JP2002355031A - 細胞パターンの形成方法 - Google Patents
細胞パターンの形成方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 表面上での正確な細胞の成長を制御及び誘導
可能とする。 【解決手段】 細胞パターンを形成しようとする表面に
細胞成長促進分子及び／又は細胞成長阻害分子を当該表
面にパターン被着させることによって予備パターンする
工程と、上記予備パターンされた表面上に細胞を培養す
ることによって上記表面上に細胞パターンを形成する工
程とを有し、上記細胞が全体組織である。
可能とする。 【解決手段】 細胞パターンを形成しようとする表面に
細胞成長促進分子及び／又は細胞成長阻害分子を当該表
面にパターン被着させることによって予備パターンする
工程と、上記予備パターンされた表面上に細胞を培養す
ることによって上記表面上に細胞パターンを形成する工
程とを有し、上記細胞が全体組織である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、表面への細胞のパ
ターンの形成方法、細胞のネットワーク及びそれに基づ
いた組織に関する。
ターンの形成方法、細胞のネットワーク及びそれに基づ
いた組織に関する。
【０００２】
【従来の技術】同一種類で他の細胞に関する挙動及び空
間的組成をより理解するために、様々な種類の細胞の機
能を研究するためには、厳密に制御された条件下で細胞
を培養できるようにする必要がある。細胞成長を誘導す
るように予めパターンされた基板上で、当該基板上のパ
ターンに沿って細胞を培養及び成長させる実験が、２年
間続けられた。
間的組成をより理解するために、様々な種類の細胞の機
能を研究するためには、厳密に制御された条件下で細胞
を培養できるようにする必要がある。細胞成長を誘導す
るように予めパターンされた基板上で、当該基板上のパ
ターンに沿って細胞を培養及び成長させる実験が、２年
間続けられた。
【０００３】上記の実験は、短期的には、生物超小型電
子回路を作製するための生きた細胞を組み込んだ、微小
な生物電子デバイスの構築を可能とするという目的の下
で為されたものである。この研究の長期的なもう１つの
目的は、生物体内へ移植される移植片として好適な人工
組織の作製を可能とすることであり、これについては、
機能不全の組織と同種類の生体由来の組織に取って代わ
るものとなるかもしれない。また、この研究の３番目の
目的は、細胞の特別な配列でこれらのデバイスの外側を
「マスク」することによって、移植組織及び／又はイン
プラントの融合を促進することである。この特別な配列
とは、細胞の化学的及び免疫学的性質、及びデバイスが
導入される生物体内の部位に適合する配列である。
子回路を作製するための生きた細胞を組み込んだ、微小
な生物電子デバイスの構築を可能とするという目的の下
で為されたものである。この研究の長期的なもう１つの
目的は、生物体内へ移植される移植片として好適な人工
組織の作製を可能とすることであり、これについては、
機能不全の組織と同種類の生体由来の組織に取って代わ
るものとなるかもしれない。また、この研究の３番目の
目的は、細胞の特別な配列でこれらのデバイスの外側を
「マスク」することによって、移植組織及び／又はイン
プラントの融合を促進することである。この特別な配列
とは、細胞の化学的及び免疫学的性質、及びデバイスが
導入される生物体内の部位に適合する配列である。
【０００４】その程度までの細胞の培養、すなわち、特
定の所期のパターンを示す培養を実現する１つの方法と
しては、前もって細胞の成長を促進させる「誘導」分子
のパターンが作られた表面にそって、細胞を成長させる
ことが挙げられる。なお、この表面には、細胞の成長を
促進しない領域が存在する。細胞成長促進分子として
は、様々な種類のものが用いられる。
定の所期のパターンを示す培養を実現する１つの方法と
しては、前もって細胞の成長を促進させる「誘導」分子
のパターンが作られた表面にそって、細胞を成長させる
ことが挙げられる。なお、この表面には、細胞の成長を
促進しない領域が存在する。細胞成長促進分子として
は、様々な種類のものが用いられる。
【０００５】Mrksichらは、金基板への細胞の付着を制
御するために、アルカンチオレートのパターンを用いた
（1996, PNAS USA, 93, 10775-10778;1997, Exp. Cell
Res., 235, 305-313）。適当な末端のアルカンチオレー
トを選択することにより、彼らは細胞成長を促進する領
域及び細胞成長を阻害する領域を作り出すことに成功し
た。Coreyらは、様々な値で線幅、交差間距離及び節の
径を有するポリリジンの格子を残すように、選択的なレ
ーザーアブレーションを行うことにより、ポリリジンコ
ートされたカバーガラス上に神経細胞をパターンした
（1991, J. Neurosc. Res., 30, 300-307）。
御するために、アルカンチオレートのパターンを用いた
（1996, PNAS USA, 93, 10775-10778;1997, Exp. Cell
Res., 235, 305-313）。適当な末端のアルカンチオレー
トを選択することにより、彼らは細胞成長を促進する領
域及び細胞成長を阻害する領域を作り出すことに成功し
た。Coreyらは、様々な値で線幅、交差間距離及び節の
径を有するポリリジンの格子を残すように、選択的なレ
ーザーアブレーションを行うことにより、ポリリジンコ
ートされたカバーガラス上に神経細胞をパターンした
（1991, J. Neurosc. Res., 30, 300-307）。
【０００６】Matsuzawaらは、基板上に、ラミニンのＢ
２鎖の神経突起伸長促進ドメインに由来する合成ペプチ
ドを化学的に付着させた（1996, J. Neurosci. Meth.,
69,189-196）。また、Matsudaらは、様々な種類の他の
ペプチドを固定化した（Matsuda et al., 1990, Trans.
Am. Soc. Artif. Int. Organs; 36(3): M559-63）。ま
た、Kleinらは、ラミニンのような細胞外基質タンパク
質（ＥＣＭ）を固定化した（1999, J. Mat. Sci. Mat.
in Med; 10: 721-727）。
２鎖の神経突起伸長促進ドメインに由来する合成ペプチ
ドを化学的に付着させた（1996, J. Neurosci. Meth.,
69,189-196）。また、Matsudaらは、様々な種類の他の
ペプチドを固定化した（Matsuda et al., 1990, Trans.
Am. Soc. Artif. Int. Organs; 36(3): M559-63）。ま
た、Kleinらは、ラミニンのような細胞外基質タンパク
質（ＥＣＭ）を固定化した（1999, J. Mat. Sci. Mat.
in Med; 10: 721-727）。
【０００７】生体分子を表面に付着させ、さらにパター
ン化するために、クロスリンカー（Clemence et al., 1
985, Bioconjugated Chem. 6: 411-417）、シランカッ
プリング剤（Plueddemann E. 2 edn New York Plenum P
ress, 1991: 1-250）を含めて、様々な技術が用いられ
てきた。
ン化するために、クロスリンカー（Clemence et al., 1
985, Bioconjugated Chem. 6: 411-417）、シランカッ
プリング剤（Plueddemann E. 2 edn New York Plenum P
ress, 1991: 1-250）を含めて、様々な技術が用いられ
てきた。
【０００８】近年、基板上に特異的パターンでタンパク
質を付着させる技術として、いわゆるマイクロコンタク
トプリンティング（microcontact printing）技術が適
用されている。この方法は、比較的単純であり、また、
生体分子のパターン化に一般的に用いることができる
（Kumar et al., 1993, Appl. Phys. Lett., 63(14), 2
002-2004）。この技術では、先ず、シリコンエラストマ
ー（ポリジメチルシロキサン，ＰＤＭＳ）を所望のパタ
ーンで鋳造することによってスタンプを作製し、その
後、このスタンプに、転写される生体分子の溶液を塗布
する。その後、「インク付けされた」スタンプを基板の
表面に接触させると、生体分子が、予め付与されたパタ
ーンにて自己集合し、基板上にパターンが形成される。
質を付着させる技術として、いわゆるマイクロコンタク
トプリンティング（microcontact printing）技術が適
用されている。この方法は、比較的単純であり、また、
生体分子のパターン化に一般的に用いることができる
（Kumar et al., 1993, Appl. Phys. Lett., 63(14), 2
002-2004）。この技術では、先ず、シリコンエラストマ
ー（ポリジメチルシロキサン，ＰＤＭＳ）を所望のパタ
ーンで鋳造することによってスタンプを作製し、その
後、このスタンプに、転写される生体分子の溶液を塗布
する。その後、「インク付けされた」スタンプを基板の
表面に接触させると、生体分子が、予め付与されたパタ
ーンにて自己集合し、基板上にパターンが形成される。
