뇨관 상피세포(distal tubule epithelial cell)을 포함하는 분절 구조를 가지고 있다. hPSC-신장 오가노이드의 생체 외(in vitro) 및 신 장 조직의 생체 내(in vivo)에서의 비교 분석은 신장 오가노이드가 사람의 신장 발 달을 되풀이한다는 사실을 보여주었다. 그러나, 네프론-유사 구조의 제한된 혈관화 (vascularization) 및 미성숙 문제는 여전히 극복해야 할 과제로 남아있다.
이에 본 발명의 한 측면은 투과성 다공성 웰 및 새로운 프로토콜을 적용하여 보다 향상된 네프론 구조를 갖는 신장 오가노이드 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면 줄기세포를 후신간엽(metanephric mesenchyme) 세포로 분화시키는 제1 단계; 후신간엽 세포를 배양하여 세포 응집체를 형성하는 제2 단계; 및 후신간엽 세포 응집체를 신장 오가노이드로 분화시키는 제3 단계를 포함하는, 신장 오가노이드의 제조방법이 제공된다.
또한 본 발명에 따르면, 저산소 조건에서 줄기세포로부터 분화된 후신간엽(metanephric mesenchyme) 세포를 포함하는 세포 응집체가 제공될 수 있으며, 상기 세포 응집체는, 정상산소 조건에서 분화된 후신간엽 세포를 포함하는 세포 응집체 대비 Brachyury(T)의 발현량이 상대적으로 더 높은 것을 특징으로 하고, 이 때 상기 저산소 조건은 산소농도 1% 초과 내지 10% 미만인 조건이며, 정상산소 조건은 산소농도 10% 이상인 조건인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명에 따르면 저산소 조건에서 형성된 후신간엽 세포 응집체로부터 분화된 신장 오가노이드가 제공될 수 있으며, 상기 신장 오가노이드는, 정상산소 조건에서 형성된 후신간엽 세포 응집체로부터 분화된 신장 오가노이드 대비 근위세관에 대응되는 mRNA, 헨레고리에 대응되는 mRNA, 및 원위세관에 대응되는 mRNA의 발현량이 상대적으로 더 높은 것을 특징으로 하되, 상기 저산소 조건은 산소농도 1% 초과 내지 10% 미만인 조건이며, 정상산소 조건은 산소농도 10%이상인 조건일 수 있다.
또한 본 발명에 따르면 저산소 조건에서 형성된 후신간엽 세포 응집체로부터 분화된 신장 오가노이드가 제공될 수 있으며, 상기 신장 오가노이드는, 인접한 신장 오가노이드와 관 구조로 연결되는 것을 특징으로 하되, 상기 저산소 조건은 산소농도 1% 초과 내지 10% 미만인 조건인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명에 따르면 저산소 조건에서 형성된 후신간엽 세포 응집체로부터 분화된 신장 오가노이드가 제공될 수 있으며, 상기 신장 오가노이드는, 정상산소 조건에서 형성된 후신간엽 세포 응집체로부터 분화된 신장 오가노이드 대비 집합관을 이루는 주세포에 대응되는 mRNA 또는 개재세포에 대응되는 mRNA 중 적어도 하나의 발현량이 상대적으로 더 높은 것을 특징으로 하되, 상기 저산소 조건은 산소농도 1% 초과 내지 10% 미만인 조건이며, 정상산소 조건은 산소농도 10% 이상일 수 있다.
또한 본 발명에 따르면 후신간엽 세포 응집체로부터 투과성 마이크로웰에 분화된 신장 오가노이드가 제공될 수 있으며, 상기 신장 오가노이드는, 비투과성 마이크로웰에서 형성된 후신간엽 세포 응집체로부터 분화된 신장 오가노이드 대비 족세포(podocyte)에 대응되는 mRNA, 근위세관에 대응되는 mRNA, 또는 원위세관에 대응되는 mRNA 중 적어도 하나의 발현량이 상대적으로 더 높은 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명에 따르면, 줄기세포로부터 분화된 후신간엽 세포의 세포 응집체를 신장 오가노이드로 분화시키기 위한 배지용 조성물이 제공될 수 있으며, 이 때 상기 배지용 조성물은 FBS를 포함할 수 있다. 이 때 상기 FBS는, 배지용 조성물 전체 부피를 기준으로 0.5 부피% 내지 5 부피%가 포함될 수 있다. 또한, 상기 배지용 조성물은 25 ng/ml 내지 50 ng/ml의 FGF9을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 의하면 새로운 프로토콜의 적용에 의해 분화 성공률이 향상되고, 보다 선명한 세뇨관의 구조 형성이 가능하며, 나아가 투과성 웰을 활용하여 더욱 향상된 네프론 기능을 발현하는 신장 오가노이드를 형성할 수 있다. 따라서 본 발명에 의해 획득되는 신장 오가노이드를 이용하는 경우 신장 관련 질병 연구 및 신독성 약물 평가 등과 같은 체외 신장 모델이 사용되는 분야에 있어서 실제 체내 신장의 질병 및 약물의 흡수와 같은 현상을 체외에서 모사할 수 있어 제약 분 야, 조직공학 분야에서 널리 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 적용될 수 있는 투과성 웰의 예시적인 제조 공정 및 제조된 웰을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 적용될 수 있는 투과성 웰의 단면을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 의해 획득되는 투과성 웰 상에서 형성된 신장 오 가노이드를 나타낸 것이다.
