WO2024096090A1 - 生体模倣システム - Google Patents

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WO2024096090A1
WO2024096090A1 PCT/JP2023/039543 JP2023039543W WO2024096090A1 WO 2024096090 A1 WO2024096090 A1 WO 2024096090A1 JP 2023039543 W JP2023039543 W JP 2023039543W WO 2024096090 A1 WO2024096090 A1 WO 2024096090A1
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WO
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chamber
cells
rptec
ltl
porous membrane
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/039543
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English (en)
French (fr)
Inventor
隆司 横川
バナン サデギヤン ラミン
遼平 上野
利和 荒岡
実 ▲高▼里
義基 佐原
Original Assignee
国立研究開発法人理化学研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass

Definitions

  • the present invention relates to a biomimetic system, and to a biomimetic system that mimics the human proximal renal tubule and a method for manufacturing the same.
  • the Micro-Physiological System also known as Organ-on-a-Chip, is an in vitro culture system that recreates a culture environment close to that in vivo within a microfluidic device fabricated using MEMS (Micro Electro Mechanical Systems) technology.
  • MEMS Micro Electro Mechanical Systems
  • the biomimetic system can reproduce the physiological functions of living tissues, and is expected to replace cell or animal experiments in drug discovery, screening of candidate drugs, pharmacokinetic or toxicity experiments, etc.
  • Patent Document 1 discloses biofunctional chips that mimic various organs and tissues, and shows, for example, a multi-layered lung-on-a-chip composed of epithelial cells, a membrane, and endothelial cells ( Figure 2 of Patent Document 1).
  • Patent Document 2 discloses a microfluidic device that includes a membrane, proximal tubule cells on a first surface of the membrane, and glomerular microvascular endothelial cells on a second surface of the membrane.
  • Patent Document 3 discloses microfluidic devices as microfluidic kidney-on-a-chip, such as human proximal tubule-kidney-chip, glomerulus (kidney)-chip, and collecting duct (kidney)-chip.
  • Patent Document 4 discloses a three-dimensional (3D) renal tubule model that includes a renal interstitial layer including renal fibroblasts and endothelial cells, and a renal epithelial tissue layer including tubular epithelial cells, in contact with the renal interstitial tissue layer.
  • 3D three-dimensional
  • Non-Patent Document 1 discloses a human renal proximal tubule chip in which epithelial cell polarization and primary cilia formation are improved compared to the conventional Transwell (registered trademark) culture system.
  • Non-Patent Document 2 discloses a microfluidic renal proximal tubule with active resorption function by co-culture of primary cultured human proximal tubule epithelial cells (hRPTEC) and human vascular endothelial cells (hMVEC).
  • Non-Patent Document 3 discloses a proximal tubule model in which 3D blood vessels are formed by co-culture of immortalized proximal tubule epithelial cells and glomerular endothelial cells.
  • proximal tubule chips can mimic the functions of human proximal tubules to a certain extent, none of them can reproduce the physiological activity of human proximal tubules in vitro.
  • the present invention aims to provide a biomimetic system that mimics the human proximal tubule, which can be used as an evaluation tool in drug discovery.
  • Non-Patent Document 4 a biomimetic system with proximal tubule epithelial cells and vascular endothelial cells on both sides of a porous membrane. While further improving and investigating this biomimetic system, the present inventors unexpectedly discovered that by using human renal proximal tubule epithelial cells (RPTEC) and LTL-positive cells derived from iPS cells instead of proximal tubule epithelial cells, it is possible to obtain a human proximal tubule chip that is closer to the living body and can be used as an evaluation tool in drug discovery, and further discovered that it can be used as an evaluation tool in drug discovery even without a vascular endothelial cell layer, which led to the completion of the present invention.
  • RPTEC human renal proximal tubule epithelial cells
  • LTL-positive cells derived from iPS cells instead of proximal tubule epithelial cells
  • the biomimetic system of one embodiment includes a microfluidic device, and human renal proximal tubule epithelial cells (RPTEC) and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells contained in the microfluidic device.
  • the microfluidic device includes a device body, a first chamber provided in the device body, a second chamber provided in the device body, and a porous membrane located between the first chamber and the second chamber and separating the first chamber from the second chamber.
  • the RPTEC and LTL-positive cells are contained in the first chamber and are adhered to a first surface of the porous membrane facing the first chamber. According to the biomimetic system of this embodiment, it is possible to obtain a biomimetic system that can reproduce the physiological functions of human proximal tubules better than conventional biomimetic systems.
  • the pluripotent stem cells may be iPS cells
  • the LTL-positive cells may be LTL-positive cells derived from renal organoids produced from iPS cells.
  • the RPTECs and LTL-positive cells contained in the first chamber and attached to the first surface of the porous membrane may be epithelial tissue obtained by co-culturing the RPTECs and the LTL-positive cells derived from the pluripotent stem cells.
  • the RPTECs may be an immortalized human renal proximal tubular epithelial cell line.
  • the biomimetic system of one embodiment may further comprise human vascular endothelial cells, the human vascular endothelial cells being contained within the second chamber and adhering to a second surface of the porous membrane facing the second chamber, and the human vascular endothelial cells being contained within the second chamber and adhering to a second surface of the porous membrane facing the second chamber.
  • the microfluidic device may further include a first supply unit provided in the device body and communicating with the first chamber, and a second supply unit provided in the device body and communicating with the second chamber.
  • the first supply unit is a supply unit for supplying the first culture medium to the first chamber and performing perfusion
  • the second supply unit is a supply unit for supplying the second culture medium to the second chamber and performing perfusion.
  • the biomimetic system of one embodiment may be a biomimetic system for screening candidate drugs, or may be a biomimetic system for confirming pharmacokinetics or conducting toxicity experiments.
  • the kit for screening candidate drugs includes a microfluidic device, human renal proximal tubule epithelial cells (RPTEC), and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells.
  • the microfluidic device includes a device body, a first chamber provided in the device body, a second chamber provided in the device body, and a porous membrane located between the first chamber and the second chamber and separating the first chamber from the second chamber.
  • a method for manufacturing a biomimetic system includes the steps of preparing a microfluidic device, seeding RPTEC and LTL-positive cells in a first chamber, culturing the cells, and adhering the RPTEC and LTL-positive cells to a first surface of the porous membrane.
  • the method may further include seeding human vascular endothelial cells in a second chamber, culturing the cells, and adhering the human vascular endothelial cells to a second surface of the porous membrane.
  • the epithelial tissue is obtained by co-culturing human renal proximal tubule epithelial cells (RPTEC) and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells.
  • the epithelial tissue may express one or more proteins selected from the group consisting of SLC22A2, SLC5A2, AQP1, LRP2, and CDH6.
  • the biomimetic system of the present invention enables in vitro evaluation closer to that of human proximal tubules than conventional biomimetic systems, which not only allows for easy evaluation of the efficacy, nephrotoxicity, and pharmacokinetics of candidate drugs in preclinical trials in drug discovery, but also serves as an alternative to animal experiments and cultured cell experiments, leading to savings in resources such as laboratory animals, reduced dropout of candidate drugs in clinical trials, and reduced drug discovery costs.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view of a microfluidic device 1 according to an embodiment, and a cross-sectional view of a biomimetic system.
  • FIG. 13 is a diagram showing an example of perfusion performed by connecting the microfluidic device to a peristaltic pump or the like.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating the effect of RPTEC/HUVEC bilayer culture on the microvilli of proximal tubular epithelial cells in Reference Example 1.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating the effect of perfusion culture on the microvilli of proximal tubular epithelial cells in Reference Example 1.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the culture protocol in Reference Example 1.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of evaluating the relative expression level of mRNA of each gene in Reference Example 1.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating the amount of albumin transport in Reference Example 1.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating the albumin transport rate in Reference Example 1.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating glucose transport amount in Reference Example 1.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating glucose transport rate in Reference Example 1.
  • This shows the results of evaluating the amount of Rhodamine 123 transported in Reference Example 1.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating the Rhodamine 123 permeability coefficient in Reference Example 1.
  • 1 shows microscopic images showing the results of evaluating the epithelial tissue morphology of a biofunction chip having epithelial tissue composed of LTL + and RPTEC in Example 1.
  • 1 shows microscopic images showing the results of evaluating the epithelial tissue morphology of a biofunction chip having epithelial tissue composed of LTL + and RPTEC in Example 1.
  • 1 shows microscopic images showing the results of evaluating the epithelial tissue morphology of a biofunction chip having epithelial tissue composed of LTL + and RPTEC in Example 1.
  • 1 shows microscopic images showing the results of evaluating the epithelial tissue morphology of a biofunction chip having epithelial tissue composed of LTL + and RPTEC in Example 1.
  • 1 shows microscopic images illustrating the results of evaluating the localization of collagen IV and lamin in a biofunctional chip having epithelial tissue composed of LTL + and RPTEC in Example 1.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating the expression level of mRNA of each gene in a biofunction chip having epithelial tissue consisting of LTL + and RPTEC in Example 1.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating the excretion (transport) of Rhodamine 123 from a biofunction chip having epithelial tissue composed of LTL + and RPTEC in Example 1.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating the excretion (transport) of Rhodamine 123 from a biofunction chip having epithelial tissue composed of LTL + and RPTEC in Example 1.
  • 1 shows the results of evaluating the cell height of the LTL + & RPTEC layer of a biofunction chip having an epithelial tissue composed of LTL + & RPTEC in Example 1.
  • FIG. FIG. 1 shows the results of evaluating the glucose transport rate of a biofunction chip having epithelial tissue composed of LTL + and RPTEC in Example 1.
  • the biomimetic system includes a microfluidic device, and human renal proximal tubule epithelial cells (RPTEC) and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells contained in the microfluidic device;
  • the microfluidic device includes: The device body, A first chamber provided in the device body; A second chamber provided in the device body; a porous membrane located between the first chamber and the second chamber and separating the first chamber from the second chamber;
  • the RPTEC and the LTL-positive cells are contained in the first chamber and adhere to a first surface of the porous membrane facing the first chamber.
  • the biomimetic system may further include human vascular endothelial cells, which are contained in the second chamber and adhere to a second surface of the porous membrane facing the second chamber.
  • a microfluidic device includes a device body, a first chamber provided in the device body, a second chamber provided in the device body, and a porous membrane located between the first chamber and the second chamber and separating the first chamber from the second chamber.
  • the microfluidic device may be any microfluidic device including a predetermined first chamber, a second chamber, and a porous membrane, and may be, for example, the device described in Non-Patent Documents 2 and 4.
  • the microfluidic device 1 of one embodiment includes a device body 10, a first chamber 2 provided in the device body 10, a second chamber 3 provided in the device body 10, and a porous membrane 4 located between the first chamber 2 and the second chamber 3 and separating the first chamber 2 and the second chamber 3.
  • the microfluidic device 1 may further include a first supply unit 5 provided in the device body 10 and communicating with the first chamber 2, and a second supply unit 6 provided in the device body 10 and communicating with the second chamber 3.
  • FIG. 1 shows an exploded perspective view of the microfluidic device 1, and the microfluidic device 1 is in a state in which the parts shown in FIG. 1 are overlapped when in use.
  • the second supply unit 6 is formed by communicating the through hole 6a with the recess 6b.
  • the microfluidic device 1 is not particularly limited as long as it is made of a material suitable for cell culture. Examples of materials include, but are not limited to, plastic resins such as polydimethylsiloxane (PDMS).
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the shape of the microfluidic device and the size is not particularly limited as long as it is a normal size for a microfluidic device, and may be, for example, 10 mm to 100 mm x 10 mm to 100 mm x 5 to 20 mm.
  • the first chamber 2 is a chamber (space) for containing human renal proximal tubular epithelial cells (RPTEC) and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells, as well as a first culture medium, and for forming and retaining a mixed cell layer containing RPTEC and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells.
  • RPTEC renal proximal tubular epithelial cells
  • the height (depth) of the first chamber 2 can be set appropriately, and may be, for example, 50 ⁇ m to 500 ⁇ m, 50 ⁇ m to 300 ⁇ m, 50 ⁇ m to 250 ⁇ m, or 100 ⁇ m to 250 ⁇ m.
  • the length of the first chamber 2 may be 1 mm to 20 mm, and the width may be 1 to 5 mm.
  • the second chamber 3 is a chamber (space) for containing human vascular endothelial cells and a second culture medium, and for forming and retaining vascular endothelial tissue containing human vascular endothelial cells.
  • the height (depth) of the second chamber 3 can be set appropriately, and may be, for example, 50 ⁇ m to 500 ⁇ m, 50 ⁇ m to 300 ⁇ m, 50 ⁇ m to 250 ⁇ m, or 100 ⁇ m to 250 ⁇ m.
  • the length of the second chamber 3 may be, for example, 1 to 20 mm, and the width may be, for example, 1 to 5 mm.
  • the second chamber 3 may be the same size as the first chamber 2.
  • the porous membrane 4 is a porous membrane that separates the first chamber 2 and the second chamber 3, and the partition made of this porous membrane 4 makes the first chamber 2 and the second chamber 3 independent spaces that do not communicate with each other.
  • the porous membrane 4 has a surface (first surface 41) facing the first chamber 2 and a surface (second surface 42) facing the second chamber 3, and RPTEC and pluripotent stem cell-derived cells are adhered to the first surface 41 of the porous membrane 4, and human vascular endothelial cells are adhered to the second surface 42.
  • the porous membrane 4 preferably has pores of 0.4 ⁇ m to 3.0 ⁇ m, preferably 1 ⁇ m to 3.0 ⁇ m. This allows the porous membrane 4 to act as a basement membrane for the cells, and the RPTEC-derived extracellular matrix fills the pores, allowing direct interaction between the RPTEC and LTL-positive cells and human vascular endothelial cells, making it possible to achieve higher proliferation rates, mitochondrial activity, and filtration efficiency for the RPTEC and LTL-positive cells.
  • the material of the porous membrane 4 is not particularly limited as long as it allows interaction between cells on both sides of the porous membrane 4, and may be, for example, polyethylene terephthalate (PET) or polycarbonate, and may be PET in particular.
  • PET polyethylene terephthalate
  • the material of the porous membrane 4 is preferably a material to which cells can adhere, and is more preferably coated with a cell adhesive such as albumin, fibronectin, or collagen.
  • the size of the porous membrane 4 is determined by the size of the first chamber 2 and the second chamber 3, and the thickness of the membrane is not particularly limited, and may be, for example, 5 ⁇ m to 50 ⁇ m, preferably 5 ⁇ m to 20 ⁇ m, or 5 ⁇ m to 10 ⁇ m.
  • the microfluidic device 1 may further include a first supply unit provided in the device body 10 and communicating with the first chamber 2, and a second supply unit provided in the device body 10 and communicating with the second chamber 3.
  • the first supply unit 5 is a supply unit for supplying the first medium to the first chamber 2 to perform perfusion
  • the second supply unit 6 is a supply unit for supplying the second medium to the second chamber 3 to perform perfusion. It is preferable that there are two or more first supply units 5 or second supply units 6 in order to perform perfusion in one direction. For example, when there are two supply units, one can be an input unit for the medium and the other can be an output unit for the medium.
  • the first supply unit 5 and the second supply unit 6 may be connected to a pump, for example, as shown in FIG. 2.
  • the sizes of the first supply unit 5 and the second supply unit 6 can be appropriately set by a person skilled in the art. It is considered that perfusion culture affects the morphology and maturation of the brush border.
  • proximal tubule human renal proximal tubule epithelial cells
  • the proximal tubule is the part of the nephron between the Bowman's capsule and the Henle's loop, and while about 70% of the glomerular filtered water and NaCl are reabsorbed in the proximal tubule, most of the metabolic substrates useful to the body, such as glucose, amino acids, lactate, and succinate, and their intermediate metabolic products are also reabsorbed in the proximal tubule. Furthermore, the secretion (excretion) of unnecessary metabolic products and exogenous chemicals such as drugs is carried out in the proximal tubule.
  • Renal proximal tubule epithelial cells are polarized epithelial cells that exhibit not only morphological but also functional asymmetry.
  • the cell membrane is divided into a brush-border membrane or apical membrane that faces the lumen of the renal tubule, and a basolateral membrane that faces the blood vessels/interstitium.
  • the presence of specific transporters in both cell membranes enables directionally selective transcellular transport, such as reabsorption and secretion (excretion).
  • the human renal proximal tubule epithelial cells in the present invention may be primary cultured cells, subcultured cells, or cell lines, and are preferably cell lines in terms of quality stability and ease of handling.
  • cell lines include immortalized human renal proximal tubule epithelial cell lines, in particular RPTEC/TERT1 cells (ATCC (registered trademark), CRL-4031 (trademark)), immortalized human proximal tubule cell line HK-2, etc.
  • LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells are cells positive for LTL (Lotus Tetragonolobus lectin), a marker for renal tubules, obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells. LTL-positive cells are thought to have the function of proximal tubule cells (PT), i.e., human renal proximal tubule epithelial cells. LTL-positive cells are thought to secrete laminin and collagen IV, increase mRNA expression levels and protein expression, and contribute to improving the function of proximal tubules.
  • PT proximal tubule cells
  • Pluripotent stem cells can be induced from fertilized eggs, cloned embryos, germline stem cells, tissue stem cells, somatic cells, etc.
  • pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), EG cells (embryonic germ cells), and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • Muse cells multi-lineage differentiating stress ending cells obtained from mesenchymal stem cells (MSCs) and GS cells produced from germ cells (e.g. testes) are also included in pluripotent stem cells.
