KR20210092726A - 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하기 위한 조성물, 인간 피부 조직 모델 동물 및 그 제조 방법 - Google Patents
모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하기 위한 조성물, 인간 피부 조직 모델 동물 및 그 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하기 위한 조성물로서, 인간 표피 세포와; 인간 진피 세포를 포함하고, 여기서 상기 인간 진피 세포가, 스페로이드 형성을 거친 비태아 유래의 인간 모유두의 세포군을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물, 및 그것이 적용된 인간 피부 조직 모델 동물을 제공한다. 또한, 이들의 제조 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하기 위한 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하기 위한 조성물이 적용된 모포를 갖는 인간 피부 조직 모델 동물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
모발은 피부에 존재하는 모포에 의해 생성된다. 모포란, 털을 둘러싸는 조직층이며, 외배엽 유래의 모모(毛母)(모모 세포), 내모근초, 외모근초나, 중배엽 유래의 진피 모근초, 모유두 등으로 구성되어 있다. 모유두를 둘러싸는 모모 세포가, 모유두로부터 공급되는 영양이나 단백질에 의해 유도되어 분열을 반복하고, 각질화됨으로써 털을 형성한다.
모발의 발육에 문제가 생김으로써 박모·탈모증이 발생한다. 박모·탈모증에는, 장년성 탈모증, 원형 탈모증, 휴지기 탈모증 등이 있고, 가장 빈도가 많은 것이 장년성 탈모증이다. 장년성 탈모증은, 남성에 있어서, 주로 남성 호르몬의 영향에 의해 야기되는 것이며, 남성형 탈모증이라고도 불린다. 털은, 성장기, 퇴행기 및 휴지기로 이루어진 헤어 사이클을 반복하면서 새로 자란다. 남성형 탈모증은, 이 헤어 사이클 중에서도 성장기가 짧아져, 가늘고 짧은 모발의 비율이 증가함으로써 야기되는 증상이다.
현재, 장년성 탈모증의 치료로서, 외용제인 미녹시딜이나, 경구약인 피나스테리드가 주로 이용되고 있다. 이들 치료법은, 모두 유효성이나 안전성이 확인되어 있으나, 반드시 모든 장년성 탈모증에 유효한 것은 아니다.
그 외에, 장년성 탈모증의 치료로서, 자가 식모술이 실시되고 있다. 자가 식모술이란, 측두부나 후두부에서 채취한 모근을 포함하는 모발을, 자기의 탈모부에 이식하는 수술 방식이다. 그러나, 상기 수술 방식은, 자기의 모발을 다른 장소로 옮겨 심는 수술 방식이기 때문에, 모발의 총 수를 늘리는 것이 아니다.
최근, 다양한 질환에 대한 재생 의료 기술이 개발되고 있고, 모발 재생 분야에 있어서도 새로운 기술이 개발되고 있다. 신규의 모발 재생 기술을 개발하기 위해서는, 발모 효과를 정확히 평가하기 위한 평가계의 확립이 중요하며, 다양한 연구 그룹이, 모포를 갖는 재구성 피부를 개발하고 있다(예컨대, 특허문헌 1 및 비특허문헌 1, 2 등).
비특허문헌 1: Ehama R., et al., Hair follicle regeneration using grafted rodent and human cells. J Invest Dermatol. 2007 Sep; 127(9): 2106-2115. Epub 2007 Apr 12.
비특허문헌 2: Lee LF., et al., A simplified procedure to reconstitute hair-producing skin. Tissue Eng. Part C Methods. 2011 Apr; 17(4): 391-400
모발 재생의 분야에 있어서 모포 유래의 세포를 이용한 치료법이 개발되고 있으나, 개발된 치료법의 효과를 정확히 평가하기 위해서는, 장기간 그 구조를 유지할 수 있는, 인간 모포를 포함하는 재구성된 인간 피부에 의한 평가계의 확립이 중요하다. 그러나, 현재까지는, 안정적으로 입수 가능한 재료를 이용함으로써, 재현성 좋게, 인간 모포를 포함하는 재구성된 인간 피부를 제공하는 것은 아직 곤란한 상황에 있다.
따라서, 본 발명은 안정적으로 입수 가능한 재료를 이용함으로써, 재현성 좋게, 인간 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하기 위한 조성물 및 그 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하기 위한 조성물이 적용된 모포를 갖는 인간 피부 조직 모델 동물 및 그 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들이 예의 연구를 행한 결과, 스페로이드 형성을 거친 비태아 유래의 인간 모유두의 세포군을 조성물 중에 포함시킴으로써, 안정적이고 또한 재현성 좋게, 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성시킬 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.
[1] 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하기 위한 조성물로서,
인간 표피 세포와;
인간 진피 세포
를 포함하고,
여기서 상기 인간 진피 세포가, 스페로이드 형성을 거친 비태아 유래의 인간 모유두 세포의 세포군을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
[2] 상기 비태아 유래의 인간 모유두 세포가, Wnt 시그널 활성화제로 자극된 비태아 유래의 인간 모유두 세포인, [1]에 기재된 조성물.
[3] 상기 Wnt 시그널 활성화제가, Wnt 리간드 패밀리 단백질 또는 Wnt 아고니스트인, [2]에 기재된 조성물.
[4] 상기 Wnt 리간드 패밀리 단백질이, Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는, [3]에 기재된 조성물.
[5] 상기 Wnt 아고니스트가, CHIR99021 또는 BIO인, [3]에 기재된 조성물.
[6] 상기 인간 진피 세포가, 인간 섬유아세포를 포함하는, [1]∼[5] 중 어느 1항에 기재된 조성물.
[7] 비인간 포유 동물에, [1]∼[6] 중 어느 1항에 기재된 조성물이 적용된, 모포를 갖는 인간 피부 조직 모델 동물.