【０００９】Kumarら及びMrksichらは、金基板上にアル
カンチオールをスタンプすることにより、パターンを形
成する上記方法を開発した（Mrksich et al. 1996, PNA
S USA, 93, 10775-10778,Mrksich et al. 1997, Exp. C
ell Res., 235, 305-313）。クロスリンカーとしてグル
タルアルデヒド（Branch et al. 1998, Med. Biol. En
g. Comput., 36, 135-141）及び硫化ＧＭＢＳ（Wheeler
et al. 1999, J. Biomech. Eng., 121, 73-78）を用い
たマイクロコンタクトプリンティング法により、ポリ−
Ｄ−リジン及びラミニンを、アミノシランで変性された
ガラス基板上に固定化した。マイクロコンタクトプリン
ティング（microcontact printing）技術は、神経細胞
の誘導に用いられている（Wheeler et al. 1999, ibi
d.; Branchet al. 2000, IEEE Transact. Biomed. En
g., 47, 3, 290-300）。
カンチオールをスタンプすることにより、パターンを形
成する上記方法を開発した（Mrksich et al. 1996, PNA
S USA, 93, 10775-10778,Mrksich et al. 1997, Exp. C
ell Res., 235, 305-313）。クロスリンカーとしてグル
タルアルデヒド（Branch et al. 1998, Med. Biol. En
g. Comput., 36, 135-141）及び硫化ＧＭＢＳ（Wheeler
et al. 1999, J. Biomech. Eng., 121, 73-78）を用い
たマイクロコンタクトプリンティング法により、ポリ−
Ｄ−リジン及びラミニンを、アミノシランで変性された
ガラス基板上に固定化した。マイクロコンタクトプリン
ティング（microcontact printing）技術は、神経細胞
の誘導に用いられている（Wheeler et al. 1999, ibi
d.; Branchet al. 2000, IEEE Transact. Biomed. En
g., 47, 3, 290-300）。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】ところで、上述した全
ての研究では、主に神経細胞から分離した細胞の培養物
を用いており、いくつかの事例においてだけパターンの
形成に成功している。
ての研究では、主に神経細胞から分離した細胞の培養物
を用いており、いくつかの事例においてだけパターンの
形成に成功している。
【００１１】しかしながら、このようにして形成された
細胞のパターンが、自然界で実際に現れるものと同じ様
相のものであるかどうかは不明であり、また、例えば生
物電子デバイス等に対して有用性があるのかどうかも不
明である。
細胞のパターンが、自然界で実際に現れるものと同じ様
相のものであるかどうかは不明であり、また、例えば生
物電子デバイス等に対して有用性があるのかどうかも不
明である。
【００１２】したがって、これらの研究から得られた結
果は、例えば、器官内細胞の空間的な配列又は器官内の
細胞間相互作用等に関しては、限定的にしか役に立たな
い。そのうえ、現在の生物電子インターフェースデバイ
ス及び細胞改良インターフェースには、これらのデバイ
スを作製するに際して再現性に問題がある。つまり、基
板上で細胞の付着及び成長を誘導し、そして完全に制御
することは、いまだ不可能である。
果は、例えば、器官内細胞の空間的な配列又は器官内の
細胞間相互作用等に関しては、限定的にしか役に立たな
い。そのうえ、現在の生物電子インターフェースデバイ
ス及び細胞改良インターフェースには、これらのデバイ
スを作製するに際して再現性に問題がある。つまり、基
板上で細胞の付着及び成長を誘導し、そして完全に制御
することは、いまだ不可能である。
【００１３】現在の生物電子インターフェースデバイス
及び細胞改良インターフェースでは、細胞がデバイスの
基板上に直接培養されるので、全てのデバイスについて
細胞の成長に成功するといった保証はない。したがっ
て、多くのデバイス及び多くの培養スターターには、培
養後に有益な細胞ネットワークが基板上に実際に現れる
ことが確実に要求される。
及び細胞改良インターフェースでは、細胞がデバイスの
基板上に直接培養されるので、全てのデバイスについて
細胞の成長に成功するといった保証はない。したがっ
て、多くのデバイス及び多くの培養スターターには、培
養後に有益な細胞ネットワークが基板上に実際に現れる
ことが確実に要求される。
【００１４】インプラントに関する問題としては、これ
らのインプラントは、たいていの場合、生体適合性が限
られていることが挙げられる。これは、インプラントの
適合性の悪さ、すなわちホストによる拒絶反応、又は単
に基板の毒性による。器官内の細胞の空間的配置に模倣
させた細胞パターンに沿って細胞を並べることで、イン
プラントの生体適合性を確実に向上させることができ
る。
らのインプラントは、たいていの場合、生体適合性が限
られていることが挙げられる。これは、インプラントの
適合性の悪さ、すなわちホストによる拒絶反応、又は単
に基板の毒性による。器官内の細胞の空間的配置に模倣
させた細胞パターンに沿って細胞を並べることで、イン
プラントの生体適合性を確実に向上させることができ
る。
【００１５】そこで本発明はこのような従来の実情に鑑
みて提案されたものであり、本発明の第１の目的は、従
来にない方法で、表面上での正確な細胞の成長を制御及
び誘導可能とすることである。また、本発明の他の目的
は、有益なデバイスを与える培養スターター又は基板の
数を減少させることにより、生物電子デバイスの生産に
かかる労力を抑制することである。また、本発明の他の
目的は、インプラント及び移植組織の生体適合性を向上
させることである。
みて提案されたものであり、本発明の第１の目的は、従
来にない方法で、表面上での正確な細胞の成長を制御及
び誘導可能とすることである。また、本発明の他の目的
は、有益なデバイスを与える培養スターター又は基板の
数を減少させることにより、生物電子デバイスの生産に
かかる労力を抑制することである。また、本発明の他の
目的は、インプラント及び移植組織の生体適合性を向上
させることである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】上述の目的を達成するた
めに、本発明の表面への細胞パターンの形成方法は、細
胞パターンを形成しようとする表面に細胞成長促進分子
及び／又は細胞成長阻害分子を当該表面にパターン被着
させることによって予備パターンする工程と、上記予備
パターンされた表面上に細胞を培養することによって上
記表面上に細胞パターンを形成する工程とを有し、上記
細胞が全体組織であることを特徴とする。
めに、本発明の表面への細胞パターンの形成方法は、細
胞パターンを形成しようとする表面に細胞成長促進分子
及び／又は細胞成長阻害分子を当該表面にパターン被着
させることによって予備パターンする工程と、上記予備
パターンされた表面上に細胞を培養することによって上
記表面上に細胞パターンを形成する工程とを有し、上記
細胞が全体組織であることを特徴とする。
【００１７】上述したような本発明に係る表面への細胞
パターンの形成方法では、細胞パターンを培養する表面
を予備パターンすることで、表面上での正確な細胞の成
長の制御及び誘導が可能となる。
パターンの形成方法では、細胞パターンを培養する表面
を予備パターンすることで、表面上での正確な細胞の成
長の制御及び誘導が可能となる。
【００１８】また、上述の目的を達成するために、本発
明の表面へのパターンの形成方法は、細胞パターンを形
成しようとする表面に、細胞成長促進分子及び／又は細
胞成長阻害分子を当該表面にパターン被着させることに
よって予備パターンする工程と、上記予備パターンされ
た表面上に細胞を培養することによって、上記表面上に
細胞パターンを形成する工程と、上記表面上に形成され
た上記細胞パターンを、その後、第２の表面へ転写する
転写工程を有し、上記細胞が全体組織及び解離された細
胞を含む群から選択されるものであることを特徴とす
る。
明の表面へのパターンの形成方法は、細胞パターンを形
成しようとする表面に、細胞成長促進分子及び／又は細
胞成長阻害分子を当該表面にパターン被着させることに
よって予備パターンする工程と、上記予備パターンされ
た表面上に細胞を培養することによって、上記表面上に
細胞パターンを形成する工程と、上記表面上に形成され
た上記細胞パターンを、その後、第２の表面へ転写する
転写工程を有し、上記細胞が全体組織及び解離された細
胞を含む群から選択されるものであることを特徴とす
る。
【００１９】上述したような本発明に係る表面へのパタ
ーンの形成方法では、細胞パターンを培養する表面を予
備パターンすることで、表面上での正確な細胞の成長の
制御及び誘導が可能となり、その転写により正確な細胞
パターンの再現が可能になる。
ーンの形成方法では、細胞パターンを培養する表面を予
備パターンすることで、表面上での正確な細胞の成長の
制御及び誘導が可能となり、その転写により正確な細胞
パターンの再現が可能になる。
