DE60019603T2

DE60019603T2 - Verfahren zur Bildung eines Zellmusters auf einer Oberfläche

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Publication number: DE60019603T2
Application number: DE60019603T
Authority: DE
Inventors: Gabriele Nelles; Akio Yasuda; Wolfgang Ackermannweg 10 Knoll; Andreas Ackermannweg 10 Offenhäusser; Chi-Kong Ackermannweg 10 Yeung; Lars Ackermannweg 10 Lauer
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Sony International Europe GmbH
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Sony Deutschland GmbH
Priority date: 2000-10-20
Filing date: 2000-10-20
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2020-10-21
Also published as: DE60019603D1; EP1199354A1; US6787358B2; EP1199354B1; US20020095219A1; JP2002355031A

Description

Um in der Lage zu sein, die Funktionen von Zellen verschiedener Typen zu studieren, so daß ihr Verhalten und die räumliche Organisation in Assoziation mit anderen Zellen des selben Typs besser verstanden werden können, ist es notwendig, in der Lage zu sein, die Zellen unter genau kontrollierten Bedingungen zu kultivieren. Für ein paar Jahre sind Versuche unternommen worden, Zellen auf vorgemusterten Substraten zu kultivieren und wachsen zu lassen, die das Zellwachstum entlang den Mustern auf diesem Substrat führen. Dies wurde im Hinblick darauf gemacht, daß man eines Tages in der Lage sein sollte, biologisch-elektronische Miniaturvorrichtungen zu bauen, die lebende Zellen beinhalten, um einen biologischen Microschaltkreis herzustellen. Ein weiteres langfristiges Ziel dieser Studien ist die Fähigkeit, künstliche Gewebe zum Einpflanzen in einen Körper eines Organismus geeignet zu machen, wodurch möglicherweise natürliches Gewebe der selben Art, das schlecht funktioniert, ersetzt wird. Ein drittes Ziel dieser Studien ist es, in der Lage zu sein, die Integration von Transplantaten und/oder Implantaten zu erleichtern, indem die äußeren Teile dieser Vorrichtungen mit einer speziellen Anordnung von Zellen „maskiert" werden, die aufgrund ihrer chemischen und immunologischen Natur ebenso wie augrund ihrer Anordnung in den Körper des Organismus an der Stelle passen, an welcher die Vorrichtung eingebaut werden soll.
Ein Weg zum Erzielen von Kulturen von Zellen in dieser Hinsicht, d.h. Kulturen, die ein spezifisches beabsichtigtes besonderes Muster zeigen, ist es, die Zellen entlang Oberflächen wachsen zu lassen, auf denen zuvor Muster eines „leitenden" Moleküls, das Zellwachstum fördert, erzeugt worden sind, und wo es Regionen gibt, die Zellwachstum nicht fördern. Verschiedene zellwachstumsfördernde Moleküle sind verwendet worden:
Mrksich et al. (1996, PNAS USA, 93, 10775–10778; 1997, Exp. Cell Res., 235, 305–313) verwendeten Alkanthiolat-Muster auf Gold, um das Anhängen von Zellen an diese Substrate zu steuern. Durch Auswahl eines geeignet terminierten Alkanthiolats gelang es ihnen, Regionen der Zellwachstumsförderung und der Zellwachstumsinhibition zu erzeugen. Corey et al.(1991, J. Neurosc. Res., 30, 300–307) waren in der Lage, Neuronen auf Polylysinbeschichteten Glas-Deckgläschen zu mustern, die durch selektive Laser-Abtragung gemustert waren, um Gitter von Polylysin mit variierenden Linienbreiten, Distanzen zwischen den Abschnitten und Knotendurchmessern zurückzulassen.
Matsuzawa et al.(1996, J. Neurosci. Meth., 69, 189–196) hängten ein synthetisches Peptid, abgeleitet von einer Neuriten-Auswuchs-fördernden Domäne der B2-Kette von Laminin, in chemischer Weise an.
Andere immobilisierten verschiedene andere Peptide (Matsuda et al., 1990, Trans. Am. Soc. Artif. Int. Organs; 36 (3): M559-63), oder extrazelluläre Matrix Proteine (ECM), wie etwa Laminin (Klein et al., 1999, J. Mat. Sci.: Mat. in Med.; 10: 721–727).