[8] 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하기 위한 조성물을 제조하는 방법으로서,
(1) 비태아 유래의 인간 모유두 세포를 포함하는 스페로이드를 조제하는 공정,
(2) 상기 스페로이드와, 인간 표피 세포와, 인간 진피 세포를 혼합하여 배양하는 공정
을 포함하는 방법.
[9] 상기 공정 (1)이, Wnt 시그널 활성화제의 존재하에서 실시되는, [8]에 기재된 방법.
[10] 상기 Wnt 시그널 활성화제가, Wnt 리간드 패밀리 단백질 또는 Wnt 아고니스트인, [9]에 기재된 방법.
[11] 상기 Wnt 리간드 패밀리 단백질이, Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는, [10]에 기재된 방법.
[12] 상기 Wnt 아고니스트가, CHIR99021 또는 BIO인, [10]에 기재된 방법.
[13] 상기 공정 (1)이, 행잉 드롭법에 의해 실시되는, [8]∼[12] 중 어느 1항에 기재된 방법.
[14] 상기 비태아 유래의 인간 모유두 세포가, 성인 유래의 인간 모유두 세포인, [8]∼[13] 중 어느 1항에 기재된 방법.
[15] 상기 인간 진피 세포가, 인간 섬유아세포를 포함하는, [8]∼[14] 중 어느 1항에 기재된 방법.
[16] 상기 인간 표피 세포가, 세포외 매트릭스 단백질 또는 그 유도체로 자극된 상기 인간 표피 세포인, [8]∼[15] 중 어느 1항에 기재된 방법.
[17] 상기 세포외 매트릭스 단백질이, 라미닌 또는 그 프래그먼트를 포함하는, [16]에 기재된 방법.
[18] 상기 공정 (2)는, 다공막을 구비하는 배양 기재(基材) 위에서 배양하는 공정인, [8]∼[17] 중 어느 1항에 기재된 방법.
[19] [8]∼[18] 중 어느 1항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 조성물을, 비인간 포유류 동물에 적용하는 공정
을 포함하는, 모포를 갖는 인간 피부 조직 모델 동물의 제조 방법.
[20] [8]∼[18] 중 어느 1항에 기재된 방법에 의해 얻어지는, 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하기 위한 조성물.
[21] [19]의 방법에 의해 얻어지는, 모포를 갖는 인간 피부 조직 모델 동물.
본 발명에 의하면, 안정적이고 또한 재현성 좋게, 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성시키는 것이 가능한 조성물 및 그 제조 방법을 제공하는 것이 가능해진다. 또한, 상기 조성물이 적용된 모포를 갖는 인간 피부 조직 모델 동물 및 그 제조 방법을 제공하는 것이 가능해진다. 본 발명에 의해 제공되는 평가계는, 개발 중인 약제, 재생 의료 기술, 또는 미용 기술의 효과, 특히 발모 효과를, 재현성 좋게 평가하는 것을 가능하게 한다.
도 1은 일 실시양태에 있어서의 본 발명의 조성물을 적용함으로써 얻어진 SCID 마우스의 피부를 나타내는 사진이다. (A) 재구성한 피부의 외관 사진. (B) (A)의 발모 부분의 확대도.
도 2는 일 실시양태에 있어서의 본 발명의 조성물을 적용함으로써 얻어진 SCID 마우스의 피부의 조직 해석 결과를 도시한다. (A) H&E 염색한, 재구성한 피부의 조직 절편. (B) (A)의 점선 부분의 확대도. 다수의 모포가 재구성 피부에 포함되어 있는 것이 나타나 있다.
도 3은 일 실시양태에 있어서의 본 발명의 조성물을 적용함으로써 얻어진 SCID 마우스의 피부의 조직 해석 결과를 도시한다. (A) 인간 Alu 서열 특이적 프로브를 이용한 계내 하이브리다이제이션에 의해 염색한, 재구성한 피부의 조직 절편의 염색상. (B) 재구성 피부와 호스트 조직의 경계 부분에 있어서의 계내 하이브리다이제이션에 의한 염색상. 재구성 피부는 인간 세포를 포함하는 것이 나타나 있고, 인간 재구성 피부인 것을 알 수 있다.
도 4는 일 실시양태에 있어서의 본 발명의 조성물을 적용함으로써 얻어진 SCID 마우스의 피부의 조직 해석 결과를 도시한다. (A) 인간 Alu 서열 특이적 프로브를 이용한 계내 하이브리다이제이션에 의해 염색한, 재구성한 피부의 조직 절편의 염색상. (B) 모간을 특이적으로 인식하는 항체 AE13에 의해 염색한, 재구성한 피부의 조직 절편의 염색상. 털 및 모포는 인간 세포를 포함하는 것이 나타나 있고, 인간 모포인 것을 알 수 있다.
도 5는 Wnt 아고니스트(CHIR99021)로 자극한 모유두(DP) 스페로이드를 도시한다. (A) 적색 형광 색소 PKH-26으로 표지(標識)한 모유두(DP) 스페로이드(좌측: 미분 간섭상, 우측: 형광상). (B) 재구성한 피부의 조직 절편의 형광상. 좌측 열: 적색 형광상(DP 스페로이드 유래), 우측 열: 항(抗)Pan-keratin 항체(녹색) 및 DAPI(청색)로부터의 형광상. 상단 및 하단은 각각 동일한 조직 절편의 상을 도시한다. 재구성 피부에 형성된 모포는 Wnt 아고니스트(CHIR99021)로 자극한 모유두(DP) 스페로이드에서 유래하는 것을 알 수 있다. 이에 의해, 재구성 피부에 있어서의 인간 모포의 형성에 Wnt 아고니스트(CHIR99021)로 자극한 모유두(DP) 스페로이드가 불가결한 것을 알 수 있다.
도 2는 일 실시양태에 있어서의 본 발명의 조성물을 적용함으로써 얻어진 SCID 마우스의 피부의 조직 해석 결과를 도시한다. (A) H&E 염색한, 재구성한 피부의 조직 절편. (B) (A)의 점선 부분의 확대도. 다수의 모포가 재구성 피부에 포함되어 있는 것이 나타나 있다.
