CN109045354A - 一种用于骨-软骨综合修复的原位成型可注射水凝胶 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于骨‑软骨综合修复的原位成型可注射水凝胶。它是以γ‑聚谷氨酸(γ‑PGA)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为主要原料，在4‑二甲氨基吡啶(DMAP)的催化作用下生成甲基丙烯酰化γ‑聚谷氨酸(mPGA)，然后将mPGA和四臂聚乙二醇巯基(4 arm PEG SH)混合均匀后原位成型即可得到用于骨‑软骨综合修复的水凝胶。本发明的原位成型可注射水凝胶具有良好的可注射性、体内成型性、生物相容性和可降解性，在骨和软骨不规则病损修复领域具有较大的应用潜力。

Description

一种用于骨-软骨综合修复的原位成型可注射水凝胶
技术领域
本发明属于生物医用高分子材料领域和有机化学的交叉领域，更具体地，涉及一种用于骨-软骨综合修复的原位成型可注射水凝胶。
背景技术
骨和软骨组织缺损是一种常见于骨外伤、骨结核和骨肿瘤的继发性损害，具有发病率高、病程长、并发症多等特点。通常，小范围骨和软骨组织缺损机体可以代偿性修复，大体积病损可以采用自体骨移植、异体骨移植和人造骨组织工程支架移植等方法进行结构和功能重建。自体骨移植是国际公认的骨修复金标准，在整合修复受损组织方面效果显著。但是自体骨移植可提供的骨移植物十分有限，且不可避免的对患者造成二次伤害。近年来，基于生物医用高分子的新型骨组织修复支架材料取得了较大的发展。高分子水凝胶是一类由物理或化学交联方式形成的具有三维网络结构的聚合物体系。高分子水凝胶具有与机体组织细胞外基质相似的三维网络结构，且生物相容性和生物活性良好，对骨和软骨组织再生具有潜在的促进作用。
骨科医生对接诊病人进行影像学检查时常发现骨和软骨组织缺损形态极不规则，常规骨移植物在形态、大小、塑型等方面均难以满足手术填补的需求。可注射水凝胶在解决上述问题方面具有极大的优势。可注射水凝胶前驱体溶液为非牛顿流体，在注射入骨和软骨组织缺损区域后能快速固化成型，实现缺损区域无死角填充。目前，可注射水凝胶的制备原理主要包括光引发、麦克尔加成反应和点击反应等。
γ-聚谷氨酸是由芽孢杆菌发酵制备的一种高分子聚合物。张超等证实γ-聚谷氨酸对软骨细胞无明显的细胞毒性，可用于修复骨和软骨组织缺损。聚乙二醇是一种人工合成的高分子材料，具有良好的成凝胶性能。现有技术中以γ-聚谷氨酸和聚乙二醇为主要原料制备水凝胶材料时需引入一定量的化学交联剂如戊二醛、环氧氯丙烷、京尼平、乙二醇二缩水甘油酯等，反应后残余的交联剂对机体具有潜在的毒性效应，难以满足可注射水凝胶材料生物相容性的一般要求。对γ-聚谷氨酸和聚乙二醇进行化学改性，得到甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸和四臂聚乙二醇巯基，有望解决上述问题，获得一种新型可注射骨修复水凝胶材料。
目前还未见到有关制备基于甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸和四臂聚乙二醇巯基的原位成型可注射骨修复水凝胶材料的报道。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种用于骨-软骨综合修复的原位成型可注射水凝胶，通过以γ-聚谷氨酸和甲基丙烯酸缩水甘油酯为主要原料制备得到甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸，然后与四臂聚乙二醇巯基按照一定的比例溶于缓冲液中，得到可注射水凝胶前驱体溶液；该前驱体溶液可进一步原位固化成型得到用于骨-软骨综合修复的水凝胶。本发明的原位成型可注射水凝胶具有良好的可注射性、体内成型性、生物相容性和可降解性，在骨和软骨不规则病损修复领域具有较大的应用潜力。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种用于骨或软骨修复的原位成型可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-PGA)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解于pH为7.0～9.0的缓冲液中，搅拌条件下使之交联得到交联溶液；
(2)将所述步骤(1)得到的交联溶液转移到透析袋中，采用去离子水透析去除分子量不满足预先设定要求的小分子物质，然后采用离心去除未溶杂质，取出上清液经冷冻干燥后得到甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸(mPGA)；