도 4는 비투과성 웰 어레이와 투과성 웰 어레이에서 형성된 신장 오가노이드의 면역형광염색 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 비투과성 웰 어레이와 투과성 웰 어레이에서 형성된 신장 오가노이드의 성숙도 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 제1 단계에서의 산소 조건에 따른 차이를 나타낸 것이다. 도 7(a)는 제1 단계에서의 산소 조건에 따른 차이의 확인을 위해 후기 원시 선(late primitive streak) 마커인 Brachyury(T)의 발현량을 역전사 중합효소 연쇄 반응으로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이고, 도 7(b)는 분화 21일째에 형성된 신장 오가노이드를 면역형광염색으로 분석한 결과에서도 저산소 조건(5%)에서 네프론 구조를 보다 선명하게 나타내는 것을 관찰한 결과는 나타낸다.
도 8 및 도 9는 산소 조건에 따라 분화된 신장 오가노이드 내에서의 관 구조 내지 연결 구조를 관찰한 결과를 도시한 것이다.
도 10은 산소 조건에 따라 관찰되는 신장 오가노이드의 세포 표면을 비교 관찰한 것이다.
도 11은 요관아(UB)의 형상 및 분화 양상을 비교 관찰한 결과를 도시한 것이다.
도 12는 제3 단계에서 FGF9 농도에 따른 네프론 구조로 발달을 나타낸 것이다.
도 13은 제3 단계에서 FBS 포함 여부에 따른 분화 정도를 면역형광염색법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 실시예에 의해 투과성 웰 상에서 형성된 신장 오가노이드의 약물 독성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 적용될 수 있는 투과성 웰의 단면을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 의해 획득되는 투과성 웰 상에서 형성된 신장 오 가노이드를 나타낸 것이다.
도 4는 비투과성 웰 어레이와 투과성 웰 어레이에서 형성된 신장 오가노이드의 면역형광염색 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 비투과성 웰 어레이와 투과성 웰 어레이에서 형성된 신장 오가노이드의 성숙도 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 제1 단계에서의 산소 조건에 따른 차이를 나타낸 것이다. 도 7(a)는 제1 단계에서의 산소 조건에 따른 차이의 확인을 위해 후기 원시 선(late primitive streak) 마커인 Brachyury(T)의 발현량을 역전사 중합효소 연쇄 반응으로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이고, 도 7(b)는 분화 21일째에 형성된 신장 오가노이드를 면역형광염색으로 분석한 결과에서도 저산소 조건(5%)에서 네프론 구조를 보다 선명하게 나타내는 것을 관찰한 결과는 나타낸다.
도 8 및 도 9는 산소 조건에 따라 분화된 신장 오가노이드 내에서의 관 구조 내지 연결 구조를 관찰한 결과를 도시한 것이다.
도 10은 산소 조건에 따라 관찰되는 신장 오가노이드의 세포 표면을 비교 관찰한 것이다.
도 11은 요관아(UB)의 형상 및 분화 양상을 비교 관찰한 결과를 도시한 것이다.
도 12는 제3 단계에서 FGF9 농도에 따른 네프론 구조로 발달을 나타낸 것이다.
도 13은 제3 단계에서 FBS 포함 여부에 따른 분화 정도를 면역형광염색법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 실시예에 의해 투과성 웰 상에서 형성된 신장 오가노이드의 약물 독성 평가 결과를 나타낸 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설 명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 신장 오가노이드의 제조방법은 줄기세포를 후신간엽 (metanephric mesenchyme) 세포로 분화시키는 제1 단계; 후신간엽 세포를 배양하여 세포 응집체를 형성하는 제2 단계; 및 후신간엽 세포 응집체를 신장 오가노이드로 분화시키는 제3 단계를 포함하는 것이다.
본 발명에 사용될 수 있는 상기 줄기세포는 유도만능줄기세포(iPSC) 및 배아줄기세포(ESC) 중 적어도 하나인 것일 수 있으며, 예를 들어 유도만능줄기세 포(iPSC)일 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 기본 배지는 동물세포의 배양에 이용되는 기초 배지를 사용할 수 있으며, 예를 들면 IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM) 배지, αMEM 배지, Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 배지, Ham'sF12(F12) 배지, RPMI 1640 배지, Advanced RPMI 1640 배 지, Fischer's배지, McCoy's 5A medium, Basal medium Eagle's(BME), MCDB media 및 이들의 혼합 배지 등이 포함된다. 예를 들어, Advanced RPMI 1640은 RPMI 1640에 비해 FBS가 적게 함유되어 있어 세포 성장률이나 세포의 형태 및 기능의 변화 없이 보다 재현성 높은 실험이 가능하도록 하므로, 바람직하다.
필요에 따라 예를 들어 알부민, 트랜스페린, KSR(KnockOut Serum Replacement)(ES세포 배양 시의 혈청 대체물)(Invitrogen), N2보충제(Invitrogen), B27 보충제(Invitrogen), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토 에탄올, 3'-티올 글리세롤 등의 하나 이상의 혈청 대체물을 포함할 수 있고 지질, 아미노산, L-글루타민, GlutaMAX(Invitrogen), 비필수 아미노산(NEAA), 비타민, 성 장 인자, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류 및 이들의 동등물 등 의 하나 이상의 물질도 함유할 수 있다. ReproFF2(리프로 셀), StemFit Basic medium(Ajinomoto) 등 미리 줄기세포 배양용으로 최적화된 배지를 사용하여도 좋다.