Verschiedene Techniken zum Anhängen und Mustergeben von Biomolekülen auf einer Oberfläche sind verwendet worden, einschließlich Crosslinkern (Clemence et al., 1985, Bioconjugated Chem. 6: 411–417), Silan-Kopplungsmitteln (Plueddemann E. 2 edn New York Plenum Press, 1991: 1–250), unter anderen. Eine vor kurzem erfolgreich angewandte Technik zum Anhängen von Proteinen in einem spezifischen Muster an ein Substrat ist die sogenannte Microkontakt-Drucktechnik. Sie ist verhältnismäßig einfach und universell zum Mustern von Biomolekülen (Kumar et al., 1993, Appl. Phys. Lett., 63 (14), 2002–2004). Bei dieser Technik wird ein Stempel produziert, indem ein Siliziumelastomer (Polydimethylsiloxan, PDMS) im erwünschten Muster gegossen wird, welcher dann mit einer Lösung des zu übertragenden Biomoleküls beschichtet wird. Nach In-Kontakt-Bringen des „mit-Tinte-versehenen" („inked") Stempels mit der Substratoberfäche ordnen sich die Biomoleküle von selbst in dem vorgegebenen Muster an („self-assemble"). Kumar et al. and Mrksich et al. entwickelten dieses Verfahren zum Erzeugen von Mustern durch Stempeln von Alkanthiolen auf Goldsubstraten (Mrksich et al. 1996, PNAS USA, 93, 10775–10778, Mrksich et al. 1997, Exp. Cell. Res. 235, 305 – 313). Poly-D-Lysin und Laminin sind immobilisiert worden unter Verwendung von Microkontakt-Drucken auf Aminosilan-derivatisierten Glassubstraten mit Glutaraldehyd als einem Quervernetzer (Branch et al. 1998, Med. Biol. Eng. Comput., 36, 135 – 141) und Sulfo-GMBS (Wheeler et al. 1999, J. Biomech. Eng., 121, 73 – 78), und die Technik des Microkontakt-Druckens ist bei der Führung von Neuronalzellen verwendet worden (Wheeler et al. 1999, ibid.; Branch et al. 2000, IEEE Transact. Biomed. Eng., 47,3, 290–300).
Alle zuvor erwähnten Studien verwendeten dissoziierte Kulturen, hauptsächlich neuralen Ursprungs, und erzielten eine erfolgreiche Musterbildung lediglich in einigen Fällen. Es ist jedoch nicht klar, ob die so geformten Zellmuster ein wahres Bild darstellen, wie es in der Natur erscheinen würde, noch ob sie nützlich sind, z.B. für bioelektronische Vorrichtungen.
Deshalb sind die aus diesen Studien zu ziehenden Schlußfolgerungen, z.B im Hinblick auf die räumliche Anordnung der Zellen innerhalb eines Organs oder der Wechselwirkungen zwischen Zellen in einem Organ, nur von beschränktem Nutzen. In ähnlicher Weise gibt es, wenn man sich gegenwärtige bioelektronische Schnittstellenvorrichtungen und Zell-modifizierte Schnittstellen anschaut, ein Problem der Reproduzierbarkeit beim Erzeugen dieser Vorrichtungen. Es ist immer noch nicht möglich, das Anhaften von Zellen und Wachstum auf Oberflächen vollständig zu kontrollieren und zu leiten. Da die Zellen bei gegenwärtigen bioelektronischen Schnittstellenvorrichtungen und Zell-modifizierten Schnittstellen direkt auf der Oberfläche dieser Vorrichtungen kultiviert werden, gibt es keine Garantie, daß das Wachstum auf allen Vorrichtungen erfolgreich sein wird, und deshalb sind eine große Menge an Vorrichtungen und eine große Menge an Startkulturen erforderlich, nur um sicherzustellen, daß einige Substrate nach der Kultivierung tatsächlich ein zelluläres Netzwerk aufweisen, das nützlich ist. Ein verwandtes Problem, betreffend Implantate, ist, daß diese oft nur eine beschränkte Biokompatibilität haben, aufgrund ihrer schlechten Integration, einer Abstoßung durch den Wirt oder einfach der Toxizität der Substrate. Das Beschichten von diesen mit einem Zellmuster, das die räumliche Organisation der Zellen innerhalb eines Organs nachahmt, würde sicherlich die Biokompatibilität von Implantaten verbessern.
Entsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, in der Lage zu sein, das Zellwachstum auf Oberflächen in einer genauen und bislang unbekannten Weise zu steuern und zu leiten. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Anstrengungen beim Herstellen von bioelektronischen Vorrichtungen durch Verringern der Anzahl an Startkulturen/Substraten, die eine erfolgreiche Vorrichtung ergeben werden, beschränken zu können. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Biokompatibilität von Implantaten und Transplantaten zu verbessern.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Bilden eines Musters von Zellen auf einer Oberfläche gemäß Anspruch 1.
Bevorzugt stammt besagtes ganzes Gewebe aus dem Körper eines Organismus.
In einer Ausführungsform stammt besagtes ganzes Gewebe aus einem Organ, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Gehirn, Leber, Niere, Muskel, Haut, Knochen, Lunge und Herz.
Es wird bevorzugt, daß besagte Zellen Organschnitte sind.