도 3은 일 실시양태에 있어서의 본 발명의 조성물을 적용함으로써 얻어진 SCID 마우스의 피부의 조직 해석 결과를 도시한다. (A) 인간 Alu 서열 특이적 프로브를 이용한 계내 하이브리다이제이션에 의해 염색한, 재구성한 피부의 조직 절편의 염색상. (B) 재구성 피부와 호스트 조직의 경계 부분에 있어서의 계내 하이브리다이제이션에 의한 염색상. 재구성 피부는 인간 세포를 포함하는 것이 나타나 있고, 인간 재구성 피부인 것을 알 수 있다.
도 4는 일 실시양태에 있어서의 본 발명의 조성물을 적용함으로써 얻어진 SCID 마우스의 피부의 조직 해석 결과를 도시한다. (A) 인간 Alu 서열 특이적 프로브를 이용한 계내 하이브리다이제이션에 의해 염색한, 재구성한 피부의 조직 절편의 염색상. (B) 모간을 특이적으로 인식하는 항체 AE13에 의해 염색한, 재구성한 피부의 조직 절편의 염색상. 털 및 모포는 인간 세포를 포함하는 것이 나타나 있고, 인간 모포인 것을 알 수 있다.
도 5는 Wnt 아고니스트(CHIR99021)로 자극한 모유두(DP) 스페로이드를 도시한다. (A) 적색 형광 색소 PKH-26으로 표지(標識)한 모유두(DP) 스페로이드(좌측: 미분 간섭상, 우측: 형광상). (B) 재구성한 피부의 조직 절편의 형광상. 좌측 열: 적색 형광상(DP 스페로이드 유래), 우측 열: 항(抗)Pan-keratin 항체(녹색) 및 DAPI(청색)로부터의 형광상. 상단 및 하단은 각각 동일한 조직 절편의 상을 도시한다. 재구성 피부에 형성된 모포는 Wnt 아고니스트(CHIR99021)로 자극한 모유두(DP) 스페로이드에서 유래하는 것을 알 수 있다. 이에 의해, 재구성 피부에 있어서의 인간 모포의 형성에 Wnt 아고니스트(CHIR99021)로 자극한 모유두(DP) 스페로이드가 불가결한 것을 알 수 있다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태에 대해 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 하기의 형태에만 한정되지 않는다. 또한, 이하의 본 발명을 실시하기 위한 형태에 대해 설명된 내용은, 특별히 한정되지 않는 한, 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하기 위한 조성물 및 그 제조 방법, 및 모포를 갖는 인간 피부 조직 모델 동물 및 그 제조 방법에 있어서, 상호 적용된다.
1. 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하기 위한 조성물
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하기 위한 조성물은,
인간 표피 세포와;
인간 진피 세포를 포함하고,
여기서 상기 인간 진피 세포가, 스페로이드 형성을 거친 비태아 유래의 인간 모유두 세포의 세포군을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.
본 명세서에 있어서 「모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하는 조성물」이란, 피부에 적용된 경우, 그 부위에 있어서, 모포의 구조를 갖는 인간 피부 모양의 조직을 재구성시키는 능력을 갖는 조성물을 말한다.
「모포(Hair Follicle: HF)」란, 일반적으로, 상피계 세포인 모모(모모 세포), 내모근초, 외모근초나, 간엽계 세포인 진피 모근초, 모유두 등을 포함하는, 털을 둘러싸는 조직층을 말한다. 본 발명의 조성물을 적용함으로써, 이러한 인간 모포를 갖는 인간 피부 모양의 조직을, 적용 부위에 있어서 재구성할 수 있다. 또한, 재구성된 모포로부터 발모한다.
본 발명에 있어서, 「표피 세포」란, 표피를 구성하는 세포이며, 분화 단계가 상이한 세포(주로 케라티노사이트)를 포함하고 있다. 생체에 있어서, 표피는, 분화 단계가 상이한 표피 세포가 층형으로 겹쳐져 형성되어 있다. 표피의 최심부는 기저층이라고 불리며, 원기둥형의 세포가 1층을 형성하고 있다. 표피 세포는 분화 단계가 진행됨에 따라 편평한 형상으로 변화하면서 외층으로 이동한다. 기저층은 진피와의 경계면에 위치하고, 그 상층에는 유극층이 존재한다. 유극층으로부터 분화 단계가 진행된 표피 세포는, 케라토히알린 과립, 라멜라 과립을 갖는 과립층을 형성한다. 과립층은, 생체 조직에 있어서는 2∼3층 정도로 구성되어 있다. 과립층으로부터 더욱 분화 단계가 진행되면, 세포핵이 소실되어, 각질층을 형성한다. 표피는, 표피 세포 외에도, 멜라닌 세포, 랑게르한스 세포, 메르켈 세포 등이 포함되어 있다. 본 발명의 조성물은, 표피 세포 외에, 표피에 포함되는 그 외의 세포가 포함되어 있어도 좋다.
일 실시양태에 있어서, 본 발명의 조성물에 포함되는 표피 세포는, 인간 유래의 표피 세포이다. 인간 표피 세포는, 시판되어 있는 인간 표피 세포여도 좋고, 생체 조직을 잘게 썰어, 콜라게나아제, 트립신 등의 단백질 분해 효소로 처리되어 얻어진 초대 인간 표피 세포여도 좋으며, 얻어진 초대 인간 표피 세포를 계대하여 증식시킨 섬유아세포여도 좋다. 일 실시양태에 있어서, 본 발명의 조성물에 포함되는 표피 세포는, 인간 태아, 신생아(예컨대, 0세∼2세), 미성년(예컨대, 3세∼17세), 또는 성인(예컨대, 18세 이상, 20세 이상, 25세 이상, 30세 이상, 35세 이상, 40세 이상) 유래 등이어도 좋다. 또한, 일 실시양태에 있어서, 본 발명의 조성물에 포함되는 표피 세포는, 다능성 줄기 세포 또는 조직 줄기 세포로부터 분화된 표피 세포여도 좋다. 다능성 줄기 세포는, iPS 세포, ES 세포 또는 Muse 세포 등이어도 좋고, 이들의 다능성 줄기 세포로부터, 공지된 방법에 의해 분화 유도함으로써 얻어지는 표피 세포를 이용해도 좋다.
