CN103732264A - 原位凝胶形成组合物 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了快速凝胶化的可喷射透明质酸基组合物、试剂盒、相关方法、前体制剂及其用途。

Description

原位凝胶形成组合物
相关申请案的交叉引用
本申请要求2011年4月20日提交的美国临时专利申请No.61/477,563的优先权益，其内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开通常涉及原位凝胶形成组合物、相关试剂盒及除其它外，制备和使用此类组合物的方法。通常在适合在混合几秒至一小时内形成凝胶的条件下，通过混合乙烯基砜官能化透明质酸、巯基官能化聚乙二醇和缓冲液制备原位凝胶形成组合物。所得生物相容性组合物可用作，例如供局部递送生物活性剂的生物医学粘合剂和封闭剂，除其它外，用作填充剂和填料。
发明背景
透明质酸是在整个结缔组织、上皮组织和神经组织广泛分布的自然发生、阴离子、非硫酸化糖胺聚糖。平均70kg(154lbs)的人在他/她的体内大致具有15克透明质酸，每天其中三分之一转变(降解和合成)(Stern R.Eur JCell Biol83(7):317–25,(2004))。因为透明质酸天然存在于身体的许多组织中并且因此生物相容，所以被认为非常适合生物医学应用。不幸的是，当呈其自然发生形式施用和用作治疗剂时，透明质酸通常从体内快速清除，使得必须频繁施用。因此，保持了未改变的透明质酸的益处，例如良好的生物相容性，但是克服了快速清除问题的透明质酸制剂非常可取。此类制剂应理想地具有良好的细胞相容性、有益的化学、流变学和其它性质，并且易于施用。
先前已经描述了经改性形式的透明质酸。例如，在国际专利公布No.WO2011/014432中描述了具有低程度取代的透明质酸及其轻微交联产物。本文描述的水凝胶和组合物具有非常低的促炎性，连同几种其它有利特征，但是不倾向于经历快速凝胶化。
快速凝胶化是原位形成凝胶的一般特征。原位形成水凝胶是在形成并应用至治疗部位后为液体，但是之后经历相变形成水凝胶的组合物。由于易于施用和在凝胶化时间方面的多功能性、粘着性好等，生物可降解的可注射原位形成凝胶代表同样提供的水凝胶的有吸引力的替代物。
因此，形成具有国际专利公布No.WO2011/014432中描述的水凝胶的优点，但是增加了具有呈原位形成凝胶形式的非常可取的益处的组合物将非常有利。
发明概述
本文提供了制备有效原位形成水凝胶的液体水凝胶前体组合物的材料。反应性前体材料足够温和，以致可在原位，例如与组织直接接触，在可能另外对凝胶形成部位的组织有害的条件或反应物不存在的情况下，进行液体到固体的相变。所得水凝胶具有良好的机械强度并且可制备成具有不同凝胶化时间。
在第一个总体方面，本文提供了包含在混合并对治疗部位应用后导致水凝胶原位形成的组分的试剂盒。
一般地，所述试剂盒包含(i)第一容器，其包含浓度为约10-300mg/mL的乙烯基砜衍生化透明质酸(“HA-VS”)的水溶液，其中所述VS-HS的约2%-70%的羟基经乙烯基砜取代，(ii)第二容器，其包含具有2至8个巯基的巯基官能化聚乙二醇，和(iii)第三容器，其包含pH范围约7-12的30-1000mM缓冲溶液以提供具有2-8%(w/v)的HA-VS浓度和2-8%(w/v)的巯基官能化聚乙二醇浓度的溶液，其中所述组分，当合并时，在混合几秒(例如5秒)至1小时内有效形成凝胶。
另一方面，本文提供了由以下的组合形成的液体组合物：(i)浓度为约10-300mg/mL的乙烯基砜衍生化透明质酸(“HA-VS”)的水溶液，其中所述VS-HS的约2%-70%的羟基经乙烯基砜取代，(ii)具有2至8个巯基的巯基官能化聚乙二醇，和(iii)pH范围约7-12的30-1000mM缓冲溶液，其中所述液体组合物中所述巯基官能化聚乙二醇的浓度范围约4-300mg/mL或10-300mg/mL，在混合几秒(例如5秒)至约1小时内有效形成凝胶。
又一方面，本文提供了一种形成能够原位形成凝胶的液体组合物的方法。所述方法包括：(i)将具有2至8个巯基，优选呈粉末形式的巯基官能化聚乙二醇添加到浓度为约10-300mg/mL的乙烯基砜衍生化透明质酸(“HA-VS”)的水溶液中，其中所述HA-VS的约2%-70%的羟基经乙烯基砜取代，从而溶解所述巯基官能化聚乙二醇以形成含乙烯基砜衍生化透明质酸-巯基官能化聚乙二醇的溶液，以及(ii)合并来自步骤(i)的所述溶液与pH范围约7-12的30-1000mM缓冲溶液，从而形成具有2-8%(w/v)的HA-VS浓度和2-8%(w/v)的巯基官能化聚乙二醇浓度的液体组合物，其中所述液体组合物在合并几秒至约1小时内有效形成凝胶。
再一方面，本文提供了一种形成能够原位形成凝胶的液体组合物的替代方法。所述方法包括：(i)将一小部分，优选呈粉末形式的巯基官能化聚乙二醇，例如约0.1重量%至约4重量%(重量/重量t巯基官能化PEG比HA-VS)添加到浓度为约10-300mg/mL的乙烯基砜衍生化透明质酸(“HA-VS”)的水溶液中，其中所述VS-HS的约2%-70%的羟基经乙烯基砜取代，从而形成溶液，(ii)任选为来自步骤(i)的所述溶液灭菌，(iii)向来自步骤(i)或步骤(ii)(若已进行)的所述溶液添加剩余量的优选呈粉末形式的巯基官能化聚乙二醇，其中所述巯基官能化聚乙二醇具有2至8个巯基，并且所述巯基官能化聚乙二醇任选无菌，从而溶解剩余量的巯基官能化聚乙二醇粉末以形成含乙烯基砜衍生化透明质酸-巯基官能化聚乙二醇的溶液，并且(iv)混合所述含乙烯基砜衍生化透明质酸-巯基官能化聚乙二醇的溶液与pH范围约7-12的30-1000mM缓冲溶液，从而形成具有2-8%(w/v)的HA-VS浓度和2-8%(w/v)的巯基官能化聚乙二醇浓度的液体组合物，从而形成在混合约几秒至约1小时内有效形成凝胶的液体组合物。
在上述方面和相关实施方案中，所述乙烯基砜衍生化透明质酸(“HA-VS”)的水溶液、所述巯基官能化聚乙二醇或所述缓冲溶液中任一种或多种可无菌。
本文还提供了由所述试剂盒、所述液体组合物和上述方法产生的原位形成的水凝胶、对治疗部位的应用方法、使用方法等。
从以下描述、实施例和权利要求将显而易见所述组合物、方法、试剂盒、用途等另外的实施方案。正如从前面和以下的描述中可以认识到，本文描述的每个特征和两个或更多个此类特征的每种组合包括在本公开的范围之内，条件是包括在此类组合中的特征并不相互矛盾。另外，可明确地将任何特征或特征的组合排除在本发明的任何实施方案之外。在以下描述中，特别是当结合所附实施例和图考虑时，提出了本发明另外的方面和优点。
附图简述
图1示出了在碱存在下透明质酸与二乙烯基砜形成乙烯基砜衍生化透明质酸(HA-VS)的反应。
图2是如实施例1(于D2O中)所述制备的乙烯基砜改性的透明质酸(HA-VS)的1H NMR图谱。基于NMR，确定透明质酸每个二糖具有约11%的乙烯基砜取代水平。
图3展示了如实施例5所述，用于测定破裂压力的破裂压力装置。
发明详述
现将在下文中更全面地描述本发明。然而，本发明可具体化为许多不同形式并且不得视为限于本文提出的实施方案；更确切地，提供这些实施方案是为使本公开全面且完整，并且将本发明的范围完全传达给本领域的技术人员。
除非另外指出，本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是前面还是以下的，均通过引用据此整体并入。在通过引用并入本文的出版物、专利或专利申请和本公开中均定义了相同术语的情况下，本公开中的定义代表控制性定义。对于参考其对特定类型的化合物、化学性质等的描述的出版物、专利和专利申请而言，属于此类化合物、化学性质等的部分是通过引用并入本文的文件的部分。
定义
必须指出的是，除非上下文另有明确规定，如本说明书中所使用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个指示物。因此，例如，提到一种“聚合物”包括单一聚合物以及两种或更多种相同或不同的聚合物。
除非另外特别注明，本文术语的定义是有机合成领域及聚合物和药物科学中使用的标准定义。
在描述和要求本发明时，将依照下述定义使用以下术语。
“生物相容性聚合物”是具有与活组织相容的降解产物，或可具有有益生物学性质的聚合物。生物相容性聚合物可本身生物相容，和/或可当连同生物活性剂使用时协同生物相容。
术语“透明质酸”意思是指未经改性或非衍生化的透明质酸。
术语“透明质酸衍生物”或“衍生化透明质酸”或“经改性的透明质酸”或“经取代的透明质酸”指已经通过与(例如)一个或多个小化学部分例如二乙烯基砜等的反应衍生化的透明质酸。
术语“反应性”指官能团(例如，存在于聚合物中)容易或以有机合成常规条件下的实用速率反应。这与不反应或为了反应需要强催化剂或不切实际的反应条件的那些基团(即，“不反应”或“惰性”基团)相反。
如本文所使用，在水溶性聚合物例如透明质酸的情况下，“分子质量”或“分子量”指通过多角度光散射测定的聚合物的标称平均分子质量。分子量可表示为数均分子量或重均分子量。除非另外指出，本文提到分子量全部指数均分子量。在分子量值不存在时，也可用其本征或固有粘度表征聚合物，这是测量分子量的粘度测定法。
术语“水凝胶”指含水的三维亲水聚合物网络或凝胶，其中水为连续相，例如其中水含量大于50%(w/w)。
如本文所使用，术语“喷雾”指雾化的组合物。
用“凝胶化”意指材料形成凝胶状态。
“无菌”组合物是使用USP无菌试验测定，没有活微生物的组合物。见“The United States Pharmacopeia”，第30次修订本，The United StatesPharmacopeial Convention:2008。
如本文所使用，术语“海绵体”指多孔水凝胶结构。
短语“可溶于水溶液”指组合物或化合物能够在室温下以至少0.1mg/mL的浓度溶解于含水缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水中。
如可交换使用的术语“药物”或“药物活性剂”或“生物活性剂”或“活性剂”指具有生物活性并且适合或用于治疗目的的任何有机或无机化合物或物质。在“药物”更广泛的定义下包括了蛋白质、激素、抗癌剂、小分子化学化合物和模拟物、寡核苷酸、DNA、RNA和基因疗法。如本文所使用，本文提到药物以及提到其它化学化合物，意在包括呈其任何药学上可接受的形式的化合物，包括异构体(例如非对映异构体和对映异构体)、盐、溶剂化物和多晶型，特别是结晶形式，以及在适用的情况下，本文所述化合物的外消旋混合物和纯异构体。
“水不溶性药物”或“水难溶性药物”是水溶性低于10mg/mL的药物。
如本文所提供，术语组合物(或水凝胶或聚合物)的“有效量”或“药学有效量”或“治疗有效量”指组合物在受试者体内提供所需反应，例如防止、减少或消除疼痛的无毒但是足够的量。所需确切量将根据受试者的种类、年龄和一般情况、治疗病状的严重程度、采用的特定药物、组合物的特性、施用方法等，因受试者而变化。任何个案中的适当“有效”量可由本领域的普通技术人员使用常规实验确定。