  • iPS cells are preferably used as pluripotent stem cells. iPS cells are cells whose pluripotency has been induced by reprogramming somatic cells by known methods.
  • iPS cells were established in mouse cells by Yamanaka et al. in 2006 (Cell, 2006, 126(4), pp.663-676), various strains of induced pluripotent stem cells have become available.
  • human induced pluripotent stem cell strains such as human iPS cell strain CRL1502.3 (MCRI, Australia), 201B7 cells, 201B7-Ff cells, 253G1 cells, 253G4 cells, 1201C1 cells, 1205D1 cells, 1210B2 cells, and 1231A3 cells established at Kyoto University are available from Kyoto University and iPS Academia Japan Co., Ltd.
  • the iPS cells in the present invention are not particularly limited, and are preferably human iPS cells, and may be any of the above iPS cell lines and known iPS cells thereof.
  • LTL positive cells derived from pluripotent stem cells can be obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells.
  • the LTL positive cells are preferably LTL positive cells derived from kidney organoids produced from iPS cells.
  • Kidney organoids can be produced by inducing differentiation from iPS cells according to known differentiation induction methods.
  • the method for producing kidney organoids is not particularly limited, but for example, the protocol of Takasato et al. ("Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells," Nat Protoc, vol. 11, pp. 1681-1692, 2016) is preferably used.
  • LTL positive cells can be enriched and selected from kidney organoids, for example, by magnetic activated cell sorting (MACS).
  • LTL-positive cells are mainly proximal tubular epithelial cells, but also include distal tubular epithelial cells, so in addition to the functions of proximal tubular epithelial cells, they are thought to have the function of water reabsorption and maintaining ion concentration homeostasis.
  • human vascular endothelial cells examples include human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), human renal vascular-derived primary cultured vascular endothelial cells (HGMEC), human dermal microvascular endothelial cells (HMVEC), and human umbilical artery endothelial cells (HUAEC), and HUVEC is particularly preferably used.
  • HUVEC is an endothelial cell that constitutes the human umbilical vein, and isolated HUVEC is generally used in physiological and pharmacological research such as macromolecular transport and angiogenesis.
  • the human vascular endothelial cells in the present invention are not particularly limited, and may be primary cultured cells, subcultured cells, or cell lines, and are preferably cell lines because of their stable quality and ease of handling. Examples of cell lines include HUVEC/TERT2 and TIME. Furthermore, cells having the properties of human vascular endothelial cells derived from pluripotent stem cells may be used as human vascular endothelial cells. It is believed that by including human vascular endothelial cells, extracellular signals emitted from the human vascular endothelial cells toward RPTECs will contribute to improving the function of the biomimetic system.
  • RPTEC and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells are accommodated in the first chamber 2 and adhere to the first surface 41 of the porous membrane 4 of the microfluidic device 1.
  • a mixed cell layer 7 containing RPTEC and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells is formed on the first surface 41 of the porous membrane 4 by co-culture of RPTEC and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells, and this mixed cell layer 7 is preferably an epithelial tissue.
  • the RPTEC and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells are seeded in the first chamber 2 separately or as a cell mixture, and the RPTEC and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells are co-cultured so that the first surface 41 of the porous membrane 4 is the bottom surface, whereby the RPTEC and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells adhere to the porous membrane 4.
  • the mixture ratio of RPTECs to LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells may be 1:9 to 9:1, for example, 2:8 to 8:2, 3:7 to 7:3, 4:6 to 6:4, and is preferably 1:1.
  • the co-culture of RPTEC and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells that adhere to the porous membrane 4 and are formed on the porous membrane 4 may be partially multilayered, but basically forms a monolayer of proximal tubular epithelial-like tissue (sometimes simply referred to as "epithelial tissue” in this specification) and has polarity.
  • the side that is not in contact with the porous membrane 4 is the apical side, the surface of which is covered with microvilli.
  • the side in contact with the porous membrane 4 is the basement membrane side.
  • the number of RPTECs and RPTENs contained in the microfluidic device 1 may be, for example, 1 ⁇ 10 4 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 6 cells/cm 2 , preferably 6 ⁇ 10 4 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 5 cells/cm 2 , and particularly 8 ⁇ 10 4 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 5 cells/cm 2 , relative to the surface area of the porous membrane 4.
  • the number of LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells contained in the microfluidic device 1 may be, for example, 1 ⁇ 10 4 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 6 cells/cm 2 , preferably 6 ⁇ 10 4 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 5 cells/cm 2 , and particularly 8 ⁇ 10 4 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 5 cells/cm 2 , relative to the surface area of the porous membrane 4.
  • the total number of RPTEC and LTL positive cells contained in the microfluidic device 1 may be, for example, 2 ⁇ 10 4 cells/cm 2 to 2 ⁇ 10 6 cells/cm 2 , preferably 1.2 ⁇ 10 5 cells/cm 2 to 2 ⁇ 10 5 cells/cm 2 , and particularly 1.6 ⁇ 10 5 cells/cm 2 to 2 ⁇ 10 5 cells /cm 2 , relative to the surface area of the porous membrane 4.
  • the RPTEC and LTL positive cells in the porous membrane 4 may preferably have a confluence of 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 100%. In the case of 100% confluence, the epithelial tissue is fused and becomes impermeable.
  • the medium for culturing RPTECs and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells may be any medium for culturing normal epithelial cells, such as REGM (Lonza (trademark) Renal Epithelial Growth Medium, CC-3190), RELAR (registered trademark, serum-free medium for culturing human renal proximal tubular epithelial cells, Cell Science Institute, Inc., 2112P05), and DMEM/F12 medium containing hTERT Immortalized RPTEC Growth Kit (ATCC (registered trademark), ACS-4007).
  • REGM is particularly preferably used.
  • human vascular endothelial cells are accommodated in the second chamber 3 and adhere to the second surface 42 of the porous membrane 4 of the microfluidic device 1.
  • the human vascular endothelial cells form a human vascular endothelial cell layer 8 on the second surface 42 of the porous membrane 4, and this human vascular endothelial cell layer 8 is preferably vascular endothelial tissue.
  • the human vascular endothelial cells are seeded in the second chamber 3 and cultured so that the second surface 42 of the porous membrane 4 serves as the bottom surface, thereby causing the human vascular endothelial cells and LTL-positive cells to adhere to the porous membrane 4.
  • Human vascular endothelial cells that adhere to and form on the porous membrane 4 may be partially multilayered, but essentially form a single-layer vascular endothelium-like tissue (sometimes simply referred to as "vascular endothelium” in this specification). This vascular endothelium interacts with epithelial tissue via the porous membrane 4, mimicking the proximal renal tubules.
  • the number of human vascular endothelial cells contained in the microfluidic device 1 may be, for example, 1 ⁇ 10 4 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 6 cells/cm 2 , preferably 7 ⁇ 10 4 /cm 2 to 1 ⁇ 10 5 /cm 2 , and particularly preferably 9 ⁇ 10 4 /cm 2 to 1 ⁇ 10 5 /cm 2 , relative to the surface area of the porous membrane 4.
  • the human vascular endothelial cells in the porous membrane 4 may preferably have a confluency of 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 100%. When 100% confluent, the vascular endothelial tissue is fused and becomes impermeable.
  • the medium for culturing human vascular endothelial cells may be any medium typically used for culturing endothelial cells, such as EGM-2 (Endothelial Growth Medium-2, Lonza).
  • the biomimetic system of one embodiment can be maintained and used in static culture or perfusion culture.
  • static culture for example, the cells can be cultured in a 37°C, 5% CO2 environment while changing the medium at 200 ⁇ l/chamber every day, and the static culture can be maintained for about 20 days.
  • perfusion culture the cells can be cultured in a 37°C, 5% CO2 environment while perfusing the medium at a flow rate of 10 ⁇ l/min.
  • proximal tubule model In the conventional proximal tubule model, an evaluation system is used in which only proximal tubule epithelial cells are cultured on a Transwell. In such an evaluation system, the interface between the tubule epithelial cells and blood vessels cannot be reproduced, and reabsorption in the proximal tubules cannot be evaluated. In addition, the proximal tubule epithelial cells express only limited transporters, and it cannot be said that it accurately reflects the in vivo situation in which multiple transporters are involved in a complex manner. Furthermore, it cannot be said that the evaluation system using a bilayer culture of proximal tubule epithelial cells and vascular epithelial cells on a conventional microfluidic device sufficiently reflects the in vivo situation.
  • the biomimetic system of the present invention can obtain the following advantages compared to a cell layer of only RPTECs in a layer of proximal tubule epithelial cells: (1) Expression of proximal tubule epithelial cell-specific transporters SLC22A2 (Solute Carrier Family 22 Member 2, OCT2, excretion of cationic drugs), SLC5A2 (Solute Carrier Family 5 Member 2, SGLT2, reabsorption of glucose), AQP1 (Aquaporin 1, reabsorption of water molecules), epithelial cell markers LRP2 (Low Density Lipoprotein-related Protein 2, Megalin, uptake of albumin, etc.), CDH6 (Cadherin 6, a protein that constitutes intercellular junctions called adherens junctions), etc.
  • Non-perfusion culture using a microfluidic device increases the transport function of P-gp (excretion of lipid-soluble drugs).
  • P-gp increase of lipid-soluble drugs.
  • SLC22A2, SLC5A2, AQP1, and CDH6 which are increased in expression as described above in (1), increases, it is believed that the transport function of these transporters also increases. Furthermore, it is believed that the transport function of these transporters is further increased by perfusion culture.
  • the biomimetic system of the present invention has two layers, a mixed cell layer of RPTECs and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells and a human vascular endothelial cell layer, sandwiched between a porous membrane, the following advantages can be obtained.
  • (3) In response to increased expression of SLC5A2 (SGLT2), glucose reabsorption increases, and the transport inhibitory effect of phlorizin can be evaluated. Furthermore, the biomimetic system shows a direction of transport efficiency corresponding to the cell polarity of RPTEC.
  • the transport activity of Rhodamine 123, a substrate of MDR1 (P-gp) is increased, and the transport inhibition by the inhibitor verapamil can be evaluated.
  • the biomimetic system shows the direction of transport efficiency corresponding to the cell polarity of RPTEC.
  • OCT2 SLC22A2
  • the transport ability of the substrate 4-Di-1-ASP increases, allowing the evaluation of transport inhibition by the inhibitor cimetidine.
  • each transporter or marker can be quantified by known methods such as mRNA expression or immunostaining.
  • An increase in the expression level means an increase of 10% or more, 15% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, or 50% or more compared to the use of RPTEC alone in the layer of proximal tubular epithelial cells.
  • the biomimetic system can reproduce the function of the proximal tubule in vitro and evaluate the reabsorption and filtration efficiency in vitro. It can also be used for screening candidate drugs or confirming pharmacokinetics or toxicity experiments. By using the biomimetic system, it is possible to screen substances with high efficacy, favorable pharmacokinetics, and/or low toxicity in the preclinical stage, leading to a higher probability of successful drug discovery and reducing the cost of drug discovery.
  • a kit for screening a candidate drug includes a microfluidic device, human renal proximal tubule epithelial cells (RPTEC), and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells.
  • the microfluidic device is as described above.
  • the kit may further include a medium or an additive component of the medium for the RPTEC and/or the LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells, and may further include an instruction manual.
  • the kit may include human vascular endothelial cells, and may include a medium or an additive component of the medium for the human vascular endothelial cells.
  • a biomimetic system having a mixed cell layer (epithelial tissue layer) of RPTECs and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells can be obtained.
  • human vascular endothelial cells can be further cultured in a second chamber so that they adhere to a second surface of the porous membrane facing the second chamber, thereby obtaining a biomimetic system having two layers, an epithelial tissue layer and an endothelial tissue layer.
  • a method for manufacturing a biomimetic system includes: (1) providing a microfluidic device; (2) seeding RPTEC and LTL-positive cells in the first chamber, culturing them, and allowing the RPTEC and LTL-positive cells to adhere to the first surface of the porous membrane; (3) The method may further include the step of seeding human vascular endothelial cells in the second chamber, culturing the cells, and allowing the cells to adhere to the second surface of the porous membrane.
  • Step (1) In the step (1) of preparing a microfluidic device, the above-mentioned microfluidic device is prepared.
  • the method of preparation will be described using the microfluidic device 1 shown in FIG. 1 as an example.
  • the internal structure of the microfluidic device is complicated, so that integral molding is difficult. For example, as shown in FIG. 1
  • a part of the second recess in the second substrate 1b is blocked by the porous membrane 4 to form the second chamber 3, and a part of the second recess not forming the second chamber 3 is blocked by the first substrate 1a to form a second channel for communicating with a second supply unit 6 described below.
  • a part of the first recess for forming the first chamber 2 in the first substrate 1a and a part of the second recess for forming the second chamber 3 in the second substrate 1b may have the same shape and correspond in position. It is preferable that there are two first channels and two second channels each for perfusing cells, and they are preferably arranged on both sides of the first chamber or the second chamber.
  • the first substrate 1a and the second substrate 1b can be produced by forming a cured material having a desired shape using a technique capable of forming a fine three-dimensional structure, such as soft lithography.
  • Materials used in soft lithography may be any commonly used material, such as epoxy resin and silicone resin.
  • it may be a thermosetting resin polymer such as polydimethylsiloxane (PDMS).
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • An example of a PDMS prepolymer is one in which a curing agent is mixed into a PDMS base material.
  • the ratio of polymer base material:curing agent is not particularly limited, but may be, for example, 5:1 to 15:1.
  • first substrate 1a corresponding to the first supply section 5 communicating with the above-mentioned first channel. It is also preferable to further provide a through hole on the first substrate 1a and a recess on the second substrate 1b corresponding to the second supply section 6 communicating with the above-mentioned second channel on the first substrate 1a and the second substrate 1b.
  • the through hole 6a formed in the first substrate 1a and the recess 6b formed in the second substrate 1b communicate with each other to form the second supply section 6. It is possible to supply culture medium from the first substrate 1a side through the first supply section 5 and the second supply section 6.
  • first supply sections 5 and two second supply sections 6 each in order to perfuse the cells in the first chamber 2 and the second chamber 3.
  • the shapes of the first substrate 1a and the second substrate 1b are not particularly limited, but it is preferable that they are rectangular plates.
  • the planes of the first substrate 1a and the second substrate 1b may be rectangular and of the same size, and the thickness of each substrate may be the same, or the first substrate 1a may be thicker than the second substrate 1b, taking into account the desired depth of the first supply section 5 and the second supply section 6.
  • the fabricated microfluidic device 1 may be sterilized with 70% ethanol or UV irradiation before being used for cell culture.
  • Step (2) is a step of seeding RPTEC and LTL-positive cells in the first chamber, culturing them, and allowing the RPTEC and LTL-positive cells to adhere to the first surface of the porous membrane.
  • the total number of RPTECs and LTL-positive cells seeded in the first chamber can be appropriately set depending on the desired number of RPTECs and LTL-positive cells after culture, and may be, for example, 1.2 ⁇ 10 5 to 6 ⁇ 10 5 /cm 2 , and preferably 3.6 ⁇ 10 5 /cm 2.
  • RPTECs can adhere to the porous membrane about one day after the start of culture, and are then cultured while being allowed to proliferate.
  • the medium and culture conditions are as described above.
  • the number of days for culture is not particularly limited, and may be, for example, 7 to 20 days, and preferably 10 to 14 days.
  • Step (3) is a step of seeding human vascular endothelial cells in the second chamber, culturing them, and adhering the human vascular endothelial cells to the second surface of the porous membrane.
  • Steps (2) and (3) may be performed in reverse order, but step (3) is preferably performed after step (2).
  • step (3) may be started 7 to 10 days after the start of the culture in step (2), after the RPTEC and LTL-positive cells have adhered to the porous membrane, preferably after the RPTEC and LTL-positive cells have formed epithelial tissue.
  • the number of human vascular endothelial cells seeded in the second chamber can be appropriately set depending on the desired number of human vascular endothelial cells after culture, and may be, for example, 1 ⁇ 10 5 to 5 ⁇ 10 5 /cm 2 , and preferably 3 ⁇ 10 5 to 4 ⁇ 10 5 /cm 2.
  • the human vascular endothelial cells can adhere to the porous membrane about one day after the start of culture, and are then cultured while being allowed to proliferate.
  • the medium and culture conditions are as described above.
  • the number of days for culture is not particularly limited, and may be, for example, 1 to 20 days, and preferably 4 to 7 days.
  • the epithelial tissue may be partially multi-layered, but if the epithelial tissue fills the entire flow channel without any gaps and the vascular endothelial tissue on the back side remains at 70% or more confluent, then the biomimetic system can be said to be complete.
  • the function of the biomimetic system can be evaluated by measuring the transport ability of the substrates Rhodamine 123 or 4-Di-1-ASP, the glucose reabsorption ability, the albumin reabsorption ability, etc.
  • Each measurement method may be any known method, such as the method described in the Examples.
  • the epithelial tissue of one embodiment is an epithelial tissue obtained by co-culturing human renal proximal tubule epithelial cells (RPTEC) and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells.
  • RPTEC human renal proximal tubule epithelial cells
  • LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells and the co-culturing method are as described above.
  • the epithelial tissue of this embodiment has the physiological functions of human proximal tubule epithelial tissue, and can therefore be used as an evaluation tool in drug discovery.
  • the epithelial tissue may express one or more proteins selected from the group consisting of SLC22A2 (OCT2, excretion of cationic drugs), SLC5A2 (SGLT2, reabsorption of glucose), AQP1 (Aquaporin 1, reabsorption of water molecules), LRP2 (Megalin, uptake of albumin, etc.), and CDH6 (Cadherin 6, a protein that constitutes intercellular junctions called adherens junctions).