한편, 상기 후신간엽 세포로 분화시키는 제1 단계는 산소 농도 1% 초과 및 10% 미만의 저산소 분위기에서 수행되는 것이 바람직하며, 예를 들어 1% 초과 및 5% 이하의 산소 분압인 것이 바람직하다. 상기 1 단계에서 산소 농도 10% 이상인 경우 분화 초기 단계인 1단계에서 바람직하게는 약 4일째에 나타나야 하는 돔 유사 형태의 안정적인 유도에 문제가 있다. 또한, 상기 1단계에서 산소 농도 1%인 조건에서는 9일차까지 분화를 진행시켜본 결과 신장 오가노이드의 크기가 비교적 작게 형성되어 네프론 구조의 관찰이 어려웠으며, 형성된 오가노이드의 개수도 산소 농도 5% 조건에서 분화시켰을 때에 비해 현저히 감소한 모습을 보였는바, 산소 농도가 1% 이하인 조건에서는 분화가 불안정한 문제가 있음을 확인하였다.
실제 인간 배아의 발달 과정 초기에는 혈관화가 되어 있지 않아 저산소 환경에서 발달이 진행되며, 이와 같은 저산소 조건에서의 신장 발달은 저산소 유도인자인 HIF의 활성화를 통해 세뇨관 형성을 향상시키는 점에 기초하여 본 발명 은 신장 오가노이드 분화 시 초기 단계인 제1 단계에서의 분위기를 배아발달 환경인 저산소 조건으로 형성하였다. 한편, 제2 단계 및 제3 단계에서는 정상 산소 분압에서 분화를 진행하였다. 이와 같은 상기 제1 단계에서 저산소 조건이 도입된 새로운 프로토콜에서 분화된 신장 오가노이드는 제3 단계 완료 후, 예를 들어 21일째에서 저산소 조건이 도입되지 않은 조건에서 분화된 신장 오가노이드에 비해 높은 재현율로 선명한 세뇨관 구조를 나타낼 수 있다.
한편, 상기 후신간엽 세포로 분화시키는 제1 단계는 i) GSK-3β억제 제 및 BMP4 억제제를 포함하는 배지, ii) Activin A를 포함하는 배지, iii) FGF9을 포함하는 배지 및 이 중 적어도 2 이상을 혼합한 배지 중 적어도 하나의 배지에서 배양하는 단계를 포함하여, 8일 내지 10일 동안 수행되는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 후신간엽 세포로 분화시키는 제1 단계는 i) GSK- 3β억제제 및 BMP4 억제제를 포함하는 배지, ii) Activin A를 포함하는 배지, 및 iii) FGF9을 포함하는 배지에서 순차적으로 각 배지 당 1일 내지 4일 동안 배양하는 단계를 포함하는 것이 바람직하며, 예를 들어 i) GSK-3β억제제 및 BMP4 억제제 를 포함하는 배지에서 약 4일, ii) Activin A를 포함하는 배지에서 약 3일, 및 iii) FGF9을 포함하는 배지에서 약 2일 동안 배양할 수 있다.
상기 BMP4 억제제로는 Chordin, NOGGIN, Follistatin 등의 단백질성 억제제, Dorsomorphin(6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy) phenyl]-3-pyridin-4-yl- pyrazolo[1,5-a]pyrimidine), LDN193189(4-(6-(4-(piperazin-1-yl) phenyl) pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl) quinoline), Gremlin(Grem1), Sclerostin, Twisted gastrulation(Tsg) protein 등일 수 있다. BMP4 억제제로서 보다 바람직하 게는 NOGGIN이며 그 농도는 예를 들면 1~100 ng/ml일 수 있고, 바람직하게는 5 내 지 20 ng/ml일 수 있다.
상기 GSK-3β억제제는 예를 들어, CHIR, CHIR99021 등을 들 수 있다. GSK-3β억제제의 농도는 사용하는 GSK-3β 억제제에 따라 당업자에게 적절히 선택 가능하나, 예를 들면 0.01μM에서 100μM, 바람직하게는, 0.1μM에서 10μM이 다.
상기 세포 응집체를 형성하는 제2 단계는 GSK-3β 억제제 및 FGF9을 포함하는 배지에서 2일 내지 3일 동안 수행되는 것이 바람직하다.
한편, 상기 제1 단계 및 제2 단계에서 사용되는 배지의 FGF9 농도는 5 ng/ml 이상 25 ng/ml 미만의 농도로 포함되는 것으로, FGF9 농도가 5 ng/ml 미만 인 경우 네프론 줄기세포의 발달과 유지에 문제가 있으며, 25 ng/ml 이상인 경우 신장 오가노이드로의 분화 효율이 불안정하다는 문제가 있다.
상기 신장 오가노이드로 분화시키는 제3 단계는 FBS를 포함하는 배지에서 7일 내지 100일 동안, 예를 들어 10일 내지 50일 동안, 또는 15일 내지 30 일 동안, 예를 들어 16일 내지 21일 동안 수행되는 것이 바람직하며, 예를 들어 상 기 신장 오가노이드로 분화시키는 제3 단계에서 사용되는 배지는 배지 조성물 전체 부피를 기준으로 0.5 내지 5 부피%의 FBS를 포함하는 배지에서 7일 내지 100일 동안 수행되는 것이다. FBS 농도가 0.5 부피% 미만인 경우 형성된 신장 오가노이드의 네프론 구조 관찰에 문제가 있으며, 5 부피% 초과의 경우 세포의 성장률이나 유전자 및 단백질 발현에 영향을 주어 세포의 표현형이 달라질 수 있기 때문에 신장 오가노이드로 분화시키는데 문제가 있다.