일 실시양태에 있어서, 본 발명의 조성물에 포함되는 표피 세포는, 세포외 매트릭스 단백질 또는 그 유도체로 자극된 표피 세포이다. 세포외 매트릭스 단백질로서는, 예컨대, 라미닌, 니도겐, 테나신, 트롬보스폰딘, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 콜라겐, 엘라스틴 등을 들 수 있다. 표피 세포를 자극하기 위한 세포외 매트릭스 단백질은, 천연형의 세포외 매트릭스 단백질이어도 좋고, 이들의 유도체(재조합체)여도 좋다. 또한, 표피 세포를 자극하는 기능을 갖는, 세포외 매트릭스 단백질의 프래그먼트여도 좋다. 세포외 매트릭스 단백질로 자극된 표피 세포가 본 발명의 조성물 중에 포함됨으로써, 상기 조성물은 인간 모포를 갖는 인간 피부 모양의 조직을 재구성하는 능력이 보다 높아져, 바람직하다.
일 실시양태에 있어서, 표피 세포를 자극하기 위한 세포외 매트릭스 단백질은, 라미닌 또는 그 프래그먼트를 포함한다. 라미닌은, α쇄(LAMA1, LAMA2, LAMA3, LAMA4, LAMA5), β쇄(LAMB1, LAMB2, LAMB3, LAMB4), γ쇄(LAMC1, LAMC2, LAMC3)의 조합에 의해 구성되는 단백질이며, 현재까지는 17종류(라미닌 1∼15 및 라미닌 212/222 및 라미닌 522)의 조합이 알려져 있다. 예컨대, α쇄, β쇄 및 γ쇄의 조합이, LAMA5, LAMB1 및 LAMC1인 라미닌은, 「라미닌 511」이라고 일컬어진다. 라미닌 511은, 별명 라미닌 10이라고도 불린다. 일 실시양태에 있어서, 표피 세포를 자극하기 위한 세포외 매트릭스 단백질은, 라미닌의 프래그먼트여도 좋고, 예컨대, 라미닌 511-E8 단편(斷片)을 이용할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「진피 세포」란, 피부에 있어서, 표피와 피하 조직 사이에 존재하는 진피에 포함되는 세포이며, 주로 섬유아세포가 포함된다. 진피는, 섬유아세포 외에, 콜라겐, 탄성 섬유(엘라스틴), 세포외 매트릭스, 히알루론산 등에 의해 구성되어 있다.
일 실시양태에 있어서, 본 발명의 조성물에 포함되는 진피 세포는, 인간 유래의 진피 세포이다. 인간 진피 세포는, 시판되어 있는 인간 진피 세포여도 좋고, 생체 조직을 잘게 썰어, 콜라게나아제, 트립신 등의 단백질 분해 효소로 처리되어 얻어진 초대 인간 진피 세포여도 좋으며, 얻어진 초대 인간 진피 세포를 계대하여 증식시킨 진피 세포여도 좋다. 일 실시양태에 있어서, 본 발명의 조성물에 포함되는 진피 세포는, 인간 태아, 신생아(예컨대, 0세∼2세), 미성년(예컨대, 3세∼17세), 또는 성인(예컨대, 18세 이상, 20세 이상, 25세 이상, 30세 이상, 35세 이상, 40세 이상) 유래 등이어도 좋다. 또한, 일 실시양태에 있어서, 본 발명의 조성물에 포함되는 진피 세포는, 다능성 줄기 세포 또는 조직 줄기 세포로부터 분화된 표피 세포여도 좋다. 다능성 줄기 세포는, iPS 세포, ES 세포 또는 Muse 세포 등이어도 좋고, 이들의 다능성 줄기 세포로부터, 공지된 방법에 의해 분화 유도함으로써 얻어지는 진피 세포를 이용해도 좋다.
털의 피부 내부 최심부의 불룩해진 부분을 모구부(hair bulb)라고 하고, 모구부의 중앙부에 있는 간엽계 세포를 포함하는 부분을 모유두(dermal papilla: DP)라고 한다. 또한, 모유두를 구성하는 세포를 「모유두 세포」라고 한다. 모유두에는 모세 혈관이나 신경이 들어가 있어, 음식물로부터의 영양이나 산소를 받아들여, 털의 발생이나 성장을 담당하고 있다. 모유두에 접한 곳에 모모 세포(hair matrix cell)가 있고, 털은 이 부위에서 생성된다. 모모 세포는, 모유두에 들어가 있는 모세 혈관으로부터 영양이나 산소를 받아들이고, 분열을 반복함으로써 털을 형성한다.
일 실시양태에 있어서, 본 발명의 조성물에 포함되는 모유두 세포는, 인간 유래의 모유두 세포이다. 일 실시양태에 있어서, 인간 모유두 세포는, 인간 모포(바람직하게는 인간 두피 모포)를 단리(單離)하고, 단리된 인간 모포로부터 모유두 영역의 조직을 또한 단리하여, 배양함으로써 증식시킬 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 두피를 5 ㎜ 정도의 직사각형 형상으로 잘라, 인산 완충 생리 식염수(PBS) 등으로 세정한 후, 필요에 따라 단백질 분해 효소 등을 이용하여 또는 외과적으로 처리하여, 표피층 및 진피층을 제거하여, 피하 지방층만으로 하고, 계속해서 모포를 물리적 수단, 예컨대 핀셋 등으로 단리한다. 모포로부터 모구부를 잘라내고, 이 모구부 하부로부터 모유두를 노출시켜 모유두(세포)를 단리할 수 있다.