“任选”或“任选地”指随后描述的情况可能发生或可能不发生，所以描述包括所述情况发生的情形和不发生的情形。
关于某种特征或实体的术语“基本上”指很大程度或几乎完全(即，85%或更高的程度)关于所述特征或实体。
尤其关于给定量的术语“约”意在涵盖+或-5%的偏差。
在以下的部分中也可找到另外的定义。
概述
本发明至少部分基于发明人对原位形成凝胶的组合物的发现。本文提供的前体组合物展示出快速凝胶化以及有益的粘着性和良好的生物相容性。通过采用具有特定程度的聚合物改性、有效促进均匀溶液形成(即，溶解)和快速凝胶化的浓度以及特定pH条件的反应物，发明人提供了，除其它外，下面将更详细地描述的具有许多有益特征的方法、形成凝胶的液体前体组合物、试剂盒和所得水凝胶。
通常通过具有特定程度的乙烯基砜改性的透明质酸与巯基官能化聚乙二醇的反应形成本文所述的水凝胶。所得水凝胶在温和条件下原位形成—无需引发剂、促进剂或其它有害添加剂。现将在下面更详细地讨论组合物的特征、相关方法、用途和试剂盒等。
制备有效原位形成凝胶的前体组合物的方法
反应物/组分
经乙烯基砜改性的透明质酸
在制备本原位形成凝胶时，采用的其中一种反应物是通过与二乙烯基砜反应经改性的透明质酸。见，例如，图1，其提供了制备经乙烯基砜改性的透明质酸的总体反应方案。透明质酸(HA)是自然发生的直链多糖，其由交替β1->3葡糖醛酸键和β1->4葡糖胺键连接的N-乙酰基-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸的交替二糖单元构成，所以重复单元为(1->4)-β-D-GlcA-(1->3)-β-D-GlcNAc。用于制备一种或多种原位形成水凝胶的组合物的透明质酸经乙烯基砜衍生化。见，例如，实施例1、2和3，其分别描述了具有不同取代水平11%、14%和20%的经乙烯基砜改性的透明质酸的制备。在示例性衍生化反应中，透明质酸羟基通过在碱的存在下与二乙烯基砜反应转化为(2-(乙烯基砜基)乙氧基)基团。所得活化透明质酸为(2-(乙烯基砜基)乙氧基)透明质酸或HA-VS。为了方便起见，本文通常将材料称为经乙烯基砜改性的透明质酸或简单地“HA-VS”。为了制备这些快速凝胶化组合物，透明质酸上的乙烯基砜取代程度可从2%至70%任意不等，尽管该范围内较低的聚合物改性水平通常是优选的。示例性经乙烯基砜改性的透明质酸将具有范围从7%至约35%，或更优选从10%至25%的乙烯基砜取代水平。
2%改性或取代程度意思是，平均2%的透明质酸二糖单元含乙烯基砜基团。特别地，在优选实施方案中，透明质酸具有约10%至约25%的通过与二乙烯基砜的加成反应衍生化的羟基。透明质酸羟基转化为(2-(乙烯基砜基)乙氧基)基团。本文通常将所得活化透明质酸称为(2-(乙烯基砜基)乙氧基)透明质酸或HA-VS。具体而言，透明质酸的羟基向(2-(乙烯基砜基)乙氧基)基团的转化程度可在介于前述任两个百分比之间的范围内：例如，10%-35%(例如，11%-35%或12-35%等等)。具体而言，透明质酸的乙烯基砜取代程度可选自以下百分比：10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%和35%，连同由提供的整数的每个组合产生的范围，例如10-15%、15-20%、20-25%等等。又一更特殊的实施方案中，透明质酸的羟基向(2-(乙烯基砜基)乙氧基)基团的转化程度为每个二糖重复单元约10-25%。
可通过许多适合方法中的任一种，例如NMR、UV或IR分析或元素分析测定透明质酸的取代/改性程度。计算聚合物例如透明质酸的取代百分比的优选方法为NMR，例如质子NMR。见，例如实施例1，其中基于1H NMR图谱中相应于透明质酸的乙烯基砜和乙酰胺甲基的相对峰面积的比例测定透明质酸改性程度。
乙烯基砜衍生化透明质酸通常将具有在约10,000至约2,000,000道尔顿范围内的平均分子量。说明性分子量范围从约15,000至1,000,000道尔顿，或从约20,000至200,000道尔顿。另外的合适分子量范围包括从约30,000道尔顿至约100,000道尔顿，或从约40,000道尔顿至约80,000道尔顿。透明质酸的分子量通常为平均分子质量值，例如，可通过多角度激光散射排阻色谱法(MALLS-SEC)测定。基于其来源，透明质酸可具有高达约3，或更优选地，高达约2的多分散度(Mw/Mn)。一般地，透明质酸原材料将具有相当狭窄的分子量分布，值小于约2.5，更优选小于约2。透明质酸的示例性多分散度范围从约1.02至约2.5，其中原始透明质酸可具有约1.02、1.05、1.1、1.2、1.3、1.3、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2,0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5或甚至更高的多分散度。
可选地，用于衍生化的合适透明质酸原材料在水中与以上提供的任一个或多个平均分子量范围相对应的特定浓度下可具有通常按厘泊计的本征粘度。
具有上述特征(改性程度、分子量等)的任何组合的HA-VS适合用于本文提供的组合物、试剂盒、方法和用途中。
巯基官能化聚乙二醇(PEG)
用于形成原位凝胶的巯基官能化PEG可为直链、支链(具有两个聚合物臂)或多臂型(例如，具有3、4、5、6、7、8个或更多个从中央核心伸出的聚合物臂)。多臂型PEG的说明性核心分子包括赤藓醇、季戊四醇、三羟甲基丙烷、甘油、甘油二聚物(3,3’-氧基二丙烷-1,2-二醇)、甘油寡聚物、山梨糖醇、六聚甘油等。多臂PEG巯基化物，例如前述的具有从中央核心分子发出的聚乙二醇臂并且具有两个或更多个末端巯基。巯基官能化PEG可通过衍生化市场上可买到的PEG原材料制备或可直接从供应商，例如Pierce(Thermo Fischer Scientific)、Laysan Bio,Inc.(Arab,Alabama)、SunBio(PEG=SHOP,Korea)等购买。
巯基官能化PEG包含两个或更多个巯基。此类巯基将与(例如)乙烯基砜衍生化透明质酸中的乙烯基砜反应。说明性巯基官能化PEG包括PEG-二巯基(HS-PEG-SH或HS-CH2CH2-(OCH2CH2)nSH)、3-臂PEG-三巯基(甘油核心)、4-臂PEG-四巯基(季戊四醇核心)或8-臂PEG-八巯基(六甘油核心)。前述多臂PEG试剂也可并非所有臂都经巯基官能化。可从Laysan Bio(Arab,Alabama)和SunBio(PEG-SHOP,Korea)获得另外的具有作为中央分子的PEG的合适巯基试剂，以及芳族二巯基化物，例如可从NanoScience获得的芳族二巯基化物。优选的PEG-巯基将具有选自2、3、4、5、6、7和8的巯基数目。在聚乙二醇直链上具有2-8个经取代的下垂巯基的聚乙二醇分子也合适。
PEG巯基化物的分子量通常小于经乙烯基砜改性的透明质酸的分子量。一般地，PEG巯基化物的分子量范围从约200至约20,000道尔顿。PEG巯基交联剂另外的示例性分子量从约1,000至约10,000道尔顿(例如，具有约1kD、2kD、3kD、4kD、5kD、6kD、7kD、8kD、9kD或10kD的分子量，其中kD等于千道尔顿)或甚至从约1,000至5,000道尔顿。因此，分子量在介于前述任何分子量之间的范围内的PEG巯基化物适合用于形成当前的水凝胶。例如，PEG巯基化物的分子量可介于约500至10,000道尔顿之间，或介于约1000与10,000道尔顿之间，或介于约2,000与9,000道尔顿之间，或介于约3,000与8,0000道尔顿之间等。交联剂例如PEG二巯基或上述其它适合交联剂的示例性分子量包括约3350、3400和5000道尔顿等。
具有例如上述特征的任何组合的PEG巯基化物(结构(例如，直链或支链)、巯基的数量、分子量等)适合用于本文提供的组合物、试剂盒、方法和用途中。
生物活性剂
本文提供的水凝胶、水凝胶前体和相关组合物和/或试剂盒可任选包含生物活性剂。生物活性剂包括小分子、蛋白质、抗体、细胞、生长因子等，例如以下描述的那些。
本文提供的试剂盒、组合物和组合中可包括的生物活性剂包括抗菌剂、抗生素、镇痛剂、抗生素、抗增殖/抗有丝分裂剂，包括天然产物例如长春花生物碱(vinca alkaloid)(例如长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)和长春瑞滨(vinorelbine))、紫杉醇(paclitaxel)、表鬼臼毒素(epidipodophyllotoxin)(例如依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide))、抗生素(更生霉素(dactinomycin)(放线菌素D(actinomycin D))、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)和伊达比星(idarubicin))、蒽环霉素(anthracycline)、米托蒽醌(mitoxantrone)、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)(光神霉素(mithramycin))和丝裂霉素(mitomycin)、酶(L-天门冬酰胺酶)；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂，例如氮芥(二氯甲二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)和类似物、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil))、乙烯亚胺和甲基蜜胺(六甲蜜胺和噻替派(thiotepa))、烷基磺酸盐-白消安(busulfan)、亚硝基脲(卡莫司汀(carmustine)(BCNU)和类似物、链脲菌素(streptozocin))、三氮烯-达卡巴嗪(trazenes-dacarbazinine)(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂的抗代谢物，例如叶酸类似物(甲氨蝶呤(methotrexate))、嘧啶类似物(氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟尿苷(floxuridine)和阿糖孢苷(cytarabine))、嘌呤类似物和相关抑制剂(巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、喷司他丁(pentostatin)和2-氯脱氧腺苷[克拉屈滨(cladribine)])；铂配位络合物(顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin))、甲苄肼(procarbazine)、羟基脲、米托坦(mitotane)、氨鲁米特(aminoglutethimide)；激素(例如雌激素)；抗凝血剂(肝素、合成肝素盐和凝血酶的其它抑制剂)；纤溶剂(例如组织纤溶酶原激活物、链激酶(streptokinase)和尿激酶(urokinase))、阿斯匹林(aspirin)、潘生丁(dipyridamole)、噻氯匹定(ticlopidine)、氯吡格雷(clopidogrel)、阿昔单抗(abciximab)；抗迁移剂；抗分泌剂(例如布雷菲德菌素A(brefeldin