상기와 같이 FBS 성분을 포함하는 경우 3차원 구조의 신장 오가노이드에 FBS 내 포함된 성장인자, ECM 분자, 호르몬 등을 공급함으로써, 분화 완료 시 까지의 세포의 생존율을 유지하면서 성공적으로 분화를 진행시킬 수 있다.
한편, 상기 신장 오가노이드로 분화시키는 제3 단계는 25 ng/ml 내지 50 ng/ml, 예를 들어 25 ng/ml 내지 40 ng/ml의 FGF9를 추가로 포함하여 2일 내 지 5일 동안 배양하는 단계를 포함하는 것으로, 상기 1 단계 및 2 단계에서 저농도의 FGF9를 포함한 것과 달리 고농도의 FGF9를 포함하여 수행되는 것이 바람직하다. 상기 제3 단계에서 FGF9 농도가 25 ng/ml 미만인 경우 신장 오가노이드가 발달된 세뇨관 구조를 가지게 하는데 문제가 있으며, 50 ng/ml 초과의 경우 세포 증식률에 영향을 주어 신장 오가노이드를 안정적으로 분화시키는데 문제가 있다.
한편, 상기 25 ng/ml 내지 50 ng/ml의 FGF9를 추가로 포함하여 2일 내지 5일 동안 배양하는 단계는 상기 제3 단계의 시작 시점 또는 초반부에 포함되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 3 단계의 시작으로부터 2일 내지 5일 동안 25 ng/ml 내지 50 ng/ml의 FGF9를 추가로 포함하는 배지를 이용하여 배양을 수행한다.
제2 단계에서 세포 응집체로 분화되는 경우 성장인자들이 세포 응집체에 충분히 전달되지 못하기 때문에, 제3 단계에서 네프론 줄기세포의 성장과 유지에 필요한 FGF9의 농도를 25 ng/ml 내지 50 ng/ml로 향상시켜 보다 성공적으로 세뇨관 구조로 분화를 향상시킬 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서 상기 제2 단계 및 제3 단계는 마이크로웰에 서 수행되는 것이 바람직하며, 이때 상기 마이크로웰은 1개 이상의 오목부를 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게 상기 1개 이상의 오목부는 마이크로웰의 하단부에 형성되는 것이다. 한편, 상기 마이크로웰은 다공성 마이크로웰인 것이 바람직하며, 다공성 마이크로웰은 다공성 멤브레인으로 형성된 것일 수 있다. 예를 들어, 한국 등록특허 제KR 10-2224065 B1호에 기재된 다공성 마이크로웰에 관한 기술을 채용할 수 있다.
상기와 같은 본 발명의 프로토콜을 사용하여 신장 오가노이드를 분화시킬 경우 분화 성공률이 균일하여 안정적이고 재현성 있는 신장 오가노이드 형성이 가능하다.
본 발명의 신장 오가노이드의 제조방법에 의해 제공되는 프로토콜에 따르면 분화 성공률이 향상되고, 나아가 세뇨관의 원활한 구조 형성이 가능하다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 신장 오가노이드의 제조
실시예 1
Geltrex 1%가 코팅된 24 웰 플레이트에 25,000~30,000 cells/well 농도의 유도만능 줄기세포(iPSC) (IMR90-4, WiCell 또는 WTC-11, CORIELL INSTITUTE)를 시딩하였으며, 이때 배지는 Y-27632 10 μM가 포함된 mTeSRTM1을 사용하였다. 하루 뒤 새로운 mTeSRTM1 배지로 교체하였으며, 이때부터 상기 줄기세포(iPSC)가 콜로니(colony, 세포 군집)를 형성하는 것을 확인하였다.
상기 줄기세포(iPSC) 콜로니가 웰을 35% 내지 40% 정도 채운 시점부터 5% 산소분압에서 분화 배지에서 분화시키는 단계를 수행하기 시작하였다(D0). 이때 분화 배지는 CHIR 10 μM, Glutamax 100 X(즉, 전체 배지 조성물 전체 부피를 기준으로 1 부피%) 및 Noggin 10 ng/ml을 포함하는 Advanced RPMI 1640의 혼합배지(RPMI 1640보다 FBS 함유량이 낮은 배지)를 사용하였으며, 저산소 환경 (5% O2)에서 수행하였다. 2일차(D2)에 새 분화 배지로 교체를 수행하였고, 4일차(D4)에 세포 형태 (morphology)가 돔 유사 형태(dome like morphology)가 되었을 때 Activin A 배지로 처리하였다. 이때 Activin A 배지는 Activin A 10 ng/ml 및 Glutamax 100X(전체 배지 조성물 전체 부피를 기준으로 1 부피%)을 포함하는 Advanced RPMI 1640의 혼합배지를 사용하였다. 7일차(D7)에 저농도 FGF9 배지 처리하였고, 이때 저농도 FGF9 배지는 FGF9 10ng/ml 및 Glutamax 100X(전체 배지 조성물 전체 부피를 기준으 로 1 부피%)를 포함하는 Advanced RPMI 1640의 혼합배지를 사용하였다.
이때 사용한 투과성 웰은 도 1과 같이 제작될 수 있으며, 먼저 도 1 의(a)와 같이 투과성 멤브레인을 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoro-2- propanol) 용액에 폴리카프로락톤(Polycarprolactone)과 플루로닉 108(Pluronic F108)을 5:5로 혼합한 5% 내지 25% 농도의 용액을 사용하여 전기방사 공정을 통해 제작하고, 그 후에 도 1의(b)와 같이 음각 몰드 및 양각 몰드를 이용하여 열성형 공정을 거쳐 투과성 웰이 제조될 수 있다. 이와 같이 제조된 투과성 웰은 다공성 구조임을 알 수 있다(도 1의(c)). 본 발명에 사용된 투과성 웰의 단면을 도 2에 나타내었다.