Diese Organschnitte sind bevorzugt organotypisch dahingehend, daß sie die Anordnung von Zellen innerhalb eines Organs nachahmen.
Bevorzugt sind besagte Zellen Gehirnschnitte.
In einer Ausführungsform ermöglicht besagtes Muster aus zellwachstumsfördernden Molekülen und/oder zellwachstumsinhibierenden Molekülen, die auf besagter vorgemusterten Oberfläche angehängt sind, das geführte Wachstum und Wandern von Zellen, wobei, bevorzugt, besagtes Muster aus zellwachstumsfördernden Molekülen und/oder zellwachstumsinhibierenden Molekülen die Anordnung von Zellen in einem Organ imitiert.
Es wird bevorzugt, daß besagtes Muster aus zellwachstumsfördernden und/oder zellwachstumsinhibierenden Molekülen eine Struktur mit Linien und Knoten hat, wobei bevorzugt, besagte Linien eine Breite im Bereich von 1–8 Micrometer haben und besagte Knoten einen Durchmesser im Bereich von 1–30 Micrometer haben, bevorzugter haben besagte Linien eine Breite im Bereich von 1–6 Micrometer und besagte Knoten haben einen Durchmesser im Bereich von 8–16 Micrometer, und am bevorzugtesten haben besagte Linien eine Breite im Bereich von 2–4 Micrometer, und besagte Knoten haben einen Durchmesser im Bereich von 10–14 Micrometer.
In einer Ausführungsform wird besagtes Muster aus zellwachstumsfördernden Molekülen und/oder zellwachstumsinhibierenden Molekülen durch wenigstens eine Schicht einer Substanz gebildet, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Polypeptid, Polyethyleneinmin und Polystyrol wobei, bevorzugt, besagtes Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend extrazelluläre Matrixproteine, Poly-L-Lysin und Poly-Ornithin, wobei, bevorzugter, besagte extrazelluläre Matrixproteine ausgewählt sind aus der Gruppe, umfassend Laminin und Fibronectin.
Bevorzugt wird besagtes Muster von Zellen, nach dem es auf besagter vorgemusterter Oberfläche gebildet worden ist, auf eine zweite Oberfläche in einem Transferschritt übertragen, wobei, bevorzugt, besagter Transferschritt die Folge umfaßt:

a) Einbetten von besagtem Muster von Zellen in einer Matrix,
b) Heben besagter Matrix, einschließlich besagten Musters von Zellen, von besagter vorgemusterter Oberfläche,
c) In-Kontakt-Bringen von besagtem Muster von Zellen, eingebettet in besagter Matrix, mit besagter zweiter Oberfläche.

In einer Ausführungsform umfaßt besagter Transferschritt weiterhin die Folge:

d) Freisetzen besagten Musters von Zellen von besagter Matrix,
e) Entfernen besagter Matrix von besagtem Muster von Zellen.

Bevorzugt ist besagte Matrix eine Zell-kompatible Matrix.
Eine Zell-kompatible Matrix ist eine Matrix, die die Lebensfähigkeit der verwendeten Zellen nicht beeinträchtigt.
Es wird bevorzugt, daß besagte Matrix eine Matrix ist, zusammengesetzt aus einem Material, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Agarose, Fibrin, Collagen und Cellulose.
In einer Ausführungsform ist besagte Matrix eine Matrix, zusammengesetzt aus einem aushärtbaren Material, wobei, bevorzugt, besagtes aushärtbares Material ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Agarose.
In einer Ausführungsform ist besagte Matrix eine Matrix, zusammengesetzt aus einem Material, das in der Lage ist, ein Gel zu bilden, wobei, bevorzugt, besagtes Material, das in der Lage ist, ein Gel zu bilden, ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Fibrinogen und Collagen.
In einer Ausführungsform ist besagte zweite Oberfläche ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Oberflächen von bioelektronischen Vorrichtungen, Sensoren, elektronischen Bestandteilen, Geweben, Implantaten und Transplantaten.
„Sensoren" sollen Biosensoren, optische Sensoren, unter anderen einschließen. "Elektronische Bestandteile" können zum Beispiel Feld-Effekt-Transistoren, Multi-Elektroden-Arrays und ähnliches sein. Transplantate können jegliche bekannte Form haben, d.h. autogen (Donor und Rezeptor identisch), syngen (genetisch identischer Donor und Rezeptor), allogen (Donor und Rezeptor gehören zur selben Spezies) und xenogen (Donor und Rezeptor gehören zu verschiedene Spezies).
In einer Ausführungsform wird besagtes Einbetten erzielt durch

aa) teilweise oder vollständiges Abdecken von besagtem Muster von Zellen mit besagter Matrix in einer flüssigen Form, und
ab) Bilden besagter Matrix.