A))；抗炎剂例如肾上腺皮质类固醇(氢化可的松(hydrocortisone)、醋酸氢化可的松(hydrocortisone acetate)、醋酸可的松(cortisone acetate)、特戊酸硫氢可的松(tixocortol pivalate)、强的松龙(prednisolone)、甲基强的松龙(methylprednisolone)、强的松(prednisone)、曲安奈德(或曲安西龙的任何其它药学上可接受的盐)、曲安西龙醇、莫米松(mometasone)、安西奈德(amcinonide)、布地奈德(budesonide)、地奈德(desonide)、醋酸氟轻松(fluocinonide)、肤轻松(fluocinolone acetonide)、氯氟松(halcinonide)、倍他米松(betamethasone)、倍他米松磷酸钠、地塞米松(dexamethasone)、地塞米松磷酸钠和氟考龙(fluocortolone)、氢化可的松-17-丁酸酯、氢化可的松-17-戊酸酯、二丙酸别氯地米松(aclometasone dipropionate)、戊酸倍他米松(betamethasone valerate)、二丙酸倍他米松(betamethasone dipropionate)、泼尼卡酯(prednicarbate)、氯倍他松-17-丁酸酯(clobetasone-17-butyrate)、氯倍他索-17-丙酸酯(clobetasol-17-propionate)、己酸氟考龙(fluocortolone caproate)、特戊酸氟考龙(fluocortolone pivalate)和醋酸氟泼尼定(fluprednidene acetate)。二丙酸倍他米松一水合物、氟尼缩松(flunisolide)、丙酸氟替卡松(fluticasonepropionate)、糠酸莫米松一水合物、曲安奈德、氟替卡松、糠酸酯、非甾族试剂(水杨酸衍生物，例如阿斯匹林)；对氨基苯酚衍生物，即对乙酰氨基酚；吲哚和茚乙酸(消炎痛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)和依托度酸(etodolac))、杂芳基乙酸(托美汀(tolmetin)、双氯芬酸(diclofenac)和酮咯酸(ketorolac))、芳基丙酸(布洛芬(ibuprofen)及衍生物)、邻氨基苯甲酸(甲灭酸(mefenamic acid)和甲氯灭酸(meclofenamic acid))、烯醇酸(吡罗昔康(piroxicam)、替诺昔康(tenoxicam)、保泰松(phenylbutazone)和羟基保泰松(oxyphenthatrazone))、萘丁美酮(nabumetone)、金化合物(金诺芬(auranofin)、金硫葡糖(aurothioglucose)、硫代苹果酸金钠(gold sodium thiomalate))；免疫抑制剂(环孢霉素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素(rapamycin))、硫唑嘌呤(azathioprine)、吗替麦考酚酯(mycophenolate mofetil))；促有丝分裂或形态发生生长因子蛋白、肽或模拟物；血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员，包括TGF-β和骨形态发生蛋白(BMP)，例如BMP-2、3、4、5、6、7、8；胰岛素和胰岛素样生长因子(IGF)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、刺猬蛋白(SHH和IHH)、激活素、抑制素、脱矿质骨(DBM)和血小板源生长因子(PDGF)、造血生长因子(G-CSF、CSF-1、GM-CSF、促红细胞生成素、细胞因子和淋巴因子，包括白细胞介素家族(IL-1至34))、干扰素、神经生长因子(NGF)、中和剂、拮抗剂或激动剂抗体、生长因子受体激动剂或拮抗剂、一氧化氮供体；反义寡核苷酸、转录因子、信号级联介体及其组合。
抗生素包括林可霉素(lincomycin)家族的抗生素(指最初从林可链霉菌(streptomyces lincolnensis)回收的一类抗生素试剂)；四环素(tetracycline)家族的抗生素(指最初从金素链霉菌(streptomyces aureofaciens)回收的一类抗生素试剂)；硫基抗生素，例如磺胺类药物等。林可霉素家族的示例性抗生素包括林可霉素本身(6,8-双脱氧-6-[[(1-甲基-4-丙基-2-吡咯烷基)-羰基]氨基-]-1-硫代-L-苏式-D-半乳-辛吡喃糖苷)、氯洁霉素(clindamycin)，林可霉素的7-脱氧、7-氯衍生物(例如，7-氯-6,7,8-三脱氧-6-[[(1-甲基-4-丙基-2-吡咯烷基)羰基]氨基]-1-硫代-L-苏式-D-半乳-辛吡喃糖苷)及其药学上可接受的盐和酯。四环素家族的示例性抗生素包括四环素本身4-(二甲氨基)-1,4,4α,5,5α,6,11,12α-八氢-3,6,12,12α-五羟基-6-甲基-1,11-二氧代-2-并四苯甲酰胺)、氯四环素(chlortetracycline)、氧四环素(oxytetracycline)、四环素、地美环素(demeclocycline)、吡甲四环素(rolitetracycline)、甲烯土霉素(methacycline)和强力霉素(doxycycline)及其药学上可接受的盐和酯，特别是酸加成盐例如盐酸盐。示例性硫基抗生素包括但不限于磺胺类药物乙酰磺胺、苯酰磺胺、磺胺嘧啶、磺胺多辛(sulfadoxine)、磺胺甲密啶(sulfamerazine)、磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine)、磺胺甲二唑(sulfamethizole)、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)及其药学上可接受的盐和酯，例如磺胺乙酰钠。抗菌剂和/或抗生素进一步包括化合物，例如红霉素(erythromycin)、杆菌肽(bacitracin)、新霉素(neomycin)、青霉素(penicillin)、多粘菌素B(polymyxin B)、四环素、紫霉素(viomycin)、氯霉素(chloromycetin)和链霉素(streptomycin)、头孢唑林(cefazolin)、氨苄青霉素(ampicillin)、氨曲南(azactam)、托普霉素(tobramycin)、氯洁霉素和庆大霉素(gentamycin)。
镇痛剂包括化合物，例如利多卡因(lidocaine)、苯坐卡因(benzocaine)和麻卡因(marcaine)。
如本文所提供的水凝胶还可以包括活细胞。示例性活细胞包括干细胞、薄壁组织干细胞、血源细胞和骨髓细胞。
另外的生物活性剂包括但不限于抑制一个或一组过程的生物活性剂，包括但不限于细胞分裂、细胞分泌、细胞迁移、细胞粘着、细胞因子、趋化因子(或其它炎性活化剂)生成和/或释放、血管发生和/或自由基形成和/或释放和/或凝血级联。具体而言，本文提供的组合物可提供(牵涉)在手术粘连的发展和/或维持中牵涉的细胞和/或非细胞过程的药理学变化。另外，本组合物可提供在再狭窄的发展和/或维持中牵涉的细胞和/或非细胞过程的药理学变化。因此，另外的生物活性剂包括但不限于抑制一个或一组过程的生物活性剂，包括但不限于细胞分裂、细胞分泌、细胞迁移、细胞粘着、细胞因子、趋化因子(或其它炎性活化剂)生成和/或释放、血管发生和/或自由基形成和/或释放。另外，用于本文的生物活性剂可抑制或影响瘢疤形成过程中牵涉的其它过程。本文提供的组合物也可有效产生增加纤维化发展的细胞和/或非细胞过程的药理学变化。因此，生物活性剂进一步包括但不限于增强一个或一组过程的生物活性剂，包括但不限于细胞分裂、细胞分泌、细胞迁移、细胞粘着、细胞因子、趋化因子(或其它炎性活化剂)生成和/或释放、血管发生和/或自由基形成和/或释放。另外的生物活性剂可增强或影响瘢疤形成过程中牵涉的其它过程，以致本文提供的组合物可为止血剂和/或防粘剂，以致药物的添加可实现纤维化的增加或减少，和/或根据药物机制导致组织增大和/或手术粘连增加或减少。例如，预期减少纤维化的药物将减少手术粘连。此外，载药制剂可增强制剂的封闭剂和/或止血剂性质，尤其是当所述试剂起增加纤维化的作用时。另外，本文提供的组合物可提供在手术粘连或再狭窄的发展和/或维持中或在抑制纤维化中牵涉的一个或多个过程的更普遍方面中牵涉的细胞和/或非细胞过程的药理学变化。因此，另外的药理学试剂包括但不限于抑制一个或一组过程的药理学试剂，例如细胞分裂、细胞分泌、细胞迁移、细胞粘着、细胞外基质生成、细胞因子(例如，TNFα、IL-1、IL-6)或其它炎性活化剂，例如趋化因子(例如，MCP-1或IL-8)生成和/或释放、血管发生和/或自由基形成和/或释放。例如，在WO2004/060346、WO2005/051452、WO2006/13547和WO2007/089878中详细公开了合适的纤维化、粘着或狭窄抑制剂，并且也易于基于体外和体内(动物)模型，例如WO2004/060346中提供的模型确定。就其中描述的活性剂而言，前述参考通过引用整体包括在本文中。
在其它实施方案内，所述活性剂可为纤维化剂、纤维化诱导剂和/或粘着诱导剂，其代表性实例可在(不限于)国际公布No.WO2005/046746、WO2005/046747和WO2006/124021中找到，就此类化合物而言其全部内容通过引用包括在本文中。
另外的适合使用的药物包括在(例如)WO2004/060346中详细阐述的药物。例如，示例性组合物可包含以下的任一种或多种：细胞周期抑制剂；紫杉醇；阿霉素；米托蒽醌；鬼臼毒素(podophyllotoxin)(例如，依托泊苷)；免疫调节剂、依维莫司(everolimus)；他克莫司；biolimus；热休克蛋白90拮抗剂；格尔德霉素(geldanamycin)；HMG CoA还原酶抑制剂；辛伐他汀(simvastatin)；IMPDH抑制剂；霉酚酸(mycophenolic acid)；1-α-25-二羟基维生素D3；抗霉菌剂例如硫康唑(sulconizole)；P38MAP激酶抑制剂例如SB220025；细胞外基质的组分例如纤连蛋白(fibronectin)；胶原蛋白；纤维蛋白；纤维蛋白原；聚赖氨酸；壳聚糖；N-羧丁基壳聚糖；RGD蛋白；选自TGFb、PDGF、VEGF、bFGF、TNFa、NGF、GM-CSF、IGF-a、IL-1、IL-8、IL-6和生长激素的炎性细胞因子；结缔组织生长因子(CTGF)；选自BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6或BMP-7的骨形态发生蛋白(BMP)；博来霉素；博来霉素的类似物或衍生物；刺激细胞增殖的增殖剂；地塞米松及其类似物和衍生物；17-.β-雌二醇(estradiol)及其类似物和衍生物；雌二醇及其类似物和衍生物；己烯雌酚(diethylstibesterol)及其类似物和衍生物；环孢霉素A及其类似物和衍生物；全反式维甲酸(ATRA)及其类似物和衍生物。在WO2005/046746、WO2005/046747、WO2006/124021、WO2004/060346、WO2005/051452、WO2006/13547和WO2007/089878中阐述了在本公开中可采用的另外的生物活性剂，就其中所述生物活性剂而言其通过引用整体并入本文。