9일차(D9)에 웰 플레이트에서 분화된 후신간엽(metanephric mesenchyme) 세포에 Accutase 처리를 하여 떼어낸 후 투과성 웰에 800 uM 웰 기준 20,000 cells/well로 시딩하였다. 이때 사용 배지는 CHIR 3 uM 및 FGF9 10ng/ml을 포함하는 Advanced RPMI 1640 및 Glutamax 100X(전체 배지 조성물 전체 부피를 기준으로 1 부피%)의 혼합배지를 사용하였으며, 9일째부터 21% 산소 분압에서 배양하 여 세포 응집체를 형성하였다.
11일차(D11)에 고농도 FGF9 배지로 교체하였으며, 이때 고농도 FGF9 배지는 FGF9 30ng/ml 및 Advanced RPMI 1640 및 Glutamax 100X(전체 배지 조성물 전체 부피를 기준으로 1 부피%)의 혼합배지를 사용하였으며, 21% 산소 분압에서 배양하여 신장 소포(Renal Vesicle) 단계로 분화시켰다.
14일차(D14)에 기본 분화 배지로 전체 배지의 부피를 기준으로 FBS 1.5 부피%를 포함하는 Advanced RPMI 1640 및 Glutamax 100X(전체 배지 조성물 전체 부피를 기준으로 1 부피%)의 혼합배지를 사용하여 21일까지 배양하였다. 그 결 과 투과성 웰 상에서 형성된 신장 오가노이드를 도 3과 같이 확인할 수 있었다.
비교예 1
실시예 1과 동일한 과정에 의해 신장 오가노이드를 제조하되, 투과성 웰이 아닌 비투과성 웰로 AggrewellTM을 사용하여 신장 오가노이드를 제조하였다.
2. 웰 타입에 의한 신장 오가노이드의 차이 확인
(1) 분화의 균일도 확인
분화된 신장 오가노이드를 분화 21일째(D21)에 DPBS로 5분간 워싱 (washing)한 후, 2시간 동안 전체 용액 부피를 기준으로 4 부피% PFA를 상온에서 처리하여 신장 오가노이드를 고정시켰다. 두 시간 후에 DPBS로 10분간 3번씩 워싱 하고 전체 완충용액 부피를 기준으로 0.3 부피%의 Triton X-100과 5 부피% 당나귀 혈청(donkey serum)을 처리하여 상온에서 블로킹(blocking)하였다. 2시간 동안 처리한 후, 전체 완충용액 부피를 기준으로 0.3 부피%의 Triton X-100과 부피%의 소혈청 알부민(BSA, Bovine Serum Albumin)을 함유한 완충용액에 1차 항체를 희석하 여 4℃에서 5일간 처리하였다. 전체 완충용액 부피를 기준으로 0.3 부피%의 Triton X-100의 PBST로 상온에서 10분 동안 3번씩 워싱하고, 전체 버퍼 부피를 기 준으로 0.3 부피%의 Triton X-100과 부피%의 소혈청 알부민(BSA)이 포함된 완충용 액에 2차 항체를 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 처리하였다. 다음날 전체 완충용액 부피를 기준으로 0.3 부피%의 Triton X-100의 PBST로 상온에서 20분 동안 3번씩 워싱하고 DPBS에 1 μg/ml 농도로 DAPI를 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 처리한 후, DPBS로 10분간 3번 워싱하였다. 이러한 과정에 의해 상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 신장 오가노이드에 대하여 면역형광염색 실험을 수행하였다.
비투과성 웰 어레이와 투과성 웰 어레이에서 형성된 신장 오가노이드 면역형광염색 비교 결과 도 4(a)에서 확인할 수 있는 바와 같이 신장의 네프론에 존재하고 있는 PODXL(podocyte), LTL(proximal tubule epithelial cell), ECAD(distal tubule epithelial cell) 마커를 비교하는 경우 본 발명에 따라 실시 예 1와 같이 투과성 웰에서 형성된 신장 오가노이드는 균일하게 잘 분화된 반면, 비교예 1의 비투과성 웰 어레이에서는 균일도가 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 균일도를 정량적으로 살펴볼 때, 도 4(b)에서 확인할 수 있는 바와 같이 비투과성 웰 어레이에서 형성된 신장 오가노이드들의 지름은 100㎛ 내지 400 ㎛ 까지의 범위에 이르렀으며, 투과성 웰 어레이에서 형성된 신장 오가노이드들의 지름은 200㎛ 내지 350㎛의 범위 내에 분포됨을 확인할 수 있었다. 즉, 비투과성 웰 어레이에서 형성된 신장 오가노이드들은 서로 다른 값의 지름을 가지는 신장 오가노이드들로 불균일하게 분화된 반면, 투과성 웰 어레이에서 형성된 신장 오가노이드들은 비교적 유사한 값의 지름을 가지는 신장 오가노이드들로 균일하게 분화하였음을 알 수 있다.
(2) 신장 오가노이드 성숙도 확인
역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-qPCR, Reverse Transcription quantitative Polymer Chain Reaction) 방법에 따라 유도 만능 줄기세포(iPSCs)를 대조군으로 신장 오가노이드에서 발현되는 마커를 정량하여 분화된 신장 오가노이드의 성숙도를 분석하였다. 실험 조건은 95 ℃에서 1분간 처리한 후, 95 ℃에서 15 초, 56 ℃ 또는 62.7 ℃에서 15초, 72 ℃에서 45초를 1 사이클로 하여 40회 반복하였다. 이러한 과정에 의해 상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 신장 오가노이드 에 대하여 성숙도를 확인하는 실험을 수행하였다.