Es wird bevorzugt, daß das Bilden besagter Matrix (ab)) erzielt wird durch Erhöhen der Temperatur oberhalb der Gel-Übergangstemperatur und/oder durch Zugabe von wenigstens einem Gel-induzierenden Bestandteil, wobei bevorzugt, besagter Gel-induzierender Bestandteil ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Thrombin und andere Blut-Coagulationsfaktoren.
Es wird bevorzugt, daß besagtes Freisetzen besagten Musters von besagter Matrix durch enzymatischen Abbau und/oder durch Senken der Temperatur unterhalb der Gel-Übergangstemperatur erzielt wird.
Weiterhin wird ein Muster von Zellen offenbart und/oder ein künstliches Gewebe, das durch eine Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung herstellbar ist, bis zu, aber ausschließlich des Transferschritts.
Ebenso wird ein Muster von Zellen und/oder ein künstliches Gewebe auf einer Oberfläche offenbart, das durch ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung bis zu, aber ausschließlich des Transferschritts herstellbar ist.
Weiterhin wird ein Muster von Zellen und/oder ein künstliches Gewebe offenbart, das durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, einschließlich des Transferschritts, herstellbar ist, und verschiedene Ausführungsformen davon.
Ebenso wird ein Muster von Zellen und/oder ein künstliches Gewebe auf einer Oberfläche offenbart, das durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, einschließlich des Transferschritts, herstellbar ist, und verschiedene Ausführungsformen davon.
Weiterhin wird offenbart eine Kombination von Mustern von Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung.
Es wird ebenso eine Kombination von künstlichen Geweben gemäß der vorliegenden Erfindung offenbart.
Es wird eine Kombination von Mustern von Zellen und künstlichen Geweben gemäß der vorliegenden Erfindung offenbart.
Der Begriff „Kombination von Mustern von Zellen" soll jede räumliche Anordnung von Mustern von Zellen einschließen, bei denen diese Muster nahe beieinander sind. Dasselbe betrifft „Kombination von künstlichen Geweben".
Es wird ebenso ein Muster von Zellen und/oder ein künstliches Gewebe und/oder eine Kombination gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Vorrichtung offenbart, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Sensoren, technische Substrate, Gewebe, Implantate und Transplantate.
Die Erfinder konnten beim Machen der vorliegenden Erfindung in deutlicher Weise demonstrieren, daß es möglich ist, Zellen von Organschnitten auf eine Anzahl von bestpassenden Mustern zu manipulieren. Bei der Verwendung von Zellen aus ganzem Gewebe konnten ausgebreitete, nahezu perfekte Muster von Zellen, z.B. Gitter, erzielt werden, die bislang unmöglich waren. Die Verwendung von Schnitten von ganzem Gewebe hat viele Vorteile gegenüber dissoziierten Kulturen dahingehend, daß, abgesehen von der Oberflächenschicht, relativ minimale mechanische Schädigung ausgeübt wird und die relative cytoarchitektonische Organisation des Gewebes bewahrt wird. Die darauffolgend gemusterten Zellen werden daher die relativen Positionen der Zellen des ursprünglichen Schnittes reflektieren. Mittels der vorliegenden Erfindung ist es möglich, in konsistenter Weise z.B. den Auswuchs von Neuronen, Neuriten und Filopodien aus Hirnstammschnitten zu erzielen, die auf ECM-Proteinstrukturen von z.B. Gitter- und Linien-Formen kultiviert werden. Durch Wahl von geeigneten Mustern von zellwachstumsfördernden Molekülen und/oder zellwachstumsinhibierenden Molekülen auf einer Oberfläche ist es möglich, beinahe jegliches erwünschte Muster von Zellen zu erzielen.
Darüberhinaus gelang es den vorliegenden Erfindern, die beinahe perfekten Muster von Zellen dahingehend weiter zu manipulieren, daß sie diese Muster in leichter Weise auf jegliche andere erwünschte Oberfläche übertragen konnten. Ein solcher Transfer kann z.B. durchgeführt werden, indem das Muster/künstliche Gewebe in Materialien eingebettet wird, die mit den Zellen dahingehend kompatibel sind, daß sie nicht die Lebensfähigkeit der Zellen stören. Ein solches Material kann z.B. Agarose sein, das in flüssiger Form über das Muster von Zellen gegossen und danach ausgehärtet wird, indem man es abkühlen läßt. Ein alternatives Verfahren wäre die Einbettung von Zellen in einem Gel aus Fibrin und/oder Collagen. Zum Beispiel kann Fibrinogen durch die Zugabe von Thrombin induziert werden, ein Gel aus Fibrin zu bilden. Modifikationen dieses Verfahrens, wobei Prothrombin in Kombination mit verschiedenen Faktoren aus der Blutgerinnungskaskade zugegeben wird, z.B. Faktor X, liegen ebenso innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Verfahren zum Bilden von Fibringelen sind z.B. beschrieben in Schense et al., 2000, Nature Biotechnology, 18, 415–419 und Ye et al., 2000, European Journal of Cardio-thoracic Surgery, 17, 587–591.