具体而言，所述药物可为一种或多种止血蛋白，包括但不限于凝血酶、纤维蛋白、纤维蛋白原、血液因子、凝血因子(例如，因子VIII和XIII)。
在一个优选实施方案中，水凝胶前体组合物包含皮质类固醇。合适皮质类固醇的实例包括氢化可的松、醋酸氢化可的松、醋酸可的松、特戊酸硫氢可的松、强的松龙、甲基强的松龙、强的松、曲安西龙、曲安西龙盐(例如曲安奈德、苯曲安奈德(triamcinolone benetonide)、呋曲安奈德(triamcinolonefuretonide)、己曲安奈德、双醋酸曲安西龙(triamcinolone diacetate)、曲安西龙醇、莫米松、安西奈德、布地奈德、地奈德、醋酸氟轻松、肤轻松、氯氟松、倍他米松、倍他米松磷酸钠、地塞米松、地塞米松磷酸钠、氟考龙、氢化可的松-17-丁酸酯、氢化可的松-17-戊酸酯、二丙酸别氯地米松、戊酸倍他米松、二丙酸倍他米松、泼尼卡酯、氯倍他松-17-丁酸酯、氯倍他索-17-丙酸酯、己酸氟考龙、特戊酸氟考龙、醋酸氟泼尼定、二丙酸倍他米松一水合物、氟尼缩松、丙酸氟替卡松、糠酸莫米松一水合物和糠酸氟替卡松(fluticasone furoate)。
用于如本文所提供的水凝胶制剂中的一种优选化合物为曲安西龙(11β,16α)-9-氟-11,16,17,21-四羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮)或其药学上可接受的盐、酯或溶剂化物。下面示出了曲安奈德的结构。
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曲安奈德
生物活性剂通常将混合、悬浮或捕获在如本文所提供的原位形成水凝胶的组合物内。可选地，生物活性剂可呈聚合物共轭体形式，或以可释放方式与用于制备水凝胶的组分，例如经改性的透明质酸或巯基官能化PEG的共价连接。
制备原位水凝胶的方法
通常通过使经乙烯基砜改性的透明质酸和PEG巯基化物在有效形成快速形成凝胶的条件下反应形成本文提供的快速凝胶化组合物。一般地，连同反应条件一起，调节试剂和反应基团的相对量以提供最佳反应。在温和受控条件下制备水凝胶前体溶液，不需要外部能源。见，例如，实施例1-21。试剂盒和/或液体组合物的一种或多种组分优选呈无菌形式。在一个优选实施方案中，HA-VS无菌。另一优选实施方案中，巯基官能化聚乙二醇和缓冲液也无菌。
方法1
虽然应认识到本领域的技术人员可基于本公开适当修改所述方法以获得本文提供的组合物、试剂盒、材料和水凝胶，但是通常如以下制备前体组合物。在第一示例性方法中，通常将如上所述的经乙烯基砜改性的透明质酸溶解于水介质中，例如水、盐水等。换言之，可使用具有本文所述特征的任何HA-VS。例如，示例性的经乙烯基砜改性的透明质酸具有11%乙烯基砜取代并且具有为100千道尔顿的分子量。水介质通常将具有范围约5-7的pH，并且在某些情况下，可略呈酸性。理想地，在可能基于其水溶性的程度上，提供呈高度浓缩溶液的经乙烯基砜改性的透明质酸以使得能够快速凝胶化。通常，提供呈浓度约10-300mg/mL的溶液的HA-VS。合适浓度的另外的示例性范围包括以下：约15-250mg/mL，或甚至更优选约20-200mg/mL。例如，HA-VS可具有选自以下的浓度：10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、50mg/mL、75mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、225mg/mL、250mg/mL或300mg/mL。另外，HA-VS可具有在源自前述任两个浓度的组合的范围内的浓度，例如介于15mg/mL与125mg/mL之间，或介于20mg/mL与150mg/mL之间等等。就在混合后所得前体组合物快速形成凝胶而言，高浓度有利。
一旦溶解，然后通常为所得经乙烯基砜改性的透明质酸水溶液灭菌。对于本文所述任何灭菌步骤的灭菌均可通过(例如)热处理、高压蒸汽灭菌(例如高压灭菌)、环氧乙烷气体(EOG)灭菌、超临界二氧化碳灭菌、辐射灭菌或无菌过滤。辐射源包括α-射线、β-射线、γ-射线、中子束、电子束和X-射线。在某些实施方案中，尤其对于固体而言，采用γ-射线灭菌或电子束灭菌。在为HA-VS溶液灭菌的一种优选方法中，通过高压灭菌。虽然可参考本文提供的呈无菌形式的试剂盒或组合物的任一种或多种组分，但是应理解此类组分可无菌或可并非无菌。
然后将巯基官能化PEG添加到优选呈无菌粉末的无菌乙烯基砜官能化透明质酸溶液中。一般地，巯基官能化PEG相对于乙烯基砜官能化透明质酸的量在从约1:1(w/w)至约2:1(w/w)的范围内。混合组分直至PEG巯基化物溶解。虽然可添加呈水溶液的巯基官能化PEG，但是由于其在水介质中的溶解性高，优选呈固体添加，因为呈固体形式添加防止了可减缓凝胶化时间的反应混合物进一步稀释。
然后将所得巯基官能化PEG-乙烯基砜-透明质酸溶液与缓冲液混合以形成快速凝胶化前体组合物。缓冲液通常pH约7-12。优选地，缓冲液pH从约7.5至11，或甚至更优选从约8.0至10.5。缓冲溶液的说明性pH包括7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5和12，或前述范围内的任何其它pH。合适的缓冲液包括碱性缓冲液例如磷酸钠、碳酸钠、咪唑、Tris、HEPES、硼酸、MOPS等。优选缓冲液为磷酸钠。缓冲溶液的强度通常将在约30至1000毫摩尔(mM)范围内。优选地，缓冲液强度从约35至800mM，或甚至更优选从约40-600mM。实施例4证明了缓冲液对凝胶化的影响(例如，pH和浓度)。可以看出，制备了从混合后小于2分钟内经历凝胶化的溶液(时间范围从瞬间到1分40秒)。
在所得的原位形成水凝胶的前体组合物中PEG-巯基反应物的浓度通常将在从约10至600mg/mL的范围内。示例性浓度从约15-500mg/mL或更优选从约20至400mg/mL。
所得前体溶液通常在混合几秒(例如，5秒)至约1小时内形成凝胶。优选地，所述溶液将在混合约15分钟内(即，从混合后约5秒至15分钟，或在混合后30秒至15分钟内的任何时刻)，或甚至更优选，在混合约10分钟内，或甚至更优选，在混合约5分钟内，或甚至更优选，在混合约3分钟内形成凝胶。
如实施例7中所述，使用直链PEG-二巯基和4-臂PEG四巯基制备快速凝胶化组合物。试验的每种组合物均在混合一分钟内凝胶化，同时破裂压力(指示凝胶强度)从约0.450PSI变为0.685PSI。
方法2
在对方法1稍作修改的方法中，将少量可溶性PEG-巯基化物添加到经乙烯基砜改性的透明质酸溶液中以减少溶解所需的时间。添加的可溶性PEG-巯基化物优选为无菌。
如以上对方法1所述，通常将经乙烯基砜改性的透明质酸溶解于水介质中，例如水、盐水等。水介质通常将具有范围约5-7的pH，并且在某些情况下，可略呈酸性。理想地，在可能基于其水溶性的程度上，提供呈高度浓缩溶液的经乙烯基砜改性的透明质酸以使得能够快速凝胶化。通常，提供呈浓度约10-300mg/mL的溶液的HA-VS。合适浓度的另外的示例性范围包括以下：约15-250mg/mL，或甚至更优选约20-200mg/mL。就在混合后所得前体组合物快速形成凝胶而言，高浓度有利。
然后将一小部分巯基官能化PEG，例如约0.1重量%至约4重量%(wt/wt巯基官能化PEG比HA-VS)，添加到乙烯基砜官能化透明质酸溶液中，优选呈粉末。可添加的巯基官能化PEG另外的示例量包括从约0.1重量%至约3.5重量%，或从约0.1至2.5%(wt/wt巯基官能化PEG比HA-VS)。混合组分直至它们溶解。
然后通常如上所述为所得的含乙烯基砜官能化透明质酸和添加的总量的一部分的巯基官能化PEG的溶液灭菌。在一种优选方法中，高压灭菌所述溶液。
然后向所得的，通常经灭菌的溶液添加剩余量的巯基官能化PEG，同样优选呈无菌粉末。混合所述组分直至PEG巯基化物溶解。与方法1中一样，虽然可添加呈水溶液的巯基官能化PEG，但是由于其在水介质中的溶解性高，优选呈固体添加，因为呈固体形式添加防止了可减缓凝胶化时间的反应混合物进一步稀释。
然后如以上在方法1下所述将所得巯基官能化PEG-乙烯基砜-透明质酸溶液与缓冲液混合以形成快速凝胶化前体组合物。
一般地，在两种方法中，添加缓冲液后，在最终的液体快速凝胶化前体溶液中乙烯基砜官能化透明质酸和巯基官能化PEG的浓度范围从约2%至约8%重量/体积。于是每种反应物的示例性浓度可选自约2%、3%、4%、5%、6%、7%和8%重量/体积，包括之间的所有范围。在一个优选实施方案中，添加缓冲液后，在最终的液体快速凝胶化前体溶液中乙烯基砜官能化透明质酸和巯基官能化PEG的浓度范围从约2%至约6%重量/体积。
在一个或多个特定实施方案中，快速凝胶化前体组合物含有如上所述的活性剂。生物活性剂的优选类别包括类固醇、生长因子、抗增殖剂和抗生素。并入目前组合物中的一个特别有利的活性剂类别为皮质类固醇。说明性皮质类固醇包括但不限于以下：曲安西龙、曲安西龙盐(例如曲安奈德、己曲安奈德、苯曲安奈德、呋曲安奈德和双醋酸曲安西龙等)和甲基强的松龙。一般地，快速凝胶化前体组合物根据其效力，基于整体组成含有约0.01重量%至约20重量%生物活性剂。原位形成水凝胶中所含的生物活性剂的说明性量从约10重量%至约20重量%，例如对于较低效力的生物活性剂而言，从约0.01重量%至约10重量%，或从约0.01%至约5%，或从约0.01%至约3%，或从约0.1%至约2%生物活性剂，或甚至从约0.1至约1%生物活性剂，例如对于更有效的生物活性剂例如曲安奈德而言。
生物活性剂可与其中一种反应物(假设没有稳定性或反应性问题)或缓冲液组分混合，或可选地，在混合时添加。换言之，可在制备原位形成凝胶的前体组合物期间的任何阶段并入生物活性剂。
形成凝胶的前体组合物可另外含有一种或多种添加剂，例如防腐剂、去沫剂、造孔剂、增塑剂、穿透增强剂、着色剂、润湿剂、均化剂、水合剂、增稠剂、填料、乳浊剂和吸收剂，虽然任何此类添加剂均应生物相容并且当包括在前体组合物中时，可通过本文所述任何方式递送。
试剂盒