  • SLC22A2 OCT2 excretion of cationic drugs
  • SLC5A2 SGLT2, reabsorption of glucose
  • AQP1 Amporin 1, reabsorption of water molecules
  • LRP2 Megalin, uptake of albumin, etc.
  • CDH6 CDH6
  • high expression means that the expression level is higher than that of a cell layer (epithelial tissue) consisting of only human renal proximal tubular epithelial cells (RPTEC).
  • epithelial tissues expressing these as drug discovery tools for example, it is possible to use the fact that the glucose reabsorption ability increases in response to increased expression of SLC5A2 to search for and evaluate drugs that inhibit glucose reabsorption (e.g., phlorizin) or drugs that promote glucose excretion using the amount of glucose as an indicator, and it is also possible to use the fact that the transport ability of the substrate 4-Di-1-ASP increases in response to increased expression of SLC22A2 to search for and evaluate drugs that inhibit the transport of 4-Di-1-ASP (e.g., cimetidine) or drugs that promote the excretion of 4-Di-1-ASP using the amount of 4-Di-1-ASP as an indicator.
  • glucose reabsorption ability increases in response to increased expression of SLC5A2 to search for and evaluate drugs that inhibit glucose rea
  • the epithelial tissue of one embodiment When used as a drug discovery tool, it can be used, for example, as a human renal proximal tubule mimetic model. That is, another embodiment of the present invention is a human renal proximal tubule mimetic model consisting of the epithelial tissue of one embodiment.
  • RPTEC By containing RPTEC, it is possible to obtain a human renal proximal tubule mimetic model that is similar to human renal proximal tubules and can be used as an evaluation tool in drug discovery.
  • one or more proteins selected from the group consisting of SLC22A2, SLC5A2, AQP1, LRP2, and CDH6 are expressed, it can be more suitably used as an evaluation tool in drug discovery.
  • Another embodiment of the present invention is a human renal proximal tubule mimicking model having a structure in which the epithelial tissue of one embodiment and human vascular endothelial cells are adhered.
  • the interface between the renal tubule epithelial cells and blood vessels can be reproduced close to that in the living body, and reabsorption in the proximal tubules can be evaluated.
  • the human renal proximal tubule mimicking model includes epithelial tissue obtained by co-culturing RPTEC and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells, many transporters are expressed compared to the case where epithelial cells containing only proximal tubule epithelial cells are used, and therefore, the in vivo situation in which multiple transporters are involved in a complex manner can be accurately reflected.
  • the model can be more suitably used as an evaluation tool in drug discovery.
  • One embodiment of the present invention is a method for producing epithelial tissue, comprising a step of co-culturing human renal proximal tubule epithelial cells (RPTEC) and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells.
  • the RPTEC and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells are as described above, and the step of co-culturing the RPTEC and LTL-positive cells derived from pluripotent stem cells can be carried out according to the co-culture method described above.
  • the epithelial tissue produced by such a method has the physiological functions of human proximal tubule epithelial tissue, and can therefore be used as an evaluation tool in drug discovery.
  • a microfluidic device 1 shown in Fig. 1 was fabricated, consisting of polydimethylsiloxane (PDMS). Two PDMS layers with identical S-shaped chambers were cast onto a silicon wafer with an embossed chamber pattern.
  • the chamber pattern was formed using standard SU-8 photolithography (SU-8 3050 (MicroChem, USA)) and had a height of about 100 ⁇ m. Each layer was identical except for the thickness, where the upper layer (with the first chamber 2) was 4 mm thick and the lower layer (with the second chamber 3) was about 2 mm thick to facilitate observation of the membrane under a microscope.
  • a porous membrane (Culture Insert, Falcon) with pores of approximately 3 ⁇ m diameter was cut to 3 mm ⁇ 20 mm and placed on the bottom layer, overlapping the top layer, covering the entire width and length of the chambers and extending slightly beyond the inflection point to completely isolate the first chamber 2 and the second chamber 3.
  • the thin PDMS layer was cured overnight to ensure bonding of the top and bottom layers.
  • the resulting microfluidic device 1 had dimensions of 20 mm ⁇ 30 mm ⁇ 10 mm, with the first chamber 2 and second chamber 3 having dimensions of 1 mm ⁇ 15 mm ⁇ 0.35 mm.
  • the first chamber 2 and the second chamber 3 were filled with 70% ethanol, dried overnight at 60°C, and then irradiated with UV for 1 hour.
  • the first chamber 2 and the second chamber 3 were filled with serum-free FNC Coating Mix (registered trademark) containing albumin, fibronectin, and collagen as a cell adhesive, and incubated at 37°C for 1 minute to coat the first surface 41 and the second surface 42 of the porous membrane 4.
  • serum-free FNC Coating Mix registered trademark
  • RPTEC/HUVEC Bilayer culture of proximal tubular epithelial cells and vascular endothelial cells
  • RPTEC vascular endothelial cells
  • vascular endothelial cells human umbilical vein endothelial cells (RFP-HUVEC, Angio Proteomie) expressing red fluorescent protein by RFP gene introduction were used.
  • RPTEC The cultured RPTEC/TERT1 (hereinafter simply referred to as "RPTEC") was detached with trypsin, neutralized with DMEM Low glucose containing 10% FBS, the action of trypsin was stopped, and the cells were collected in a centrifuge tube and centrifuged at 200 x g for 3 minutes.
  • RPTEC was suspended in REGM medium to a concentration of 4 x 106 cells/ml, and 30 ⁇ l of the cell suspension was seeded in the first chamber 2 through the first supply part 5 of the sterilized and coated microfluidic device 1, and RPTEC was seeded on the first surface 41 of the porous membrane 4.
  • Static culture was performed at 37 ° C. and 5% CO2 . After 10 days of culture (Day 10), the RPTEC became confluent, the tissue fused, and became impermeable.
  • RFP-HUVEC were further seeded on the second surface 42 of the porous membrane 4 to form a bilayer construct of RPTEC/HUVEC.
  • RFP-HUVEC (hereinafter simply referred to as "HUVEC") was cultured in endothelial cell growth medium-2 (EGM-2, Lonza, Switzerland) in a T75 flask until 80% confluent. Thereafter, the cells were collected with trypsin as described above and suspended in EGM-2 to a concentration of 4 x 106 cells/ml medium. 30 ⁇ l of the cell suspension was injected into the second chamber 3, the device was turned upside down, and incubated for 1 hour to allow the cells to adhere to the porous membrane 4.
  • EGM-2 endothelial cell growth medium-2
  • the second chamber 3 was then slowly rinsed with warm medium to remove unattached cells.
  • the biofunctional chip was turned upside down and statically cultured at 37°C and 5% CO2 to obtain a biofunctional chip with a bilayer culture of RPTEC/HUVEC.
  • the RPTEC layer was immunostained with EpCAM antibody and fluorescently labeled secondary antibody, and the HUVEC layer was observed under a fluorescent microscope using red fluorescent protein (RFP), and it was confirmed that both formed a uniform, confluent monolayer (data not shown).
  • a bubble-free perfusion culture apparatus as shown in Fig. 2 was used, and the first medium (REGM) and the second medium (EGM-2) were fed at a rate of 10 ⁇ l/min (0.06 dyn/cm 2 ) into the first chamber 2 and the second chamber 3 via the first supply unit 5 and the second supply unit 6 shown in Fig. 1, for perfusion culture.
  • medium exchange was also performed from Day 11 at a rate of 1 ⁇ l/min using a bubble-free perfusion culture apparatus as shown in Fig. 2.
  • CDH6 epithelial cell markers CDH6
  • EPCAM EpCAM
  • ABCB1 P-gp/MDR1
  • AQP1 AQP1
  • SLC22A2 OCT2
  • SLC5A2 SGLT2
  • Reverse transcription of cDNA was performed using the PrimeScriptTM RT Master Mix kit as follows: The mRNA solution was mixed with nuclease-free water and RT Master Mix according to the manufacturer's instructions. It was then vortexed briefly and placed in a thermal cycler (Bio-Rad T100 Thermal Cycler) and reacted at 37°C for 15 minutes, 85°C for 5 seconds, and 4°C. The cDNA product was stored at -30°C for PCR.
  • TaqMan® Universal PCR Master Mix was used for PCR.
  • the template cDNA was thawed and cooled on ice together with TaqMan Universal PCR Master Mix and TaqMan Gene Expression Assay. Meanwhile, the QuantStudio® 5 real-time PCR system was set up. All reagents were gently vortexed. A master mix containing the above reagents except for the template cDNA was prepared according to the manufacturer's instructions, and cDNA was added to the master mix. 10 ⁇ L of the master mix + cDNA solution was applied to 1/384 well of a 384-well plate for each sample. PCR was repeated for each target gene. qPCR was performed with the QuantStudio® 5 real-time PCR system. Data was analyzed using Microsoft Excel.)
  • each mRNA The expression levels of each mRNA are shown in Figure 6 as relative expression levels to the housekeeping gene ⁇ -actin.
  • the bar (i) is for Day 14/Day 4
  • the bar (iv) is for Day 17, and of the two bars (ii) and (iii), the left one is for Day 14/Day 4 and the right one is for Day 17/Day 7.
  • Figure 6 shows that the expression levels of EpCAM, AQP1, ABCB1, and SLC22A2 were increased in RPTEC/HUVEC bilayer culture (with perfusion) compared to RPTEC only (with perfusion), and that the expression levels of EpCAM, AQP1, ABCB1, and SLC22A2 were increased compared to RPTEC/HUVEC bilayer culture (without perfusion). Furthermore, immunostaining confirmed that perfusion in bilayer culture increased the expression of megalin (data not shown).
  • BSA-AlexaFluorTM 488 conjugate ThermoFisher
  • the transport direction was a ⁇ b in the case of the direction from the RPTEC epithelial tissue side to the HUVEC side.
  • the direction from the apical membrane side to the basement membrane side was the a ⁇ b direction
  • the direction from the basement membrane side to the apical membrane side was the b ⁇ a direction.
  • glucose reabsorption (transport amount) evaluation To evaluate the transport ability of the membrane transporter SGLT2, glucose reabsorption (transport amount) was evaluated using a fluorescently labeled glucose probe, 2-NBD-Glucose (Abcam, ab146200; 2-NBDG).
  • Figure 9 shows the amount of 2-NBDG transported before (0 hours), 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, and 6 hours after addition of 2-NBDG.
  • an inhibitor was added in the a ⁇ b direction
  • the amount of glucose transported decreased compared to when no inhibitor was added.
  • Glucose transport was also observed in the b ⁇ a direction, but the amount was about 1/3 of that in the a ⁇ b direction.
  • Rhodamine 123 Rhodamine 123, Sigma-Aldrich, R8004
  • EGM-2 medium 200 ⁇ l of EGM-2 medium supplemented with 2.5 ⁇ M Rhodamine 123 (Rhodamine 123, Sigma-Aldrich, R8004) was added to the vascular endothelial tissue of RPTEC/HUVEC bilayer culture Day 14/Day 4, and the amount of Rhodamine 123 excreted to the RPTEC side through the HUVEC vascular endothelial tissue was sampled and measured.
  • the amount of transport in the a ⁇ b direction and the amount of transport of RPTEC only were also measured.
  • an inhibition experiment was performed in which 300 ⁇ M of the inhibitor verapamil was added to the chambers on both sides of the porous membrane.
  • Figure 11 shows that in both RPTEC/HUVEC bilayer cultures and RPTEC only (monolayer), the amount of Rhodamine 123 transported in the b ⁇ a direction was greater than in the a ⁇ b direction. Furthermore, the amount of Rhodamine 123 transported in the presence of inhibitors was reduced compared to the b ⁇ a direction and the absence of inhibitors. On the other hand, in the a ⁇ b direction, the amount of transported in the absence of inhibitors was reduced compared to the presence of inhibitors. This is because the measured transport direction (a ⁇ b) is opposite to the transport direction of P-gp (b ⁇ a).
  • Rhodamine 123 transport rate was measured and compared under various conditions. Note that “with perfusion” refers to the culture using protocol (iii) in Figure 5, “without perfusion” refers to the culture using protocol (ii), and RPTECs alone were cultured using protocol (iv). The results are shown in Figure 12.
  • Figure 12 shows that the amount of Rhodamine 123 transported in the b ⁇ a direction was greater than that in the a ⁇ b direction, regardless of whether or not bilayer culture was used or perfusion was used (1>3, 4>6, 10>12). This demonstrated that the biomimetic system of the present invention is consistent with the direction of Rhodamine 123 excretion in the living body. Furthermore, regardless of whether or not bilayer culture was used, the amount of Rhodamine 123 transported in the b ⁇ a direction was reduced by inhibition with the inhibitor verapamil (1>2, 4>5). This demonstrated that Rhodamine 123 is transported via a transporter. Furthermore, the amount of Rhodamine 123 transported in the b ⁇ a direction was increased by perfusion (10>4). This demonstrated that the transport ability of P-gp is increased by perfusion. Furthermore, the amount of Rhodamine 123 transported in the b ⁇ a direction was increased by bilayer culture (1>4). This demonstrated that bilayer culture increases the transport activity of P-gp.
  • Example 1 Co-culture of proximal tubular epithelial cells and LTL-positive cells ⁇ Preparation of LTL-positive cells derived from iPS cells> Renal organoids were prepared using human iPS cell line CRL1502.3 (MCRI, Australia) according to the protocol of Takasato et al. (Nat Protoc, vol. 11, pp. 1681-1692, 2016). Briefly, frozen iPSC vials (10 6 cells/mL frozen in 200 ⁇ L Stem Cell Banker) were subcultured three times, and then differentiation induction was performed.
  • LTL-positive cells in kidney organoids were selected using biotin-LTL (Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL), Biotinylated, Vector Labs, B-1325-2), a proximal tubule marker, and anti-biotin microbeads (Anti- Biotin MicroBeads, Miltenyi Biotec, 130-095-485) as a secondary antibody.
  • biotin-LTL Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL), Biotinylated, Vector Labs, B-1325-2
  • a proximal tubule marker a proximal tubule marker
  • Anti-biotin microbeads Anti- Biotin MicroBeads, Miltenyi Biotec, 130-095-485
  • RPTEC/TERT1 ⁇ Biofunctional chip having epithelial tissue composed of LTL + &RPTEC> RPTEC/TERT1 (hereinafter, simply referred to as "RPTEC") is derived from a material (ATCC Material) obtained from ATCC (American Type Culture Collection).
  • ATCC Material obtained from ATCC (American Type Culture Collection).
  • the first surface of the porous membrane of the sterilized microfluidic device was filled with serum-free FNC Coating Mix (registered trademark) and incubated at 37°C for 1 minute to coat it.
  • FNC Coating Mix registered trademark
  • 3.5 x 105 / cm2 mixed cells 50%/50%) in which LTL + cells and RPTEC were mixed at a ratio of 1:1 (number) were seeded and cultured in REGM at 37°C and 5% CO2 for 7 days.
  • 100% LTL + cells or 100% RPTEC were also seeded and cultured in the same manner.
  • FIG 13 The results of observation under an optical microscope are shown in Figure 13.
  • the upper row of (b) shows images of 100% LTL + cells on Day 2, Day 4, and Day 7, and the lower row shows images of 50%:50% LTL + cells and RPTEC co-culture on Day 2, Day 4, and Day 7.
  • An enlarged image of the co-culture of LTL + cells and RPTEC on Day 7 is shown in (c). From Figure 13, it was observed that LTL + cells alone formed cell aggregates and were unable to form an epithelial tissue barrier, but functional epithelial tissue was formed by mixing RPTEC.
  • the morphology of epithelial tissue was evaluated by immunostaining for F-actin and EpCAM. Specifically, cells were fixed with PFA (4%) for 10 minutes, then blocked with DPBS blocking buffer containing donkey serum (10%) for 60 minutes at room temperature, and immersed in a primary antibody (EpCAM 1/200) solution at 4°C overnight. After washing the tissue with DPBS, it was immersed in donkey anti-mouse AF-488 secondary antibody at room temperature for 1 hour. Finally, the tissue was washed with DPBS containing DAPI and Phalloidin (both 1/1000), and nuclei and F-actin were stained, respectively.
  • Figure 14 shows that LTL + cells alone formed cell aggregates and were unable to form an epithelial tissue barrier, but that mixing RPTEC allowed the formation of functional epithelial tissue.
  • Epithelial tissue morphology was also evaluated by immunostaining with P-gp, ZO1 and LTL.
  • Cells were fixed, blocked and stained in the same manner as above.
  • P-gp, ZO1 and LTL antibodies were prepared in blocking buffer at concentrations of 1/50, 1/200 and 1/200, respectively.
  • Secondary antibodies were prepared in DPBS at 1/400 for P-gp, ZO1 and LTL, using AF-568 anti-rabbit, AF488 anti-mouse and AF647 anti-streptavidin, respectively. After application of secondary antibodies, cells were washed with DPBS containing 1/1000 DAPI and nuclei were stained.
  • FIG. 15 The results of the epithelial tissue on Day 7 are shown in FIG. 15, and the results of the epithelial tissue on Day 14 are shown in FIG. 16.
  • the upper row of FIG. 15 shows images of RPTEC only, and the lower row shows images of LTL + & RPTEC. From FIG. 15, it was observed that the expression levels of P-gp, ZO1, and LTL in LTL + & RPTEC increased compared to RPTEC only on Day 7. From FIG. 16, the expression level of P-gp in LTL + & RPTEC increased compared to RPTEC only on Day 14. This suggested that the excretion function via P-gp in epithelial tissue consisting of LTL + & RPTEC was improved.