【００２０】また、上述した本発明の目的は、転写段階
を除いて、上述した本発明の方法により生産可能な細胞
のパターン及び／又は人工組織によって達成される。さ
らにまた、本発明の目的は、転写段階を除いて、上述し
た本発明の方法により生産可能な、表面上の細胞のパタ
ーン及び／又は人工組織によって達成される。また、本
発明の目的は、転写段階及びそれについての様々な実施
形態を含む、上述した本発明の方法により生産可能な、
細胞のパターン及び／又は人工組織によって達成され
る。また、本発明の目的は、転写段階及びそれについて
の様々な実施形態を含む、上述した本発明の方法により
生産可能な、表面上の細胞のパターン及び／又は人工組
織によって解決される。
を除いて、上述した本発明の方法により生産可能な細胞
のパターン及び／又は人工組織によって達成される。さ
らにまた、本発明の目的は、転写段階を除いて、上述し
た本発明の方法により生産可能な、表面上の細胞のパタ
ーン及び／又は人工組織によって達成される。また、本
発明の目的は、転写段階及びそれについての様々な実施
形態を含む、上述した本発明の方法により生産可能な、
細胞のパターン及び／又は人工組織によって達成され
る。また、本発明の目的は、転写段階及びそれについて
の様々な実施形態を含む、上述した本発明の方法により
生産可能な、表面上の細胞のパターン及び／又は人工組
織によって解決される。
【００２１】また、本発明の目的は、本発明の細胞のパ
ターンの組み合わせによって達成される。また、本発明
の目的は、本発明の人工組織の組み合わせによって達成
される。また、本発明の目的は、本発明の細胞パターン
及び人工組織の組み合わせによって達成される。「細胞
パターンの組み合わせ」という用語は、いかなる細胞パ
ターンの空間的配置も含むことを意味し、この細胞パタ
ーンは互いに近接している。「人工組織の組み合わせ」
についても同様である。
ターンの組み合わせによって達成される。また、本発明
の目的は、本発明の人工組織の組み合わせによって達成
される。また、本発明の目的は、本発明の細胞パターン
及び人工組織の組み合わせによって達成される。「細胞
パターンの組み合わせ」という用語は、いかなる細胞パ
ターンの空間的配置も含むことを意味し、この細胞パタ
ーンは互いに近接している。「人工組織の組み合わせ」
についても同様である。
【００２２】さらにまた、本発明の目的は、センサ、技
術的基板（technical substrate）、組織、インプラン
ト及び移植組織を含む群から選ばれるデバイスにおけ
る、本発明に従った細胞のパターン、及び／又は人工組
織、及び／又は組み合わせの使用によって達成される。
術的基板（technical substrate）、組織、インプラン
ト及び移植組織を含む群から選ばれるデバイスにおけ
る、本発明に従った細胞のパターン、及び／又は人工組
織、及び／又は組み合わせの使用によって達成される。
【００２３】
【発明の実施の形態】以下、本発明を適用した表面上の
細胞のパターンの形成方法、細胞のネットワーク及びそ
れに基づいた組織について、図面を参照しながら詳細に
説明する。
細胞のパターンの形成方法、細胞のネットワーク及びそ
れに基づいた組織について、図面を参照しながら詳細に
説明する。
【００２４】本発明者らは、本発明を適用することで、
多くの最適なパターン上に、器官の組織切片の細胞を処
理できることを明らかにした。すなわち、本発明の細胞
パターンの形成方法は、細胞パターンを形成しようとす
る表面に細胞成長促進分子及び／又は細胞成長阻害分子
を当該表面にパターン被着させることによって予備パタ
ーンする工程と、上記予備パターンされた表面上に細胞
を培養することによって上記表面上に細胞パターンを形
成する工程とを有する。
多くの最適なパターン上に、器官の組織切片の細胞を処
理できることを明らかにした。すなわち、本発明の細胞
パターンの形成方法は、細胞パターンを形成しようとす
る表面に細胞成長促進分子及び／又は細胞成長阻害分子
を当該表面にパターン被着させることによって予備パタ
ーンする工程と、上記予備パターンされた表面上に細胞
を培養することによって上記表面上に細胞パターンを形
成する工程とを有する。
【００２５】ここで、上記細胞は全体組織である。そし
て、当該全体組織は生物の組織体に由来するものである
ことが好ましい。具体的には、上記全体組織が、脳、肝
臓、腎臓、筋肉、皮膚、骨、肺及び心臓を含む群から選
ばれる器官に由来するものであることが好ましい。ま
た、上記細胞が、器官の組織切片であることが好まし
い。これらの器官の組織切片は、器官の組織切片が器官
内での細胞の配列を模倣する点で、器官適合性を有する
(organotypic)ものであることが好ましい。また、上記
細胞は、脳の組織切片であることが好ましい。
て、当該全体組織は生物の組織体に由来するものである
ことが好ましい。具体的には、上記全体組織が、脳、肝
臓、腎臓、筋肉、皮膚、骨、肺及び心臓を含む群から選
ばれる器官に由来するものであることが好ましい。ま
た、上記細胞が、器官の組織切片であることが好まし
い。これらの器官の組織切片は、器官の組織切片が器官
内での細胞の配列を模倣する点で、器官適合性を有する
(organotypic)ものであることが好ましい。また、上記
細胞は、脳の組織切片であることが好ましい。
【００２６】また、上記予備パターンされた表面に付着
した上記細胞成長促進分子及び／又は細胞成長阻害分子
のパターンは、細胞の成長及び移動の誘導を可能とし、
そして、上記細胞成長促進分子及び／又は細胞成長阻害
分子のパターンが、器官の細胞の配列を模倣するもので
あることが好ましい。さらに、上記細胞成長促進分子及
び／又は細胞成長阻害分子のパターンは、筋（line）及
び節（node）を有する構造を有し、ここで、上記筋の幅
が１μｍ〜８μｍの範囲であり、上記節の直径が１μｍ
〜３０μｍの範囲であることが好ましく、上記筋の幅が
１μｍ〜６μｍの範囲であり、上記節の直径が８μｍ〜
１６μｍの範囲であることがより好ましく、上記筋の幅
が２μｍ〜４μｍの範囲であり、上記節の直径が１０μ
ｍ〜１４μｍの範囲であることが最も好ましい。
した上記細胞成長促進分子及び／又は細胞成長阻害分子
のパターンは、細胞の成長及び移動の誘導を可能とし、
そして、上記細胞成長促進分子及び／又は細胞成長阻害
分子のパターンが、器官の細胞の配列を模倣するもので
あることが好ましい。さらに、上記細胞成長促進分子及
び／又は細胞成長阻害分子のパターンは、筋（line）及
び節（node）を有する構造を有し、ここで、上記筋の幅
が１μｍ〜８μｍの範囲であり、上記節の直径が１μｍ
〜３０μｍの範囲であることが好ましく、上記筋の幅が
１μｍ〜６μｍの範囲であり、上記節の直径が８μｍ〜
１６μｍの範囲であることがより好ましく、上記筋の幅
が２μｍ〜４μｍの範囲であり、上記節の直径が１０μ
ｍ〜１４μｍの範囲であることが最も好ましい。
【００２７】上記細胞成長促進分子及び／又は細胞成長
阻害分子のパターンは、ポリペプチド、ポリエチレンイ
ミン及びポリスチレンを含む群から選ばれる物質の少な
くとも１層によって形成されることが好ましい。ここ
で、上記ポリペプチドが、細胞外タンパク質、ポリ−Ｌ
−リジン及びポリ−オルニチンを含む群から選択され、
上記細胞外タンパク質が、ラミニン及びフィブロネクチ
ンを含む群から選択されることが好ましい。
阻害分子のパターンは、ポリペプチド、ポリエチレンイ
ミン及びポリスチレンを含む群から選ばれる物質の少な
くとも１層によって形成されることが好ましい。ここ
で、上記ポリペプチドが、細胞外タンパク質、ポリ−Ｌ
−リジン及びポリ−オルニチンを含む群から選択され、
上記細胞外タンパク質が、ラミニン及びフィブロネクチ
ンを含む群から選択されることが好ましい。
【００２８】以上説明したように、本発明では広範な全
体組織から得られた細胞を用いることで、従来は困難で
あった、例えば格子状（grid）等のほぼ完全な細胞のパ
ターンを実現することができた。全体組織から得られる
組織切片を使用することは、表面の層は別として、従来
に比べて機械的なダメージが小さくなること及びその組
織の構成が維持されるという点で、分離された細胞を用
いた培養よりも多くの利点がある。その後パターン化さ
れた細胞は、最初の組織切片の細胞の相対的な位置を反
映したものとなる。
体組織から得られた細胞を用いることで、従来は困難で
あった、例えば格子状（grid）等のほぼ完全な細胞のパ
ターンを実現することができた。全体組織から得られる
組織切片を使用することは、表面の層は別として、従来
に比べて機械的なダメージが小さくなること及びその組
織の構成が維持されるという点で、分離された細胞を用
いた培養よりも多くの利点がある。その後パターン化さ
れた細胞は、最初の組織切片の細胞の相対的な位置を反
映したものとなる。
【００２９】本発明を用いることにより、例えばグリッ
ド及び／又は筋形状等のＥＣＭタンパク質の構造で培養
された、例えば、脳幹組織切片からの神経細胞、神経突
起及び糸状仮足を安定して成長させることができる。表
面上の、細胞成長促進分子及び／又は細胞成長阻害分子
の適当なパターンを選択することによって、いかなる所
望の細胞パターンも実現することができる。
ド及び／又は筋形状等のＥＣＭタンパク質の構造で培養
された、例えば、脳幹組織切片からの神経細胞、神経突
起及び糸状仮足を安定して成長させることができる。表