以上组分可呈试剂盒的形式供给，例如，用于临床环境中。例如，此类试剂盒可在第一容器中装有如上所述乙烯基砜衍生化透明质酸的无菌或非无菌水溶液。可选地，乙烯基砜衍生化透明质酸可呈固体(例如，呈粉末)供给，然后在与巯基官能化PEG混合之前溶解于如上所述的水介质中。在后面的实施方案中，提供在上述浓度范围之内的HA-VS溶液的合适体积的水介质通常也将与试剂盒一起提供。试剂盒在第二容器中还包含巯基官能化PEG，优选呈无菌形式的固体提供。虽然如上所述，优选固体形式以便不会在混合后进一步稀释反应物，但是也可在第二容器中提供呈水溶液的巯基官能化PEG。另外在第三容器中提供了无菌或非无菌的缓冲溶液，例如装有如前面描述的缓冲液，例如pH范围约7-12的30-1000mM缓冲溶液。
根据前面描述的方法，在一个替代实施方案中，第一容器可装有乙烯基砜衍生化透明质酸的无菌或非无菌水溶液，结合少量巯基官能化PEG，例如约0.1重量%至约4重量%(wt/wt巯基官能化PEG比HA-VS)，或从约0.1重量%至约3.5重量%，或从约0.1至2.5%(wt/wt巯基官能化PEG比HA-VS)。
试剂盒可进一步包含一般地通常将单独包装并且在使用之前立即与其它试剂盒组分混合的生物活性剂。虽然不一定，但是优选呈固体提供此类生物活性剂。
试剂盒中还包括混合和随后使用的说明书。
如以上所述的容器包括容纳以上组分的任何合适的、药学上可接受的包装容器。例如，合适的容器包括玻璃、塑料、箔和薄膜形成的容器例如泡罩包装、瓶子、袋、安瓿、小瓶、注射器(单、双或多个)、移液管、涂抹器、管子等。
例如，前述组分可各自包装于通常(例如)用通气孔盖密封的注射器中。注射器可由塑料(例如聚丙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯)或玻璃或任何其它药学上可接受的材料制成。注射器的体积范围可从0.5mL至20mL，优选体积为1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL和7mL。
然后可将注射器置于容器，例如箔袋中，再将其密封。所述袋可经真空密封，在惰性气体例如氮气或氩气下密封，或在一个或多个真空/回填周期之后密封，其中回填气体为惰性气体例如氮气或氩气。对于在一个或多个真空/回填周期下密封的袋而言，可调节周期以便最后在真空或惰性气体下密封所述袋。所述袋可任选装有干燥剂和/或除氧剂。
应用方法
可将本文所述组分涂抹到许多身体部位的任一处。示例性部位包括皮肤、黏膜、体腔、骨的内表面、组织部位、空隙、动脉、静脉、管道等。
可使用(例如)注射器(有或无针头)、导管、套管针、气体辅助喷雾装置、手动喷雾涂抹器、内窥镜气体辅助涂抹器等，将本文提供的快速凝胶化组合物，或可选地，其组分涂抹到治疗部位。说明性喷雾装置包括EASY SPRAY喷雾器(Baxter AG,USA)、FibriJet(Micromedics Inc.USA)等。FibriJet系列包括标准雾化涂抹器试剂盒(
Figure BDA0000427935440000241
手动喷雾涂抹器)以及气体辅助雾化涂抹器试剂盒(
Figure BDA0000427935440000242
气体辅助喷雾涂抹器)，二者均适合涂抹所述的快速凝胶化组合物。
用途
本文所述的快速凝胶化组合物可用于许多应用中，例如用于胚胎发育、组织构造、伤口愈合、血管发生和肿瘤发生。见D.D.Allison和K.J.Grande-Allen，Tissue Engineering，第12卷，第8期，2131-2140(2006)；G.D.Prestwich等，Tissue Engineering，第12卷，第8期，2171-2180(2006)；G.D.Prestwich等，Tissue Engineering，第12卷，第12期，3405-3416(2006)。
例如，本文提供的任选含有一种或多种生物活性剂，快速凝胶化的可喷射组合物可用作粘合组合物，例如可用于各种应用，包括防止出血、覆盖开放性伤口和其它生物医学应用的组织粘合剂和封闭剂。例如，所述组合物可用于防止身体的腰部、硬脑膜、鼻、窦、腹部、腱和关节区域的手术粘连。例如，这些组合物可用于并置手术切开或外伤性撕裂的组织，使血流例如来自伤口的血流减速，预防再狭窄或血液凝固，药物递送；烧伤敷药，以实现止血，和帮助活组织修复和再生长。所述组合物可用于补充或诱导并且再生哺乳动物受试者，例如人体内的受损器官或组织。所述组合物被分解或吸收，或可选地，留在受试者(例如，哺乳动物受试者)体内，当嵌入或含于其中时对受试者没有不利影响。当用作封闭剂时，快速凝胶化组合物在身体的以下区域中有用：血管、硬脑膜、肺部、肠道、膀胱、肠管、眼睛和局部。例如，当用作血管封闭剂时，所述组合物可用作静脉到静脉的封闭剂、动脉到静脉的封闭剂、静脉到动脉的封闭剂、静脉到合成聚合物的封闭剂、动脉到合成聚合物的封闭剂、合成聚合物到动脉的封闭剂和合成聚合物到静脉的封闭剂。所述组合物也可用于关节镜或开放性关节手术，例如，以修复关节(即，软骨)的组织。
当目的是使组合物粘着在组织表面时，组合物必须具有足够的粘着强度和足够的内聚强度，以致可发生向组织的粘着，组合物不会破坏或撕裂并离开涂抹所述组合物的组织。组合物的粘着强度指组合物保持附着于其涂抹表面的能力，而组合物的内聚强度指向组合物施加外力时，组合物保持呈单个实体的能力。为测量粘着强度和内聚强度的组合，可进行破裂试验(见，例如，实施例5)。如果组合物具有小于0.2PSI的破裂压力，则将组合物表征为具有相对弱的内聚/粘着强度。组合物表现出的破裂强度越高，组合物的粘着/内聚强度越高。本文提供的水凝胶组合物具有良好的粘着性和粘着强度。
所述的快速凝胶化组合物也可用作组织填料、皮肤填料、填充剂(例如,作为尿道或食道填充剂)和栓塞剂以及修复软骨缺损/受伤的试剂和增强骨修复和/或生长的试剂。
所述的快速凝胶化组合物也可用作药物递送媒介物，例如用于经局部、肌肉内、关节内、皮下、向眼区、皮内局部递送生物活性剂，用于治疗骨内缺损、软骨缺损、组织空隙和体腔。
所述组合物也可用于治疗骨关节炎或类风湿性关节炎，或其它炎症性关节炎，例如痛风或焦磷酸钙沉积病(例如，通过注入关节的关节内空间)，或用于减少或预防可在外科手术后形成的粘连。
现将连同某些实施方案一起描述本申请，这并非旨在限制本发明的范围。相反，本申请包括所有替代方案、修改和等效方案，如同包括在权利要求范围内一样。因此，为了说明某些实施方案，以下将说明本申请的实践并且提出是为了提供认为是对其过程和概念方面的有用且易于理解的描述的内容。
示例性方面和实施方案
以下是根据本文提供的教学的说明性方面和实施方案。
方面1.第一方面，本公开提供了一种试剂盒，包含：
(i)第一容器，其包含浓度为约10-300mg/mL的乙烯基砜衍生化透明质酸(“HA-VS”)的水溶液，其中所述HA-VS的约2%-70%的羟基经乙烯基砜取代，
(ii)第二容器，其包含具有2至8个巯基的巯基官能化聚乙二醇，和
(iii)第三容器，其包含pH范围约7-12，当与所述第一和第二容器的内容物混合时，有效提供具有2-8%(w/v)的HA-VS浓度和2-8%(w/v)的巯基官能化聚乙二醇浓度的溶液的量的30-1000mM缓冲溶液，
其中所述第一、第二和第三容器的组分，合并时，在混合约5秒至1小时内有效形成凝胶。(所述HA-VS、所述巯基官能化聚乙二醇和所述缓冲溶液中任一种或多种可呈无菌形式)。
方面2.第二方面，本公开提供了一种在其组分混合后能够形成水凝胶的液体组合物。所述液体制剂由以下的组合形成：(i)浓度为约10-300mg/mL的乙烯基砜衍生化透明质酸(“HA-VS”)的水溶液，其中所述HA-VS的约2%-70%的羟基经乙烯基砜取代，(ii)具有2至8个巯基的巯基官能化聚乙二醇，和(iii)pH范围约7-12的30-1000mM缓冲溶液，其中所述液体组合物中所述巯基官能化聚乙二醇的浓度范围约4-300mg/mL，并且所述可喷射液体组合物在混合组分(i)、(ii)和(iii)约5秒至约1小时内有效形成凝胶。(所述HA-VS、所述巯基官能化聚乙二醇和所述缓冲溶液中任一种或多种可呈无菌形式)。
方面3.第三方面，提供了一种形成能够原位形成凝胶的可喷射液体组合物的方法。所述方法包括步骤：
(i)将具有2至8个巯基的巯基官能化聚乙二醇添加到浓度为约4-300mg/mL的乙烯基砜衍生化透明质酸(“HA-VS”)的水溶液中，其中所述HA-VS的约2%-70%的羟基经乙烯基砜取代，从而溶解所述巯基官能化聚乙二醇以形成含乙烯基砜衍生化透明质酸-巯基官能化聚乙二醇的溶液，以及(ii)合并来自步骤(i)的所述溶液与pH范围约7-12的30-1000mM缓冲溶液，从而形成具有2-8%(w/v)的HA-VS浓度和2-8%(w/v)的巯基官能化聚乙二醇浓度的液体组合物，其中所述液体组合物在混合约5秒至约1小时内有效形成凝胶。
方面4.第四方面，提供了一种形成能够原位形成凝胶的液体组合物的方法，其中所述方法包括步骤：
(i)将总量的一部分，优选呈无菌形式的巯基官能化聚乙二醇添加到浓度为约10-300mg/mL的乙烯基砜衍生化透明质酸(“HA-VS”)的水溶液中，其中所述HA-VS的约2%-70%的羟基经乙烯基砜取代，从而形成溶液，
(ii)优选为来自步骤(i)的所述溶液灭菌，
(iii)向来自步骤(i)或步骤(ii)(若已进行)的所述溶液添加剩余量的巯基官能化聚乙二醇，其中所述巯基官能化聚乙二醇具有2至8个巯基，从而溶解剩余量的巯基官能化聚乙二醇以形成含乙烯基砜衍生化透明质酸-巯基官能化聚乙二醇的溶液，并且
(iv)混合所述含乙烯基砜衍生化透明质酸-巯基官能化聚乙二醇的溶液与pH范围约7-12的30-1000mM缓冲溶液，
从而形成具有2-8%(w/v)的HA-VS浓度和2-8%(w/v)的巯基官能化聚乙二醇浓度的液体组合物，其中所述液体组合物在混合约5秒至约1小时内有效形成凝胶。
实施方案1.在涉及方面1-4中任一个或多个的一个实施方案中，乙烯基砜衍生化透明质酸的约7%-35%或10%至25%的羟基经乙烯基砜取代。
实施方案2.在涉及方面1-4中任一个或多个并且也可与实施方案1结合的第二个实施方案中，巯基官能化聚乙二醇具有选自2、3、4、5、6、7和8的巯基数目。
实施方案3.在涉及方面1-4中任一个或多个并且也可与实施方案和/或实施方案2结合的第三个实施方案中，巯基官能化聚乙二醇具有选自2、3和4的巯基数目。
实施方案4.在涉及方面1-4中任一个或多个并且也可与实施方案1-3中任一个或多个结合的第四个实施方案中，所述乙烯基砜衍生化透明质酸的平均分子量范围从约10,000至约2,000,000道尔顿，或从约15,000至约1,000,000道尔顿，或从约20,000至约200,000道尔顿。
实施方案5.在涉及方面1-4中任一个或多个并且也可与实施方案1-3中任一个或多个结合的第五个实施方案中，所述乙烯基砜衍生化透明质酸的平均分子量为约100,000道尔顿。
实施方案6.在涉及方面1-4中任一个或多个并且也可与实施方案1-5中任一个或多个结合的第六个实施方案中，所述巯基官能化聚乙二醇为直链的。
实施方案7.在涉及方面1-4中任一个或多个并且也可与实施方案1-6中任一个或多个结合的第七个实施方案中，所述巯基官能化聚乙二醇为支链的。
实施方案8.在涉及方面1-4中任一个或多个并且也可与实施方案1-7中任一个或多个结合的第八个实施方案中，所述巯基官能化聚乙二醇的平均分子量从约1,000至约10,000道尔顿。