  • Figure 17 The results are shown in Figure 17.
  • the left side of Figure 17 shows the results for RPTEC only, and the right side shows the results for LTL + & RPTEC.
  • collagen IV and laminin were present in greater amounts in the LTL + & RPTEC co-culture than in the case of RPTEC only.
  • the expression levels and distribution of laminin and megalin were improved by perfusion culture (data not shown).
  • FIG. 19 shows the results of the transport amount. From FIG. 19, the transport amount of Rhodamine 123 was increased in the LTL + & RPTEC co-culture compared to RPTEC alone. In addition, the direction of the transport efficiency corresponding to the cell polarity of the epithelial cells was shown. This suggested that the function of P-gp was improved in the LTL + & RPTEC co-culture. On the other hand, no further significant improvement in the transport function was observed by perfusion culture.
  • Both surfaces of the porous membrane of the sterilized microfluidic device were coated with FNC in advance as described above.
  • 3.5 x 10 5 /cm 2 mixed cells (50%/50%) of LTL + cells and RPTEC/TERT1 mixed at 1:1 (number) were seeded on the first surface of the porous membrane and cultured in REGM at 37°C and 5% CO 2 for 10 days.
  • 100% RPTEC was also seeded and cultured in the same manner. After 10 days of culture (Day 10), the cells became confluent, the tissues were fused, and they became impermeable.
  • FIG. 21 The results of observation and measurement using a transmission electron microscope are shown in FIG. 21.
  • (a) and (c) are micrographs of the RPTEC side of RPTEC monolayer culture and LTL + & RPTEC coculture, respectively, with the left side showing the result without perfusion and the right side showing the result with perfusion.
  • the glucose transport rate of the biofunctional chip having epithelial tissue consisting of LTL + & RPTEC was evaluated in the same manner as in the above-mentioned Reference Example 1 ⁇ Glucose reabsorption (transport amount) evaluation>.
  • the results are shown in FIG. 22.
  • the glucose transport rate was increased compared to RPTEC.
  • the glucose transport rate was increased compared to when perfusion was not performed. This suggested that the glucose transport ability was increased by LTL + & RPTEC co-culture and further increased by perfusion.
  • 1...microfluidic device 10...device body, 1a...first substrate, 1b...second substrate, 2...first chamber, 3...second chamber, 4...porous membrane, 5...first supply part, 6...second supply part, 6a...through hole, 6b...recess, 7...mixed cell layer, 8...human vascular endothelial cell layer, 41...first surface of porous membrane, 42...second surface of porous membrane.

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Abstract

生体模倣システムであって、マイクロ流体デバイス、並びに、該マイクロ流体デバイス内に収容される、ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞を備え、マイクロ流体デバイスは、デバイス本体と、デバイス本体に設けられた第１のチャンバーと、デバイス本体に設けられた第２のチャンバーと、第１のチャンバーと第２のチャンバーとの間に位置し、第１のチャンバーと第２のチャンバーとを隔てる多孔質膜とを備え、ＲＰＴＥＣ及びＬＴＬ陽性細胞が第１のチャンバー内に収容され、かつ、多孔質膜の第１のチャンバーに面する第１の表面に接着している生体模倣システムが、開示される。

Description

生体模倣システム
　本発明は、生体模倣システムに関し、ヒト近位尿細管を模倣する生体模倣システム及びその製造方法に関する。
　生体模倣システム（Micro-Physiological System: MPS）は、生体機能チップ（Organ-on-a-Chip）とも呼ばれ、ＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical Systems）技術を用いて作製された微小流体デバイス内に、ｉｎ　ｖｉｖｏに近い培養環境を再構築したｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養系のことである。生体模倣システムは、生体組織の生理機能を再現でき、創薬の際、候補薬剤のスクリーニング、薬物動態又は毒性実験等において、細胞実験又は動物実験の代わりになると期待されている。
　特許文献１には、様々器官、組織を模倣する生体機能チップが開示されており、例えば上皮細胞とメンブレンと内皮細胞から構成される多層肺オンチップが示されている（特許文献１の図２）。
　近位尿細管は原尿からの栄養素再吸収の最大８０％を担っており、そのため循環血中の薬物が蓄積し、毒性を生じやすくなる。近年、近位尿細管の濾過機能等の生理機能をｉｎ　ｖｉｔｒｏで模倣した、生体模倣システム（近位尿細管チップ（proximal tubule on a chip）ともいう）が多く開発されている。例えば、特許文献２には、膜と、膜の第１の表面に近位尿細管細胞と、膜の第２の表面に糸球体微小血管内皮細胞とを含むマイクロ流体デバイスが開示されている。特許文献３には、マイクロ流体腎臓オンチップとしてのマイクロ流体デバイス、例えば、ヒト近位尿細管－腎臓チップ、糸球体（腎臓）－チップ、集合管（腎臓）－チップが開示されている。また、特許文献４には、腎線維芽細胞及び内皮細胞を含む腎間質層と、尿細管上皮細胞を含む腎上皮組織層とを含み、腎上皮組織は腎間質組織層と接触している、３次元（３Ｄ）腎尿細管モデルが開示されている。
　さらに、非特許文献１には、従来のトランズウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標））培養系と比較して、上皮細胞の分極及び一次繊毛形成が向上したヒト腎近位尿細管チップが開示されている。非特許文献２には、初代培養ヒト近位尿細管上皮細胞（ｈＲＰＴＥＣ）とヒト血管内皮細胞（ｈＭＶＥＣ）との共培養による能動的再吸収性機能を有するマイクロ流体腎近位尿細管が開示されている。また、非特許文献３には、不死化近位尿細管上皮細胞と糸球体内皮細胞との共培養によって３Ｄ血管形成された近位尿細管モデルが開示されている。
　しかしながら、従来の近位尿細管チップは、ある程度ヒトの近位尿細管の機能を模倣できるものの、ヒトの近位尿細管が持つ生理活性機能を生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で再現できるものはなかった。
ＷＯ２０１３０８６５０２Ａ１ ＵＳ２０２００２６９２３４Ａ１ ＷＯ２０２０１７２６７０Ａ１ ＷＯ２０１６０５７５７１Ａ１
Jang, K. J. et al., Human kidney proximal tubule-on-a-chip for drug transport and nephrotoxicity assessment. Integr Biol (Camb) 5, 1119-1129, doi:10.1039/c3ib40049b (2013). Vedula EM et al., A microfluidic renal proximal tubule with active reabsorptive function. PLoS ONE 12(10): e0184330. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0184330 (2017). Lin, N. Y. C. et al., Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 116, 5399-5404, doi:10.1073/pnas.1815208116 (2019). Ramin Banan Sadeghian et al., A bioinspired human proximal tubule-on-a-chip with both Epithelial and endothelial tissue layers for online Monitoring of nephrotoxicity and filtration properties, p. 1631-1634, 22nd International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, November 11-15, 2018, Kaohsiung, Taiwan
　本発明は、創薬における評価ツールとして使用できる、ヒトの近位尿細管を模倣した生体模倣システムを提供することを目的とする。
　本発明者らは、以前多孔質膜の両面にそれぞれ近位尿細管上皮細胞及び血管内皮細胞を有する生体模倣システムを開発した（非特許文献４）。本発明者らは、この生体模倣システムについてさらに改良・検討しているうち、意外なことに、近位尿細管上皮細胞の代わりに、ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）及びｉＰＳ細胞由来のＬＴＬ陽性細胞を用いることで、より生体に近く、創薬における評価ツールとして使用できるヒト近位尿細管チップを得ることができ、さらに、血管内皮細胞層を有さなくても、創薬における評価ツールとして使用できることを見出し、本発明の完成に至った。
　一実施形態の生体模倣システムは、マイクロ流体デバイス、並びに、該マイクロ流体デバイス内に収容される、ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞を備えるものである。ここで、上記マイクロ流体デバイスは、デバイス本体と、デバイス本体に設けられた第１のチャンバーと、デバイス本体に設けられた第２のチャンバーと、第１のチャンバーと第２のチャンバーとの間に位置し、第１のチャンバーと第２のチャンバーとを隔てる多孔質膜とを備える。また、ＲＰＴＥＣ及びＬＴＬ陽性細胞が第１のチャンバー内に収容され、かつ、多孔質膜の第１のチャンバーに面する第１の表面に接着している。本実施形態の生体模倣システムによれば、従来の生体模倣システムよりも、ヒトの近位尿細管の生理機能を再現できる生体模倣システムを得ることができる。
　一実施形態の生体模倣システムにおいて、多能性幹細胞がｉＰＳ細胞であってよく、また、ＬＴＬ陽性細胞が、ｉＰＳ細胞から作製した腎臓オルガノイド由来のＬＴＬ陽性細胞であってもよい。また、第１のチャンバー内に収容され、かつ、多孔質膜の第１の表面に接着しているＲＰＴＥＣ及びＬＴＬ陽性細胞は、ＲＰＴＥＣと多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞とを共培養することによって得られた上皮組織であってよい。ここで、ＲＰＴＥＣが、ヒト腎近位尿細管上皮不死化細胞株であってよい。
　さらに、一実施形態の生体模倣システムが、ヒト血管内皮細胞をさらに備え、該ヒト血管内皮細胞が第２のチャンバー内に収容され、かつ、多孔質膜の第２のチャンバーに面する第２の表面に接着しており、ヒト血管内皮細胞が第２のチャンバー内に収容され、かつ、多孔質膜の第２のチャンバーに面する第２の表面に接着していてもよい。
　一実施形態の生体模倣システムにおいて、マイクロ流体デバイスが、デバイス本体に設けられ、第１のチャンバーに連通する第１の供給部と、デバイス本体に設けられ、第２のチャンバーに連通する第２の供給部とをさらに備えてもよい。ここで、第１の供給部は、第１の培地を第１のチャンバーに供給し灌流を行うための供給部であり、第２の供給部は、第２の培地を第２のチャンバーに供給し灌流を行うための供給部である。
　一実施形態の生体模倣システムは、候補薬物のスクリーニングのための生体模倣システムであってもよく、また、薬物動態の確認又は毒性実験のための生体模倣システムであってもよい。
　一実施形態の候補薬物のスクリーニングのためのキットは、マイクロ流体デバイス、ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）、及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞を含むものである。ここで、上記マイクロ流体デバイスは、デバイス本体と、デバイス本体に設けられた第１のチャンバーと、デバイス本体に設けられた第２のチャンバーと、第１のチャンバーと第２のチャンバーとの間に位置し、第１のチャンバーと第２のチャンバーとを隔てる多孔質膜とを備える。
　一実施形態の生体模倣システムを製造する方法は、マイクロ流体デバイスを用意する工程と、ＲＰＴＥＣ及びＬＴＬ陽性細胞を第１のチャンバーに播種し、培養し、ＲＰＴＥＣ及びＬＴＬ陽性細胞を多孔質膜の第１の表面に接着させる工程とを含む。上記方法は、ヒト血管内皮細胞を第２のチャンバーに播種し、培養し、ヒト血管内皮細胞を多孔質膜の第２の表面に接着させる工程をさらに含んでもよい。
　一実施形態の上皮組織は、ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）と多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞とを共培養して得られる上皮組織である。上皮組織は、ＳＬＣ２２Ａ２、ＳＬＣ５Ａ２、ＡＱＰ１、ＬＲＰ２及びＣＤＨ６からなる群より選択される１以上のタンパク質を発現していてもよい。
　本発明の生体模倣システムは、従来の生体模倣システムよりも、ヒトの近位尿細管に近い評価がｉｎ　ｖｉｔｒｏで可能になり、それにより、創薬における前臨床試験において、候補薬剤の有効性、腎毒性及び薬物動態を簡便に評価できるのみならず、動物実験及び培養細胞実験の代替となり得、実験動物などの資源を節約、臨床試験における候補薬剤の脱落の削減、ないし創薬コスト削減につながる。
一実施形態のマイクロ流体デバイス１を分解して示す斜視図及び生体模倣システムの断面図である。 マイクロ流体デバイスを蠕動ポンプ等につないで、灌流する際の一例を示す図である。 参考例１における、ＲＰＴＥＣ／ＨＵＶＥＣ二層培養による近位尿細管上皮細胞の微絨毛への影響を評価した結果を示す図である。 参考例１における、灌流培養による近位尿細管上皮細胞の微絨毛への影響を評価した結果を示す図である。 参考例１における培養プロトコールを示す模式図である。 参考例１における、各遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量を評価した結果を示すグラフである。 参考例１における、アルブミン輸送量を評価した結果を示す図である。 参考例１における、アルブミン輸送率を評価した結果を示す図である。 参考例１における、グルコース輸送量を評価した結果を示す図である。 参考例１における、グルコース輸送率を評価した結果を示す図である。 参考例１における、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３輸送量を評価した結果を示す図である。 参考例１における、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３透過係数を評価した結果を示す図である。 実施例１における、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣからなる上皮組織を有する生体機能チップの上皮組織形態を評価した結果を示す顕微鏡画像である。 実施例１における、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣからなる上皮組織を有する生体機能チップの上皮組織形態を評価した結果を示す顕微鏡画像である。 実施例１における、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣからなる上皮組織を有する生体機能チップの上皮組織形態を評価した結果を示す顕微鏡画像である。 実施例１における、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣからなる上皮組織を有する生体機能チップの上皮組織形態を評価した結果を示す顕微鏡画像である。 実施例１における、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣからなる上皮組織を有する生体機能チップにおけるコラーゲンＩＶ及びラミンンの局在を評価した結果を示す顕微鏡画像である。 実施例１における、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣからなる上皮組織を有する生体機能チップにおける各遺伝子のｍＲＮＡの発現量を評価した結果を示す図である。 実施例１における、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣからなる上皮組織を有する生体機能チップのＲｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３の排出（輸送）を評価した結果を示す図である。 実施例１における、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣからなる上皮組織を有する生体機能チップのＲｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３の排出（輸送）を評価した結果を示す図である。 実施例１における、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣからなる上皮組織を有する生体機能チップのＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣ層の細胞高さを評価した結果を示す図である。 実施例１における、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣからなる上皮組織を有する生体機能チップのグルコース輸送率を評価した結果を示す図である。