面上の、細胞成長促進分子及び／又は細胞成長阻害分子
の適当なパターンを選択することによって、いかなる所
望の細胞パターンも実現することができる。
【００３０】さらにまた、本発明者らは、上述のように
して得られた、ほぼ完全な細胞パターンを処理すること
により、これらのパターンを所望の他の表面上に容易に
転写することに成功した。
して得られた、ほぼ完全な細胞パターンを処理すること
により、これらのパターンを所望の他の表面上に容易に
転写することに成功した。
【００３１】すなわち、本発明に係る表面上のパターン
の形成方法は、細胞パターンを形成しようとする表面
に、細胞成長促進分子及び／又は細胞成長阻害分子を当
該表面にパターン被着させることによって予備パターン
する工程と、上記予備パターンされた表面上に細胞を培
養することによって、上記表面上に細胞パターンを形成
する工程と、上記予備パターンされた表面上に形成され
た上記細胞パターンを、その後、第２の表面へ転写する
転写工程とを有し、上記細胞が全体組織及び解離された
細胞を含む群から選択されるものである。
の形成方法は、細胞パターンを形成しようとする表面
に、細胞成長促進分子及び／又は細胞成長阻害分子を当
該表面にパターン被着させることによって予備パターン
する工程と、上記予備パターンされた表面上に細胞を培
養することによって、上記表面上に細胞パターンを形成
する工程と、上記予備パターンされた表面上に形成され
た上記細胞パターンを、その後、第２の表面へ転写する
転写工程とを有し、上記細胞が全体組織及び解離された
細胞を含む群から選択されるものである。
【００３２】ここで、上記転写工程が、 ａ）マトリクスに上記細胞パターンを埋め込む手順と、 ｂ）上記予備パターンされた表面から、上記細胞パター
ンを含む上記マトリクスを引き上げる手順と、 ｃ）上記マトリクスに埋め込まれた上記細胞パターン
を、上記第２の表面に接触させる手順とを含むことが好
ましい。
ンを含む上記マトリクスを引き上げる手順と、 ｃ）上記マトリクスに埋め込まれた上記細胞パターン
を、上記第２の表面に接触させる手順とを含むことが好
ましい。
【００３３】具体的には、上記転写工程が、さらに、 ｄ）上記マトリクスから、上記細胞パターンを離型する
手順と、 ｅ）上記細胞パターンから、上記マトリクスを除去する
手順とを含むことが好ましい。
手順と、 ｅ）上記細胞パターンから、上記マトリクスを除去する
手順とを含むことが好ましい。
【００３４】上記マトリクスは、細胞と適合性があるこ
とが好ましい。細胞と適合性があるとは、用いられる細
胞の生存能力を妨げないということである。上記マトリ
クスは、アガロース、フィブリン、コラーゲン及びセル
ロースを含む群から選ばれる材料からなることが好まし
い。具体的には、上記マトリクスは、硬化可能な材料か
らなり、上記硬化可能な材料が、アガロースを含む群か
ら選ばれることが好ましい。この場合には、アガロース
が液体の状態で細胞パターンを注入し、その後に冷却す
ることで硬化する。
とが好ましい。細胞と適合性があるとは、用いられる細
胞の生存能力を妨げないということである。上記マトリ
クスは、アガロース、フィブリン、コラーゲン及びセル
ロースを含む群から選ばれる材料からなることが好まし
い。具体的には、上記マトリクスは、硬化可能な材料か
らなり、上記硬化可能な材料が、アガロースを含む群か
ら選ばれることが好ましい。この場合には、アガロース
が液体の状態で細胞パターンを注入し、その後に冷却す
ることで硬化する。
【００３５】また、上記マトリクスとして、ゲルを形成
可能な材料を用いることもできる。上記ゲルを形成可能
な材料が、フィブリノゲン及びコラーゲンを含む群から
選ばれることが好ましい。フィブリノゲンは、トロンビ
ンの添加によって、フィブリンのゲル形成を促進する。
フィブリンのゲルを形成する方法は、例えば、Schense
et al., 2000, Nature Biotechnology, 18, 415-419及
びYe et al., 2000, European Journal of Cardio-thor
acic Surgery, 17, 587-591に記載されており、これら
の記載も参照として本明細書の記載に含める。コラーゲ
ンのゲルは、コラーゲンの冷たい中性溶液を加熱するこ
とによりコラーゲン分子が自己集合して形成される。こ
のような方法は、例えば、O'Connor et al., 2000, Bio
sensors and Bioelectronics, 14, 871-881,に記載され
ており、これらの記載も参照として本明細書の記載に含
める。
可能な材料を用いることもできる。上記ゲルを形成可能
な材料が、フィブリノゲン及びコラーゲンを含む群から
選ばれることが好ましい。フィブリノゲンは、トロンビ
ンの添加によって、フィブリンのゲル形成を促進する。
フィブリンのゲルを形成する方法は、例えば、Schense
et al., 2000, Nature Biotechnology, 18, 415-419及
びYe et al., 2000, European Journal of Cardio-thor
acic Surgery, 17, 587-591に記載されており、これら
の記載も参照として本明細書の記載に含める。コラーゲ
ンのゲルは、コラーゲンの冷たい中性溶液を加熱するこ
とによりコラーゲン分子が自己集合して形成される。こ
のような方法は、例えば、O'Connor et al., 2000, Bio
sensors and Bioelectronics, 14, 871-881,に記載され
ており、これらの記載も参照として本明細書の記載に含
める。
【００３６】細胞パターンが転写される上記第２の表面
は、生物電子デバイスの表面、センサ、電子素子、組
織、インプラント及び移植組織を含む群から選ばれる。
「センサ」は、特に、バイオセンサ、光学的センサを含
む。「電子素子」としては、例えば、電界効果トランジ
スタ、多極アレイ（multi-electrode array）及びその
他同種類のものが挙げられる。移植組織としては、例え
ば、自原性（autogenesis）（ドナーと受容者とが同
一）、同質遺伝性（syngenous）（遺伝的にドナーと受
容者とが同一）、同種間性（allogenous）（ドナーと受
容者とが同じ種に属する）、及び異種間性（xenogenou
s）（ドナーと受容者とが異なる種に属する）等、公知
のいかなる形態のものが適用可能である。
は、生物電子デバイスの表面、センサ、電子素子、組
織、インプラント及び移植組織を含む群から選ばれる。
「センサ」は、特に、バイオセンサ、光学的センサを含
む。「電子素子」としては、例えば、電界効果トランジ
スタ、多極アレイ（multi-electrode array）及びその
他同種類のものが挙げられる。移植組織としては、例え
ば、自原性（autogenesis）（ドナーと受容者とが同
一）、同質遺伝性（syngenous）（遺伝的にドナーと受
容者とが同一）、同種間性（allogenous）（ドナーと受
容者とが同じ種に属する）、及び異種間性（xenogenou
s）（ドナーと受容者とが異なる種に属する）等、公知
のいかなる形態のものが適用可能である。
【００３７】具体的には、上記埋め込み工程が、 ａａ）液体状の上記マトリクスで、上記細胞パターンの
一部又は全体を被覆する手順と、 ａｂ）上記マトリクスを形成する手順とを有することが
好ましい。
一部又は全体を被覆する手順と、 ａｂ）上記マトリクスを形成する手順とを有することが
好ましい。
【００３８】上記マトリクスの形成は、ゲル転移温度以
上に温度を上昇させること、及び／又は少なくとも１つ
のゲル誘導要素の添加により行われることが好ましい。
ここで上記ゲル誘導要素が、トロンビン及び他の血液凝
固因子を含む群から選ばれることが好ましい。この方法
の改良型、例えばＸ因子等の血液凝固カスケードからの
様々な因子と組み合わせてプロトロンビンを添加する方
法も、本発明の範囲内である。
上に温度を上昇させること、及び／又は少なくとも１つ
のゲル誘導要素の添加により行われることが好ましい。
ここで上記ゲル誘導要素が、トロンビン及び他の血液凝
固因子を含む群から選ばれることが好ましい。この方法
の改良型、例えばＸ因子等の血液凝固カスケードからの
様々な因子と組み合わせてプロトロンビンを添加する方
法も、本発明の範囲内である。
【００３９】上記マトリクスからの上記細胞パターンの
離型は、酵素による分解及び／又はゲル転移温度未満に
温度を低下させることによって行われることが好まし
い。
離型は、酵素による分解及び／又はゲル転移温度未満に
温度を低下させることによって行われることが好まし
い。
【００４０】上述したように、本発明の細胞パターンの
転写は、例えば、細胞の生存能力を妨害しないという意
味で生体適合性のある材料からなるマトリクスに、細胞
パターン又は人工組織を埋め込むことによって行われ
る。本発明によれば、全てのマトリクスは、その性質に
拘わらず、すでに表面上に形成された細胞又は人工組織
のパターン上に集合する。これは、本発明によれば、細
胞及び人工組織のパターンの形成後においてのみ、マト
リクスがパターン形成されるということを意味する。続
いて、ゲルを用いることによって、この細胞パターンを
他の場所へと転写する。続いて、例えばゲル転移温度未
満に温度を下げること、酵素的な分解、その他の方法等