实施方案9.在涉及方面1-4中任一个或多个并且也可与实施方案1-8中任一个或多个结合的第九个实施方案中，所述巯基官能化聚乙二醇的分子量小于所述乙烯基砜衍生化透明质酸的分子量。
实施方案10.在涉及方面1-4中任一个或多个并且也可与实施方案1-9中任一个或多个结合的第十个实施方案中，所述乙烯基砜衍生化透明质酸(“HA-VS”)的水溶液浓度范围约20-200mg/mL。
实施方案11.在涉及方面1-4中任一个或多个并且也可与实施方案1-10中任一个或多个结合的第十一个实施方案中，所述巯基官能化聚乙二醇呈粉末形式。
实施方案12.在涉及方面1-4中任一个或多个并且也可与实施方案1-11中任一个或多个结合的第十二个实施方案中，所述巯基官能化聚乙二醇相对于所述乙烯基砜衍生化透明质酸的量范围从约1:1(w/w)至约0.4:1(w/w)。
实施方案13.在涉及方面1-4中任一个或多个并且也可与实施方案1-12中任一个或多个结合的第十三个实施方案中，所述缓冲溶液的pH范围从约8.0至10.5。
实施方案14.在涉及方面1并且也可与实施方案1-13中任一个或多个结合的第十四个实施方案中，所述第一、第二或第三容器之一进一步包含生物活性剂。
实施方案15.在涉及方面1并且也可与实施方案1-13中任一个或多个结合的第十五个实施方案中，所述试剂盒进一步包含含生物活性剂的第四容器。
实施方案16.在涉及方面2并且也可与实施方案1-13中任一个或多个结合的第十六个实施方案中，所述液体组合物进一步包含生物活性剂。
实施方案17.在涉及实施方案14-16中任一个或多个的第十七个实施方案中，所述生物活性剂为皮质类固醇，例如曲安西龙或曲安西龙的药学上可接受的盐或酯，例如曲安奈德或己曲安奈德。
实施方案18.在涉及方面1并且也可与实施方案1-15、17中任一个或多个结合的第十八个实施方案中，所述第一容器包含相对于所述乙烯基砜衍生化透明质酸(w/w)，约0.1重量%至约3.5重量%的巯基官能化聚乙二醇。
实施方案19.在涉及方面1-4中任一个或多个并且也可与实施方案1-18中任一个或多个结合的第十九个实施方案中，在最终的液体组合物中所述巯基官能化聚乙二醇的浓度范围约10-300mg/mL，或约6-250mg/mL，或约8-200mg/mL。
实施方案20.在涉及方面3并且也可与实施方案1-13和/或19中任一个或多个结合的第二十个实施方案中，将生物活性剂添加到步骤(i)的含乙烯基砜衍生化透明质酸-巯基官能化聚乙二醇的溶液中，或来自步骤(ii)合并之前的所述缓冲溶液中，或步骤(ii)中形成的所述液体组合物中。
实施方案21.在涉及实施方案20的这个实施方案中，所述生物活性剂为皮质类固醇，例如为曲安西龙或曲安西龙的药学上可接受的盐或酯，例如曲安奈德或己曲安奈德。
实施方案22.在涉及方面4并且可与实施方案1-13中任一个或多个结合的这个实施方案中，步骤(i)中的巯基官能化聚乙二醇的所述部分包含相对于所述乙烯基砜衍生化透明质酸(w/w)，约0.1重量%至约3.5重量%的巯基官能化聚乙二醇。
实施方案23.在涉及方面4并且可与实施方案1-13和/或22中任一个或多个结合的这个实施方案中，将生物活性剂添加到步骤(i)的所述溶液中，或添加到来自步骤(iii)的含乙烯基砜衍生化透明质酸-巯基官能化聚乙二醇的所述溶液中，或添加到来自步骤(iv)混合之前的所述缓冲溶液中，或添加到步骤(iv)中形成的所述液体组合物中。
实施方案24.在与实施方案23相关的这个实施方案中，所述生物活性剂为皮质类固醇，例如为曲安西龙或曲安西龙的药学上可接受的盐或酯，例如曲安奈德或己曲安奈德。
实施方案25.在这个实施方案中，本文提供了根据方面1和/或2并且可与实施方案1-19中任一个或多个结合，用于对身体部位的应用中的试剂盒或可喷射液体组合物。
实施方案26.在与实施方案25相关的这个实施方案中，所述剂盒或可喷射液体组合物可用于胚胎发育、组织构造、组织封闭应用、伤口愈合、血管发生、肿瘤发生，用于防止手术粘连或治疗骨关节炎或类风湿性关节炎，用于关节镜或开放性关节手术以修复关节(即，软骨)的组织和实现止血。
实施例
提出以下实施例为本领域的普通技术人员提供对如何产生和评估本文提供的化合物、组合物和方法的全面公开和描述，并且旨在仅为示例性。因此，实施例决非旨在限制发明人视为其发明的范围。反应条件有许多变化和组合，例如组分浓度、所需溶剂、溶剂混合物、温度、压力和其它反应参数及可用于优化产物特征例如纯度、产率等的条件。也将这些视为在本公开的范围之内。除非本文另外指出或上下文明确矛盾，本发明涵盖所有可能变化中上述元素的任何组合。
材料
1H NMR波谱仪：400MHz
聚乙二醇二巯基化物，HS-(CH2CH2O)nCH2CH2SH，“PEG-(SH)2”，MW=3350
PEG(SH)4=C((CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2SH)4，MW=10,000，季戊四醇核心(Sunbio PEG-SHOP)
实施例1
乙烯基砜衍生化透明质酸(HA-VS)(Mw=100K)的合成
Figure BDA0000427935440000321
HA-OH基团的改性
向1L烧杯中称取5g透明质酸(HA)[Mw=100K，Shesiedo]。向HA中添加500mL无菌过滤水。使用具有锚形桨叶的悬挂式搅拌器搅拌混合物16.5小时，此时HA溶解。向搅拌的HA溶液中添加333mL的0.25N NaOH溶液(13.9mL6N NaOH添加到319mL去离子水中)。约1分钟后，向搅拌溶液中快速添加150mL二乙烯基砜溶液(18mL二乙烯基砜溶于132mL去离子水中)。2分钟后(从二乙烯基砜溶液添加完成开始测量)，通过快速添加13.7mL6N HCl将溶液的pH调节至介于5和6之间。然后使用切向流过滤系统(spectrapor系统，夹头P/N M6-100S-301-01P)透析反应溶液。总体积为原溶液体积的11倍。一旦完成纯化步骤，就将溶液浓缩至约400mL。从TFF系统中移出乙烯基砜官能化HA(HA-VS)并置于玻璃容器中，然后使用干冰/丙酮冷冻玻璃容器。然后冻干所述材料。一经干燥，就将所述材料(4.6g)置于箔袋中并热封。将经改性的HA样品送去进行1H-NMR分析。
1H-NMR图谱(图2)显示，HA的乙烯基砜取代水平为约11%。
实施例2
乙烯基砜衍生化透明质酸(HA-VS)的合成：IV=1.3m3/kg
向4L烧杯中称取20g透明质酸(HA)[本征粘度(IV)1.3m3/kg，Shesiedo]。向HA中添加2000mL无菌过滤水。使用具有锚形桨叶的悬挂式搅拌器搅拌混合物16.5小时，此时HA溶解。向搅拌的HA溶液中添加1335mL的0.25N NaOH溶液(55.6mL6N NaOH添加到1280mL去离子水中)。约1分钟后，向搅拌溶液中快速添加二乙烯基砜溶液(72mL二乙烯基砜溶于530mL去离子水中)。2分钟后(从二乙烯基砜溶液添加完成开始测量)，通过快速添加55mL6N HCl将溶液的pH调节至介于5和6之间。然后使用切向流过滤系统(spectrapor系统，夹头P/N M6-100S-301-01P)透析反应溶液。总体积为原溶液体积的11倍。一旦完成纯化步骤，就将溶液浓缩至约2600mL。从TFF系统中移出乙烯基砜官能化HA(HA-VS)并置于不锈钢盘中。然后使用Millrock冻干器冻干所述材料。一经干燥，就将所述材料(20.15g)置于箔袋中，然后热封箔袋。将经改性的HA样品送去进行1H-NMR分析。
1H-NMR图谱显示，HA的乙烯基砜取代水平为约14%。
实施例3
乙烯基砜衍生化透明质酸(HA-VS)的合成
向4L烧杯中称取20g透明质酸(HA)[Mw=900K，Novozymes]。向HA中添加2000mL无菌过滤水。使用具有锚形桨叶的悬挂式搅拌器搅拌混合物16.5小时，此时HA溶解。向搅拌的HA溶液中添加1335mL的0.25N NaOH溶液(55.6mL6N NaOH添加到1280mL去离子水中)。约1分钟后，向搅拌溶液中快速添加二乙烯基砜溶液(72mL二乙烯基砜溶于528mL去离子水中)。2分钟后(从二乙烯基砜溶液添加完成开始测量)，通过快速添加56mL6N HCl将溶液的pH调节至介于5和6之间。然后使用切向流过滤系统(spectrapor系统，夹头P/N M6-100S-301-01P)透析反应溶液。总体积为原溶液体积的11倍。一旦完成纯化步骤，就将溶液浓缩至约2500mL。从TFF系统中移出乙烯基砜官能化HA(HA-VS)并置于不锈钢盘中。然后使用Millrock冻干器冻干所述材料。一经干燥，就将所述材料(17.5g)置于箔袋中，然后热封箔袋。将经改性的HA样品送去进行1H-NMR分析。
1H-NMR图谱显示，HA的乙烯基砜取代水平为约20%。
实施例4
凝胶形成-缓冲液影响
在样品管中用不同量的磷酸钠缓冲液pH8或磷酸钠缓冲液pH9.5将1mL的25mg/mL HA-VS(实施例3)的pH调节为pH6.5至pH9.5。向HA-VS溶液添加干(粉末)PEG(SH)2。混合溶液并且通过溶液流动的视觉缺乏测量凝胶形成的时间。下表总结了试验的样品。
表1.
Figure BDA0000427935440000341
实施例5
破裂压力试验
使用图3所示装置进行破裂压力试验。
为模拟组织，使用胶原肠衣。将肠衣置于破裂压力装置顶上并且使用O形橡胶圈固定。使用18号针在肠衣上打孔。以使材料覆盖孔(用18号针产生)的方式将原位凝胶化材料置于肠衣之上。5分钟后，将压力计(Omega型：DPG5500B-05G)置零并且将泵调至100mL/分钟流速。测量破裂压力，为刚好在水易于流过形成的凝胶之前压力计上的最大压力。
实施例6
HA-VS/HS-PEG-SH凝胶化(HA-VS取代14%)
向10mL注射器中称取125mg的HA-VS(实施例2)。通过向注射器中添加5mL H2O使HA-VS溶解并且在旋转器上混合过夜。将2.5mL溶解的HA-VS转移到新的10mL注射器中。然后在250℉下为这个10mL注射器高压灭菌15分钟。向10mL注射器中称取40mg PEG(SH)2。向第二个10mL注射器中称取第二个等分试样的40mg PEG(SH)2。用1.5mL未经高压灭菌和经高压灭菌的HA-VS，使用以下程序进行凝胶化。使用鲁尔母接头(luerconnector)将装有HA-VS的注射器连接至装有PEG(SH)2的注射器。通过推动活塞将HA-VS转移到PEG(SH)2注射器中。来回传递注射器的内容物几次直至PEG(SH)2溶解。向混合物添加100ul的1M磷酸钠pH8.5缓冲液。两种条件的凝胶化时间均为约30秒。
实施例7
使用二和四-官能化PEG凝胶化
向10mL注射器中称取150mg的HA-VS(实施例2)。通过向注射器中添加6mL H2O并且在旋转器上混合过夜使HA-VS溶解。用1.5mL HA-VS和40mg PEG(SH)2或40mg PEG(SH)4进行凝胶化。向每份样品中添加100μl的1M磷酸钠pH8.5缓冲液以完成凝胶化。将每种溶液涂抹到肠衣上进行破裂压力试验(实施例5)。到1分钟时每种产品均已凝胶化。测量破裂力。
表2.