Collagengele können durch Selbst-Anordnung („self-assembly") von Collagenmolekülen beim Wärmen von kalten neutralen Lösungen von Collagen gebildet werden. Ein solches Verfahren ist z.B. beschrieben in O'Conner et al., 2000, Biosensors and Bioelectronics, 14, 871–881.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden alle Matrizen, unabhängig von ihrer Natur, auf einem Muster von Zellenkünstlichem Gewebe angeordnet, das bereits auf einer Oberfläche gebildet worden ist. Dies bedeutet, daß gemäß der vorliegenden Erfindung die Matrix nur nach der Bildung des Musters von Zellenkünstlichen Gewebes gebildet wird. Mittels des Gels kann das Muster von Zellen dann anderswohin übertragen werden.
Ein Entfernen der Matrix kann dann z.B. erzielt werden durch Senkung der Temperatur unterhalb der Gel-Übergangstemperatur, enzymatischem Abbau und ähnliches.
Dies macht die Produktion von bioelektronischen Vorrichtungen viel wirtschaftlicher und ermöglicht eine genaue Kontrolle der Eigenschaften dieser Vorrichtungen, da nur erfolgreiche Muster von Zellen verwendet und auf die Oberflächen dieser Vorrichtungen übertragen werden. Wenn ein perfektes Muster von Zellen gebildet worden ist, kann es unter Verwendung einer Matrix stabilisiert und von dem Substrat genommen und auf Biosensoren übertragen werden, wie etwa Feld-Effekt-Transistoren etc., die selbst möglicherweise zunächst nicht als Substrate für Zellwachstum geeignet sind. Bei einer „vorkultivierten Situation" gemäß der vorliegenden Erfindung werden nur nützliche Muster von Zellen verwendet und auf die Vorrichtungen übertragen werden. Daher kann die Anzahl an Vorrichtungen, die erforderlich sind, besser kontrolliert werden. Dies trifft für alle anderen erwähnten Anwendungen zu und ergibt eine große Flexibilität im Hinblick auf mögliche Anwendungen. Dieser „Ansatz der leichten Verfügbarkeit" („off-the-shelf-approach") ist sehr nützlich, wenn die Verfügbarkeit von Vorrichtungen beschränkt ist, da die Vorrichtung selbst für Zellwachstum und Kultur nicht so gut geeignet ist, oder wenn die weitere Handhabung der Zellen auf diesen Vorrichtungen eine irreversible Schädigung an den Zellen verursacht. In diesem Fall kann ein neues Muster von Zellen (das auf einem vorgemusterten Substrat wachsengelassen worden ist) auf dieselbe Vorrichtung gebracht werden, und die Messungen (jeglicher Art, die mit dieser besonderen Vorrichtung stattfinden sollen) können wieder aufgenommen werden. Alternativ kann das Muster von Zellen, das in einer Vorrichtung verwendet worden ist, in sterile Bedingungen überführt werden (d.h. von der Vorrichtung abgenommen werden) und dann zum Inkubator für eine weitere Kultivationsperiode zurückgebracht werden.
Unter Verwendung einer Kombination aus organotypischem ganzen Gewebe und sorgfältig angelegten vorgemusterten Oberflächen gelang es den vorliegenden Erfindern, eine große Vielzahl von Mustern von Zellen zu produzieren. Gemäß jeglicher Anforderung (abhängig von der Vorrichtung) können weitere Muster entworfen werden. Obwohl die Microkontakt-Drucktechnik hier unten als eine geeignete Technik zum Erzeugen einer Oberfläche diskutiert wird, die dahingehend vorgemustert ist, daß sie zellwachstumsfördernde Moleküle und/oder zellwachstumsinhibierende Moleküle daran angehängt hat, soll die vorliegende Erfindung in keiner Weise auf diese besondere Technik beschränkt sein. Andere Techniken zum Erzeugen von vorgemusterten Oberflächen, wie etwa Photolithographie, Laser-Abtragungstechniken mit lithographischen Masken etc. werden ebenso in Erwägung gezogen.
Weitere Vorteile und Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung können den folgenden Beispielen und Figuren entnommen werden, obwohl die Erfindung in keiner Weise darauf beschränkt ist. Bei den Figuren
zeigt 1 die Migration von organotypischen Hirnstammneuronen auf Lamininbeschichtetem Gewebekulturplastik;
zeigt 2 das Wachstum von Neuriten auf Lamininspuren;
zeigt 3 die Bewertung einer Vielzahl von extrazellulären Matrixproteinmustern, und
zeigt 4 das Wachstum von neuronalen Fortsätzen.