によって、このマトリクスを除去する。
転写は、例えば、細胞の生存能力を妨害しないという意
味で生体適合性のある材料からなるマトリクスに、細胞
パターン又は人工組織を埋め込むことによって行われ
る。本発明によれば、全てのマトリクスは、その性質に
拘わらず、すでに表面上に形成された細胞又は人工組織
のパターン上に集合する。これは、本発明によれば、細
胞及び人工組織のパターンの形成後においてのみ、マト
リクスがパターン形成されるということを意味する。続
いて、ゲルを用いることによって、この細胞パターンを
他の場所へと転写する。続いて、例えばゲル転移温度未
満に温度を下げること、酵素的な分解、その他の方法等
によって、このマトリクスを除去する。
【００４１】本発明では、完全な細胞パターンだけをこ
れらデバイスの表面に転写して用いることで、生物電子
デバイスの生産をより経済的にするとともに、これらの
デバイスの特性の正確な制御が可能となる。完全な細胞
パターンが形成されると、この細胞パターンをマトリク
スを用いて固定して、さらに基板から剥離し、それ自身
では細胞成長の最初の場となる基板としては不適当な、
電界効果トランジスタ等のようなバイオセンサ上などに
転写することができる。
れらデバイスの表面に転写して用いることで、生物電子
デバイスの生産をより経済的にするとともに、これらの
デバイスの特性の正確な制御が可能となる。完全な細胞
パターンが形成されると、この細胞パターンをマトリク
スを用いて固定して、さらに基板から剥離し、それ自身
では細胞成長の最初の場となる基板としては不適当な、
電界効果トランジスタ等のようなバイオセンサ上などに
転写することができる。
【００４２】「予備培養された状態（pre-cultured-sit
uation）」を用いる本発明によれば、有用な細胞パター
ンだけが用いられ、そしてその細胞パターンがデバイス
上に転写される。そして、このような操作により、要求
される多くのデバイスをよりよく制御することができ
る。これは、これまで言及した全ての他の応用例、考え
られる応用例についても広く当てはまる。
uation）」を用いる本発明によれば、有用な細胞パター
ンだけが用いられ、そしてその細胞パターンがデバイス
上に転写される。そして、このような操作により、要求
される多くのデバイスをよりよく制御することができ
る。これは、これまで言及した全ての他の応用例、考え
られる応用例についても広く当てはまる。
【００４３】この「特別あつらえでないアプローチ（of
f-the-shelf-approach）」は、デバイスの入手が限られ
ているとき、デバイスそれ自体は細胞成長及び培養にあ
まり適さないとき、又はこれらのデバイス上での細胞の
操作が、不可逆的なダメージを細胞に与えるときに非常
に有用である。
f-the-shelf-approach）」は、デバイスの入手が限られ
ているとき、デバイスそれ自体は細胞成長及び培養にあ
まり適さないとき、又はこれらのデバイス上での細胞の
操作が、不可逆的なダメージを細胞に与えるときに非常
に有用である。
【００４４】この場合、予備パターン化された基板上に
成長する新たな細胞のパターンは、同じようなデバイス
上に配置することができ、この特定のデバイスで行われ
るあらゆる種類の測定が再開される。或いはまた、ある
デバイスで用いられた細胞パターンは、すなわち、細胞
パターンをデバイスから外した状態で、無菌状態へ移す
ことができ、測定を行った後で、当該細胞パターンは、
さらなる培養のために培養器へと戻される。
成長する新たな細胞のパターンは、同じようなデバイス
上に配置することができ、この特定のデバイスで行われ
るあらゆる種類の測定が再開される。或いはまた、ある
デバイスで用いられた細胞パターンは、すなわち、細胞
パターンをデバイスから外した状態で、無菌状態へ移す
ことができ、測定を行った後で、当該細胞パターンは、
さらなる培養のために培養器へと戻される。
【００４５】本発明者らは、器官適合性の全体組織の組
み合わせと、表面上に注意深く予備パターンを形成する
ことにより、極めて多様な細胞パターンを形成すること
に成功した。また、デバイスに依存するあらゆる要求に
従って、さらに多くのパターンのデザインが可能とな
る。また、人工組織を作製することにも成功した。
み合わせと、表面上に注意深く予備パターンを形成する
ことにより、極めて多様な細胞パターンを形成すること
に成功した。また、デバイスに依存するあらゆる要求に
従って、さらに多くのパターンのデザインが可能とな
る。また、人工組織を作製することにも成功した。
【００４６】細胞成長促進分子及び／又は細胞成長阻害
分子を表面上に被着させることで、表面を予備パターン
するために適当な技術として、マイクロコンタクトプリ
ンティング（microcontact printing）技術について以
下の実験例に述べるが、本発明は、特にこの技術に限定
されるものではない。表面を予備パターンするための技
術として、他に例えばフォトリソグラフィ、リソグラフ
ィ用マスクを用いたレーザーアブレーション技術等が挙
げられるが、これらの技術も、本発明の範囲に含まれ
る。
分子を表面上に被着させることで、表面を予備パターン
するために適当な技術として、マイクロコンタクトプリ
ンティング（microcontact printing）技術について以
下の実験例に述べるが、本発明は、特にこの技術に限定
されるものではない。表面を予備パターンするための技
術として、他に例えばフォトリソグラフィ、リソグラフ
ィ用マスクを用いたレーザーアブレーション技術等が挙
げられるが、これらの技術も、本発明の範囲に含まれ
る。
【００４７】なお、本発明は、明細書、特許請求の範囲
及び／又は添付された図面に開示された本発明のそれぞ
れの特徴を別々に適用することもできるし、それらをあ
らゆる組み合わせで適用することもできる。いずれの形
態においても本発明を実現することができる。
及び／又は添付された図面に開示された本発明のそれぞ
れの特徴を別々に適用することもできるし、それらをあ
らゆる組み合わせで適用することもできる。いずれの形
態においても本発明を実現することができる。
【００４８】〈実験例〉本発明について行った実験例に
ついて述べるが、本発明はこれらの例に限定されるもの
ではない。
ついて述べるが、本発明はこれらの例に限定されるもの
ではない。
【００４９】実験例１ 本発明の方法を用いて、表面上に多くの種類のラミニン
のパターンを形成した。これらのパターンは、細胞成長
を厳密に制御することで形成することができる。これら
のパターンを表１〜表３に示す。
のパターンを形成した。これらのパターンは、細胞成長
を厳密に制御することで形成することができる。これら
のパターンを表１〜表３に示す。
【００５０】
【表１】
【００５１】
【表２】
【００５２】
【表３】
【００５３】実験例２ ・脳幹細胞と器官適合性を有する細胞の培養 発生１５日齢〜１８日齢のＳＤラット（Sprague-Dawley
rat）の胎児の脳全体を摘出した。このとき、脳脚を切
開して取り出された、くちばし状の脳橋及び小脳を横断
切断することによって延髄及び脳橋を除去した。そし
て、無菌状態の冷却されたｐＨ７．４の脳幹組織切片培
養基で、脳幹細胞組織切片の冠状切片（coronal sectio
ns)を得た。マキルウェイン組織切断器を用いて切り取
ったこれらの組織切片の厚さは２５０μｍであった。
rat）の胎児の脳全体を摘出した。このとき、脳脚を切
開して取り出された、くちばし状の脳橋及び小脳を横断
切断することによって延髄及び脳橋を除去した。そし
て、無菌状態の冷却されたｐＨ７．４の脳幹組織切片培
養基で、脳幹細胞組織切片の冠状切片（coronal sectio
ns)を得た。マキルウェイン組織切断器を用いて切り取
ったこれらの組織切片の厚さは２５０μｍであった。
【００５４】このようにして準備された組織切片（通
常、ラット脳幹細胞から約６〜１２組織切片得られ
る。）を、３７℃、５％のＣＯ２雰囲気に設定された培
養器内に、最低４〜５時間放置した。この保温培養によ
って、切り取られたことによってダメージを受けた細胞
を、切り取られた組織切片の表面から分離させる。
常、ラット脳幹細胞から約６〜１２組織切片得られ
る。）を、３７℃、５％のＣＯ２雰囲気に設定された培
養器内に、最低４〜５時間放置した。この保温培養によ
って、切り取られたことによってダメージを受けた細胞
を、切り取られた組織切片の表面から分離させる。
【００５５】この保温培養の後、当該組織切片を、表面
を洗浄したスパチュラを用いて、ラミニンコートされた
対照試料上、及びラミニンがパターンされたテスト基板
上に載置した。このとき、組織切片にさらにダメージを
与えないように気をつけなければならない。
を洗浄したスパチュラを用いて、ラミニンコートされた
対照試料上、及びラミニンがパターンされたテスト基板
上に載置した。このとき、組織切片にさらにダメージを
与えないように気をつけなければならない。
【００５６】Ｇ ｈｗｉｌｅｒによって記載された方法
とは異なり、組織切片を固定する際に、プラズマ凝固物
又はコラーゲンは用いない。プラズマ凝固物又はコラー
ゲンのどちらの方法も、細胞の移動、特にＥＣＭパター
ン上での移動を妨げるからである。また、回転チューブ
技術は不要である。
とは異なり、組織切片を固定する際に、プラズマ凝固物
又はコラーゲンは用いない。プラズマ凝固物又はコラー