모유두 세포의 배양은, 동물 세포의 배양에 이용되는 시판되는 영양 배지를 그대로, 또는 개성(改性)한 것으로 배양(초대 배양 및 계대 배양)할 수 있다. 모유두 세포의 배양에 사용할 수 있는 대표적인 배지로서는, 소 태아 혈청을 포함하는 둘베코 변성 이글 배지, 창 배지(Chang's medium), MesenPRO 배지(Thermo fisher사) 등을 들 수 있다. 배지에는, 또한 필요에 따라 세포 증식 인자, 호르몬이나 그 외의 미량 영양소를 첨가할 수 있다. 이들의 구체적인 것으로서는, 트랜스페린, 인슐린, 트리요오도티로닌, 글루카곤, 하이드로코르티손, 테스토스테론, 에스트라디올, 프로게스테론, 셀레늄 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 인간 모유두 세포는, 비태아 유래의 인간 모유두 세포이며, 예컨대, 미성년(예컨대, 3세∼17세), 또는 성인(예컨대, 18세 이상) 유래의 모유두 세포이다. 본 발명에 의하면, 종래에서는 곤란했던 비태아 유래의 인간 모유두 세포를 이용해도, 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성시킬 수 있게 된다.
다른 실시양태에 있어서, 본 발명의 조성물에 포함되는 모유두 세포는, 다능성 줄기 세포 또는 조직 줄기 세포로부터 분화된 모유두 세포여도 좋다. 다능성 줄기 세포는, iPS 세포, ES 세포 또는 Muse 세포 등이어도 좋고, 이들의 다능성 줄기 세포로부터, 분화 유도함으로써 얻어지는 모유두 세포를 이용해도 좋다.
일 실시양태에 있어서, 본 발명의 조성물은, 스페로이드 형성을 거친 비태아 유래의 인간 모유두 세포의 세포군을 포함하고 있다. 본 명세서에 있어서, 「스페로이드」란, 세포끼리 집합 또는 응집한 구(球)형의 세포 집합체를 말한다. 스페로이드를 형성하는 방법으로서는, 예컨대, 세포 접착성이 낮은 표면을 갖는 U바닥의 웰 중에 세포를 부유시킨 상태에서 스페로이드를 형성시키는 방법, 소정의 요철 구조면 상에 세포를 접착시킨 상태에서 스페로이드를 형성시키는 방법, 행잉 드롭법, 배지를 포함하는 세포 배양 챔버를 회전시키면서 대량의 세포를 배양함으로써 스페로이드를 제작하는 방법 등이 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 인간 모유두 세포의 세포군은, 바람직하게는, 행잉 드롭법에 의해 형성된 스페로이드이다. 스페로이드 형성을 거친 비태아 유래의 인간 모유두 세포의 세포군이 조성물에 포함됨으로써, 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하는 효율이 상승한다.
스페로이드 형성한 인간 모유두 세포의 세포군 1개당 포함되는 인간 모유두 세포의 수는, 예컨대 1×10개∼1×105개여도 좋고, 바람직하게는 1×102개∼1×104개, 보다 바람직하게는 1×102개∼5×103개이다. 또한, 스페로이드 형성한 인간 모유두 세포의 세포군의 평균 직경은, 20 ㎛∼1000 ㎛, 바람직하게는, 50 ㎛∼300 ㎛, 보다 바람직하게는 70 ㎛∼200 ㎛이다.
일 실시양태에 있어서, 본 발명의 조성물에 포함되는 비태아 유래의 인간 모유두 세포는, Wnt 시그널 활성화제로 자극된 비태아 유래의 인간 모유두 세포이다. Wnt 시그널이란, β-카테닌의 핵 이행을 재촉하여, 전사 인자로서의 기능을 발휘하는 일련의 작용을 말한다. 본 시그널은 세포간 상호작용에 기인하여, 예컨대, 어느 세포로부터 분비된 Wnt3A라고 하는 단백이 또 다른 세포에 작용하여, 세포 내의 β-카테닌이 핵 이행하여, 전사 인자로서 작용하는 일련의 흐름이 포함된다. 일련의 흐름은 상피 간엽 상호작용을 예로 하는 기관 구축의 최초의 현상을 일으킨다. Wnt 시그널은 β-카테닌 경로, PCP 경로, Ca2+ 경로의 3가지 경로를 활성화함으로써, 세포의 증식이나 분화, 기관 형성이나 초기 발생 시의 세포 운동 등 각종 세포 기능을 제어하는 것으로 알려져 있다. Wnt 시그널이 갖는 그 미분화 상태 유지 기능에 의해, 분화를 억제할 목적으로 ES 세포의 배양 시에 이용되고 있다(예컨대, Noburo Sato et al., Nature Medicine Vol.10, No.1, Jan. 2004). Wnt 시그널 활성화제로 자극된 비태아 유래의 인간 모유두 세포가 본 발명의 조성물에 포함됨으로써, 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하는 효율이 상승한다.
Wnt 시그널 활성화제는, Wnt 리간드 패밀리 단백질 또는 Wnt 아고니스트여도 좋다. Wnt 리간드 패밀리 단백질로서는, 예컨대 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16 등을 들 수 있고, 이들의 Wnt 리간드 패밀리 단백질을 조합하여 이용해도 좋다.