Beispiel 1
Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung konnte eine große Vielzahl von Mustern von Laminin auf einer Oberfläche in erfolgreicher Weise bei der vorliegenden Erfindung angewandt werden. Diese Muster, bei denen eine genaue Kontrolle des Zellwachstums erzielt werden konnte, werden in Tabelle 1 gezeigt:
Beispiel 2
Organotypische Kulturen von Hirnstammschnitten
Nach Extraktion von ganzen Embryonen-Rattengehirnen aus 15–18 Tage alten Sprague-Dawley-Ratten wurden die Medulla und Pons durch einen Transversalschnitt durch die rostrale Pons entfernt, und das Cerebellum wurde durch Sezieren der Pendunkuli entfernt. Die coronalen Abschnitte der Hirnstammschnitte wurden unter sterilen Bedingungen in gekühltem Gehirnschnitt-Kulturmedium (pH 7,4) geerntet. Diese Schnitte, die unter Verwendung eines McIlwain Tissue Chopper geschnitten wurden, waren 250 μm dick. Die so hergestellten Schnitte (gewöhnlich ungefähr 6 bis 12 Schnitte pro Rattenhirnstamm) wurden in einen Inkubator bei 37°C und einer 5% CO₂-angereicherten Atmosphäre für mindestens 4–5 Stunden gebracht. Diese Inkubationsperiode war vorgesehen, um es geschädigten Zellen (als ein Ergebnis des Schneidens) zu ermöglichen, sich von den Oberflächen der geschnittenen Stücke zu lösen. Nach dieser Inkubationsperiode wurden die Stücke dann auf Kontrollen (Lamininbeschichtet) und Testsubstraten (Laminin-gemustert) unter Verwendung eines kleinen oberflächenpolierten Spatels positioniert. Sorgfalt muß verwendet werden, um die hergestellten Schnitte nicht noch weiter zu schädigen. Anders als das von Gähwiler (1997, Trends in Neurosci., 20 (10), 471–477) beschriebene Verfahren wurde ein Plasmagerinnsel oder Collagen beim Immobilisieren der Schnitte nicht verwendet, da beide Verfahren die Zellmigrationen, insbesondere die Migration auf ECM-Mustern, behindern würden. Darüberhinaus wurde davon ausgegangen, daß die Roller-Tube-Technik nicht notwendig war. Stattdessen wurde in allen Kulturschalen eine kritische Menge an Medium zugegeben, so daß die Schnitte sich nicht von der Oberfläche lösten. Nach 2–3 Tagen in Kultur sollten die Schnitte ein signifikantes Ausmaß an Migration durchlaufen haben, und mehr Medium konnte in diesem Stadium zugegeben werden. Ein Antimitosemittel, Cytosin-β-D-Arabinofuranosid (ARA-C, SIGMA C-6645), wurde am Tag 4 oder 5 zugegeben, um die Proliferation von nicht-neuronalen Zellen zu inhibieren, sofern und wann immer notwendig. Wenn ARA-C verwendet wurde, wurde das Kulturmedium nach 5 bis 7 Tagen wieder auf ARA-C-freies Medium umgestellt.
Beispiel 3
Mikrokontakt-Drucken und Lösungen
Mikrostempel für das Experiment wurden mittels Photolithographie und Formpressen („moulding"), hergestellt. Ein Elektronenstrahlschreiber transponierte die verschiedenen Strukturen, die für das Experiment entworfen worden waren, auf eine Chrommaske. Unter Anwendung von UV-Photolithograhie wurden Master-Formen („master moulds") aus mittels Spin-Coating erzeugten 12,5 μm dicken Photoresist-Schichten (AZ 4562, Clariant GmbH, Deutschland) auf 0,6 mm dicken Silicium Wafers (MEMC Electronic Materials, Deutschland) erzeugt. Polydimethylsiloxan (PDMS)-Mikrostempel wurden dann durch Aushärtung von Sylgard 182 (Dow Corning, Deutschland) in 10 ml Eppendorf-Röhrchen für 48 Stunden bei 55°C umgedreht auf den Master-Formen hergestellt. Nach der Freisetzung aus der Master-Form wurde ein endgültiger Aushärtungsschritt für 1 h bei 110°C durchgeführt. Um die Stempelhydrophilie zu erhöhen, wurden PDMS-Stempel in entionisierten Wasser für mindestens 24 Stunden gelagert. Vor der Mustergebung wurden die Stempel aus dem Wasser genommen und in einem 70% Ethanol-Bad für 1 Minuten sterilisiert. Das Versehen mit Tinte („inking") fand für 30 Sekunden in 25 μg/ml (~ 0,25 μM) Lamininlösung statt. Der mit Tinte versehene Stempel wurde dann in einem weichen Stickstoffluftstrom getrocknet und unmittelbar auf das Substrat für 10 Sekunden gepreßt. In allen Experimenten wurden Nicht-Gewebekultur-Polystyrol-Schalen mit 3 cm Durchmesser (Greiner Labortechnik, Deutschland) verwendet.