ゲンのどちらの方法も、細胞の移動、特にＥＣＭパター
ン上での移動を妨げるからである。また、回転チューブ
技術は不要である。
【００５７】その代わりに、組織切片が表面から分離し
ないように、全ての培養皿において大量の培養基を添加
した。培養２〜３日後には、組織切片がかなり広範囲に
わたって移動するので、より多くの培養基をこの段階で
添加してもよい。
ないように、全ての培養皿において大量の培養基を添加
した。培養２〜３日後には、組織切片がかなり広範囲に
わたって移動するので、より多くの培養基をこの段階で
添加してもよい。
【００５８】非神経細胞の増殖を阻害するために、有糸
分裂阻害剤であるシトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド
（ＡＲＡ−Ｃ、ＳＩＧＭＡ Ｃ−６６４５）を、必要に
応じて４日目又は５日目に添加した。ＡＲＡ−Ｃを用い
た場合、培養基は５日後〜７日後に、ＡＲＡ−Ｃを添加
しない状態に戻った。
分裂阻害剤であるシトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド
（ＡＲＡ−Ｃ、ＳＩＧＭＡ Ｃ−６６４５）を、必要に
応じて４日目又は５日目に添加した。ＡＲＡ−Ｃを用い
た場合、培養基は５日後〜７日後に、ＡＲＡ−Ｃを添加
しない状態に戻った。
【００５９】実験例３ ・マイクロコンタクトプリンティング（Micro contact
printing）及び溶液 実験用のマイクロスタンプをフォトリソグラフィ及び成
形によって作製した。実験用にデザインした種々の構造
パターンを、電子ビームでクロムマスクに書き込んだ。
そして、紫外線フォトリソグラフィ技術を用いて、厚さ
０．６ｍｍのシリコンウェハ（MEMC Electronic Materi
als, Germany）上に、厚さ１２．５μｍのフォトレジス
ト層（AZ 4562, Clariant GmbH, Germany）がスピンコ
ートされてなるマスター型を作製した。
printing）及び溶液 実験用のマイクロスタンプをフォトリソグラフィ及び成
形によって作製した。実験用にデザインした種々の構造
パターンを、電子ビームでクロムマスクに書き込んだ。
そして、紫外線フォトリソグラフィ技術を用いて、厚さ
０．６ｍｍのシリコンウェハ（MEMC Electronic Materi
als, Germany）上に、厚さ１２．５μｍのフォトレジス
ト層（AZ 4562, Clariant GmbH, Germany）がスピンコ
ートされてなるマスター型を作製した。
【００６０】引き続いて、１０ｍｌエッペンドルフ管内
で５５℃、４８時間処理してシルガード１８２（Dow Co
rning, Germany）を硬化させることにより、上記マスタ
ー型に逆状態の、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）
のマイクロスタンプを作製した。マスター型を離型した
後、１１０℃で１時間処理して、最終硬化を行った。
で５５℃、４８時間処理してシルガード１８２（Dow Co
rning, Germany）を硬化させることにより、上記マスタ
ー型に逆状態の、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）
のマイクロスタンプを作製した。マスター型を離型した
後、１１０℃で１時間処理して、最終硬化を行った。
【００６１】スタンプの親水性を向上させるために、最
低２４時間、ＰＤＭＳスタンプを脱イオン水中に保持し
た。パターン形成を行う前に、スタンプを水から取り出
し、７０％エタノール浴中で１分間の滅菌を行った。
低２４時間、ＰＤＭＳスタンプを脱イオン水中に保持し
た。パターン形成を行う前に、スタンプを水から取り出
し、７０％エタノール浴中で１分間の滅菌を行った。
【００６２】そして、スタンプを２５μｇ／ｍｌ（〜
０．２５μＭ）のラミニン溶液中に３０秒間浸すことに
よりインク付けを行った。その後、インクが付けられた
スタンプを、穏やかな窒素空気流中で乾燥し、直ちに基
板上に１０秒間押しつけた。全ての実験において、基板
として、組織培養用ではないポリスチレン製の直径３ｃ
ｍのペトリ皿（Greiner Labortechick, Germany）を用
いた。
０．２５μＭ）のラミニン溶液中に３０秒間浸すことに
よりインク付けを行った。その後、インクが付けられた
スタンプを、穏やかな窒素空気流中で乾燥し、直ちに基
板上に１０秒間押しつけた。全ての実験において、基板
として、組織培養用ではないポリスチレン製の直径３ｃ
ｍのペトリ皿（Greiner Labortechick, Germany）を用
いた。
【００６３】脳組織切片培養基は、２０％〜２５％の胎
児牛血清（ＳＩＧＭＡ，Ｆ７５２４）及び４ｍＭのグル
タミン（ＳＩＧＭＡ，Ｇ７５１３）で補足されたＨＡＭ
ＳＦ１０（ＳＩＧＭＡ；Ｇ７５１３）から作製したもの
を用いた。ラミニン（1243217, Boehringer Mannheim G
mbH, Germany）は、無菌のＰＢＳ中で再構成されたもの
である。
児牛血清（ＳＩＧＭＡ，Ｆ７５２４）及び４ｍＭのグル
タミン（ＳＩＧＭＡ，Ｇ７５１３）で補足されたＨＡＭ
ＳＦ１０（ＳＩＧＭＡ；Ｇ７５１３）から作製したもの
を用いた。ラミニン（1243217, Boehringer Mannheim G
mbH, Germany）は、無菌のＰＢＳ中で再構成されたもの
である。
【００６４】実験例４ ・細胞パターンの実現 図１Ａ〜図１Ｄは、ラミニンコートされた組織培養プラ
スチック上における、器官適合性を有する(organotypi
c)脳幹神経細胞の移動を示す図である。図１Ａに示すよ
うに、培養３日目では、移動した神経細胞をはっきりと
認識することができ、また、神経突起の成長がすでに始
まっていた。図１Ｂに示すように、培養５日目では、こ
れらの樹枝状突起及び神経突起は、かなりの長さに成長
していた。１３日目（図１Ｃ）及び２０日目（図１Ｄ）
では、この神経突起は、グリア細胞及び他の非神経細胞
の上に広く行き渡るネットワークを形成する全ての神経
細胞と合流するようになった。
スチック上における、器官適合性を有する(organotypi
c)脳幹神経細胞の移動を示す図である。図１Ａに示すよ
うに、培養３日目では、移動した神経細胞をはっきりと
認識することができ、また、神経突起の成長がすでに始
まっていた。図１Ｂに示すように、培養５日目では、こ
れらの樹枝状突起及び神経突起は、かなりの長さに成長
していた。１３日目（図１Ｃ）及び２０日目（図１Ｄ）
では、この神経突起は、グリア細胞及び他の非神経細胞
の上に広く行き渡るネットワークを形成する全ての神経
細胞と合流するようになった。
【００６５】図２は、本発明の技術を用いて、神経突起
の成長及び神経細胞の移動を誘導することの有効性を示
す図である。用いたパターンには関係なく、ラミニンで
パターンされた基板上の脳幹組織切片は、神経突起の急
速な成長を示した。そしてこの神経突起は、２週間以内
にスタンプされたパターンの端まで伸び、２週間の終わ
りには神経突起は成熟して厚くなった。
の成長及び神経細胞の移動を誘導することの有効性を示
す図である。用いたパターンには関係なく、ラミニンで
パターンされた基板上の脳幹組織切片は、神経突起の急
速な成長を示した。そしてこの神経突起は、２週間以内
にスタンプされたパターンの端まで伸び、２週間の終わ
りには神経突起は成熟して厚くなった。
【００６６】図３及び図４は、細胞外基質タンパク質の
様々な評価を示す図である。図３ＡＡ及び図３ＡＢに示
すパターン１は、節（node）の直径が１０μｍであり、
筋（line）の幅が２μｍである。図３ＢＡ及び図３ＢＢ
に示すパターン２は、節の直径が１０μｍであり、筋の
幅が４μｍである。図３ＣＡ及び図３ＣＢに示すパター
ン３は、節の直径が１０μｍであり、筋の幅が６μｍで
あった。図４ＤＡ及び部３ＤＢに示すパターン４は、節
の直径が１０μｍであり、筋の幅が２μｍであった。図
４ＥＡ及び図４ＥＢに示すパターン５は、節の直径が１
０μｍであり、筋の幅が２μｍであった。図４ＦＡ及び
図４ＦＢに示すパターン６は、節の直径が２０μｍであ
り、トラックが４μｍであった。培養初期には、移動し
た神経細胞及び突起の成長プロセスは、全てのパターン
において殆ど重なり合うことなくはっきりと見えてい
た。これらの培養物は、少なくとも培養１０日目までは
成熟を続け、ラミニンでスタンプされたパターンの元の
形状が識別可能であった。
様々な評価を示す図である。図３ＡＡ及び図３ＡＢに示
すパターン１は、節（node）の直径が１０μｍであり、
筋（line）の幅が２μｍである。図３ＢＡ及び図３ＢＢ
に示すパターン２は、節の直径が１０μｍであり、筋の
幅が４μｍである。図３ＣＡ及び図３ＣＢに示すパター
ン３は、節の直径が１０μｍであり、筋の幅が６μｍで
あった。図４ＤＡ及び部３ＤＢに示すパターン４は、節
の直径が１０μｍであり、筋の幅が２μｍであった。図
４ＥＡ及び図４ＥＢに示すパターン５は、節の直径が１
０μｍであり、筋の幅が２μｍであった。図４ＦＡ及び
図４ＦＢに示すパターン６は、節の直径が２０μｍであ
り、トラックが４μｍであった。培養初期には、移動し
た神経細胞及び突起の成長プロセスは、全てのパターン
において殆ど重なり合うことなくはっきりと見えてい
た。これらの培養物は、少なくとも培養１０日目までは
成熟を続け、ラミニンでスタンプされたパターンの元の