＜生体模倣システム＞
　一実施形態の生体模倣システムは、マイクロ流体デバイス、並びに、該マイクロ流体デバイス内に収容される、ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞を備え、
　上記マイクロ流体デバイスは、
　　デバイス本体と、
　　上記デバイス本体に設けられた第１のチャンバーと、
　　上記デバイス本体に設けられた第２のチャンバーと、
　　上記第１のチャンバーと上記第２のチャンバーとの間に位置し、上記第１のチャンバーと上記第２のチャンバーとを隔てる多孔質膜と
　を備え、
　上記ＲＰＴＥＣ及び上記ＬＴＬ陽性細胞が上記第１のチャンバー内に収容され、かつ、上記多孔質膜の上記第１のチャンバーに面する第１の表面に接着している。一実施形態の生体模倣システムは、ヒト血管内皮細胞をさらに備えてもよく、上記ヒト血管内皮細胞が上記第２のチャンバー内に収容され、かつ、上記多孔質膜の上記第２のチャンバーに面する第２の表面に接着していてもよい。
（マイクロ流体デバイス）
　一実施形態のマイクロ流体デバイスは、デバイス本体と、デバイス本体に設けられた第１のチャンバーと、デバイス本体に設けられた第２のチャンバーと、第１のチャンバーと第２のチャンバーとの間に位置し、第１のチャンバーと第２のチャンバーとを隔てる多孔質膜とを備える。マイクロ流体デバイスは、所定の第１のチャンバー、第２のチャンバー、及び多孔質膜を備える任意のマイクロ流体デバイスであってよく、例えば、非特許文献２及び４に記載のデバイスであってよい。
　一実施形態のマイクロ流体デバイス１は、図１に示されるように、デバイス本体１０と、デバイス本体１０に設けられた第１のチャンバー２と、デバイス本体１０に設けられた第２のチャンバー３と、第１のチャンバー２と第２のチャンバー３との間に位置し、第１のチャンバー２と第２のチャンバー３とを隔てる多孔質膜４とを備える。また、マイクロ流体デバイス１が、デバイス本体１０に設けられ、第１のチャンバー２に連通する第１の供給部５と、デバイス本体１０に設けられ、第２のチャンバー３に連通する第２の供給部６とをさらに備えてもよい。なお、図１はマイクロ流体デバイス１を分解して示す斜視図を示しており、マイクロ流体デバイス１の使用時の状態は、図１に示す各パーツが重なった状態である。第２の供給部６は、貫通孔６ａと凹部６ｂとが連通して形成される。
　マイクロ流体デバイス１は、細胞培養に適した材料から形成されるものであれば、特に限定されない。材料としては、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のプラスチック樹脂を挙げることできるが、これらに限定されない。マイクロ流体デバイスの形状も限定されず、大きさはマイクロ流体デバイスとしての通常の大きさであればよく特に限定されず、例えば、１０ｍｍ～１００ｍｍ×１０ｍｍ～１００ｍｍ×５～２０ｍｍに収まるサイズであってよい。
　第１のチャンバー２は、ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞並びに第１の培地を収容し、ＲＰＴＥＣ及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞を含む混合細胞層を形成させ、保持するためのチャンバー（空間）である。その形状及び大きさは特に限定されない。第１のチャンバー２の高さ（深さ）は適宜設定できるが、例えば、５０μｍ～５００μｍであってもよく、５０μｍ～３００μｍ、５０μｍ～２５０μｍ、又は１００μｍ～２５０μｍであってもよい。第１のチャンバー２の長さが１ｍｍ～２０ｍｍであってよく、幅が１～５ｍｍであってよい。
　第２のチャンバー３は、ヒト血管内皮細胞及び第２の培地を収容し、ヒト血管内皮細胞を含む血管内皮組織を形成させ、保持するためのチャンバー（空間）である。その形状及び大きさは特に限定されない。第２のチャンバー３の高さ（深さ）は適宜設定できるが、例えば、５０μｍ～５００μｍであってもよく、５０μｍ～３００μｍ、５０μｍ～２５０μｍ、又は１００μｍ～２５０μｍであってもよい。第２のチャンバー３の長さが、例えば１～２０ｍｍであってよく、幅が例えば１～５ｍｍであってよい。さらに、第２のチャンバー３は第１のチャンバー２と同じサイズであってもよい。
　多孔質膜４は、第１のチャンバー２と第２のチャンバー３とを隔てる多孔質の膜であり、この多孔質膜４からなる隔壁によって、第１のチャンバー２及び第２のチャンバー３が独立した空間となり、互いに連通していない。多孔質膜４は、第１のチャンバー２に面する表面（第１の表面４１）と、第２のチャンバー３に面する表面（第２の表面４２）を有し、多孔質膜４の第１の表面４１にＲＰＴＥＣ及び多能性幹細胞由来が接着しており、第２の表面４２にヒト血管内皮細胞が接着している。
　多孔質膜４は、０．４μｍ～３．０μｍ、好ましくは１μｍ～３．０μｍの孔があることが好ましい。これにより、多孔質膜４が細胞にとって基底膜の役割を果たし、また、ＲＰＴＥＣ由来細胞外マトリックスが孔を埋めることで、ＲＰＴＥＣ及びＬＴＬ陽性細胞とヒト血管内皮細胞との間の直接的な相互作用が可能になり、ＲＰＴＥＣ及びＬＴＬ陽性細胞のより高い増殖速度、ミトコンドリア活性、及び濾過効率を実現可能になる。
　多孔質膜４の材質は、多孔質膜４の両側の細胞の相互作用を可能する材質であれば特に限定されず、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネートであってよく、特にＰＥＴであってよい。多孔質膜４の材質は細胞が接着できる材質であることが好ましく、また、例えばアルブミン、フィブロネクチン及びコラーゲン等の細胞接着剤でコーティングされていることがさらに好ましい。多孔質膜４のサイズは、第１のチャンバー２及び第２のチャンバー３のサイズによって決定され、膜の厚みは特に限定されず、その厚みは例えば５μｍ～５０μｍであってよく、好ましくは５μｍ～２０μｍ、又は５μｍ～１０μｍであってよい。
　マイクロ流体デバイス１が、デバイス本体１０に設けられ、第１のチャンバー２に連通する第１の供給部と、デバイス本体１０に設けられ、第２のチャンバー３に連通する第２の供給部とをさらに備えてもよい。第１の供給部５は、第１の培地を第１のチャンバー２に供給し灌流を行うための供給部であり、第２の供給部６は、第２の培地を第２のチャンバー３に供給し灌流を行うための供給部である。第１の供給部５又は第２の供給部６は、灌流を一方向に行うために、２つ以上があることが好ましい。例えば、供給部が２つある場合は、１つは培地の投入部とし、もう一つは培地の排出部とすることができる。マイクロ流体デバイス１に対して、灌流を行うために、第１の供給部５及び第２の供給部６は、例えば、図２に示されるように、ポンプに接続されてもよい。第１の供給部５及び第２の供給部６のサイズは当業者が適宜に設定することができる。灌流培養は、刷子縁の形態及び成熟に影響を及ぼすことが考えられる。
（ヒト腎近位尿細管上皮細胞）
　近位尿細管は、ネフロンにおける尿細管のボーマン嚢とヘンレループの間の部分であり、糸球体濾過された水とＮａＣｌはその約７０％が近位尿細管で再吸収されるのに対し、グルコース、アミノ酸、乳酸、コハク酸など生体にとって有用な代謝の基質及びそれらの中間代謝産物の大部分は近位尿細管にて再吸収されている。さらに不要な代謝産物、薬物などの外因性化学物質の分泌（排出）は近位尿細管で行われている。
　近位尿細管上皮細胞（renal proximal tubule epithelial cell；ＲＰＴＥＣ）は、極性を持つ上皮細胞であり、形態学的のみならず機能的にも非対称性を示す。細胞膜は尿細管腔に面した刷子縁膜（brush-border membrane）又は頂端膜（apical membrane）と、血管／間質に面した側底膜（basolateral membrane）に区分される。両細胞膜には特異的な輸送体（トランスポーター）が局在することで、再吸収及び分泌（排出）といった方向選択的な経細胞輸送（transcellular transport）が可能となる。
　本発明におけるヒト腎近位尿細管上皮細胞は、初代培養細胞であっても、継代培養細胞であっても、また細胞株であってもよく、品質の安定性及び扱いやすさから、細胞株であることが好ましい。細胞株としては、ヒト腎近位尿細管上皮不死化細胞株、特に、ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＣＲＬ－４０３１（商標））、不死化ヒト近位尿細管細胞株ＨＫ－２等が挙げられる。
（多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞）
　多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞は、多能性幹細胞を分化誘導して得られた、腎尿細管のマーカーであるＬＴＬ（Ｌｏｔｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　ｌｅｃｔｉｎ）が陽性の細胞である。ＬＴＬ陽性細胞は、近位尿細管細胞（ＰＴ）、すなわち、ヒト腎近位尿細管上皮細胞の機能を有すると考えられている。ＬＴＬ陽性細胞はラミニン及びコラーゲンＩＶを分泌し、ｍＲＮＡ発現レベルやタンパク質発現を上昇させて、近位尿細管の機能向上に寄与すると考えられている。
　多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）、ＥＧ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）等を挙げることが出来る。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）から得られるＭｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉ－ｌｉｎｅａｇｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　ｓｔｒｅｓｓ　ｅｎｄｕｒｉｎｇ　ｃｅｌｌ）や、生殖細胞（例えば精巣）から作製されたＧＳ細胞も多能性幹細胞に包含される。多能性幹細胞としては、ｉＰＳ細胞が好ましく用いられる。ｉＰＳ細胞は、体細胞を、公知の方法等により初期化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）することにより、多能性を誘導した細胞である。ｉＰＳ細胞は、２００６年、山中らによりマウス細胞で樹立されて（Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４），ｐｐ．６６３－６７６）以来、様々な株化された人工多能性幹細胞が入手可能となった。例えば、ヒトｉＰＳ細胞であるＣＲＬ１５０２．３株（ＭＣＲＩ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、京都大学で樹立された２０１Ｂ７細胞、２０１Ｂ７－Ｆｆ細胞、２５３Ｇ１細胞、２５３Ｇ４細胞、１２０１Ｃ１細胞、１２０５Ｄ１細胞、１２１０Ｂ２細胞、１２３１Ａ３細胞等のヒト人工多能性幹細胞株が、京都大学及びｉＰＳアカデミアジャパン株式会社より入手可能である。株化された人工多能性幹細胞として、例えば、京都大学で樹立されたＦｆ－Ｉ０１細胞、Ｆｆ－Ｉ１４細胞及びＱＨＪＩ０１ｓ０４細胞が、京都大学より入手可能である。本発明におけるｉＰＳ細胞は、特に限定されず、ヒトｉＰＳ細胞であることが好ましく、また、上記のいずれのｉＰＳ細胞株及びその既知のｉＰＳ細胞であってもよい。
　多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞は、多能性幹細胞を分化誘導することによって得ることができる。ＬＴＬ陽性細胞は、特にｉＰＳ細胞から作製した腎臓オルガノイド由来のＬＴＬ陽性細胞であることが好ましい。腎臓オルガノイドは、既知の分化誘導方法にしたがってｉＰＳ細胞から分化誘導によって作製することができる。腎臓オルガノイドの作製方法は特に限定されないが、例えばＴａｋａｓａｔｏら（"Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells," Nat Protoc, vol. 11, pp. 1681-1692, 2016）のプロトコールが好ましく用いられる。簡単に述べると、ヒトｉＰＳ細胞を所定の分化誘導因子とともに培養することによって中間中胚葉を誘導し、次いで中間中胚葉を三次元培養環境に移して腎臓オルガノイドを形成させる。腎臓オルガノイドから、例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）にてＬＴＬ陽性細胞を濃縮・選別することができる。ＬＴＬ陽性細胞は主に近位尿細管上皮細胞であるが遠位尿細管上皮細胞も含むので近位尿細管上皮細胞の機能に加えて、水分の再吸収やイオン濃度の恒常性維持機能を有すると考えられる。
（ヒト血管内皮細胞）
　ヒト血管内皮細胞としては、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells；ＨＵＶＥＣ）、ヒト腎血管由来初代培養血管内皮細胞（ＨＧＭＥＣ）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）、ヒト臍帯動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）等が挙げられ、特にＨＵＶＥＣが好ましく用いられる。ＨＵＶＥＣは、ヒト臍帯静脈を構成する内皮細胞であり、単離されたＨＵＶＥＣは、高分子輸送、血管形成などの生理学及び薬理学的研究に一般的に使用されている。本発明におけるヒト血管内皮細胞は特に限定されず、初代培養細胞であっても、継体培養細胞であっても、また細胞株であってもよく、品質の安定性及び扱いやすいさから、細胞株であることが好ましい。細胞株としては、ＨＵＶＥＣ／ＴＥＲＴ２、ＴＩＭＥ等が挙げられる。さらに、ヒト血管内皮細胞としては、多能性幹細胞由来のヒト血管内皮細胞の性質を持つ細胞を用いてもよい。ヒト血管内皮細胞を含ませることで、ヒト血管内皮細胞からＲＰＴＥＣに向かって発せられる細胞外シグナルが生体模倣システムの機能向上に寄与すると考えられる。
（第１のチャンバー２内の細胞について）
　生体模倣システムにおいて、図１の生体模倣システムの断面図に示されているように、ＲＰＴＥＣ及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞が第１のチャンバー２内に収容され、かつ、マイクロ流体デバイス１の多孔質膜４の第１の表面４１に接着している。ＲＰＴＥＣ及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞の共培養によって多孔質膜４の第１の表面４１にＲＰＴＥＣ及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞を含む混合細胞層７を形成しており、この混合細胞層７が上皮組織であることが好ましい。ＲＰＴＥＣ及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞を別々に又は細胞混合物として、第１のチャンバー２に播種し、多孔質膜４の第１の表面４１が底面となるように、ＲＰＴＥＣ及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞を共培養することによって、ＲＰＴＥＣ及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞が多孔質膜４に接着している。播種時において、ＲＰＴＥＣと多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞との混合比は、１：９～９：１であってよく、たとえば２：８～８：２、３：７～７：３、４：６～６：４であってよく、好ましくは１：１である。
　多孔質膜４に接着し、多孔質膜４の上に形成されるＲＰＴＥＣ及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞の共培養物は、部分的に多層化してもよいが、基本的には単層の近位尿細管上皮様組織（本明細書において、単に「上皮組織」という場合がある）を形成しており、かつ、極性を有している。多孔質膜４に接していない側は、頂端膜（apical）側であり、その表面が微絨毛に覆われている。多孔質膜４に接している側は、基底膜側である。
　マイクロ流体デバイス１に含まれるＲＰＴＥＣ及びの数は、多孔質膜４の表面積に対して、例えば、１×１０４個／ｃｍ２～１×１０６個／ｃｍ２であってよく、好ましくは６×１０４個／ｃｍ２～１×１０５個／ｃｍ２であってよく、特に８×１０４個／ｃｍ２～１×１０５個／ｃｍ２であってよい。マイクロ流体デバイス１に含まれる多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞の数は、多孔質膜４の表面積に対して、例えば、１×１０４個／ｃｍ２～１×１０６個／ｃｍ２であってよく、好ましくは６×１０４個／ｃｍ２～×１０５個／ｃｍ２であってよく、特に８×１０４個／ｃｍ２～１×１０５個／ｃｍ２であってよい。マイクロ流体デバイス１に含まれるＲＰＴＥＣ及びＬＴＬ陽性細胞の合計数は、多孔質膜４の表面積に対して、例えば、２×１０４個／ｃｍ２～２×１０６個／ｃｍ２であってよく、好ましくは１．２×１０５個／ｃｍ２～２×１０５個／ｃｍ２であってよく、特に１．６×１０５個／ｃｍ２～２×１０５個／ｃｍ２であってよい。多孔質膜４におけるＲＰＴＥＣ及びＬＴＬ陽性細胞が、好ましくは７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上又は１００％のコンフルエントを有してもよい。１００％コンフルエントの場合は、上皮組織は融合し、不浸透性になる。
　ＲＰＴＥＣ及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞を培養する培地は、通常上皮細胞を培養するための培地であればよく、例えば、ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ（商標）Ｒｅｎａｌ　Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＣ－３１９０）、ＲＥＬＡＲ（登録商標、ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞培養用無血清培養液、株式会社細胞科学研究所、２１１２Ｐ０５）、ｈＴＥＲＴ　Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ　ＲＰＴＥＣ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｋｉｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＡＣＳ－４００７）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地などが挙げられる。そのうち、特にＲＥＧＭが好ましく用いられる。
（第２のチャンバー３内の細胞について）
　生体模倣システムにおいて、図１の生体模倣システムの断面図に示されているように、ヒト血管内皮細胞が第２のチャンバー３内に収容され、かつ、マイクロ流体デバイス１の多孔質膜４の第２の表面４２に接着している。ヒト血管内皮細胞が多孔質膜４の第２の表面４２にヒト血管内皮細胞層８を形成しており、このヒト血管内皮細胞層８が血管内皮組織であることが好ましい。ヒト血管内皮細胞を第２のチャンバー３に播種し、多孔質膜４の第２の表面４２が底面となるように、ヒト血管内皮細胞を培養することによって、ヒト血管内皮細胞及びＬＴＬ陽性細胞が多孔質膜４に接着している。