그 결과 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 신장의 네프론에 존재하고 있는 PODXL(podocyte), LTL(proximal tubule epithelial cell), ECAD(distal tubule epithelial cell) 마커를 비교하는 경우 본 발명에 따라 실시예 1와 같이 투과성 웰에서 형성된 신장 오가노이드는 모든 마커에서 비교예 1의 비투과성 웰 어레이보다 향상된 결과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 투과성 웰에서 형성된 신장 오가노이드는 비투과성 웰에서 형성된 신장 오가노이드와 비교할 때, PODXL(podocyte; 족세포)에 대응되는 mRNA, LTL(proximal tubule epithelial cell; 근위세관)에 대응되는 mRNA, ECAD(distal tubule epithelial cell; 원위세관)에 대응되는 mRNA는 모두 1 배 초과 및 2배 이내의 범위에서 더 높은 발현량을 보였다.
3. 프로토콜에 따른 신장 오가노이드의 차이 확인
(1) 세포로 분화시키는 제1 단계에서 산소 농도에 따른 차이
실시예 1과 동일한 과정에 의해 신장 오가노이드를 제조하되, 제1 단계에서 저산소 조건이 아닌 21% 산소 농도에서 분화를 진행시킬 경우, 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이 분화 4일째가 되어도 세포 형태(morphology)가 돔 유사 형태(dome like morphology)로 밀집해지지 않았으나(우측 사진), 5% 저산소 조건에 서 분화를 진행한 경우 3일 만에 돔 유사 형태가 나타났고 4일째까지 그 형태를 유 지하여 분화 4일째에 배치 마다 안정적으로 돔 유사 형태(dome like morphology)가 나타나는 것을 확인하였다(좌측 사진).
보다 명확한 확인을 위해 후기 원시선(late primitive streak) 마커 인 Brachyury(T)의 발현량을 역전사 중합효소 연쇄반응으로 분석한 결과 도 7(a)에 서 확인할 수 있는 바와 같이 21% 산소 환경에서 보다 저산소 환경(5%)에서 분화된 신장 오가노이드가 후기 원시선(late primitive streak) 마커인 Brachyury(T)의 발현량이 보다 향상된 것을 확인하였다.
나아가 분화 21일째에 면역형광염색으로 분석한 결과에서도 저산소 조건(5%)에서 네프론 구조를 보다 선명하게 나타내는 것을 관찰하였다 도 7(b).
또한, 5% 저산소 조건에서 9일차까지 분화시킨 신장 오가노이드와 기존 프로토콜에 따른 정상산소 조건(예를 들어 21% 산소 환경)에서 9일차까지 분화시킨 신장 오가노이드를 면역형광염색 실험을 통해 비교하였을 때에도 상당한 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 구체적으로는, 도 8의 (a)에 도시되어 있는 것과 같이 저산소 조건에서 분화된 신장 오가노이드에서는 근위세뇨관(LTL)마커와 원위세뇨관(ECAD) 마커에 의해 염색된 관 구조가 정상산소 조건에서 분화된 신장 오가노이드에서 관찰된 것에 비해 더 긴 것을 확인할 수 있었다. 또한, 이를 정량적으로 분석해 본 결과에서도 저산소 조건에서 분화된 오가노이드의 '오가노이드 당 관 마커가 염색된 비율'이 정상산소 조건에서의 오가노이드보다 더 높음을 확인할 수 있었다. 도 8의 (b)는 각 관 마커의 mRNA 발현량을 비교한 그래프로, 저산소 조건에서 분화된 오가노이드 내 근위세관에 대응되는 mRNA(ABCB1, AQP1, SLC34A1) 헨레고리에 대응되는 mRNA(UMOD), 원위세관에 대응되는 mRNA(ECAD)의 발현량은 정상산소 조건에서 분화된 오가노이드와 비교할 때 상대적으로 더 높은 값을 가지는 점을 확인할 수 있었다. 더 정확하게는, 저산소 조건에서 분화된 오가노이드의 경우 정상산소 조건에서 분화된 것에 비해 ABCB1 mRNA는 3배 이상, AQP1 mRNA는 2배 이상, SLC34A1 mRNA는 2배 이상, UMOD mRNA는 1.5배 이상, ECAD mRNA는 2배 이상의 발현량을 보였다.
또 다른 한편, 5% 저산소 조건에서 형성된 신장 오가노이드는 앞서 설명한 것처럼 정상산소 조건에서 형성된 신장 오가노이드보다 긴 관 구조를 가질 뿐만 아니라, 관 구조가 길어짐에 따라 인접한 오가노이드들끼리 연결되는 양상도 보였다. 사람의 네프론 구조가 피질 깊은 곳에서는 연결세뇨관으로 네프론끼리 이어진 구조를 가진다는 사실이 알려져 있는데, 저산소 조건에서 이처럼 인접 오가노이들끼리 긴 관 구조에 의해 연결되는 양상을 보인다는 관찰 결과는 저산소 조건에서 형성된 신장 오가노이드가 실제 인간 네프론과 그 구조가 유사하다는 점을 시사한다.