形状が識別可能であった。
【００６７】図５乃至図７は、幅２μｍの筋（節の直径
１０μｍ）で殆ど完全なパターンが実現できること及び
完全な格子（grid）構造が形成されることを示す図であ
る。パターン１の培養１４日目における神経突起の成長
を、図５では４０倍、図６では１００倍、図７では２０
０倍と、倍率を次第に増して示す。この神経突起の完全
なネットワークは、最小幅（２μｍ）のパターンで得ら
れた。図中の＊は、それらの対応する倍率における基板
上の同じポイントを示す。しかしながら、この特別なパ
ターンでは、視覚的に確認できる神経細胞で実際にパタ
ーン上に移動したものは極めて少ない。つまり、そのパ
ターンは、神経突起の成長によってのみ形成されるもの
である。節の径が１０μｍ〜１４μｍであり、筋の幅が
２〜４μｍであるようなパターンが、神経細胞の制限に
最も適していた。
１０μｍ）で殆ど完全なパターンが実現できること及び
完全な格子（grid）構造が形成されることを示す図であ
る。パターン１の培養１４日目における神経突起の成長
を、図５では４０倍、図６では１００倍、図７では２０
０倍と、倍率を次第に増して示す。この神経突起の完全
なネットワークは、最小幅（２μｍ）のパターンで得ら
れた。図中の＊は、それらの対応する倍率における基板
上の同じポイントを示す。しかしながら、この特別なパ
ターンでは、視覚的に確認できる神経細胞で実際にパタ
ーン上に移動したものは極めて少ない。つまり、そのパ
ターンは、神経突起の成長によってのみ形成されるもの
である。節の径が１０μｍ〜１４μｍであり、筋の幅が
２〜４μｍであるようなパターンが、神経細胞の制限に
最も適していた。
【００６８】筋幅を様々に変えて行った実験では、筋幅
が６μｍの場合に最もよく神経細胞の移動が生ることが
示された。この筋幅では、神経突起の完全なネットワー
クは、マイクロコンタクトプリンティング（microconta
ct printing）技術に使われる最初のスタンプ（直径１
０ｍｍ）とほぼ同じ面積に広がっていた。細胞は、節
（node）に向かって移動する傾向があり（Klein et a
l., 1999, J. of Mat. Sci; Mat. in Med., 10, 721-72
9）、また、脳神経細胞を用いたときにも同じ現象が観
察されることが知られている。節上に移動したこれらの
神経細胞を、その後固定化する。数日間の培養の後、神
経細胞の神経突起が成長し始め、単純な線状の神経細胞
のネットワークを形成した。
が６μｍの場合に最もよく神経細胞の移動が生ることが
示された。この筋幅では、神経突起の完全なネットワー
クは、マイクロコンタクトプリンティング（microconta
ct printing）技術に使われる最初のスタンプ（直径１
０ｍｍ）とほぼ同じ面積に広がっていた。細胞は、節
（node）に向かって移動する傾向があり（Klein et a
l., 1999, J. of Mat. Sci; Mat. in Med., 10, 721-72
9）、また、脳神経細胞を用いたときにも同じ現象が観
察されることが知られている。節上に移動したこれらの
神経細胞を、その後固定化する。数日間の培養の後、神
経細胞の神経突起が成長し始め、単純な線状の神経細胞
のネットワークを形成した。
【００６９】
【発明の効果】以上の説明からも明らかなように、本発
明によれば、従来にない方法で、表面上での正確な細胞
の成長の制御及び誘導を可能にすることができる。ま
た、本発明によれば、有益なデバイスを与える培養スタ
ータ（starter cultures）又は基板の数を減少させるこ
とにより、生物電子デバイスの生産にかかる労力を抑制
可能とする。また、本発明によれば、インプラント及び
移植組織の生体適合性を向上させることができる。
明によれば、従来にない方法で、表面上での正確な細胞
の成長の制御及び誘導を可能にすることができる。ま
た、本発明によれば、有益なデバイスを与える培養スタ
ータ（starter cultures）又は基板の数を減少させるこ
とにより、生物電子デバイスの生産にかかる労力を抑制
可能とする。また、本発明によれば、インプラント及び
移植組織の生体適合性を向上させることができる。
【図１】ラミニンコートされた組織培養プラスチック上
の器官の機能を維持した状態(organotypic) である脳幹
神経細胞の移動を示す図であり、Ａは培養３日目、Ｂは
培養５日目、Ｃは培養１３日目、Ｄは培養２０日目の状
態を示す図である。
の器官の機能を維持した状態(organotypic) である脳幹
神経細胞の移動を示す図であり、Ａは培養３日目、Ｂは
培養５日目、Ｃは培養１３日目、Ｄは培養２０日目の状
態を示す図である。
【図２】ラミニンのトラック上に神経突起が成長した様
子を示す図である。
子を示す図である。
【図３】細胞外基質タンパク質の様々な評価を示す図で
ある。
ある。
【図４】細胞外基質タンパク質の様々な評価を示す図で
ある。
ある。
【図５】パターン１の培養１４日目における神経突起の
成長を示す図であり、倍率４０倍で示す図である。
成長を示す図であり、倍率４０倍で示す図である。
【図６】パターン１の培養１４日目における神経突起の
成長を示す図であり、倍率１００倍で示す図である。
成長を示す図であり、倍率１００倍で示す図である。
【図７】パターン１の培養１４日目における神経突起の
成長を示す図であり、倍率２００倍で示す図である。
成長を示す図であり、倍率２００倍で示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 500382141 マックス プランク ゲゼルシャフト ツ ル フォルデルング デル ウィッセンシ ャフテン エー．ヴェー. ドイツ連邦共和国 ディー−80539 ミュ ンヘン ホフガルテンシュトラーセ ８ (72)発明者 ネレス、ガブリエーレ ドイツ連邦共和国 70327 シュトゥット ゥガルトヘデルフィンガー シュトラーセ 61 ソニー インターナショナル（ヨー ロッパ） ゲゼルシャフト ミット ベシ ュレンクテル ハフツング アドバンスド テクノロジー センター シュトゥット ゥガルト内 (72)発明者 安田 章夫 ドイツ連邦共和国 70327 シュトゥット ゥガルトヘデルフィンガー シュトラーセ 61 ソニー インターナショナル（ヨー ロッパ） ゲゼルシャフト ミット ベシ ュレンクテル ハフツング アドバンスド テクノロジー センター シュトゥット ゥガルト内 (72)発明者 クノッル、ヲルフガング ドイツ連邦共和国 55128 マインツ ア ッケルマンウェグ 10 マックス プラン ク インスティテュート フル ポリメル フォルシュング内 (72)発明者 オッフェンハウザー、アンドレアス ドイツ連邦共和国 55128 マインツ ア ッケルマンウェグ 10 マックス プラン ク インスティテュート フル ポリメル フォルシュング内 (72)発明者 ヨン、チー コング ドイツ連邦共和国 55128 マインツ ア ッケルマンウェグ 10 マックス プラン ク インスティテュート フル ポリメル フォルシュング内 (72)発明者 ラウアー、ラース ドイツ連邦共和国 55128 マインツ ア ッケルマンウェグ 10 マックス プラン ク インスティテュート フル ポリメル フォルシュング内 Ｆターム(参考） 4B065 AA90X BB19 BB25 BC41 BC50 CA44 4C081 BA12 BC01 CD34 EA01 4C097 BB01 MM04
Claims (40)
- 【請求項１】 細胞パターンを形成しようとする表面
に、細胞成長促進分子及び／又は細胞成長阻害分子を当
該表面にパターン被着させることによって予備パターン
する工程と、 上記予備パターンされた表面上に細胞を培養することに
よって、上記表面上に細胞パターンを形成する工程とを
有し、 上記細胞が全体組織であることを特徴とする表面への細
胞パターンの形成方法。 - 【請求項２】 上記全体組織が、生物の組織体に由来す
るものであることを特徴とする請求項１記載の表面への
細胞パターンの形成方法。 - 【請求項３】 上記全体組織が、脳、肝臓、腎臓、筋
肉、皮膚、骨、肺及び心臓を含む群から選ばれる器官に
由来するものであることを特徴とする請求項１又は請求
項２のいずれかに記載の表面への細胞パターンの形成方
法。 - 【請求項４】 上記細胞が、器官の組織切片であること
を特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれかに記載の
表面への細胞パターンの形成方法。 - 【請求項５】 上記細胞が、脳の組織切片であることを
特徴とする請求項４記載の表面への細胞パターンの形成
方法。 - 【請求項６】 上記予備パターンされた表面に被着され
た上記細胞成長促進分子及び／又は細胞成長阻害分子の
パターンが、細胞の成長及び移動を誘導することを特徴
とする請求項１乃至請求項５のいずれかに記載の表面へ
の細胞パターンの形成方法。 - 【請求項７】 上記細胞成長促進分子及び／又は細胞成
長阻害分子のパターンが、器官の細胞の配列を模倣した
ものであることを特徴とする請求項６記載の表面への細
胞パターンの形成方法。 - 【請求項８】 上記細胞成長促進分子及び／又は細胞成
長阻害分子のパターンが、筋及び節を有する構造である
ことを特徴とする請求項１乃至請求項７のいずれかに記