Wnt 아고니스트로서는, 예컨대 글리코겐신타아제키나아제-3(GSK-3) 저해제, R-스폰딘 1∼4, 노린(Norrin) 등을 들 수 있다. GSK-3 저해제로서는, 예컨대, CHIR99021, 비스-인돌로(인디루빈) 화합물(BIO)((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심), 그 아세톡심 유사체 BIO-아세톡심(2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-아세톡심), 티아디아졸리딘(TDZD) 유사체(4-벤질-2-메틸-1,2,4-티아디아졸리딘-3,5-디온), 옥소티아디아졸리딘-3-티온 유사체(2,4-디벤질-5-옥소티아디아졸리딘-3-티온), 티에닐 α-클로로메틸케톤 화합물(2-클로로-1-(4,4-디브로모-티오펜-2-일)-에타논), 페닐 α브로모메틸케톤 화합물(α-4-디브로모아세토페논), 티아졸 함유 요소 화합물(N-(4-메톡시벤질)-N'-(5-니트로-1,3-티아졸-2-일)우레아)이나 GSK-3β 펩티드 저해제, 예컨대 H-KEAPPAPPQSpP-NH2 등을 들 수 있다.
Wnt 시그널 활성화제의 첨가량은 특별히 제한되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 결정될 수 있다. 예컨대, Wnt 시그널 활성화제로서 CHIR99021을 모유두 세포에 사용하는 경우, 그 양은 예컨대 0.1 μM∼10 μM 정도로 자극할 수 있으나, 그러한 양에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은, 상기한 세포 외에, 예컨대, 생체 적합 가능한 물질을 포함해도 좋다. 생체 적합 가능한 물질이란, 예컨대, 물, 생리 식염수, 인산 완충액, 세포 배양 배지, 생체 적합성 하이드로겔(키토산겔, 콜라겐겔, 젤라틴, 펩티드겔, 라미닌겔 및 피브린겔 등) 등이어도 좋고, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은, 바람직하게는, 다공막을 구비하는 배양 기재 위에서 조정된다. 다공막을 구비하는 배양 기재는, 예컨대, 셀 컬쳐 인서트를 이용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제조 방법은, 후술한다.
본 발명의 조성물을, 인간이나 비인간 포유 동물에 적용함으로써, 적용된 부위에 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구축시킬 수 있다.
2. 모포를 갖는 인간 피부 조직 모델 동물
일 실시양태에 있어서, 본 발명의 조성물은, 비인간 포유 동물에 적용된다. 이에 의해, 모포를 갖는 인간 피부 조직 모델 동물이 얻어진다. 비인간 포유 동물로서는, 예컨대, 래트, 마우스, 모르모트, 마모셋, 토끼, 개, 고양이, 양, 돼지, 염소, 원숭이, 침팬지 혹은 이들의 면역계가 억제된 비인간 포유류 동물 등을 들 수 있으나, 바람직하게는 면역계가 억제된 비인간 포유류 동물이다. 발명의 모포를 갖는 인간 피부 조직 모델 동물의 제조 방법은, 후술한다.
본 발명의 모포를 갖는 인간 피부 조직 모델 동물에, 발모 또는 육모 효과가 기대되는 후보 물질을 적용하여, 예컨대, 모포로부터의 발모 상태나, 모포 조직의 상태, 발모에 관련되는 마커 등을 관찰함으로써, 후보 물질의 발모 또는 육모 효과를 평가할 수 있다. 후보 인자로서는, 예컨대, 저분자 화합물, 펩티드, 핵산, 단백질, 포유 동물(예컨대, 마우스, 래트, 돼지, 소, 양, 원숭이, 인간 등)의 세포, 조직 추출물 또는 세포 배양 상청, 식물 유래의 화합물 또는 추출물(예컨대, 생약 엑기스, 생약 유래의 화합물), 및 미생물 유래의 화합물 혹은 추출물 또는 배양 산물 등이어도 좋다. 또한, 예컨대, 본 발명의 조성물에 포함되는 인간 모유두 세포의 도너나, 배양 조건 등의 차이에 따라, 형성되는 모포 및/또는 모포로부터의 발모에 주는 영향을 평가하는 것이어도 좋다.
3. 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하기 위한 조성물을 제조하는 방법, 및 그에 의해 얻어지는 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하기 위한 조성물
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하기 위한 조성물을 제조하는 방법은,
(1) 비태아 유래의 인간 모유두 세포를 포함하는 스페로이드를 조제하는 공정,
(2) 상기 스페로이드와, 인간 표피 세포와, 인간 진피 세포를 혼합하여 배양하는 공정
을 포함하고 있다.
본 발명의 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 비태아 유래의 인간 모유두 세포를 포함하는 스페로이드를 조제하는 공정은, 예컨대, 세포 접착성이 낮은 표면을 갖는 U바닥의 웰 중에 세포를 부유시킨 상태에서 스페로이드를 형성시키는 방법, 소정의 요철 구조면 상에 세포를 접착시킨 상태에서 스페로이드를 형성시키는 방법, 행잉 드롭법, 배지를 포함하는 세포 배양 챔버를 회전시키면서 대량의 세포를 배양함으로써 스페로이드를 제작하는 방법 등이 적용 가능하지만, 바람직하게는, 행잉 드롭법이다.
행잉 드롭법이란, 세포를 포함하는 배양액의 액적을 배양 접시의 덮개의 천장측에 점착시키거나, 혹은 특수한 배양 기구(예컨대, Elplasia MPc(쿠라레사, 일본))에 의해 액적을 제작하고, 표면 장력에 의해 배양액 내의 세포를 액적의 상태로 배양하는 방법이다. 이와 같이 배양함으로써, 세포는 배양 기재 표면과의 접촉에 의해 받는 영향을 최소한으로 할 수 있다.
비태아 유래의 인간 모유두 세포를 포함하는 스페로이드와, 인간 표피 세포와, 인간 진피 세포는, 목적에 따라, 각각의 세포수(또는 스페로이드의 수)를 조정할 수 있으나, 예컨대, 스페로이드:인간 표피 세포:인간 진피 세포가, 10∼10000:0.1×106∼100×106:0.1×106∼100×106, 바람직하게는 20∼3000:1×106∼10×106:1×106∼10×106, 보다 바람직하게는 50∼1000:3×106∼6×106:3×106∼6×106으로 혼합하여 배양해도 좋다.