(3)将所述步骤(2)得到的所述甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸(mPGA)溶解于pH为7.0～9.0的缓冲液中，并向其中加入四臂聚乙二醇巯基(4arm PEG SH)，混匀后得到可注射水凝胶前驱体溶液，该前驱体溶液用于经原位成型得到用于骨或软骨修复的水凝胶。
优选的，所述制备方法还包括步骤：
(4)将所述步骤(3)得到的所述前驱体溶液快速注入模具或待修复的目标区域内，所述前驱体溶液经原位固化成型即可得到具有目标形状的骨或软骨修复水凝胶材料。
优选的，所述步骤(1)得到的交联溶液对应的γ-PGA的含量为20～40g/L，GMA的含量为20～50g/L,DMAP的含量为5.0～8.0×10-5g/L；所述步骤(1)所采用的所述pH为7.0～9.0的缓冲液优选为pH为8.0的磷酸盐缓冲液。
优选的，所述步骤(1)中，所述交联是在4～40℃、且避光条件下进行的，搅拌速率为800～1500rpm,交联时间为36～48h。
优选的，所述步骤(2)中，所述透析袋的截留分子量为3500，透析时间为48～72h。
优选的，所述步骤(2)中，所述离心的转速为3000～12000rpm,离心时间为10～30min。
优选的，所述步骤(3)得到的水凝胶前驱体溶液中，甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸的质量分数为7～9.5％,四臂聚乙二醇巯基的质量分数为0.5～3％；所述步骤(3)所采用的所述pH为7.0～9.0的缓冲液优选为pH为8.0的磷酸盐缓冲液。
优选的，所述步骤(4)中，所述原位固化成型是在4～40℃环境下反应15～30min。
按照本发明的另一方面，本发明提供了利用上述制备方法制备得到的用于骨或软骨修复的可注射水凝胶前驱体溶液或原位成型可注射水凝胶。
按照本发明的又一方面，本发明提供了一种用于形成用于修复骨或软骨的水凝胶的前驱体，其特征在于，该前驱体包括第一组分、第二组分和第三组分，其中，所述第一组分为甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸(mPGA)，所述第二组分为四臂聚乙二醇巯基(4arm PEG SH)，所述第三组分为pH为7.0～9.0的缓冲液，所述第一组分用于与所述第二组分均匀混合分散于所述第三组分中经原位成型得到用于骨或软骨修复的水凝胶。
优选的，所述甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸(mPGA)是先将γ-聚谷氨酸(γ-PGA)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解于pH为7.0～9.0的缓冲液中，搅拌条件下使之交联得到交联溶液，接着再将交联溶液转移到透析袋中，采用去离子水透析去除分子量不满足预先设定要求的小分子物质，然后采用离心去除未溶杂质，取出上清液经冷冻干燥后得到的。
优选的，所述第一组分、所述第二组分与所述第三组分三者的质量之比为(7～9.5)：(0.5～3)：(87.5～92.5)，所述第三组分优选为pH为8.0的磷酸盐缓冲液。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，以γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为主要原料，在4-二甲氨基吡啶(DMAP)的催化作用下生成甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸(mPGA)，然后将mPGA和四臂聚乙二醇巯基(4arm PEG SH)优选按照一定的比例混匀后原位成型即可得到用于骨-软骨综合修复的水凝胶。本发明给出的水凝胶前驱溶液制备方法，得到的水凝胶前驱溶液可通过原位成型得到可用于骨-软骨综合修复的原位成型可注射水凝胶，例如可将制得的前驱体溶液注射到骨缺损区域原位成型后用于促进愈合，相较于传统水凝胶移植材料，具有可注射性这一大优势，非常适用于实际应用；当然，除了用于骨-软骨综合修复外，基于该水凝胶前驱溶液制备方法，进一步原位成型得到的水凝胶也可用于单一的骨修复或单一的软骨修复。