使用的PEG 破裂压力(PSI)
PEG(SH)2 0.571
PEG(SH)2 0.465
PEG(SH)2 0.685
PEG(SH)4 0.490
PEG(SH)4 0.450
PEG(SH)4 0.603
实施例8
经电子束灭菌的HA-VS的凝胶化
将0.4g的抗坏血酸和0.4g的PEG4000溶解于50mL H2O中。使用6NNaOH将溶液调节至pH6.14，接着将溶液转移到1.25g的冻干HA-VS(实施例2)中。彻底混合后，将3mL等分试样转移到特氟隆海绵模中，并且冻干以形成海绵体。将海绵体置于5mL注射器中并送去在46kGy下进行电子束灭菌。通过将1/2灭菌海绵体溶解于PEG(SH)2(40mg于750ul H2O中)溶液中进行凝胶化。向HA-VS/PEG(SH)2溶液中添加750ul的150mM磷酸钠pH8.4。所得HA-VS浓度为25mg/mL。然后测量凝胶化的时间。非电子束海绵体的凝胶化时间为52秒，而对于电子束海绵体而言为4分钟。当电子束HA-VS浓度增加到60mg/mL时，凝胶化时间从4分钟减少到50秒。
实施例9
凝胶化1
向10mL注射器中称取HA-VS(实施例1)并且溶解于H2O中以形成41mg/mL溶液。向1.5mL的HA-VS溶液添加40mg PEG(SH)2。混合HA-VS和PEG(SH)2。一旦PEG(SH)2溶解，就添加100μl1M磷酸钠pH8.5并混合成混合物。在5分钟内形成透明凝胶。
实施例10
凝胶化2
向1mL注射器中称取HA-VS(实施例1)并且溶解于H2O中以形成60mg/mL溶液。向0.2mL的HA-VS溶液添加10mg PEG(SH)2。混合HA-VS和PEG(SH)2。一旦PEG(SH)2溶解，就添加15μl1M磷酸钠pH8.5并混合成混合物。混合物在40秒内凝胶化。
实施例11
凝胶化3
向1mL注射器中称取HA-VS(实施例1)并且溶解于H2O中以形成60mg/mL溶液。向0.4mL的HA-VS溶液添加10mg PEG(SH)2。混合HA-VS和PEG(SH)2。一旦PEG(SH)2溶解，就添加26.7μl1M磷酸钠pH8.5并混合成混合物。混合物在1分30秒内凝胶化。
实施例12
凝胶化4
向3mL注射器中称取HA-VS(实施例1)并且溶解于H2O中以形成60mg/mL溶液。向1.5mL的HA-VS溶液添加75mg PEG(SH)2。混合HA-VS和PEG(SH)2。一旦PEG(SH)2溶解，就添加115μl1M磷酸钠pH8.5并混合成混合物。然后将混合物挤到肠衣上(实施例5)。混合物在2分钟内凝胶化并且测量破裂压力(实施例5)为1.24PSI。
实施例13
凝胶化5
向3mL注射器中称取HA-VS(实施例1)并且溶解于H2O中以形成120mg/mL溶液。向0.75mL的HA-VS溶液添加75mg PEG(SH)2。混合HA-VS和PEG(SH)2。一旦PEG(SH)2溶解，就添加750μl150mM磷酸钠pH8.8并混合成混合物。混合物在1分40秒内内凝胶化。
实施例14
凝胶化6
向3mL注射器中称取HA-VS(实施例1)并且溶解于H2O中以形成120mg/mL溶液。向0.75mL的HA-VS溶液添加75mg PEG(SH)2。混合HA-VS和PEG(SH)2。一旦PEG(SH)2溶解，就添加750μl300mM磷酸钠pH8.8并混合成混合物。混合物在40秒内凝胶化。通过GPC测量HA-VS的分子量为100kDa。
表3.
Figure BDA0000427935440000381
实施例15
凝胶化7-经高压灭菌的HA-VS
向3mL注射器中称取HA-VS(实施例1)并且溶解于H2O中以形成120mg/mL溶液。然后在250℉下为溶液高压灭菌15分钟。一旦冷却至室温，就向0.75mL的HA-VS溶液添加75mg PEG(SH)2。混合HA-VS和PEG(SH)2。一旦PEG(SH)2溶解，就添加750μl300mM磷酸钠pH8.8并混合成混合物。混合物在60秒内凝胶化。
通过GPC测量高压灭菌后HA-VS的分子量为76kDa。
实施例16
高压灭菌之前向HA-VS添加PEG(SH)2
以每mLHA-VS为0、0.02、0.2、0.4、0.7、1.0、1.3、2.0、5.0和10mg向HA-VS(120mg/mL)(实施例1)中添加PEG(SH)2。彻底混合后，在250℉下为HA-VS/PEG高压灭菌15分钟。然后用107mg PEG(SH)2/mL HA-VS，使用0.3M磷酸钠pH8.8和0.15M碳酸钠pH9.25进行凝胶化。到2分钟时材料凝胶化。使凝胶经受破裂力试验。
表4.
Figure BDA0000427935440000391
实施例17
凝胶化8-缓冲液的影响
在250℉下为120mg/mL HA-VS(实施例1)高压蒸汽灭菌15分钟。使用0.9/1比例(g/g)的HA-VS/PEG(SH)2，用以下缓冲液进行凝胶化：(1)0.3M磷酸钠，pH8.8，(2)0.2M碳酸钠，pH9.25和(3)0.3M碳酸钠，pH9.4。溶液在3分钟内凝胶化并且测量破裂压力(实施例5)。
表5.
次数 缓冲液 破裂压力(PSI)
1 0.3M磷酸盐，pH8.8 1.30
2 0.2M碳酸盐，pH9.3 1.90
3 0.3M碳酸盐，pH9.4 2.26
实施例18
凝胶化9-缓冲液的作用
将3g HA-VS(实施例1)溶解于25mL H2O中以形成120mg/mL HA-VS溶液。按1mg PEG/120mg HA-VS比例向6mL的120mg/mL HA-VS中添加60μl的100mg/mL PEG(SH)2。高压蒸汽灭菌有或无PEG(SH)2的120mg/mLHA-VS。对于两种凝胶而言，使用108mg的PEG(SH)2，用0.3M磷酸钠pH8.8及0.15M碳酸钠pH9.25和0.3M碳酸钠pH9.4进行凝胶化。
表6.
Figure BDA0000427935440000411
实施例19
凝胶化10-气体辅助喷雾
高压蒸汽灭菌具有PEG/HA-VS1mg/120mg比例的120mg/mLHA-VS(实施例1)。如下表所详述将HA-VS等分至3mL注射器中并且与PEG(SH)2混合。然后如下表所定义，将缓冲溶液等分至第二个3mL注射器中。将HA-VS/PEG(SH)2注射器和相应的缓冲液注射器连接至气体辅助喷雾装置(Fibrijet Part#SA-3652,Micromedics)。气体辅助喷雾装置的出气口经调节器(Tissomat,Baxter)与CO2罐连接。调节器的出口压力设为20PSI。然后通过激活气体源并且同时压下HA-VS/PEG(SH)2注射器和相应缓冲液注射器的活塞将溶液喷射到肠衣上。材料于1分钟内在肠衣上凝胶化。通过身体接触薄膜评估每种薄膜对肠衣的粘着性并且将薄膜的粘着性彼此相对分级，数字1为最弱而4为最强。
表7.
Figure BDA0000427935440000421
实施例20
HA-VS取代的影响
进行分别具有2%、6%、14%(实施例2)和20%(实施例3)取代的HA-VS(Mw约600kD)的凝胶化和破裂力。按25mg/mL将HA-VS溶解于3mL塑料注射器中的去离子H2O中整夜，然后高压蒸汽灭菌(250℉，15分钟)。使各2mL的HA-VS溶液与53mg的干燥PEG(SH)2混合，然后与133μl的0.3M碳酸钠pH9.4混合。将混合材料挤在肠衣(实施例5)上。5分钟后，使用2%经取代的HA-VS和6%经取代的HA-VS的材料并未在此时完全凝胶化。使用14%经取代的HA-VS和20%经取代的HA-VS的材料到5分钟时已经凝胶化(材料在1分钟内已经凝胶化)。为凝胶化样品测量破裂力。
表8.
Figure BDA0000427935440000422
实施例21
气体辅助喷雾
分别为50mg/mL14%经取代的HA-VS(实施例2)和20%经取代的HA-VS(实施例3)高压蒸汽灭菌(250℉，15分钟)。然后制备每种样品以如以下进行气体辅助喷雾：如下表所详述将HA-VS等分至3mL注射器中并且与PEG(SH)2混合。然后如下表所定义，将缓冲溶液等分至第二个3mL注射器中。将HA-VS/PEG(SH)2注射器和相应的缓冲液注射器连接至气体辅助喷雾装置(Fibrijet Part#SA-3652,Micromedics)。气体辅助喷雾装置的出气口经调节器(Tissomat,Baxter)与CO2罐连接。调节器的出口压力设为20PSI。然后通过激活气体源并且同时压下HA-VS/PEG(SH)2注射器和相应缓冲液注射器的活塞将溶液喷射到肠衣上。材料于1分钟内在肠衣上凝胶化。通过身体接触薄膜评估每种薄膜对肠衣的粘着性并且将薄膜的粘着性彼此相对分级，数字1为最弱而2为最强。
表9.