　多孔質膜４に接着し、多孔質膜４の上に形成されるヒト血管内皮細胞は、部分的に多層化してもよいが、基本的には単層の血管内皮様組織（本明細書において、単に「血管内皮」という場合がある）を形成する。この血管内皮は、多孔質膜４を介して、上皮組織と相互作用し、近位尿細管を模倣する。
　マイクロ流体デバイス１に含まれるヒト血管内皮細胞の数は、多孔質膜４の表面積に対して、例えば、１×１０４個／ｃｍ２～１×１０６個／ｃｍ２であってよく、好ましくは７×１０４／ｃｍ２～１×１０５／ｃｍ２であってよく、特に好ましくは９×１０４／ｃｍ２～１×１０５／ｃｍ２であってよい。多孔質膜４におけるヒト血管内皮細胞が、好ましくは７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上又は１００％のコンフルエントを有してもよい。１００％コンフルエントの場合は、血管内皮組織は融合し、不浸透性になる。
　ヒト血管内皮細胞を培養する培地は、通常内皮細胞を培養するための培地であればよく、例えば、ＥＧＭ－２（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ－２、Ｌｏｎｚａ）などが挙げられる。
　一実施形態の生体模倣システムは、静置培養又は灌流培養にて維持、使用することができる。静置培養の場合は、例えば、毎日２００μｌ／チャンバーの培地を交換しながら３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養すればよく、静置培養は凡そ２０日間ほど維持することができる。灌流培養の場合は、例えば、１０μｌ／分の流量で培地を灌流しながら、３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養すればよい。
（生体模倣システムの機能）
　従来の近位尿細管モデルは、近位尿細管上皮細胞のみをＴｒａｎｓｗｅｌｌ上で培養する評価系が用いられており、このような評価系においては、尿細管上皮細胞と血管との界面を再現できず、近位尿細管における再吸収を評価できない。また、近位尿細管上皮細胞は限られたトランスポーターしか発現しておらず、複数のトランスポーターが複雑に関与しあっている生体内の状況を正確に反映しているとはいえない。さらに、従来のマイクロ流体デバイス上で近位尿細管上皮細胞と血管上皮細胞との二層培養による評価系によっても十分に生体内の状況を反映しているとはいえない。
　本発明の生体模倣システムは、ＲＰＴＥＣ及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞の混合細胞層を用いることによって、近位尿細管上皮細胞の層においてＲＰＴＥＣのみの細胞層に比べて、下記の利点を得ることができる。
（１）近位尿細管上皮細胞特異的なトランスポーターＳＬＣ２２Ａ２（Ｓｏｌｕｔｅ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｆａｍｉｌｙ　２２　Ｍｅｍｂｅｒ　２、ＯＣＴ２、カチオン性薬剤の排泄）、ＳＬＣ５Ａ２（Ｓｏｌｕｔｅ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｆａｍｉｌｙ　５　Ｍｅｍｂｅｒ　２、ＳＧＬＴ２、グルコースの再吸収）、ＡＱＰ１（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ　１、水分子の再吸収）、上皮細胞マーカーであるＬＲＰ２（Ｌｏｗ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　２、Ｍｅｇａｌｉｎ、アルブミンなどの取り込み）、ＣＤＨ６（Ｃａｄｈｅｒｉｎ　６、アドヘレンスジャンクションと呼ばれる細胞間結合を構成するタンパク質）等の発現が上昇する。
（２）マイクロ流体デバイスを用いた無灌流培養により、Ｐ－ｇｐ（脂溶性薬剤の排泄）の輸送機能が上昇する。また、上記（１）の発現が上昇したＳＬＣ２２Ａ２、ＳＬＣ５Ａ２、ＡＱＰ１、ＣＤＨ６の発現が上昇することから、これらのトランスポーターの輸送機能も上昇すると考えられる。さらに、灌流培養により、これらのトランスポーターの輸送機能がさらに上昇すると考えられる。
　本発明の生体模倣システムは、多孔質膜を挟んで、ＲＰＴＥＣ及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞の混合細胞層と、ヒト血管内皮細胞層との二層を有する場合は、以下の利点を得ることができる。
（３）ＳＬＣ５Ａ２（ＳＧＬＴ２）の発現上昇に対応して、グルコースの再吸収能が上昇し、フロリジンによる輸送阻害効果を評価できる。また、生体模倣システムはＲＰＴＥＣの細胞極性に対応した輸送効率の方向性を示す。
（４）ＭＤＲ１（Ｐ－ｇｐ）の基質であるＲｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３の輸送能が上昇し、阻害剤ベラパミルによる輸送阻害を評価できる。また、生体模倣システムはＲＰＴＥＣの細胞極性に対応した輸送効率の方向性を示す。
（５）ＳＬＣ２２Ａ２（ＯＣＴ２）の発現上昇に対応して、基質である４－Ｄｉ－１－ＡＳＰの輸送能が上昇し、阻害剤シメチジンによる輸送阻害を評価できる。
　各トランスポーター又はマーカーの発現は、ｍＲＮＡの発現又は免疫染色等既知の方法によって定量することができる。発現量の上昇は、近位尿細管上皮細胞の層においてＲＰＴＥＣのみを用いるものに比べて、１０％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上増加することを意味する。
（生体模倣システムの用途）
　一実施形態の生体模倣システムは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで近位尿細管の機能を再現でき、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの再吸収及び濾過効率を評価することができる。また、候補薬物のスクリーニング又は薬物動態の確認又は毒性実験のために用いることができる。生体模倣システムを用いることにより、前臨床段階で高い薬効、好ましい薬物動態、及び／又は低い毒性を有する物質をスクリーニングすることで、より成功可能性の高い創薬につながるとともに、創薬コストをも低減できる。
＜候補薬物のスクリーニングのためのキット＞
　一実施形態の候補薬物のスクリーニングのためのキットは、マイクロ流体デバイス、ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）、及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞を含む。ここで、マイクロ流体デバイスは上述のとおりである。一実施形態のキットは、ＲＰＴＥＣ及び／又は多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞の培地又は培地の添加成分をさらに含んでもよく、また、使用説明書をさらに備えてもよい。また、キットはヒト血管内皮細胞を含んでもよく、ヒト血管内皮細胞の培地又は培地の添加成分を含んでもよい。
　多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞とＲＰＴＥＣとを、マイクロ流体デバイスの第１のチャンバー内に、かつ、多孔質膜の第１のチャンバーに面する第１の表面に接着するように共培養することで、ＲＰＴＥＣ及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞の混合細胞層（上皮組織層）を有する生体模倣システムを得ることができる。必要に応じてさらに、第２のチャンバー内に、かつ、多孔質膜の第２のチャンバーに面する第２の表面に接着するようにヒト血管内皮細胞を培養して、上皮組織層と内皮組織層の二層を有する、生体模倣システムを得ることができる。
＜生体模倣システムの製造方法＞
　一実施形態の生体模倣システムの製造方法は、
（１）マイクロ流体デバイスを用意する工程と、
（２）ＲＰＴＥＣ及びＬＴＬ陽性細胞を第１のチャンバーに播種し、培養し、ＲＰＴＥＣ及びＬＴＬ陽性細胞を多孔質膜の第１の表面に接着させる工程と
を含み、
（３）ヒト血管内皮細胞を第２のチャンバーに播種し、培養し、ヒト血管内皮細胞を多孔質膜の第２の表面に接着させる工程をさらに含んでもよい。
（工程（１））
　マイクロ流体デバイスを用意する工程（１）において、上述のマイクロ流体デバイスを作製する。以下、図１に示されるマイクロ流体デバイス１を例にその作製方法について説明する。マイクロ流体デバイスの内部構造が複雑であるため、一体成型が困難である。例えば、図１に示されるように、第１のチャンバー２及び第２のチャンバー３に対応する凹部をそれぞれ有する２つの層（基板）と、多孔質膜４とを用意し、第１のチャンバー２を形成するための凹部（第１の凹部）を有する基板（第１の基板１ａ）、多孔質膜４、第２のチャンバー３を形成するための凹部（第２の凹部）を有する基板（第２の基板１ｂ）の順に、位置を併せて接合することによって作製することができる。第１の基板１ａにおける第１の凹部の一部が多孔質膜４によって塞がり第１のチャンバー２を形成し、第１のチャンバー２を形成しない第１の凹部の部分は、第２の基板１ｂによってふさがり、後述の第１の供給部５に連通するための第１のチャンネルを形成する。第２の基板１ｂにおける第２の凹部の一部が多孔質膜４によって塞がり第２のチャンバー３を形成し、第２のチャンバー３を形成しない第２の凹部の部分は、第１の基板１ａによってふさがり、後述の第２の供給部６に連通するための第２のチャンネルを形成する。第１の基板１ａにおける、第１のチャンバー２を形成するための第１の凹部の一部と、第２の基板１ｂにおける、第２のチャンバー３を形成するための第２の凹部の一部とは、形状が同じであって、かつ、位置が対応していてよい。第１のチャンネル及び第２のチャンネルは、細胞を灌流するためにそれぞれ２つあることが好ましく、第１のチャンバー又は第２のチャンバーの両側に配置することが好ましい。
　第１の基板１ａ及び第２の基板１ｂは、例えば、ソフトリソグラフィー等の微細な立体構造を形成できる技術を用いて、所望の形状を有する硬化物を形成することによって作製することができる。ソフトリソグラフィーに用いられる材料としては、通常用いられるものであればよく、例えばエポキシ樹脂、シリコーン樹脂等が挙げられる。例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の熱硬化性樹脂のポリマーであってもよい。ＰＤＭＳプレポリマーとしては、ＰＤＭＳ主剤に硬化剤を混入させたものが挙げられる。ポリマー主剤：硬化剤の比率は特に限定されないが、例えば、５：１～１５：１であってもよい。
　第１の基板１ａ上に、上述の第１のチャンネルに連通する第１の供給部５に対応する貫通孔をさらに備えることが好ましい。また、第１の基板１ａ及び第２の基板１ｂ上に、上述の第２のチャンネルに連通する第２の供給部６に対応する、第１の基板１ａにおける貫通孔及び第２の基板１ｂにおける凹部をさらに備えることが好ましい。第１の基板１ａに形成された貫通孔６ａと第２の基板１ｂに形成された凹部６ｂとが連通して第２の供給部６を形成する。第１の基板１ａ側から第１の供給部５、第２の供給部６を介して培地を供給可能である。第１のチャンバー２及び第２のチャンバー３内の細胞を灌流するために、第１の供給部５及び第２の供給部６はそれぞれ２つあることが好ましい。第１の基板１ａ及び第２の基板１ｂの形状は特に限定されないが、長方形の板であることが好ましい。この場合、第１の基板１ａと第２の基板１ｂの平面が同じサイズの長方形であってよく、また、それぞれの基板の厚さが同じであってもよく、第１の供給部５及び第２の供給部６の所望の深さを考慮して、第１の基板１ａを第２の基板１ｂよりも厚くしてもよい。
　作製されたマイクロ流体デバイス１は、細胞培養に供される前に、７０％エタノール又はＵＶ照射等によって滅菌を行ってもよい。
（工程（２））
　工程（２）は、ＲＰＴＥＣ及びＬＴＬ陽性細胞を第１のチャンバーに播種し、培養し、ＲＰＴＥＣ及びＬＴＬ陽性細胞を多孔質膜の第１の表面に接着させる工程である。
　第１のチャンバーに播種されるＲＰＴＥＣ及びＬＴＬ陽性細胞の合計数は、培養後の所望のＲＰＴＥＣ及びＬＴＬ陽性細胞の数によって適宜に設定できるが、例えば、１．２×１０５～６×１０５／ｃｍ２であってよく、好ましくは３．６×１０５／ｃｍ２であってよい。培養開始から約１日でＲＰＴＥＣが多孔質膜に接着することができ、その後、増殖させながら培養する。培地及び培養条件は上述のとおりである。培養日数は特に限定されないが、例えば、７日～２０日であってよく、好ましくは１０日～１４日であってよい。
（工程（３））
　工程（３）は、ヒト血管内皮細胞を第２のチャンバーに播種し、培養し、ヒト血管内皮細胞を多孔質膜の第２の表面に接着させる工程である。工程（２）と工程（３）は、順番を前後にしてもよいが、工程（３）は工程（２）の後であることが好ましい。先に上皮組織を成熟させてからヒト血管内皮細胞を播種することで、培地の混合を防ぎ、それぞれの細胞の至適培養条件を実現できるからである。例えば、工程（２）の培養開始７日～１０日後、ＲＰＴＥＣ及びＬＴＬ陽性細胞が多孔質膜に接着したのち、好ましくはＲＰＴＥＣ及びＬＴＬ陽性細胞が上皮組織を形成したのち、工程（３）を開始させてもよい。なお、ヒト血管内皮細胞を第２のチャンバーに播種する際には、多孔質膜の第２の表面を上にする。
　第２のチャンバーに播種されるヒト血管内皮細胞の数は、培養後の所望のヒト血管内皮細胞の数によって適宜に設定できるが、例えば、１×１０５～５×１０５／ｃｍ２であってよく、好ましくは３×１０５～４×１０５／ｃｍ２であってよい。培養開始から約１日でヒト血管内皮細胞が多孔質膜に接着することができ、その後、増殖させながら培養する。培地及び培養条件は上述のとおりである。培養日数は特に限定されないが、例えば、１日～２０日であってよく、好ましくは４日～７日であってよい。
　ＲＰＴＥＣ及びＬＴＬ陽性細胞からなる上皮組織、並びに、ヒト血管内皮細胞からなる血管内皮組織を顕微鏡で観察し、上皮組織が部分的に多層化する場合もあるが、流路全体に隙間なく上皮組織が埋め尽くされて、かつ、裏側の血管内皮組織も７０％以上コンフルエントを維持していれば、生体模倣システムの完成といえる。
　また、生体模倣システムの機能について、基質であるＲｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３又は４－Ｄｉ－１－ＡＳＰの輸送能、グルコースの再吸収能、アルブミンの再吸収能等を測定することによって、評価することができる。それぞれの測定方法は既知の方法であればよく、例えば実施例に記載の方法が挙げられる。
＜上皮組織＞
　一実施形態の上皮組織は、ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）と多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞とを共培養して得られる上皮組織である。ＲＰＴＥＣ及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞、並びに共培養方法は上述したとおりである。本実施形態の上皮組織は、ヒトの近位尿細管上皮組織の生理機能を備えるものであるため、創薬における評価ツールとして使用できる。
　一実施形態の上皮組織は、ＳＬＣ２２Ａ２（ＯＣＴ２、カチオン性薬剤の排泄）、ＳＬＣ５Ａ２（ＳＧＬＴ２、グルコースの再吸収）、ＡＱＰ１（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ　１、水分子の再吸収）、ＬＲＰ２（Ｍｅｇａｌｉｎ、アルブミンなどの取り込み）及びＣＤＨ６（Ｃａｄｈｅｒｉｎ　６、アドヘレンスジャンクションと呼ばれる細胞間結合を構成するタンパク質）からなる群より選択される１以上のタンパク質を発現していてもよい。とりわけＳＬＣ２２Ａ２、ＳＬＣ５Ａ２、ＡＱＰ１、ＬＲＰ２及びＣＤＨ６からなる群より選択される１以上のタンパク質を高発現していることが好ましい。ここで、「高発現」とは、ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）のみの細胞層（上皮組織）に比べて発現量が高いことを意味する。これらを発現する上皮組織を創薬ツールとして用いると、例えばＳＬＣ５Ａ２の発現上昇に対応してグルコースの再吸収能が上昇することを利用し、グルコース量を指標としてグルコースの再吸収を阻害する薬剤（例えば、フロリジン）又はグルコースの排出を促進する薬剤の探索及び評価等を行うことができ、またＳＬＣ２２Ａ２の発現上昇に対応して基質である４－Ｄｉ－１－ＡＳＰの輸送能が上昇することを利用し、４－Ｄｉ－１－ＡＳＰ量を指標として４－Ｄｉ－１－ＡＳＰの輸送を阻害する薬剤（例えば、シメチジン）又は４－Ｄｉ－１－ＡＳＰの排出を促進する薬剤の探索及び評価等を行うことができる。
　一実施形態の上皮組織を創薬ツールとして用いる場合、例えばヒト腎近位尿細管模倣モデルとして用いることができる。すなわち、本発明の他の一実施形態は、一実施形態の上皮組織からなるヒト腎近位尿細管模倣モデルである。ＲＰＴＥＣを含有することで、ヒト腎近位尿細管に近く、創薬における評価ツールとして使用できるヒト腎近位尿細管模倣モデルを得ることができる。また、ＳＬＣ２２Ａ２、ＳＬＣ５Ａ２、ＡＱＰ１、ＬＲＰ２及びＣＤＨ６からなる群より選択される１以上のタンパク質を発現していると、より好適に創薬における評価ツールとして使用できる点は、上述のとおりである。
　また、本発明の他の一実施形態は、一実施形態の上皮組織及びヒト血管内皮細胞が接着した構造を有するヒト腎近位尿細管模倣モデルである。ヒト血管内皮細胞と接着した構造を有することにより、尿細管上皮細胞と血管との界面を生体に近く再現することができ、近位尿細管における再吸収を評価することができる。また、ヒト腎近位尿細管模倣モデルが、ＲＰＴＥＣと多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞とを共培養して得られる上皮組織を含むことで、近位尿細管上皮細胞のみを含む上皮細胞を用いた場合と比較して多くのトランスポーターが発現するため、複数のトランスポーターが複雑に関与しあっている生体内の状況を正確に反映することができる。ＳＬＣ２２Ａ２、ＳＬＣ５Ａ２、ＡＱＰ１、ＬＲＰ２及びＣＤＨ６からなる群より選択される１以上のタンパク質を発現していると、より好適に創薬における評価ツールとして使用できる点は、上述のとおりである。
＜上皮組織の製造方法＞
　本発明の一実施形態は、ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）と多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞とを共培養する工程を含む上皮組織の製造方法である。ＲＰＴＥＣ及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞は上述したとおりであり、ＲＰＴＥＣと多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞とを共培養する工程は、上述した共培養方法に従い行うことができる。このような方法により製造した上皮組織は、ヒトの近位尿細管上皮組織の生理機能を備えるものであるため、創薬における評価ツールとして使用できる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（マイクロ流体デバイスの作製）
　ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなる、図１に示されるマイクロ流体デバイス１を作製した。エンボス加工されたチャンバーパターンを有するシリコンウェハー上に、同じＳ字形チャンバーを有する２つのＰＤＭＳ層をキャスト成形した。チャンバーパターンは、標準的なＳＵ－８フォトリソグラフィ（ＳＵ－８　３０５０（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ、米国））を用いて形成され、約１００μｍの高さを有した。それぞれの層は、厚さを除いて同一であり、顕微鏡下で膜を観察しやすいように、上層（第１のチャンバー２を有する層）は４ｍｍの厚さであり、下層（第２のチャンバー３を有する層）は約２ｍｍの厚さであった。ＰＤＭＳポリマー（ＰＤＭＳ主剤：硬化剤＝１０：１（重量比））（東レ・ダウコーニング株式会社、日本）を６５℃で一晩硬化させた後、スラブを切断し、シリコンウェハーから剥がした。チャンバー側を下に向けた下層をガラススライド上に静かに置き、最初に薄いＰＤＭＳ（未硬化）層でスピンコーティングし、次いで直ちに除去した。この薄いＰＤＭＳ層は、多孔質膜４が層間に挟まれた後に、接着層として機能した。約直径３μｍまでの孔を有する多孔質膜（カルチャーインサート、Ｆａｌｃｏｎ）を３ｍｍ×２０ｍｍに切断し、チャンバーの幅全体及びその長さをカバーし、屈曲点をわずかに超えて延在して、第１のチャンバー２と第２のチャンバー３とを完全に隔離するように、下層に配置し、上層を重ねた。薄いＰＤＭＳ層を一晩硬化させることによって上層と下層を確実に接合した。得られたマイクロ流体デバイス１は、２０ｍｍ×３０ｍｍ×１０ｍｍを有し、第１のチャンバー２及び第２のチャンバー３のサイズは１ｍｍ×１５ｍｍ×０．３５ｍｍであった。
　細胞播種前に滅菌のために、第１のチャンバー２及び第２のチャンバー３を７０％エタノールで満たし、６０℃にて一晩乾燥させ、さらに１時間ＵＶ照射を行った。第１のチャンバー２及び第２のチャンバー３を、細胞接着剤としてアルブミン、フィブロネクチン及びコラーゲンを含有する無血清ＦＮＣ　Ｃｏａｔｉｎｇ　Ｍｉｘ（登録商標）で満たし、３７℃で１分間インキュベートし、多孔質膜４の第１の表面４１及び第２の表面４２をコーティングした。
参考例１　近位尿細管上皮細胞と血管内皮細胞（ＲＰＴＥＣ／ＨＵＶＥＣ）の二層培養
　上記作製したマイクロ流体デバイスを用いて、ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）とヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）との二層培養を行った。ＲＰＴＥＣとしては、ヒト腎近位尿細管上皮不死化細胞株であるＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＣＲＬ－４０３１（商標））を用いた。血管内皮細胞としては、ＲＦＰ遺伝子導入により、赤色蛍光タンパク質を発現するヒト臍帯静脈内皮細胞（ＲＦＰ－ＨＵＶＥＣ、Ａｎｇｉｏ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｅ）を用いた。
　培養したＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１（以下、単に「ＲＰＴＥＣ」という）をトリプシンで剥離し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ　Ｌｏｗ　ｇｌｕｃｏｓｅで中和し、トリプシンの作用を止め、遠心分離用チューブに回収し、２００×ｇで３分間遠心した。ＲＰＴＥＣを４×１０６細胞／ｍｌになるように、ＲＥＧＭ培地に懸濁し、該細胞懸濁液３０μｌを、滅菌し、コーティングしたマイクロ流体デバイス１の第１の供給部５を介して、第１のチャンバー２に播種し、多孔質膜４の第１の表面４１上にＲＰＴＥＣを播種した。３７℃、５％ＣＯ２にて静置培養した。培養１０日後（Ｄａｙ１０）、ＲＰＴＥＣがコンフルエントになり、組織は融合し、不浸透性になった。
　Ｄａｙ１０に、ＲＰＴＥＣ／ＨＵＶＥＣの二層構築物を形成するために、さらに、多孔質膜４の第２の表面４２上に、ＲＦＰ－ＨＵＶＥＣを播種した。具体的には、ＲＦＰ－ＨＵＶＥＣ（以下、単に「ＨＵＶＥＣ」という）を、８０％コンフルエントになるまでＴ７５フラスコ中で内皮細胞増殖培地－２（ＥＧＭ－２、Ｌｏｎｚａ、スイス）で培養した。その後、上記と同様にトリプシンで細胞を回収し、４×１０６細胞／ｍｌ培地となるようにＥＧＭ－２に懸濁した。３０μｌの細胞懸濁液を第２のチャンバー３に注入し、デバイスをひっくり返して、細胞が多孔質膜４に接着できるように１時間インキュベートした。次いで、第２のチャンバー３を温培地でゆっくりとすすぎ、付着していない細胞を除去した。翌日、生体機能チップをひっくり返して、３７℃、５％ＣＯ２にて静置培養し、ＲＰＴＥＣ／ＨＵＶＥＣの二層培養による生体機能チップを得た。ＲＰＴＥＣの層については、ＥｐＣＡＭ抗体による免疫染色及び蛍光標識二次抗体にて、ＨＵＶＥＣの層については、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）にて蛍光顕微鏡にて観察し、両方とも均一なコンフルエントな単層を形成していることが確認できた（データ示さず）。
　灌流する場合は、図２に示されるような無気泡灌流培養装置を用いて、図１に示される第１の供給部５及び第２の供給部６を介して、第１の培地（ＲＥＧＭ）及び第２の培地（ＥＧＭ－２）を、第１のチャンバー２及び第２のチャンバー３に、１０μｌ／分（０．０６ｄｙｎ／ｃｍ２）の速度で流して、灌流培養した。なお、静置培養の場合にも、Ｄａｙ１１から、図２に示されるような無気泡灌流培養装置を用いて１μｌ／分の速度で培地交換を行った。
＜二層培養による微絨毛への影響＞
　ＲＰＴＥＣ／ＨＵＶＥＣ二層培養４日目（Ｄａｙ１４／Ｄａｙ４）に、二層培養による頂端膜側の微絨毛に対する影響を評価した。透過型電子顕微鏡にて観察し、測定した結果を図３に示す。（ａ）及び（ｃ）はそれぞれＲＰＴＥＣ／ＨＵＶＥＣ二層培養のＲＰＴＥＣ及びＨＵＶＥＣの顕微鏡写真であり、（ｂ）はＨＵＶＥＣを含まず、ＲＰＴＥＣのみを培養した場合（ＲＰＴＥＣ単層培養）の顕微鏡写真である。また、微絨毛の密度及び長さを測定した結果はそれぞれ（ｄ）及び（ｅ）に示す。なお、図中に二層はＲＰＴＥＣ／ＨＵＶＥＣ二層培養を意味する。図３から、ＲＰＴＥＣ／ＨＵＶＥＣ二層培養はＲＰＴＥＣのみに比べて微絨毛密度が増加したが、微絨毛の長さは有意な変更はなかったことが認められた。
＜灌流培養による微絨毛への影響＞
　静置培養と比較するために、ＲＰＴＥＣ単層培養の１日目（Ｄａｙ１１／Ｄａｙ１）から４日目（Ｄａｙ１４／Ｄａｙ４）まで灌流培養を行った。透過型電子顕微鏡にて観察し、測定した結果を図４に示す。（ａ）は静置培養のＲＰＴＥＣの顕微鏡写真であり、（ｂ）は灌流培養のＲＰＴＥＣの顕微鏡写真である。また、微絨毛の密度及び長さを測定した結果はそれぞれ（ｃ）及び（ｄ）に示す。図４から、灌流培養は静置培養に比べて微絨毛密度と微絨毛の長さの両方において有意な増加が認められた。
＜二層培養及び灌流培養によるｍＲＮＡ発現量への影響＞
　図５に示すプロトコールで、（ｉ）ディッシュ上の２次元（２Ｄ）培養、（ｉｉ）マイクロ流体デバイス上のＲＰＴＥＣ／ＨＵＶＥＣ二層培養（灌流なし）、（ｉｉｉ）マイクロ流体デバイス上のＲＰＴＥＣ／ＨＵＶＥＣ二層培養（灌流あり）、並びに、（ｉｖ）マイクロ流体デバイス上のＲＰＴＥＣのみ（灌流あり）を行った。
　培養後のそれぞれのＲＰＴＥＣ組織における、上皮細胞マーカーであるＣＤＨ６（Ｃａｄｈｅｒｉｎ　６）、ＥＰＣＡＭ（ＥｐＣＡＭ）、ＡＢＣＢ１（Ｐ－ｇｐ／ＭＤＲ１）、ＡＱＰ１、ＳＬＣ２２Ａ２（ＯＣＴ２）、及びＳＬＣ５Ａ２（ＳＧＬＴ２）のｍＲＮＡの発現量を評価した。
　具体的には、第１のチャンバーに、３５０μＬのＲＡ１溶解バッファーと３．５μＬのβ－メルカプトエタノール（１％）の混合液を１００μＬ注入し、ＲＰＴＥＣ組織からｍＲＮＡを抽出し、得られたｍＲＮＡ溶液を残りの２５０μＬの混合液と混合した。ライセートをボルテックスし、後で使用するために－８０℃で保存した。ｍＲＮＡの濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ　Ｏｎｅ／ＯｎｅＣ　Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ　ＵＶ－Ｖｉｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。
　ｃＤＮＡの逆転写はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘキットを用いて以下の方法で行った。ｍＲＮＡ溶液をメーカーの取扱説明書通りにヌクレアーゼフリーの水とＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘと混合した。その後、軽くボルテックスし、サーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｔ１００　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ）に入れ、３７℃で１５分、８５℃で５秒、４℃で反応させた。ｃＤＮＡ産物はＰＣＲのために－３０℃で保存した。
　ＰＣＲには、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘを用いた。鋳型となるｃＤＮＡを解凍し、ＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ、ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙと一緒に氷で冷やした。その間にＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）５　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍをセットアップした。すべての試薬を静かにボルテックスした。鋳型となるｃＤＮＡを除いた上記の試薬を含むマスターミックスをメーカーの指示通りに作成し、ｃＤＮＡをマスターミックスに加えた。マスターミックス＋ｃＤＮＡ溶液１０μＬを３８４ウェルプレートの１／３８４ウェルにサンプルごとに塗布した。ＰＣＲは標的遺伝子ごとに繰り返した。ｑＰＣＲはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）５　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　で実施した。データはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌで解析した。）
　それぞれのｍＲＮＡ発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるβ－アクチンに対する相対発現量にて図６に示す。各グラフ中、（ｉ）のバーはＤａｙ１４／Ｄａｙ４、（ｉｖ）のバーはＤａｙ１７、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の２つのバーのうち、左はＤａｙ１４／Ｄａｙ４、右はＤａｙ１７／Ｄａｙ７の結果である。図６から、ＲＰＴＥＣ／ＨＵＶＥＣ二層培養（灌流あり）は、ＲＰＴＥＣのみ（灌流あり）に比べて、ＥｐＣＡＭ、ＡＱＰ１、ＡＢＣＢ１、及びＳＬＣ２２Ａ２の発現量が増加し、また、ＲＰＴＥＣ／ＨＵＶＥＣ二層培養（灌流なし）に比べて、ＥｐＣＡＭ、ＡＱＰ１、ＡＢＣＢ１、及びＳＬＣ２２Ａ２の発現量が増加したことが認められる。また、二層培養で灌流するとメガリン（ｍｅｇａｌｉｎ）の発現量が増加することは免疫染色で確認された（データ示さず）。
＜アルブミン再吸収（輸送量）評価＞
　膜輸送体（トランスポーター）のＬＲＰ２／ｍｅｇａｌｉｎの輸送能を評価するため、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と蛍光色素ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）とのコンジュゲートであるＢＳＡ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）４８８コンジュゲート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、アルブミン再吸収（輸送量）を評価した。輸送方向は、ＲＰＴＥＣ上皮組織側→ＨＵＶＥＣ側の方向の場合、ａ→ｂ方向とした。ａ→ｂ方向と反対の、ＨＵＶＥＣ側→ＲＰＴＥＣ上皮組織側の方向をｂ→ａ方向とした。なお、ＨＵＶＥＣを含まないＲＰＴＥＣ単層培養の場合において、頂端膜側→基底膜側の方向をａ→ｂ方向とし、基底膜側→頂端膜側の方向をｂ→ａ方向とした。
　具体的には、ａ→ｂ方向の場合、ＢＳＡ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）４８８コンジュゲート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ａ１３１００）を５０μｇ／ｍｌ添加したＲＥＧＭ培地２００μｌを、ＲＰＴＥＣ／ＨＵＶＥＣ二層培養Ｄａｙ１４／Ｄａｙ４のＲＰＴＥＣ上皮組織に添加し、ＲＰＴＥＣ上皮組織によって再吸収され、ＨＵＶＥＣ側へ輸送されたＢＳＡ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）４８８の量をサンプリングし、測定した。対照として、ＨＵＶＥＣを含まない、Ｄａｙ１４のＲＰＴＥＣのみの生体機能チップも用いた。また、アルブミン添加２４時間後、細胞をＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄ３５７１）で染色し、共焦点レーザー顕微鏡にて、それぞれの生体機能チップを観察した。
　結果を図７に示す。（ａ）はＲＰＴＥＣのみ、（ｂ）はＲＰＴＥＣ／ＨＵＶＥＣ二層培養の共焦点レーザー顕微鏡画像である。これらの結果から、ＲＰＴＥＣのみと比べると、ＲＰＴＥＣ／ＨＵＶＥＣ二層培養ではアルブミンの基底膜側への蓄積が認められる。（ｃ）はアルブミン添加前（０時間）、１２時間後、２４時間後のＢＳＡ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）４８８の合計輸送量のグラフである。この結果から、ＲＰＴＥＣ／ＨＵＶＥＣ二層培養のアルブミンの輸送量はＲＰＴＥＣのみの場合の２倍以上であった。
　さらに、様々な条件でアルブミンの輸送率を測定し比較した。トランスポーターによるアルブミンの輸送を阻害するために、通常の培養温度（３７℃）ではなく４℃にて灌流した（ｗ／４℃）。なお、「灌流有」は図５の（ｉｉｉ）のプロトコール、「灌流無」は（ｉｉ）のプロトコール、ＲＰＴＥＣのみは（ｉｖ）のプロトコールで培養したものであった。結果は図８に示す。
　図８から、二層培養か単層培養か、又は灌流の有無に関わらず、ａ→ｂ方向でアルブミン輸送は認められたが、ｂ→ａ方向ではアルブミン輸送は認められなかった（１＞３、４＞６、７＞９、１０＞１２）。このことは、本発明の生体模倣システムはＲＰＴＥＣの細胞極性に対応した輸送方向と一致することを証明した。また、二層培養か単層培養か、又は灌流の有無にかかわらず、ａ→ｂ方向でのアルブミン輸送量が４℃での阻害によって低下した（１＞２、４＞５、７＞８）。このことは、アルブミンがトランスポーターを経由して輸送されていることを証明した。また、ＲＰＴＥＣ単層培養、二層培養のいずれの条件においても、灌流によりａ→ｂアルブミン輸送量が増加した（１＞７、４＞１０）。このことは、灌流によりアルブミンの再吸収能が上昇することを証明した。さらに、灌流の有無にかかわらず、二層培養はＲＰＴＥＣ単層培養に比べてａ→ｂ方向でのアルブミン輸送量が増加した（１＞４、７＞１０）。このことは、ＲＰＴＥＣ／ＨＵＶＥＣ二層培養によりアルブミンの再吸収能が上昇することを証明した。
＜グルコースの再吸収（輸送量）評価＞
　膜輸送体（トランスポーター）のＳＧＬＴ２の輸送能を評価するため、蛍光標識したグルコースプローブである２－ＮＢＤ－Ｇｌｕｃｏｓｅ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１４６２００；２－ＮＢＤＧ）を用いて、グルコースの再吸収（輸送量）を評価した。
　具体的には、ａ→ｂ方向の場合、２－ＮＢＤＧを０．５ｍＭ添加したＲＥＧＭ培地２００μｌを、ＲＰＴＥＣ単層培養Ｄａｙ１４／Ｄａｙ４のＲＰＴＥＣ上皮組織に添加し、ＲＰＴＥＣ上皮組織によって再吸収され、基底膜側へ（ａ→ｂ方向）輸送された２－ＮＢＤＧの量をサンプリングし、測定した。対照として、ｂ→ａ方向の輸送量も測定した。さらに、２－ＮＢＤＧとともに、１ｍＭの、ＳＧＬＴ２の阻害剤であるフロリジンを添加した阻害実験も行った。
　２－ＮＢＤＧ添加前（０時間）、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後の２－ＮＢＤＧの輸送量を図９に示す。図９から、ａ→ｂ方向において、阻害剤を添加した場合、阻害剤なしに比べて、グルコース輸送量が減少した。また、ｂ→ａ方向においてもグルコース輸送量が認められたが、ａ→ｂ方向の１／３ほどの量であった。
　さらに、様々な条件でグルコース輸送率を測定し比較した。なお、「灌流有」は図５の（ｉｉｉ）のプロトコール、「灌流無」は（ｉｉ）のプロトコール、ＲＰＴＥＣのみは（ｉｖ）のプロトコールで培養したものであった。結果は図１０に示す。
　図１０から、二層培養、灌流の有無に関わらず、ａ→ｂグルコース輸送量が、ｂ→ａ方向に比べ大きいことが示された（１＞３、４＞６、７＞９、１０＞１２）。このことは、本発明の生体模倣システムは生体内におけるグルコース再吸収方向と一致することを証明した。また、二層培養、灌流の有無にかかわらず、ａ→ｂ方向でのグルコース輸送量がフロリジンの阻害によって低下した（１＞２、４＞５、７＞８）。このことは、グルコースがトランスポーターを経由して輸送されていることを証明した。また、ＲＰＴＥＣのみ、二層培養のいずれの条件においても、灌流によりａ→ｂ方向でのグルコース輸送量が増加した（１＞７、４＞１０）。このことは、灌流によりグルコース輸送量が上昇することを証明した。さらに、灌流の有無にかかわらず、二層培養によりａ→ｂ方向でのグルコース輸送量が増加した（１＞４、７＞１０）。このことは、灌流によりグルコース輸送量が上昇することを証明した。
＜Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３の排出（輸送）評価＞
　膜輸送体（トランスポーター）のＭＤＲ１（Ｐ－ｇｐ）の輸送能を評価するため、Ｐ－ｇｐの基質であるＲｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３を用いて、その排出（輸送）を評価した。
　具体的には、ｂ→ａ方向の場合、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，　Ｒ８００４）を２．５μＭ添加したＥＧＭ－２培地２００μｌを、ＲＰＴＥＣ／ＨＵＶＥＣ二層培養Ｄａｙ１４／Ｄａｙ４の血管内皮組織に添加し、ＨＵＶＥＣ血管内皮組織を通して、ＲＰＴＥＣ側へ排泄されたＲｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３の量をサンプリングし、測定した。対照として、ａ→ｂ方向の輸送量、及びＲＰＴＥＣのみの輸送量も測定した。さらに、多孔質膜の両側のチャンバーに、３００μＭの阻害剤であるベラパミルを添加した阻害実験も行った。
　結果を図１１に示す。図１１から、ＲＰＴＥＣ／ＨＵＶＥＣ二層培養、ＲＰＴＥＣのみ（単層）のいずれも、ｂ→ａでのＲｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３輸送量が、ａ→ｂ方向に比べ大きかった。また、ｂ→ａ方向、阻害剤無に比べて、阻害剤有のＲｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３輸送量が減少した。一方でａ→ｂ方向では阻害剤有に比べて阻害剤無の輸送量が減少した。これは測定した輸送方向（ａ→ｂ）がＰ－ｇｐの輸送方向（ｂ→ａ）と逆行するからである。
　さらに、様々な条件でＲｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３輸送率を測定し比較した。なお、「灌流有」は図５の（ｉｉｉ）のプロトコール、「灌流無」は（ｉｉ）のプロトコール、ＲＰＴＥＣのみは（ｉｖ）のプロトコールで培養したものであった。結果は図１２に示す。