本发明通过选用γ-聚谷氨酸和甲基丙烯酸缩水甘油酯为主要原料制备得到甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸，其中4-二甲氨基吡啶为催化剂具有较高的催化活性，pH为7.0～9.0的缓冲液(尤其是pH＝8.0的磷酸盐缓冲液)为此开环加成反应提供适宜的pH环境。此反应具有反应条件温和(例如可在室温下避光即可反应)，取代度高等优点。本发明采用甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸和四臂聚乙二醇巯基制备得到可注射水凝胶前驱体溶液。甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸已采用透析和高速离心等工艺去除甲基丙烯酸缩水甘油酯、4-二甲氨基吡啶等小分子单体物质和其他难溶杂质，极大程度的降低了前驱体溶液的生物毒性。与聚乙二醇相比，四臂聚乙二醇巯基每条支链末端均含有一个巯基，增加反应位点的数目有利于提高交联密度，进而改善水凝胶的力学性能。甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸分子上的碳碳双键与四臂聚乙二醇巯基上的巯基发生麦克尔加成反应，此反应可在生理条件(37℃，pH＝7.35～7.45)下进行，且反应速率适中，可为体内注射等手术操作预留充足的时间。所获得的骨修复水凝胶材料具有较好的可注射性、体内成型性、生物相容性和可降解性，有望应用于修复骨和软骨组织缺损。
本发明所获得的用于骨-软骨综合修复的原位成型可注射水凝胶中，通过调节甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸和四臂聚乙二醇巯基的含量可得到不同的成凝胶时间和力学性能。本发明得到的用于形成用于修复骨或软骨的水凝胶的前驱体中，第一组分甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸(mPGA)与第二组分四臂聚乙二醇巯基(4arm PEG SH)两者的质量比优选控制为(7～9.5)：(0.5～3)，确保两者同时混合在第三组分(pH为7.0～9.0的缓冲液，尤其是pH＝8.0的磷酸盐缓冲液)后能够在较短时间内得到的用于修复骨或软骨的水凝胶，并且得到的水凝胶具有良好的力学性能；该前驱体包含的三种组分可仅在使用时才混合均匀，即当该前驱体需要形成用于修复骨或软骨的水凝胶时，第一组分才与第二组分均匀混合并分散于第三组分中形成前驱体溶液。
核磁共振氢谱实验表明，本发明用于骨-软骨综合修复的原位成型可注射水凝胶中甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸的取代度为7.2％。
流变实验表明，本发明用于骨-软骨综合修复的原位成型可注射水凝胶的成凝胶时间为750～1000s。
大鼠体内埋植实验表明，本发明用于骨-软骨综合修复的原位成型可注射水凝胶具有良好的生物相容性和可降解性，不会引起明显的炎症反应。
总体来说，本发明具有如下优点和有益效果：(1)选取γ-聚谷氨酸和甲基丙烯酸缩水甘油酯之间的开环反应制备得到甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸，通过对反应条件进行优化，如加入催化剂4-二甲氨基吡啶，调整溶液pH至8.0等，提高了开环反应的速率和取代度；(2)选取甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸和四臂聚乙二醇巯基之间的麦克尔加成反应制备得到可注射水凝胶，该加成反应具有反应条件温和、反应速率适中、无需添加催化剂和引发剂，生物毒性低等优点；(3)所获得的原位成型可注射骨修复水凝胶材料具有良好的可注射性、体内成型性、生物相容性和可降解性，非常有潜力应用于骨和软骨组织缺损修复领域。
附图说明
图1是实施例1所获得的甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸核磁共振氢谱实验的结果。
图2是实施例1所获得的可注射水凝胶前驱体溶液流变实验的结果。
图3中的(a)、(b)均是实施例1所获得的用于骨-软骨综合修复的原位成型可注射水凝胶材料大鼠体内注射实验的结果。
图4是实施例1所获得的用于骨-软骨综合修复的原位成型可注射水凝胶材料应用于家兔骨和软骨组织缺损综合修复的示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