Gehirnschnittmedium wurde aus HAMS F10 (SIGMA; N1387), supplementiert mit 20–25% fötalem Rinderserum (SIGMA, F7524) und 4 mM Glutamin (SIGMA, G7513), gemacht. Laminin (1243217, Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland) wurde in steriler PBS rekonstituiert.
Beispiel 4
Erzielte Zellmuster
1 zeigt die Migration von organotypischen Hirnstammneuronen auf Lamininbeschichtetem Gewebekulturplastik. Am Tag 3 (1A) in Kultur waren migrierte Neuronen in deutlicher Weise identifizierbar, und das Wachstum von Neuriten hatte bereits begonnen. Am Tag 5 (1B) waren diese Dendriten und axonalen Fortsätze auf eine signifikante Län ge gewachsen. Nach 13 (1C) und 20 Tagen (1D) wurde die Kultur konfluent, wobei alle Neuronen ein diffuses Netzwerk auf Gliazellen und anderen nicht-neuronalen Zellen bildeten.
2 zeigt die Wirksamkeit, mit der Neuritenauswuchs und neuronale Migration unter Verwendung der Technik der vorliegenden Erfindung geführt werden kann. Unabhängig von dem verwendeten Muster zeigten Hirnstammschnitte auf Laminin-gemusterten Substraten ein rasches Wachstum an Neuriten, und diese erstreckten sich bis zum Rand der gestempelten Muster innerhalb von zwei Wochen. Am Ende von zwei Wochen waren die Axone ausgewachsen („reached maturity") und wurden verdickt.
3 zeigt die Bewertung einer Vielzahl von extrazellulären Matrixproteinmustern (3AA und 3AB). Muster 1, Knoten 10 μm, Spur 2 μm; (3BA und 3BB) Muster 2, Knoten 10 μm, Spur 4 μm); (3CA und 3CB) Muster 3; Knoten 10 μm, Spur 6 μm; (3 DA und 3DB) Muster 4, Knoten 10 μm, Spur 2 μm; (3EA und 3EB) Muster 5, Knoten 10 μm, Spur 2 μm; (3FA und 3FB) Muster 6, Knoten 20 μm, Spur 4 μm. Während der frühen Tage in Kultur waren die migrierten Neuronen und die wachsenden Fortsätze in deutlicher Weise sichtbar mit geringer Überlappung auf allen Mustern. Diese Kulturen reiften weiter und nach 10 Tagen oder mehr waren die ursprünglichen Formen der Laminingestempelten Muster identifizierbar.
4 zeigt, daß nahezu perfekte Muster erzielt werden konnten unter Verwendung einer Linienbreite von 2 μm (Knotendurchmesser = 10 μm), und eine perfekte Gitterstruktur konnte gebildet werden. Die Figur zeigt das Wachstum von neuronalen Fortsätzen auf Muster 1, 14 Tage alte Kultur, bei fortschreitend erhöhten Vergrößerungen von × 40 (4A), × 100 (4B), × 200 (4C). Dieses perfekte Netzwerk von Fortsätzen wurde mit Mustern der kleinsten Spur (2 μm) erhalten. * weist auf denselben Punkt des Substrats in ihren jeweiligen entsprechenden Vergrößerungen hin. Mit diesem besonderen Muster wanderten jedoch sehr wenige sichtbar identifizierbare Neuronen tatsächlich auf das Muster, was wiederum ausschließlich aus Neuritenauswuchs gebildet wird. Muster mit Knotengröße von 10–14 μm und einer Linienbreite von 2–4 μm waren die geeignetsten für die Beschränkung von Neuronen. Experimente unter Verwendung verschiedener Linienbreiten zeigten, daß die beste neuronale Migration bei einer Linienbreite von 6 μm stattfand, wenn ein perfektes Netzwerk von Fortsätzen näherungsweise dieselbe Fläche des ursprünglichen Stempels (10 mm Durchmesser) be setzt hatte, die für die Mikrokontakt-Drucktechnik verwendet wurde. Es ist bekannt, daß Zellen eine Tendenz haben, zu den Knoten zu migrieren (Klein et al., 1999, J. of Mat. Sci: Mat. in Med., 10, 721–729; Corey et al., 1991, J. of Neurosci., 30, 300–307), und dasselbe Phänomen wurde bei Neuronen aus Gehirnschnitten beobachtet. Diese Neuronen wurden immobilisiert, sobald sie auf die Knoten migriert waren. Nach einer Anzahl von Tagen in Kultur begannen die neuronalen Fortsätze der Neuronen zu wachsen und bildeten ein einfaches lineares neuronales Netzwerk.