載の表面への細胞パターンの形成方法。 - 【請求項９】 上記筋の幅が１μｍ〜８μｍの範囲であ
り、上記節の直径が１μｍ〜３０μｍの範囲であること
を特徴とする請求項８記載の表面への細胞パターンの形
成方法。 - 【請求項１０】 上記筋の幅が１μｍ〜６μｍの範囲で
あり、上記節の直径が８μｍ〜１６μｍの範囲であるこ
とを特徴とする請求項９記載の表面への細胞パターンの
形成方法。 - 【請求項１１】 上記筋の幅が２μｍ〜４μｍの範囲で
あり、上記節の直径が１０μｍ〜１４μｍの範囲である
ことを特徴とする請求項１０記載の表面への細胞パター
ンの形成方法。 - 【請求項１２】 上記細胞成長促進分子及び／又は細胞
成長阻害分子のパターンが、ポリペプチド、ポリエチレ
ンイミン及びポリスチレンを含む群から選ばれる物質の
少なくとも１層によって形成されることを特徴とする請
求項１乃至請求項１１のいずれかに記載の表面への細胞
パターンの形成方法。 - 【請求項１３】 上記ポリペプチドが、細胞外基質タン
パク質、ポリ−Ｌ−リジン及びポリ−オルニチンを含む
群から選択されることを特徴とする請求項１２記載の表
面への細胞パターンの形成方法。 - 【請求項１４】 上記細胞外基質タンパク質が、ラミニ
ン及びフィブロネクチンを含む群から選択されることを
特徴とする請求項１３記載の表面への細胞パターンの形
成方法。 - 【請求項１５】 細胞パターンを形成しようとする表面
に、細胞成長促進分子及び／又は細胞成長阻害分子を当
該表面にパターン被着させることによって予備パターン
する工程と、 上記予備パターンされた表面上に細胞を培養することに
よって、上記表面上に細胞パターンを形成する工程と、 上記表面上に形成された上記細胞パターンを、その後、
第２の表面へ転写する転写工程とを有し、 上記細胞が、全体組織及び解離された細胞を含む群から
選択されるものであることを特徴とする請求項１乃至請
求項１４のいずれかに記載の表面への細胞パターンの形
成方法。 - 【請求項１６】 上記転写工程が、 ａ）マトリクスに上記細胞パターンを埋め込む手順と、 ｂ）上記予備パターンされた表面から、上記細胞パター
ンを含む上記マトリクスを引き上げる手順と、 ｃ）上記マトリクスに埋め込まれた上記細胞パターン
を、上記第２の表面に接触させる手順とを含むことを特
徴とする請求項１５記載の表面への細胞パターンの形成
方法。 - 【請求項１７】 上記転写工程が、さらに ｄ）上記マトリクスから、上記細胞パターンを離型する
手順と、 ｅ）上記細胞パターンから、上記マトリクスを除去する
手順とを含むことを特徴とする請求項１５又は請求項１
６のいずれかに記載の表面への細胞パターンの形成方
法。 - 【請求項１８】 上記マトリクスが、細胞と適合性のあ
ることを特徴とする請求項１６及び請求項１７のいずれ
かに記載の表面への細胞パターンの形成方法。 - 【請求項１９】 上記マトリクスが、アガロース、フィ
ブリン、コラーゲン及びセルロースを含む群から選ばれ
る材料からなることを特徴とする請求項１６乃至請求項
１８のいずれかに記載の表面への細胞パターンの形成方
法。 - 【請求項２０】 上記マトリクスが、硬化可能な材料か
らなることを特徴とする請求項１６乃至請求項１８のい
ずれかに記載の表面への細胞パターンの形成方法。 - 【請求項２１】 上記硬化可能な材料が、アガロースを
含む群から選ばれることを特徴とする請求項２０に記載
の表面への細胞パターンの形成方法。 - 【請求項２２】 上記マトリクスが、ゲルを形成可能な
材料からなることを特徴とする請求項１６乃至請求項１
８のいずれかに記載の表面への細胞パターンの形成方
法。 - 【請求項２３】 上記ゲルを形成可能な材料が、フィブ
リノゲン及びコラーゲンを含む群から選ばれることを特
徴とする請求項２２記載の表面への細胞パターンの形成
方法。 - 【請求項２４】 上記第２の表面が、生物電子デバイス
の表面、センサ、電子素子、組織、インプラント及び移
植組織を含む群から選ばれることを特徴とする請求項１
５乃至請求項２１のいずれかに記載の表面への細胞パタ
ーンの形成方法。 - 【請求項２５】 上記埋め込み工程が、 ａａ）液体状の上記マトリクスで、上記細胞パターンの
一部又は全体を被覆する手順と ａｂ）上記マトリクスを形成する手順とを有することを
特徴とする請求項１６乃至請求項２４のいずれかに記載
の表面への細胞パターンの形成方法。 - 【請求項２６】 上記マトリクスの形成は、ゲル転移温
度以上に温度を上昇させること、及び／又は少なくとも
１つのゲル誘導要素の添加により行われることを特徴と
する請求項２５記載の表面への細胞パターンの形成方
法。 - 【請求項２７】 上記ゲル誘導要素が、トロンビン及び
他の血液凝固因子を含む群から選ばれることを特徴とす
る請求項２６記載の表面への細胞パターンの形成方法。 - 【請求項２８】 上記マトリクスからの上記細胞パター
ンの離型は、酵素による分解及び／又はゲル転移温度未
満に温度を低下させることによって行われることを特徴
とする請求項１７乃至請求項２７のいずれかに記載の表
面への細胞パターンの形成方法。 - 【請求項２９】 請求項１乃至請求項１４のいずれかに
記載される表面への細胞パターンの形成方法によって作
成可能である細胞パターン。 - 【請求項３０】 請求項１乃至請求項１４のいずれかに
記載される表面への細胞パターンの形成方法によって作
成可能である表面上の細胞パターン。 - 【請求項３１】 請求項１乃至請求項２８のいずれかに
記載される表面への細胞パターンの形成方法によって作
成可能である細胞パターン。 - 【請求項３２】 請求項１乃至請求項２８のいずれかに
記載される表面への細胞パターンの形成方法によって作
成可能である表面上の細胞パターン。 - 【請求項３３】 請求項１乃至請求項１４のいずれかに
記載される表面への細胞パターンの形成方法によって作
成可能である人工組織。 - 【請求項３４】 請求項１乃至請求項１４のいずれかに
記載される表面への細胞パターンの形成方法によって作
成可能である表面上の人工組織。 - 【請求項３５】 請求項１乃至請求項２８のいずれかに
記載される表面への細胞パターンの形成方法によって作
成可能である人工組織。 - 【請求項３６】 請求項１乃至請求項２８のいずれかに
記載される表面への細胞パターンの形成方法によって作
成可能である表面上の人工組織。 - 【請求項３７】 請求項２９乃至請求項３２のいずれか
に記載される細胞パターンの組み合わせ。 - 【請求項３８】 請求項３３乃至請求項３６のいずれか
に記載される人工組織の組み合わせ。 - 【請求項３９】 請求項２９乃至請求項３２のいずれか
に記載される細胞パターン及び請求項３３乃至請求項３
６のいずれかに記載される人工組織の組み合わせ。 - 【請求項４０】 センサ、技術的基板、組織、インプラ
ント及び移植組織を含む群から選ばれるデバイスにおけ
る、請求項２９乃至請求項３２のいずれかに記載の細胞
パターン、及び／又は請求項３３乃至請求項３６のいず
れかに記載の人工組織、及び／又は請求項３７又は請求
項３８のいずれかに記載の組み合わせの使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP00122915A EP1199354B1 (en) | 2000-10-20 | 2000-10-20 | A method of forming a cell pattern on a surface |
| EP00122915.2 | 2000-10-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002355031A true JP2002355031A (ja) | 2002-12-10 |
Family
ID=8170154
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001322549A Abandoned JP2002355031A (ja) | 2000-10-20 | 2001-10-19 | 細胞パターンの形成方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6787358B2 (ja) |
| EP (1) | EP1199354B1 (ja) |
| JP (1) | JP2002355031A (ja) |
| DE (1) | DE60019603T2 (ja) |
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| KR101561744B1 (ko) | 2013-12-19 | 2015-10-20 | 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 | 3차원 세포이식용 패치 및 그의 제조방법 |
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| US6893851B2 (en) | 2000-11-08 | 2005-05-17 | Surface Logix, Inc. | Method for arraying biomolecules and for monitoring cell motility in real-time |
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