Figure BDA0000427935440000431

Claims (51)

1.一种试剂盒，包含：
(i)第一容器，其包含浓度为约10-300mg/mL的乙烯基砜衍生化透明质酸(“HA-VS”)的水溶液，其中所述HA-VS的约2%-70%的羟基经乙烯基砜取代，
(ii)第二容器，其包含具有2至8个巯基的巯基官能化聚乙二醇，和
(iii)第三容器，其包含pH范围约7-12，当与所述第一和第二容器的内容物混合时，有效提供具有2-8%(w/v)的HA-VS浓度和2-8%(w/v)的巯基官能化聚乙二醇浓度的溶液的量的30-1000mM缓冲溶液，
其中所述第一、第二和第三容器的组分合并时，在混合约5秒至1小时内有效形成凝胶。
2.一种由以下的组合形成的液体组合物：(i)浓度为约10-300mg/mL的乙烯基砜衍生化透明质酸(“HA-VS”)的水溶液，其中所述HA-VS的约2%-70%的羟基经乙烯基砜取代，(ii)具有2至8个巯基的巯基官能化聚乙二醇，和(iii)pH范围约7-12的30-1000mM缓冲溶液，
其中所述液体组合物中所述巯基官能化聚乙二醇的浓度范围约4-300mg/mL，并且
所述液体组合物在混合组分(i)、(ii)和(iii)约5秒至约1小时内有效形成凝胶。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的试剂盒或液体组合物，其中所述乙烯基砜衍生化透明质酸的约7%-35%或10%至25%的羟基经乙烯基砜取代。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒或液体组合物，其中所述巯基官能化聚乙二醇的巯基数目选自2、3、4、5、6、7和8。
5.根据权利要求4所述的试剂盒或液体组合物，其中所述巯基官能化聚乙二醇的巯基数目选自2、3和4。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的试剂盒或液体组合物，其中所述乙烯基砜衍生化透明质酸的平均分子量范围从约10,000至约2,000,000道尔顿。
7.根据权利要求6所述的试剂盒或液体组合物，其中所述乙烯基砜衍生化透明质酸的平均分子量范围从约15,000至约1,000,000道尔顿或从约20,000至约200,000道尔顿。
8.根据权利要求7所述的试剂盒或液体组合物，其中所述乙烯基砜衍生化透明质酸的平均分子量为约100,000道尔顿。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的试剂盒或液体组合物，其中所述巯基官能化聚乙二醇为直链的。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的试剂盒或液体组合物，其中所述巯基官能化聚乙二醇为支链的。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的试剂盒或液体组合物，其中所述巯基官能化聚乙二醇的平均分子量从约1,000至约10,000道尔顿。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的试剂盒或液体组合物，其中所述巯基官能化聚乙二醇的分子量小于所述乙烯基砜衍生化透明质酸的分子量。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的试剂盒或液体组合物，其中所述乙烯基砜衍生化透明质酸(“HA-VS”)的水溶液的浓度范围约20-200mg/mL。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的试剂盒或液体组合物，其中所述巯基官能化聚乙二醇呈粉末形式。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的试剂盒或液体组合物，其中所述巯基官能化聚乙二醇相对于乙烯基砜衍生化透明质酸的量范围从约1:1(w/w)至约0.4:1(w/w)。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的试剂盒或液体组合物，其中所述缓冲溶液的pH范围从约8.0至10.5。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的试剂盒，其中所述第一、第二或第三容器的其中一个进一步包含生物活性剂。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的试剂盒，进一步包含含生物活性剂的第四容器。
19.根据权利要求2-16中任一项所述的液体组合物，进一步包含生物活性剂。
20.根据权利要求17或权利要求18所述的试剂盒，或根据权利要求19所述的液体组合物，其中所述生物活性剂为皮质类固醇。
21.根据权利要求20所述的试剂盒或可喷射液体组合物，其中所述皮质类固醇为曲安西龙、曲安奈德或己曲安奈德。
22.根据权利要求1-18或20-21中任一项所述的试剂盒，其中所述第一容器进一步包含相对于所述乙烯基砜衍生化透明质酸(w/w)，约0.1重量%至约3.5重量%的巯基官能化聚乙二醇。
23.一种形成能够原位形成凝胶的液体组合物的方法，包括：
(i)将具有2至8个巯基的巯基官能化聚乙二醇添加到浓度为约4-300mg/mL的乙烯基砜衍生化透明质酸(“HA-VS”)的水溶液中，其中所述HA-VS的约2%-70%的羟基经乙烯基砜取代，从而溶解所述巯基官能化聚乙二醇以形成含乙烯基砜衍生化透明质酸-巯基官能化聚乙二醇的溶液，以及
(ii)合并来自步骤(i)的所述溶液与pH范围约7-12的30-100mM缓冲溶液，从而形成具有2-8%(w/v)的HA-VS浓度和2-8%(w/v)的巯基官能化聚乙二醇浓度的液体组合物，
其中所述液体组合物在合并约5秒至约1小时内有效形成凝胶。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述巯基官能化聚乙二醇呈粉末形式。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中：
(i)所述乙烯基砜衍生化透明质酸的约7%至35%或10%至25%的羟基经乙烯基砜取代；和/或
(ii)所述乙烯基砜衍生化透明质酸的平均分子量范围从约10,000至约2,000,000道尔顿；或从约15,000至约1,000,000道尔顿，或从约20,000至约200,000道尔顿；或平均分子量为约100,000道尔顿，和/或
(iii)所述乙烯基砜衍生化透明质酸(“HA-VS”)的水溶液的浓度范围约20-200mg/mL；和/或
(iv)所述巯基官能化聚乙二醇的分子量小于所述乙烯基砜衍生化透明质酸的分子量；和/或
(v)巯基官能化聚乙二醇相对于乙烯基砜衍生化透明质酸的量范围从约1:1(w/w)至约0.4:1(w/w)；和/或
(vi)所述缓冲溶液的pH范围从约8.0至10.5。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的方法，其中：
(i)所述液体组合物中所述巯基官能化聚乙二醇的浓度范围约10-300mg/mL，或约6-250mg/mL，或约8-200mg/mL；和/或
(ii)所述巯基官能化聚乙二醇的巯基数目选自2、3、4、5、6、7和8；或巯基数目选自2、3和4；和/或
(iii)所述巯基官能化聚乙二醇为直链的；和/或
(iv)所述巯基官能化聚乙二醇为支链的；和/或
(v)所述巯基官能化聚乙二醇的平均分子量从约1,000至约10,000道尔顿。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的方法，进一步包括将生物活性剂添加到步骤(i)的所述含乙烯基砜衍生化透明质酸-巯基官能化聚乙二醇的溶液中，或添加到来自步骤(ii)的所述合并之前的所述缓冲溶液中，或添加到步骤(ii)中形成的所述液体组合物中。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述生物活性剂为皮质类固醇。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述皮质类固醇为曲安西龙、曲安奈德或己曲安奈德。
30.一种形成能够原位形成凝胶的液体组合物的方法，包括：
(i)将总量的一部分的巯基官能化聚乙二醇添加到浓度为约10-300mg/mL的乙烯基砜衍生化透明质酸(“HA-VS”)的水溶液中，其中所述HA-VS的约2%-70%的羟基经乙烯基砜取代，从而形成溶液，
(ii)任选为来自步骤(i)的所述溶液灭菌，
(iii)向来自步骤(i)或步骤(ii)(若已进行)的所述溶液添加剩余量的巯基官能化聚乙二醇，其中所述巯基官能化聚乙二醇具有2至8个巯基，从而溶解剩余量的巯基官能化聚乙二醇以形成含乙烯基砜衍生化透明质酸-巯基官能化聚乙二醇的溶液，并且
(iv)混合所述含乙烯基砜衍生化透明质酸-巯基官能化聚乙二醇的溶液与pH范围约7-12的30-1000mM缓冲溶液，
从而形成具有2-8%(w/v)的HA-VS浓度和2-8%(w/v)的巯基官能化聚乙二醇浓度的液体组合物，从而形成在混合约5秒至约1小时内有效形成凝胶的液体组合物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中步骤(i)中所述部分的巯基官能化聚乙二醇包含相对于所述乙烯基砜衍生化透明质酸(w/w)，约0.1重量%至约3.5重量%的巯基官能化聚乙二醇。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的方法，其中所述巯基官能化聚乙二醇呈粉末形式。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的方法，其中：
(i)所述乙烯基砜衍生化透明质酸的约7%至35%或10%至25%的羟基经乙烯基砜取代；和/或
(ii)所述乙烯基砜衍生化透明质酸的平均分子量范围从约10,000至约2,000,000道尔顿；或从约15,000至约1,000,000道尔顿，或从约20,000至约200,000道尔顿；或平均分子量为约100,000道尔顿，和/或
(iii)步骤(i)中的所述乙烯基砜衍生化透明质酸(“HA-VS”)的水溶液的浓度范围约20-200mg/mL；和/或
(iv)所述巯基官能化聚乙二醇的分子量小于所述乙烯基砜衍生化透明质酸的分子量；和/或
(v)在最终的液体溶液中巯基官能化聚乙二醇相对于乙烯基砜衍生化透明质酸的量范围从约1:1(w/w)至约0.4:1(w/w)；和/或
(vi)所述缓冲溶液的pH范围从约8.0至10.5。
34.根据权利要求30-33中任一项所述的方法，其中：
(i)在最终的液体组合物中所述巯基官能化聚乙二醇的浓度范围约10-300mg/mL，或约6-250mg/mL，或约8-200mg/mL；和/或
(ii)所述巯基官能化聚乙二醇的巯基数目选自2、3、4、5、6、7和8；或巯基数目选自2、3和4；和/或
(iii)所述巯基官能化聚乙二醇为直链的；和/或
(iv)所述巯基官能化聚乙二醇为支链的；和/或
(v)所述巯基官能化聚乙二醇的平均分子量从约1,000至约10,000道尔顿。
35.根据权利要求30-34中任一项所述的方法，进一步包括将生物活性剂添加到步骤(i)的所述溶液中，或添加到来自步骤(iii)的所述含乙烯基砜衍生化透明质酸-巯基官能化聚乙二醇的溶液中，或添加到来自步骤(iv)混合之前的所述缓冲溶液中，或添加到步骤(iv)中形成的所述液体组合物中。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述生物活性剂为皮质类固醇。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述皮质类固醇为曲安西龙、曲安奈德或己曲安奈德。
38.根据权利要求1-22中任一项所述的试剂盒或液体组合物，用于对身体部位的应用中。
39.根据权利要求38所述的试剂盒或液体组合物，用于胚胎发育、组织构造、伤口愈合、血管发生或肿瘤发生。
40.根据权利要求38所述的试剂盒或液体组合物，用于防止手术粘连或治疗骨关节炎或类风湿性关节炎。
41.根据权利要求1-18和20-22中任一项所述的试剂盒，其中所述乙烯基砜衍生化透明质酸(“HA-VS”)的水溶液无菌。
42.根据权利要求1-18、20-22和41中任一项所述的试剂盒，其中所述巯基官能化聚乙二醇和所述缓冲溶液无菌。
43.根据权利要求2-16、19、20和21所述的液体组合物，其中所述乙烯基砜衍生化透明质酸(“HA-VS”)的水溶液无菌。
44.根据权利要求2-16、19、20、21和43所述的液体组合物，其中所述巯基官能化聚乙二醇和所述缓冲溶液无菌。
45.根据权利要求23-29中任一项所述的方法，其中所述乙烯基砜衍生化透明质酸(“HA-VS”)的水溶液、所述巯基官能化聚乙二醇或所述缓冲溶液中任一种或多种无菌。
46.根据权利要求30-37中任一项所述的方法，包括(ii)为来自步骤(i)的所述溶液灭菌。
47.根据权利要求30-37和46中任一项所述的方法，其中来自步骤(iii)的所述巯基官能化聚乙二醇和所述缓冲溶液其中之一或二者均无菌。
48.一种由根据权利要求2-16、19-21、43和44中任一项所述的液体组合物形成的水凝胶。
49.根据权利要求38所述的试剂盒或液体组合物，用于关节镜或开放性关节手术中以修复关节(即，软骨)的组织。
50.根据权利要求38所述的试剂盒或液体组合物，用于组织封闭应用中。
51.根据权利要求38所述的试剂盒或液体组合物，用于实现止血。
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Denomination of invention: In-situ gel forming compositions

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