Claims

Verfahren zur Bildung eines Musters von Zellen auf einer Oberfläche, wobei die Oberfläche dahingehend vorgemustert ist, daß sie ein Muster aus zellwachstumsfördernden Molekülen und/oder zellwachstumsinhibierenden Molekülen daran angehängt hat, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen auf der vorgemusterten Oberfläche kultiviert werden, so daß sie ein Muster aus Zellen auf besagter Oberfläche bilden, wobei besagte Zellen ganzes Gewebe sind, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß das Muster aus zellwachstumsfördernden Molekülen und/oder zellwachstumsinhibierenden Molekülen durch wenigstens eine Schicht einer Substanz gebildet wird, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Polypeptid, Polyethylenimin und Polystyrol, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß das Muster aus zellwachstumsfördernden Molekülen und/oder zellwachstumsinhibierenden Molekülen eine Struktur mit Linien und Knoten hat, wobei besagte Linien eine Breite im Bereich von 1–8 Mikrometern haben und besagte Knoten einen Durchmesser im Bereich von 1–30 Mikrometern haben wobei eine Linien- und Knotenbreite verwendet wird, ausgewählt aus den folgenden Kombinationen:
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes, ganzes Gewebe aus dem Körper eines Organismus stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–2, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes ganzes Gewebe aus einem Organ stammt, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Gehirn, Leber, Niere, Muskel, Haut, Knochen, Lunge, Herz.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Zellen Organschnitte sind.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Zellen Gehirnschnitte sind.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Muster von zellwachstumsfördernden Molekülen und/oder zellwachstumsinhibierenden Molekülen, die an eine besagte vorgemusterte Oberfläche angehängt sind, das geführte Wachstum und Migration von Zellen ermöglicht.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Muster an zellwachstumsfördernden Molekülen und/oder zellwachstumsinhibierenden Molekülen die Anordnung von Zellen in einem Organ imitiert.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend extrazelluläre Matrixproteine, Poly-L-Lysin und Poly-Ornithin.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß besagte extrazelluläre Matrixproteine ausgewählt sind aus der Gruppe, umfassend Laminin und Fibronectin.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Muster von Zellen, nachdem es auf besagter vorgemusterter Oberfläche gebildet worden ist, auf eine zweite Oberfläche in einem Transferschritt übertragen wird.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß besagter Transferschritt die Folge umfaßt: a) Einbetten von besagtem Muster von Zellen in einer Matrix, b) Heben besagter Matrix, einschließlich besagten Musters von Zellen, von besagter vorgemusterter Oberfläche, c) In-Kontakt-Bringen von besagtem Muster von Zellen, eingebettet in besagte Matrix, mit besagter zweiter Oberfläche.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10–11, dadurch gekennzeichnet, daß besagter Transferschritt weiterhin die Folge umfaßt: d) Freisetzen besagten Musters von Zellen von besagter Matrix, e) Entfernen besagter Matrix von besagtem Muster von Zellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11–12, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Matrix eine Zell-kompatible Matrix ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11–13, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Matrix eine Matrix ist, zusammengesetzt aus einem Material, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Agarose, Fibrin, Collagen und Cellulose.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11–13, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Matrix eine Matrix ist, zusammengesetzt aus einem aushärtbaren Material.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes aushärtbare Material ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Agarose.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11–13, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Matrix eine Matrix ist, zusammengesetzt aus einem Material, das in der Lage ist, ein Gel zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Material, das in der Lage ist, ein Gel zu bilden, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Fibrinogen und Collagen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10–16, dadurch gekennzeichnet, daß besagte zweite Oberfläche ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Oberflächen von bioelektronischen Vorrichtungen, Sensoren, elektronischen Bestandteilen, Geweben, Implantaten und Transplantaten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11–19, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Einbetten erzielt wird durch aa) teilweises oder vollständiges Abdecken von besagtem Muster von Zellen mit besagter Matrix in einer flüssigen Form, und ab) Bilden besagter Matrix.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Bilden besagter Matrix (ab)) erzielt wird durch Erhöhen der Temperatur oberhalb der Gel-Übergangstemperatur und/oder durch Zugabe von wenigstens einem Gel-induzierenden Bestandteil.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß besagter Gel-induzierender Bestandteil ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Thrombin und andere Blut-Koagulationsfaktoren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12–22, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Freisetzen besagten Musters von besagter Matrix durch enzymatischen Abbau und/oder durch Senken der Temperatur unterhalb der Gel-Übergangstemperatur erzielt wird.