일 실시양태에 있어서, 상기 공정 (1)은, Wnt 시그널 활성화제의 존재하에서 실시된다. Wnt 시그널 활성화제에 의해 활성화한 인간 모유두 세포는, 모포의 재구성이 보다 촉진된다. Wnt 시그널 활성화제로 인간 모유두 세포를 처리하는 시간은, 6시간∼120시간, 바람직하게는 12시간∼108시간, 보다 바람직하게는 24시간∼96시간, 더욱 바람직하게는 36시간∼84시간이다.
일 실시양태에 있어서, 본 발명의 방법에 이용되는 인간 표피 세포가, 세포외 매트릭스 단백질 또는 그 유도체로 자극된 인간 표피 세포이다. 인간 표피 세포를 자극하는 방법으로서는, 예컨대, 세포외 매트릭스 단백질 또는 그 유도체를 첨가한 배지에서 배양하는 방법이나, 세포외 매트릭스 단백질 또는 그 유도체를 코팅한 배양 기재 위에서 배양하는 방법 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 세포외 매트릭스 단백질 또는 그 유도체를 코팅한 배양 기재 위에서 배양하는 방법이다. 코팅하는 방법은, 공지된 방법에 따르면 되고, 특별히 한정되지 않는다. 세포외 매트릭스 단백질 또는 그 유도체로 자극된 인간 표피 세포를 이용함으로써, 모포의 재구성이 보다 촉진된다.
일 실시양태에 있어서, 본 발명의 방법에 포함되는 공정 (2)는, 다공막을 구비하는 배양 기재 위에서 배양하는 공정이다. 다공막을 구비하는 배양 기재는, 예컨대, 시판되는 셀 컬쳐 인서트를 이용할 수 있다. 다공막의 평균 구멍 직경은, 적절히 선택할 수 있고, 예컨대, 약 0.01 ㎛∼약 100 ㎛, 바람직하게는 0.05 ㎛∼50 ㎛, 보다 바람직하게는 0.1 ㎛∼25 ㎛, 가장 바람직하게는 1 ㎛∼10 ㎛이다.
일 실시양태에 있어서, 공정 (2)는, 상기 스페로이드와, 인간 표피 세포와, 인간 진피 세포를 혼합한 현탁액을, 다공막을 구비하는 배양 기재 위에 적용하여, 소정 시간(예컨대, 배지 등의 액체 성분이 배출되는 시간, 예컨대 0.5시간∼3시간), 배양한다. 이에 의해, 배양 기재 상에 시트형의 조성물이 형성된다.
일 실시양태에 있어서, 상기한 방법을 실시함으로써, 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하기 위한 조성물을 얻을 수 있다.
4. 모포를 갖는 인간 피부 조직 모델 동물의 제조 방법
본 발명은 모포를 갖는 인간 피부 조직 모델 동물의 제조 방법을 제공한다. 일 실시양태에 있어서, 모포를 갖는 인간 피부 조직 모델 동물은, 상기한 조성물을, 비인간 포유류 동물에 적용하는 공정을 포함하는 방법에 의해 제조된다.
일 실시양태에 있어서, 본 발명의 조성물을 비인간 포유류 동물에 적용하는 공정은, 예컨대, 비인간 포유류 동물의 임의의 부위(예컨대 등부)의 피부를 임의의 크기로 절개하고, 절개된 부위에 조성물을 이식함으로써 실시할 수 있다. 절개 부위의 크기는, 적용되는 조성물의 크기 및 형태(현탁액 형태, 또는 시트 형태 등) 등에 따라, 적절히 설정할 수 있기 때문에, 특별히 한정되지 않는다. 또한, 절개 부위의 깊이는, 적용되는 비인간 포유류 동물의 피부의 두께에 의존하기 때문에 한정되지 않는다. 절개에 의해 피부가 제거된 부위에, 본 발명의 조성물을 적용하고, 절개 부위 주변의 피부와 함께 봉합함으로써, 조성물을 이식할 수 있다. 조성물을 적용한 후에, 임의의 드레싱재 등에 의해 적용 부위를 보호하여, 물리적으로 조성물이 탈락하는 것을 방지한다.
실시예
이하에, 본 발명을 실시예에 기초하여 더욱 상세히 설명하지만, 이들은 본 발명을 조금도 한정하는 것이 아니다.
<실시예 1: 재구성 피부의 제작>
(1) 세포의 준비
모유두 세포는 인간 모포(20∼65세, 남성)로부터 메스와 핀셋을 이용하여, 모유두 영역을 단리한 후, 배양 디시에 정치(靜置)하고, MesenPRO 배지(Thermo fisher사)에 의해 배양을 행하여, 모유두 세포를 얻었다. 인간 섬유아세포 및 표피 세포는 이와이 가가쿠 야쿠힌으로부터 시판되는 세포를 구입하여 준비하였다.
(2) 세포의 조정
단리한 인간 모유두 세포에 대해 CHIR99021(Axon Medchem사) 3 μM을 첨가하여 배양을 행한 후, Elplasia MPc(쿠라레사, 일본)를 이용한 행잉 드롭법에 의해 스페로이드를 형성시켰다.
인간 표피 세포는 iMatrix-511(닛피사)로 코팅한 배양 플라스크 상에서, Epilife 배지(Thermo fisher사)에 의해 배양을 행하였다.
인간 섬유아세포는 DMEM 배지와 F12 배지를 3:1로 혼합하고, 5% FBS 및 40 ng/ml bFGF(PeproTech사), 20 ng/ml EGF(PeproTech사), B27(등록 상표) 서플리먼트(Thermo Fisher Scientific K.K.)를 포함하는 배지에서 배양하였다.
(3) 재구성 피부의 형성
인간 섬유아세포 300만∼600만개, 인간 표피 세포 300만∼600만개, 인간 모유두 스페로이드 100∼1000개를 포함하는 혼합물을 시판되는 셀 컬쳐 인서트(코닝사)에 정치하고, 용액이 배출되어, 세포만이 잔존할 때까지 37℃ 인큐베이터에서 단시간 배양하여, 이식물을 조정하였다.