도 9는 정상산소 조건(21% 산소 환경)에서 형성된 신장 오가노이드와 저산소 조건(5% 산소 환경)에서 형성된 신장 오가노이드 내에서의 연결 구조를 비교 관찰한 또 다른 결과를 도시한 것이다. 도 9의 (a)를 살펴보면, 정상산소 조건에서의 사진에서는 인접한 오가노이드 사이에 특별한 연결 구조가 보이지 않는 반면, 저산소 조건에서는 인접한 오가노이드 사이에 관 구조가 형성되어 있는 것을 확인할 수 있다. 또한 도 9의 (b)는 원위세뇨관과 집합관 모두에 염색되는 ECAD 마커와 집합관에 염색되는 CALB1 마커를 염색한 결과를 도시한 것으로, 좌측의 정상산소 조건에서와는 달리 우측 저산소 환경에서는 인접 오가노이드들 사이를 연결하고 있는 신장된 관 구조에서 CALB1 마커가 선명하게 보이는 점에서 저산소 조건에서 분화된 오가노이드 내에서 인접 오가노이드들 사이에 구조적으로 집합관이 형성되었음을 확인할 수 있다. 참고로 (b)의 좌측 사진은 1:50um, 우측 사진은 1:100um의 스케일로 나타내어진 것이다. 또한, 도 9의 (c)는 집합관을 이루는 세 종류의 세포와 그 마커 principal cell (AQP2, AQP4), type alpha intercalated cell (SLC4A1), 및 type beta intercalacted cell (SLC26A4)의 마커까지 총 네 가지 종류의 유전자 발현량을 상대적으로 비교한 그래프로, 저산소 조건에서 분화된 오가노이드의 경우 정상산소 조건에서 분화된 것에 비해 AQP2 mRNA는 2배 이상, AQP4 mRNA는 2배 이상, SLC4A1 mRNA는 1.5배 이상, SLC26A4 mRNA는 2배 이상의 발현량을 보였다. 다른 한편, 저산소 조건에서 분화된 신장 오가노이드를 21일 차에 관찰해 본 결과, (d)에 도시되어 있는 것처럼 집합관의 주세포 마커인 CALB1 유전자 발현량이 정상산소 조건에서 분화된 신장 오가노이드 대비 15배 이상 높은 것으로 확인되었다.
도 10의 (a)는 SEM 이미지를 통해 정상산소 조건(21% 산소농도) 및 저산소 조건(5% 산소농도)에서 분화된 신장 오가노이드의 세포 표면을 비교 관찰한 것이다. 사람의 신장에서 근위세뇨관 상피세포는 하나의 긴 일차섬모와 그 주변에 존재하는 미세융모를 가지며, 원위세뇨관 상피세포는 미세융모 없이 하나의 긴 일차섬모만 가진다는 점이 알려져 있다. 이 때 일차 섬모는 신장에서 네프론의 구조와 기능을 유지하는 역학을 하는 것으로도 알려져 있다. 도 10의 (a)를 참고할 때, 사진 이미지에는 저산소 조건에서 분화된 오가노이드가 더 높은 밀도로 형성된 근위세뇨관 미세융모를 가지며, 근위세뇨관과 원위세뇨관 일차섬모 역시 정상산소 조건에서 분화된 오가노이드 대비 더 길게 형성되어 실제 사람의 섬모 길이와 유사하다는 점을 확인할 수 있었다. 도 10의 (b)는 일차섬모에 발현되어 섬모의 발달에 영향을 주는 단백질인 ANO1의 유전자 발현량을 비교한 것으로, 저산소 조건에서의 ANO1 mRNA 발현량이 정상산소 조건 대비 1.5배 이상 높은 것으로 관찰되었다. 이를 통해 저산소 조건에서 섬모가 길게 형성된다는 점을 유추할 수 있다.
도 11은 집합관 줄기세포인 요관아(UB)의 형상과 분화 양상을 비교관찰한 결과를 도시한 것이다. 집합관이 형성됨에 따라 네프론 줄기세포가 형성되는 기간이 9일차인데, 이 때 정상산소 조건(21% 산소농도)과 저산소 조건(5% 산소농도)에서의 요관아(UB) 형성 및 분화 양상을 비교한 결과 양 조건에서는 상당히 다른 양상이 나타남을 확인하였다. 도 11의 (a)를 참고할 때, 두 조건 모두에서 집합관 마커이자 UB마커로도 사용되는 CALB1이 발현됨을 알 수 있으나, 정상산소 조건에서는 발현 양상이 어떤 특정한 구조를 이루고 있지 않은 반면, 저산소 조건에서는 CALB1이 SIX2가 발현된 신장소포(renal vesicle) 주변을 따라 구조적으로 발현되었음을 확인할 수 있다. 또한, 저산소 환경에서 축적되는 것으로 알려진 저산소 유도인자(HIF1A)도 염색하여 비교해 본 결과, 저산소 조건에서 발현의 정도가 정상산소 조건 대비 현저히 높다는 점을 확인할 수 있었으며, CALB1의 발현 부위에 축적되어 집합관 발달에 영향을 주었다는 점을 유추할 수 있었다. 한편, 유전자 수준에서도 MM(Metanephric mesenchyme; 후신간엽)세포와 UB세포의 mRNA 발현량을 비교해 본 결과, 저산소 조건에서 MM마커인 SIX2가 정상산소 조건 대비 상대적으로 감소한 것에 비해, UB마커인 CALB1은 1.5배 이상으로 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 이로부터는 분화 과정 중 UB세포의 발달로 저산소 조건에서 집합관이 형성될 수 있었음을 알 수 있다.
(2) 오가노이드로 분화시키는 제3 단계에서 FGF9 농도에 따른 차이
실시예 1과 동일한 과정에 의해 신장 오가노이드를 제조하되, 제3 단계에서 FGF9을 10 μg/ml, 및 20 μg/ml 농도로 각각 함유한 배지를 처리한 경우 에는 모든 배지마다 안정적으로 네프론 구조를 가지지 않는다는 문제가 있었다.