　図１２から、二層培養、灌流の有無に関わらず、ｂ→ａ方向のＲｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３輸送量が、ａ→ｂ方向に比べ大きいことが示された（１＞３、４＞６、１０＞１２）。このことは、本発明の生体模倣システムは生体内におけるＲｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３排出方向と一致することを証明した。また、二層培養の有無にかかわらず、ｂ→ａ方向のＲｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３輸送量が、阻害剤ベラパミルの阻害によって低下した（１＞２、４＞５）。このことは、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３がトランスポーターを経由して輸送されていることを証明した。また、灌流によりｂ→ａ方向のＲｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３輸送量が増加した（１０＞４）。このことは、灌流によりＰ－ｇｐの輸送能が上昇することを証明した。さらに、二層培養によりｂ→ａ方向のＲｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３輸送量が増加した（１＞４）。このことは、二層培養によりＰ－ｇｐの輸送能が上昇することを証明した。
実施例１　近位尿細管上皮細胞とＬＴＬ陽性細胞との共培養
＜ｉＰＳ細胞由来のＬＴＬ陽性細胞の作製＞
　腎臓オルガノイドは、ヒトｉＰＳ細胞であるＣＲＬ１５０２．３株（ＭＣＲＩ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて、Ｔａｋａｓａｔｏら（Nat Protoc, vol. 11, pp. 1681-1692, 2016）のプロトコールに従って作製した。簡単に述べると、凍結ｉＰＳＣバイアル（１０６細胞／ｍＬを２００μＬのＳｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋｅｒで凍結したもの）を３回継代培養した後、分化誘導を行った。分化誘導の開始日（Ｄａｙ０）からは８μＭのＣＨＩＲを添加したＡＰＥＬ２にて培養し、Ｄａｙ２とＤａｙ４に同じ培地で培地交換し、Ｄａｙ５に２００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ９と１μｇ／ｍＬのヘパリンを含むＡＰＥＬ２に交換した。Ｄａｙ５までに中間中胚葉が形成された。Ｄａｙ７まで同じ培地で毎日培地交換した。Ｄａｙ７に中間中胚葉を３次元培養環境に移した。１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに入れた細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットをトランスウェル６ウェルパックに移して腎臓オルガノイドを形成した。培地はＤａｙ２２まで同じものを使用し、１日おきに交換した。分化誘導開始日から２２日目（Ｄａｙ２２）の腎臓オルガノイドの光学顕微鏡画像を図１３の（ａ）に示す。腎臓オルガノイドは、スフィア状の細胞集団であった。
　Ｄａｙ２２の腎臓オルガノイド１６個をＴｕｍｏｒ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃｌ、１３０－０９５－４８５）で単細胞化し、回収した細胞を磁気活性化細胞選別（ＯｃｔｏＭＡＣＳ　ｓｔａｒｔｉｎｇ　ｋｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０４２－１０８）に供した。近位尿細管マーカーであるビオチン－ＬＴＬ（Ｌｏｔｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ（ＬＴＬ）、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓ、Ｂ－１３２５－２）を、二次抗体として抗ビオチンマイクロビーズ（Ａｎｔｉ－Ｂｉｏｔｉｎ　ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９５－４８５）を用いて、腎臓オルガノイド中のＬＴＬ陽性細胞（以下、「ＬＴＬ＋細胞」という場合がある）を選別した。
＜ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣからなる上皮組織を有する生体機能チップ＞
　ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１（以下、単に「ＲＰＴＥＣ」という）は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手された材料（ＡＴＣＣ　Ｍａｔｅｒｉａｌ）に由来する。滅菌したマイクロ流体デバイスの多孔質膜の第１の表面を、無血清ＦＮＣ　Ｃｏａｔｉｎｇ　Ｍｉｘ（登録商標）で満たし、３７℃で１分間インキュベートしコーティングした。この多孔質膜の上に、ＬＴＬ＋細胞とＲＰＴＥＣとを１：１（数）で混合した３.５×１０５／ｃｍ２混合細胞（５０％／５０％）を播種し、ＲＥＧＭで３７℃、５％　ＣＯ２の環境下で７日間培養した。コントロールとして、ＬＴＬ＋細胞１００％又はＲＰＴＥＣ１００％も播種し、同様に培養した。
　光学顕微鏡にて観察した結果を図１３に示す。（ｂ）の上の段はＬＴＬ＋細胞１００％の培養開始Ｄａｙ２、Ｄａｙ４、及びＤａｙ７の画像であり、下段は５０％：５０％のＬＴＬ＋細胞とＲＰＴＥＣの共培養のＤａｙ２、Ｄａｙ４、及びＤａｙ７の画像である。ＬＴＬ＋細胞とＲＰＴＥＣの共培養のＤａｙ７の拡大画像は（ｃ）に示す。図１３から、ＬＴＬ＋細胞のみでは細胞凝集塊となり、上皮組織のバリア形成できなかったが、ＲＰＴＥＣを混合することで機能的な上皮組織を形成できたことが認められた。
　Ｆ－ａｃｔｉｎ及びＥｐＣＡＭの免疫染色によって上皮組織の形態を評価した。具体的には、細胞をＰＦＡ（４％）で１０分間固定した後、ロバ血清（１０％）を含むＤＰＢＳブロッキングバッファーで６０分間、室温でブロッキングし、一次抗体（ＥｐＣＡＭ　１／２００）溶液に４℃で一晩浸した。組織をＤＰＢＳで洗浄した後、ロバ抗マウスＡＦ－４８８二次抗体を室温で１時間浸した。最後に、ＤＡＰＩとＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ（ともに１／１０００）を含むＤＰＢＳで組織を洗浄し、核とＦ－ａｃｔｉｎをそれぞれ染色した。
　結果を図１４に示す。上段はＬＴＬ＋細胞のみ、中段はＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣ（ＬＴＬ＋／ＲＰＴＥＣ）、下段はＲＰＴＥＣのみ（ＬＴＬ－／ＲＰＴＥＣ）の画像である。図１４から、ＬＴＬ＋細胞のみでは細胞凝集塊となり、上皮組織のバリア形成できなかったが、ＲＰＴＥＣを混合することで機能的な上皮組織を形成できたことが認められた。
　また、Ｐ－ｇｐ、ＺＯ１及びＬＴＬで免疫染色よって上皮組織の形態を評価した。細胞を固定し、ブロッキングし、上記と同様の方法で染色した。Ｐ－ｇｐ、ＺＯ１及びＬＴＬ抗体は、ブロッキングバッファーにそれぞれ１／５０、１／２００、及び１／２００の濃度で調製した。２次抗体は、Ｐ－ｇｐ、ＺＯ１、ＬＴＬに対して、それぞれＡＦ－５６８抗ウサギ、ＡＦ４８８抗マウス、ＡＦ６４７抗ストレプトアビジンを、ＤＰＢＳで１／４００に調製した。２次抗体を適用した後、１／１０００のＤＡＰＩを含むＤＰＢＳで洗浄し、核を染色した。
　Ｄａｙ７の上皮組織の結果を図１５に示し、Ｄａｙ１４の上皮組織の結果を図１６に示す。図１５の上段はＲＰＴＥＣのみ、下段はＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣの画像である。図１５から、Ｄａｙ７において、ＲＰＴＥＣのみに比べて、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣのＰ－ｇｐ、ＺＯ１及びＬＴＬの発現量が増加したことが認められた。図１６から、Ｄａｙ１４において、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣのＰ－ｇｐの発現量が、ＲＰＴＥＣのみに比べて増加した。このことは、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣからなる上皮組織Ｐ－ｇｐを介した排出機能が向上することを示唆した。
　さらに、細胞外マトリックスであるコラーゲンＩＶ及びラミンンの局在を評価した。組織を固定し、ブロッキングし、上記と同様の方法で染色した。コラーゲンＩＶ抗体とラミニン抗体は、それぞれ１／３００と１／５０の濃度で、ブロッキングバッファーに調製した。２次抗体はいずれもＡＦ－５６８抗ウサギ（１／４００）を使用した。２次抗体を適用した後、１／１０００のＤＡＰＩを含むＤＰＢＳで洗浄し、核を染色した。
　結果を図１７に示す。図１７の左側はＲＰＴＥＣのみ、右側はＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣの結果である。図１７から、静置培養の場合、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣ共培養において、コラーゲンＩＶ及びラミニンがＲＰＴＥＣのみに比べ多く存在した。また、灌流培養によって、ラミニン及びメガリン（ｍｅｇａｌｉｎ）の発現量及び発現分布が向上した（データ示さず）。
　参考例１と同様に、各種トランスポーター及び細胞マーカーのｍＲＮＡ発現量を測定し、結果を図１８に示す。図１８から、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣ共培養において、ＡＱＰ１、ＬＲＰ２、ＳＧＬＴ２、及びＣＤＨ６の発現量は、ＲＰＴＥＣのみよりも上昇したが、ＥｐＣＡＭ及びＰ－ｇｐとＯＣＴ２の発現量は、ＲＰＴＥＣのみとは有意差がなかった。一方、ＬＴＬ＋細胞のみと比較した場合、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣ共培養において全ての遺伝子の発現量が増加した。
　さらに、参考例１と同様に、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３の排出（輸送）評価を評価した。結果を図１９に示す。図１９は輸送量の結果を示す。図１９から、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣ共培養において、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３の輸送量がＲＰＴＥＣ単独に比べて増加した。また、上皮細胞の細胞極性に対応した輸送効率の方向性を示した。このことは、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣ共培養のほうがＰ－ｇｐの機能が向上したことを示唆した。一方、灌流培養によって輸送機能のさらなる有意な向上は認められなかった。
　滅菌したマイクロ流体デバイスの多孔質膜の両側の表面を、上記と同様に予めＦＮＣでコーティングした。多孔質膜の第１の表面上に、ＬＴＬ＋細胞とＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１とを１：１（数）で混合した３.５×１０５／ｃｍ２混合細胞（５０％／５０％）を播種し、ＲＥＧＭで３７℃、５％ＣＯ２の環境下で１０日間培養した。コントロールとして、ＲＰＴＥＣ１００％も播種し同様に培養した。培養１０日後（Ｄａｙ１０）、コンフルエントになり、組織は融合し、不浸透性になった。
　ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣからなる上皮組織を有する生体機能チップのＲｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３の透過係数を上記の同様な方法で評価した。結果を図２０に示す。結果はｎ＝５の平均値及び標準偏差で示されている。図中において、Ｎ．Ｓ．はｐ値が０．０５を超える（すなわち、統計学的有意差がない）ことを示し、＊＊はｐ値が０．０１以下であることを示し、＊＊＊＊はｐ値が０．０００１以下であることを示す。図２０から、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣ共培養の場合、ＲＰＴＥＣに比べてＲｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３の輸送能が上昇したが、灌流培養によっては静置培養に比べてさらなる輸送能の向上は認められなかった。このことは、Ｐ－ｇｐの機能はＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣ共培養により上昇することを示唆した。
　さらに、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣからなる上皮組織を有する生体機能チップに対して、Ｄａｙ１４／Ｄａｙ４に、上皮細胞の高さに対する影響を評価した。透過型電子顕微鏡にて観察し、測定した結果を図２１に示す。（ａ）及び（ｃ）はそれぞれ、ＲＰＴＥＣ単層培養及びＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣ共培養のＲＰＴＥＣ側の顕微鏡写真であり、左は灌流無、右は灌流有の結果である。また、ＲＰＴＥＣ単層培養及びＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣ共培養の細胞の長さを測定した結果はそれぞれ（ｂ）及び（ｄ）に示す。結果はｎ＝６の平均値及び標準偏差で示されている。図２１から、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣ共培養、ＲＰＴＥＣ単層培養のいずれの場合も上皮細胞の高さは灌流によって増加したことが認められた。また、微絨毛の長さ及び密度も増加した（データ示さず）。さらに、共培養したのち、ＬＴＬ＋とＲＰＴＥＣとの細胞数の比率（１：１）は維持されており、Ｄａｙ７から培養全期間にわたってＬＴＬ＋とＲＰＴＥＣとが密接に結合していることも確認できた（データ示さず）。
　さらに、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣからなる上皮組織を有する生体機能チップのグルコース輸送率を、上記参考例１の＜グルコースの再吸収（輸送量）評価＞と同様な方法で評価した。結果を図２２に示す。結果はｎ＝５の平均値及び標準偏差で示されている。図中において、＊はｐ値が０．０５以下であることを示す。図２２から、静置培養において、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣ共培養の場合、ＲＰＴＥＣに比べてグルコースの輸送率が上昇した。また、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣ共培養において、灌流を行った場合、灌流を行わない場合と比べてグルコースの輸送率が上昇した。このことは、グルコース輸送能が、ＬＴＬ＋＆ＲＰＴＥＣ共培養により上昇し、灌流によりさらに上昇することを示唆した。
　１…マイクロ流体デバイス、１０…デバイス本体、１ａ…第１の基板、１ｂ…第２の基板、２…第１のチャンバー、３…第２のチャンバー、４…多孔質膜、５…第１の供給部、６…第２の供給部、６ａ…貫通孔、６ｂ…凹部、７…混合細胞層、８…ヒト血管内皮細胞層、４１…多孔質膜の第１の表面、４２…多孔質膜の第２の表面。

Claims (14)

  1. 　生体模倣システムであって、マイクロ流体デバイス、並びに、該マイクロ流体デバイス内に収容されるヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞を備え、
    　前記マイクロ流体デバイスは、
    　　デバイス本体と、
    　　前記デバイス本体に設けられた第１のチャンバーと、
    　　前記デバイス本体に設けられた第２のチャンバーと、
    　　前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとの間に位置し、前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとを隔てる多孔質膜と
    　を備え、
    　前記ＲＰＴＥＣ及び前記ＬＴＬ陽性細胞が前記第１のチャンバー内に収容され、かつ、前記多孔質膜の前記第１のチャンバーに面する第１の表面に接着している、
    生体模倣システム。
  2. 　前記多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項１に記載の生体模倣システム。
  3. 　前記ＬＴＬ陽性細胞が、ｉＰＳ細胞から作製した腎臓オルガノイド由来のＬＴＬ陽性細胞である、請求項２に記載の生体模倣システム。
  4. 　前記第１のチャンバー内に収容され、かつ、前記多孔質膜の前記第１の表面に接着している前記ＲＰＴＥＣ及び前記ＬＴＬ陽性細胞は、ＲＰＴＥＣと多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞とを共培養することによって得られた上皮組織である、請求項１～３のいずれか一項に記載の生体模倣システム。
  5. 　前記ＲＰＴＥＣが、ヒト腎近位尿細管上皮不死化細胞株である、請求項１～３のいずれか一項に記載の生体模倣システム。
  6. 　前記生体模倣システムが、ヒト血管内皮細胞をさらに備え、前記ヒト血管内皮細胞が前記第２のチャンバー内に収容され、かつ、前記多孔質膜の前記第２のチャンバーに面する第２の表面に接着している、請求項１～３のいずれか一項に記載の生体模倣システム。
  7. 　前記マイクロ流体デバイスが、
    　前記デバイス本体に設けられ、前記第１のチャンバーに連通する第１の供給部と、
    　前記デバイス本体に設けられ、前記第２のチャンバーに連通する第２の供給部と
    をさらに備え、
    　前記第１の供給部は、第１の培地を前記第１のチャンバーに供給し灌流を行うための供給部であり、前記第２の供給部は、第２の培地を前記第２のチャンバーに供給し灌流を行うための供給部である、
    請求項１～３のいずれか一項に記載の生体模倣システム。
  8. 　候補薬物のスクリーニングのための、請求項１～３のいずれか一項に記載の生体模倣システム。
  9. 　薬物動態の確認又は毒性実験のための、請求項１～３のいずれか一項に記載の生体模倣システム。
  10. 　マイクロ流体デバイス、ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）、及び多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞を含む、候補薬物のスクリーニングのためのキットであって、
    　前記マイクロ流体デバイスは、
    　　デバイス本体と、
    　　前記デバイス本体に設けられた第１のチャンバーと、
    　　前記デバイス本体に設けられた第２のチャンバーと、
    　　前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとの間に位置し、前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとを隔てる多孔質膜と
    　を備える、
    キット。
  11. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の生体模倣システムを製造する方法であって、
    　前記マイクロ流体デバイスを用意する工程と、
    　前記ＲＰＴＥＣ及び前記ＬＴＬ陽性細胞を前記第１のチャンバーに播種し、培養し、前記ＲＰＴＥＣ及び前記ＬＴＬ陽性細胞を前記多孔質膜の前記第１の表面に接着させる工程と
    を含む、方法。
  12. 　請求項６に記載の生体模倣システムを製造する方法であって、
    　前記マイクロ流体デバイスを用意する工程と、
    　前記ＲＰＴＥＣ及び前記ＬＴＬ陽性細胞を前記第１のチャンバーに播種し、培養し、前記ＲＰＴＥＣ及び前記ＬＴＬ陽性細胞を前記多孔質膜の前記第１の表面に接着させる工程と、
    　前記ヒト血管内皮細胞を前記第２のチャンバーに播種し、培養し、前記ヒト血管内皮細胞を前記多孔質膜の前記第２の表面に接着させる工程と
    を含む、方法。
  13. 　ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）と多能性幹細胞由来のＬＴＬ陽性細胞とを共培養して得られる、上皮組織。
  14. 　ＳＬＣ２２Ａ２、ＳＬＣ５Ａ２、ＡＱＰ１、ＬＲＰ２及びＣＤＨ６からなる群より選択される１以上のタンパク質を発現する、請求項１３に記載の上皮組織。
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