(4) 이식물의 이식
마취하의 SCID 개체(찰스 리버사)의 등부 피부를 약 1∼2 ㎝×약 1∼2 ㎝의 크기로 절개하고, 조정한 이식물을 절개 부위에 적용하며, 그것을 주위의 피부와 봉합하였다. 그 후, 드레싱재 및 붕대에 의해 이식부를 보호하였다. 약 10일 후, 드레싱재를 제거하고, 약 2∼3개월 후에, 재구성 피부의 유무를 확인하며, 카메라 부착 실체 현미경으로 사진 촬영을 행하였다. 그 결과, 이식편의 이식 부위에 발모를 보였다(도 1).
<실시예 2: 재구성 피부의 조직 해석>
재구성 피부를 적출하여, 4% 파라포름알데히드 용액으로 하룻밤 고정한 후, 파라핀 포매 조직 블록을 작성하였다. 마이크로톰으로 4 ㎛의 두께의 조직 절편을 작성한 후, 각종 조직 염색을 실시하였다. 친수 처리를 실시한 조직 절편을, 일반적인 수법으로 H.&E. 염색하고, AxioScan(zeiss사)으로 사진 촬영하였다(도 2).
또한, 재구성된 모포를 포함하는 조직이, 인간 세포로 구성되는 조직인지를 확인하기 위해서, 인간 게놈 특이적 반복 서열(Alu 서열)을 프로브로 한 계내 하이브리다이제이션(이하 ISH)을 일반적인 수법에 의해 실시하고, 마찬가지로 사진 촬영을 실시하였다(도 3).
또한 모간을 특이적으로 인식하는 항체 AE13(Abcam사)의 면역 염색과 Alu-ISH의 이중 염색을 실시하였다(도 4). 면역 염색 및 ISH의 기본 수기는 「포스트 게놈 연구 시대의 면역 염색/계내 하이브리다이제이션」(요도사)을 참고로 하여 실시하였다.
그 결과, 모포를 포함하는, 재구성된 피부 조직이, 이식한 인간 세포 유래인 것이 확인되었다. 또한, 모간이 형성되어 있는 것도 확인할 수 있었다.
<실시예 3: 형광 표지한 모유두 스페로이드의 추적 실험>
CHIR99021 3 uM 존재하에서 배양한 모유두 세포를 적색 형광 색소 PKH-26(시그마 알드리치사)으로, 부속의 프로토콜에 따라 표지하였다(도 5). 표지한 모유두 스페로이드를 포함하는 재구성 피부를 제작한 결과, 모포 형성의 기초가 되는 모유두 부위에 적색의 형광이 보여졌다. 이것으로부터, 재구성 피부에서 보여진 모포는 모유두 스페로이드에 의해 유도 형성된 것이라고 결론지어졌다(도 5).
<실시예 4: 스페로이드화한 모유두 세포의 유무, 및 CHIR99021 자극의 유무에 의한, 모포를 갖는 인간 피부 조직의 재구성의 능력의 확인>
스페로이드화한 모유두 세포의 유무, 및 CHIR99021 자극의 유무의 조건 이외에는, 실시예 1에 기재한 방법에 따라, SCID 마우스에 모포를 갖는 인간 피부 조직의 재구성을 시도하였다. 결과를 이하에 나타낸다.
Claims (21)
- 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하기 위한 조성물로서,
인간 표피 세포와;
인간 진피 세포
를 포함하고,
여기서 상기 인간 진피 세포가, 스페로이드 형성을 거친 비태아 유래의 인간 모유두 세포의 세포군을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 비태아 유래의 인간 모유두 세포가, Wnt 시그널 활성화제로 자극된 비태아 유래의 인간 모유두 세포인 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 Wnt 시그널 활성화제가, Wnt 리간드 패밀리 단백질 또는 Wnt 아고니스트인 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 Wnt 리간드 패밀리 단백질이, Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 Wnt 아고니스트가, CHIR99021 또는 BIO인 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 진피 세포가, 인간 섬유아세포를 포함하는 조성물.
- 비인간 포유 동물에, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 조성물이 적용된, 모포를 갖는 인간 피부 조직 모델 동물.
- 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하기 위한 조성물을 제조하는 방법으로서,
(1) 비태아 유래의 인간 모유두 세포를 포함하는 스페로이드를 조제하는 공정,
(2) 상기 스페로이드와, 인간 표피 세포와, 인간 진피 세포를 혼합하여 배양하는 공정
을 포함하는 방법. - 제8항에 있어서, 상기 공정 (1)이, Wnt 시그널 활성화제의 존재하에서 실시되는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 Wnt 시그널 활성화제가, Wnt 리간드 패밀리 단백질 또는 Wnt 아고니스트인 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 Wnt 리간드 패밀리 단백질이, Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 Wnt 아고니스트가, CHIR99021 또는 BIO인 방법.
- 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공정 (1)이, 행잉 드롭법에 의해 실시되는 방법.
- 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비태아 유래의 인간 모유두 세포가, 성인 유래의 인간 모유두 세포인 방법.
- 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 진피 세포가, 인간 섬유아세포를 포함하는 방법.
- 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 표피 세포가, 세포외 매트릭스 단백질 또는 그 유도체로 자극된 상기 인간 표피 세포인 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 세포외 매트릭스 단백질이, 라미닌 또는 그 프래그먼트를 포함하는 방법.
- 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공정 (2)는, 다공막을 구비하는 배양 기재(基材) 위에서 배양하는 공정인 방법.
- 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 조성물을, 비인간 포유류 동물에 적용하는 공정
을 포함하는, 모포를 갖는 인간 피부 조직 모델 동물의 제조 방법. - 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는, 모포를 갖는 인간 피부 조직을 재구성하기 위한 조성물.
- 제19항에 기재된 방법에 의해 얻어지는, 모포를 갖는 인간 피부 조직 모델 동물.
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