向100mL pH＝8.0的磷酸盐缓冲液中依次加入3.0gγ-聚谷氨酸、75mg4-二甲氨基吡啶和3.3g甲基丙烯酸缩水甘油酯,室温避光条件下1000rpm搅拌36h使之交联。将溶液转移到截留分子量为3500的透析袋中，采用去离子水透析48h(分子量小于3500的物质均可被去除)，然后使用离心机5000rpm离心10min。取出上清液经冷冻干燥后得到甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸。将甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸和四臂聚乙二醇巯基分别溶解于pH＝8.0的磷酸盐缓冲液中得到质量分数为10％的甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸溶液和10％的四臂聚乙二醇巯基溶液。将上述溶液按照质量比1:4、1:7、1:10和1:13的比例(甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸：四臂聚乙二醇巯基)混合均匀得到可注射水凝胶前驱体溶液。将前驱体溶液快速注入机体内，前驱体溶液原位固化成型即可得到用于骨-软骨综合修复的水凝胶。
实施例2
将实施例1所获得的甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸冷冻干燥后研磨成粉末，采用核磁共振氢谱实验检测材料取代度。将5mg粉末溶解在600μL氘代氯仿试剂中，采用400MHZ核磁共振仪检测其氢谱。
图1是实施例1所获得的甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸核磁共振氢谱实验的结果，如图所见，当GMA接枝到γ-PGA侧链α位羧基之后，4.32ppm(H,-CH-)谱峰出现裂分；δ6.17ppm处和δ5.76ppm出现碳碳双键质子(2H,CH2＝)的特征谱峰，说明接枝成功，取代度为7.2％。
实施例3
将实施例1所获得的可注射水凝胶前驱体溶液滴加到流变仪的载物台上，采用振荡模式检测前驱体溶液的流变学行为。检测温度为37℃，振荡频率为1HZ，测试间距为100μm。
图2是实施例1所获得的可注射水凝胶前驱体溶液流变实验的结果。如图所见，在37℃条件下，IBRH1:4，IBRH1:7，IBRH1；10和IBRH1:13的相转变时间依次为960s，870s，860s，780s。
实施例4
将实施例1所获得的可注射水凝胶前驱体溶液注射入大鼠背部皮下组织，注射量为500mL/只。常规饲养实验动物，一周后将大鼠安乐死。解剖大鼠的皮下组织，肉眼观察注射部位有无局灶性炎症反应。
图3是实施例1所获得的可注射水凝胶前驱体溶液体内注射实验的结果。如图3中的(a)所示，将前驱体溶液注射入大鼠皮下组织后立即形成明显的皮丘，该皮丘在30分钟内体积无明显缩小，表明前驱体溶液在大鼠体内固化成为水凝胶。水凝胶生物相容性实验的结果如图3中的(b)所示，水凝胶在体内埋植一周后皮下结缔组织在水凝胶表面增生形成了一个薄层组织囊腔，周围组织未观察到明显的红肿等局灶性炎性症状。上述现象表明本发明原位成型可注射水凝胶具有良好的生物相容性，有望应用于骨-软骨综合修复
图4是实施例1所获得的用于骨-软骨综合修复的原位成型可注射水凝胶应用于家兔骨和软骨综合修复的示意图。首先打开家兔膝关节腔并充分暴露股骨末端，在股骨头表面钻出直径4mm，高度3mm的骨和软骨组织缺损区域。将可注射水凝胶前驱体溶液注射到缺损组织表面，待其原位固化成型后即可手术缝合。如图所见，将可注射水凝胶前驱体溶液注入骨和软骨组织缺损区域，前驱体溶液在缺损区域原位成型后可充分的填充缺损组织。
上述实施例1中所采用的pH＝8.0的磷酸盐缓冲液还可以用其他pH为7.0～9.0的缓冲液代替，当然pH＝8.0的磷酸盐缓冲液具有例如接枝反应产率高等更优效果。除了室温外，交联反应还可以在满足4～40℃的其他温度下进行；原位固化成型反应除了可以在机体体温温度条件下进行外，也可以在满足4～40℃的其他温度(如室温)下进行。原位固化成型反应除了直接在机体中进行外，出于实验等其他目的，还可以在模具等其他目标区域内固化成型，
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于骨或软骨修复的原位成型可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-PGA)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解于pH为7.0～9.0的缓冲液中，搅拌条件下使之交联得到交联溶液；