한편, 실시예 1과 같이 30 ng/ml 농도로 혼합한 배지로 신장 오가노 이드를 분화시키는 경우에 세포가 보다 안정적으로 네프론 구조로 발달하고, 특히 세뇨관 구조로 선명하게 분화되는 것을 관찰하여 분화 제3 단계에서는 보다 고농도인 30 ng/ml의 농도로 FGF9를 처리하는 것이 바람직함을 확인하였다. 도 12는 제3 단계에서 FGF9 농도에 따른 네프론 구조로 발달을 나타낸 것이다.
(3)오가노이드로 분화시키는 제3 단계에서 FBS 포함 여부에 따른 차이
오가노이드로 분화시키는 제3 단계에서 FBS 포함 여부에 따른 분화 정도를 면역형광염색법으로 분석하고 그 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에서 확 인할 수 있는 바와 같이 FBS를 포함하지 않은 배지 조성으로 분화가 진행된 신장 오가노이드는 내부에 네프론 구조를 관찰할 수 없었으나, 전체 배지 조성의 1.5 부피% 로 FBS를 추가한 배지 조성에서 분화된 신장 오가노이드는 내부에 네프론과 유 사한 구조를 가지는 것을 확인하였다.
4. 신장 오가노이드의 약물 독성 평가
Advanced RPMI 1640에 0, 30 60 uM으로 타크로리무스를 농도 별로 37℃에서 24시간 동안 처리하였으며, 24시간 후 DPBS로 3번 워싱한 후 calcein- AM과 ethidium homodimer-1으로 각각 생세포와 사세포를 염색하였다. 이러한 과정에 의해 상기 실시예 1에서 획득된 신장 오가노이드의 약물 독성을 평가하였다.
그 결과 도 14에서 확인할 수 있는 바와 같이 신장에 독성이 있다고 알려진 타크로리무스(FK506)를 농도 별로 처리하는 경우 농도가 높을수록 세포가 많이 죽는 것을 관찰하였으며, 이에 따라 본 발명에 의해 신장 오가노이드가 제조된 것을 확인할 수 있다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발 명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
Claims (7)
- 저산소 조건에서 줄기세포로부터 분화된 후신간엽(metanephric mesenchyme) 세포를 포함하는 세포 응집체로서,
상기 세포 응집체는,
정상산소 조건에서 분화된 후신간엽 세포를 포함하는 세포 응집체 대비 Brachyury(T)의 발현량이 상대적으로 더 높은 것을 특징으로 하되,
상기 저산소 조건은 산소농도 1% 초과 내지 10% 미만인 조건이며,
정상산소 조건은 산소농도 10%이상인 조건인,
세포 응집체.
- 저산소 조건에서 형성된 후신간엽 세포 응집체로부터 분화된 신장 오가노이드로서,
상기 신장 오가노이드는,
정상산소 조건에서 형성된 후신간엽 세포 응집체로부터 분화된 신장 오가노이드 대비 근위세관에 대응되는 mRNA, 헨레고리에 대응되는 mRNA, 또는 원위세관에 대응되는 mRNA 중 적어도 하나의 발현량이 상대적으로 더 높은 것을 특징으로 하되,
상기 저산소 조건은 산소농도 1% 초과 내지 10% 미만인 조건이며,
정상산소 조건은 산소농도 10%이상인 조건인,
신장 오가노이드
- 저산소 조건에서 형성된 후신간엽 세포 응집체로부터 분화된 신장 오가노이드로서,
상기 신장 오가노이드는,
인접한 신장 오가노이드와 관 구조로 연결되는 것을 특징으로 하되,
상기 저산소 조건은 산소농도 1% 초과 내지 10% 미만인 조건인,
신장 오가노이드.
- 저산소 조건에서 형성된 후신간엽 세포 응집체로부터 분화된 신장 오가노이드로서,
상기 신장 오가노이드는,
정상산소 조건에서 형성된 후신간엽 세포 응집체로부터 분화된 신장 오가노이드 대비 집합관을 이루는 주세포에 대응되는 mRNA, 또는 개재세포에 대응되는 mRNA 중 적어도 하나의 발현량이 상대적으로 더 높은 것을 특징으로 하되,
상기 저산소 조건은 산소농도 1% 초과 내지 10% 미만인 조건이며,
정상산소 조건은 산소농도 10% 이상인,
신장 오가노이드.
- 후신간엽 세포 응집체로부터 투과성 마이크로웰에 분화된 신장 오가노이드로서,
상기 신장 오가노이드는,
비투과성 마이크로웰에서 형성된 후신간엽 세포 응집체로부터 분화된 신장 오가노이드 대비 족세포(podocyte)에 대응되는 mRNA, 근위세관에 대응되는 mRNA, 또는 원위세관에 대응되는 mRNA 중 적어도 하나의 발현량이 상대적으로 더 높은 것을 특징으로 하는,
신장 오가노이드.
- 줄기세포로부터 분화된 후신간엽 세포의 세포 응집체를 신장 오가노이드로 분화시키기 위한 배지용 조성물로서, FBS가 배지용 조성물 전체 부피를 기준으로 0.5부피% 내지 5부피% 포함된 것을 특징으로 하는,
배지용 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 배지용 조성물은, 25 ng/ml 내지 50 ng/ml의 FGF9을 더 포함하는 것을 특징으로 하는,
배지용 조성물.
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