(2)将所述步骤(1)得到的交联溶液转移到透析袋中，采用去离子水透析去除分子量不满足预先设定要求的小分子物质，然后采用离心去除未溶杂质，取出上清液经冷冻干燥后得到甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸(mPGA)；
(3)将所述步骤(2)得到的所述甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸(mPGA)溶解于pH为7.0～9.0的缓冲液中，并向其中加入四臂聚乙二醇巯基(4arm PEG SH)，混匀后得到可注射水凝胶前驱体溶液，该前驱体溶液用于经原位成型得到用于骨或软骨修复的水凝胶。
2.如权利要求1所述用于骨或软骨修复的原位成型可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括步骤：
(4)将所述步骤(3)得到的所述前驱体溶液快速注入模具或待修复的目标区域内，所述前驱体溶液经原位固化成型即可得到具有目标形状的骨或软骨修复水凝胶材料。
3.如权利要求1所述用于骨或软骨修复的原位成型可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)得到的交联溶液对应的γ-PGA的含量为20～40g/L，GMA的含量为20～50g/L,DMAP的含量为5.0～8.0×10-5g/L；所述步骤(1)所采用的所述pH为7.0～9.0的缓冲液优选为pH为8.0的磷酸盐缓冲液。
4.如权利要求1所述用于骨或软骨修复的原位成型可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述交联是在4～40℃、且避光条件下进行的，搅拌速率为800～1500rpm,交联时间为36～48h。
5.如权利要求1所述用于骨或软骨修复的原位成型可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述透析袋的截留分子量为3500，透析时间为48～72h。
6.如权利要求1所述用于骨或软骨修复的原位成型可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述离心的转速为3000～12000rpm,离心时间为10～30min。
7.如权利要求1－6任意一项所述用于骨或软骨修复的原位成型可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)得到的水凝胶前驱体溶液中，甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸的质量分数为7～9.5％,四臂聚乙二醇巯基的质量分数为0.5～3％；所述步骤(3)所采用的所述pH为7.0～9.0的缓冲液优选为pH为8.0的磷酸盐缓冲液。
8.如权利要求1－7任意一项所述用于骨或软骨修复的原位成型可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述原位固化成型是在4～40℃环境下反应15～30min。
9.利用如权利要求1－8任意一项所述制备方法制备得到的用于骨或软骨修复的可注射水凝胶前驱体溶液或原位成型可注射水凝胶。
10.一种用于形成用于修复骨或软骨的水凝胶的前驱体，其特征在于，该前驱体包括第一组分、第二组分和第三组分，其中，所述第一组分为甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸(mPGA)，所述第二组分为四臂聚乙二醇巯基(4arm PEG SH)，所述第三组分为pH为7.0～9.0的缓冲液，所述第一组分用于与所述第二组分均匀混合分散于所述第三组分中经原位成型得到用于骨或软骨修复的水凝胶；
优选的，所述甲基丙烯酰化γ-聚谷氨酸(mPGA)是先将γ-聚谷氨酸(γ-PGA)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解于pH为7.0～9.0的缓冲液中，搅拌条件下使之交联得到交联溶液，接着再将交联溶液转移到透析袋中，采用去离子水透析去除分子量不满足预先设定要求的小分子物质，然后采用离心去除未溶杂质，取出上清液经冷冻干燥后得到的；
优选的，所述第一组分、所述第二组分与所述第三组分三者的质量之比为(7～9.5)：(0.5～3)：(87.5～92.5)，所述第三组分优选为pH为8.0的磷酸盐缓冲液。
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