PT2699274E

PT2699274E - Composições formadoras de gel in situ

Info

Publication number: PT2699274E
Application number: PT127191583T
Authority: PT
Inventors: David M Gravett; George Y Daniloff; Pingren He
Original assignee: Carbylan Therapeutics Inc
Priority date: 2011-04-20
Filing date: 2012-04-18
Publication date: 2015-06-23
Also published as: EP2699274A1; HK1195265A1; US20170239358A1; KR20140023372A; DK2699274T3; US20140221307A1; ES2537411T3; MX340323B; CN103732264A; MX2013012184A; AU2012245517A1; AU2012245517B2; WO2012145439A1; EP2699274B1; CN103732264B; US9492383B2; JP5998201B2; JP2014514320A; CA2833739A1

Description

DESCRIÇÃO

COMPOSIÇÕES FORMADORAS DE GEL IN SITU

CAMPO A divulgação refere-se de forma geral a composições formadoras de gel in situ, a kits relacionados, e métodos para preparar e utilizar as ditas composições, entre outras cosas. As composições formadoras de gel in situ são preparadas geralmente misturando uma solução aquosa de ácido hialurónico funcionalizado com vinilsulfona, um polietilenoglicol funcionalizado com tiol, e um tampão, em condições adequadas para formar um gene num lapso de tempo desde segundos a uma hora de mistura. Podem ser utilizados as composições biocompativeis resultantes, por exemplo, como adesivos biomédicos e vedantes, para a administração localizada de princípios ativos, como agentes de volume e cargas, entre outras utilizações.

ANTECEDENTES 0 ácido hialurónico é um glicosaminoglicano não sulfatado, aniónico, que é produzido naturalmente e que é distribuído amplamente através dos tecidos conjuntivos, epiteliais, e neurais. Uma pessoa com um peso médio de 70 kg (154 lb) tem a grosso modo 15 gramas de ácido hialurónico em seu corpo, um terço do qual é reposto (degradado e sintetizado) a cada dia (Stern R. Eur J Cell Biol 83 (7) : 317-25, (2004) ) . Como o ácido hialurónico encontra-se naturalmente em muitos tecidos do corpo e é, portanto, biocompatível, acredita-se que é muito adequado para aplicações biomédicas. Infelizmente, quando se administra e se utiliza ácido hialurónico como agente terapêutico em sua forma natural, é eliminado normalmente de forma rápida do corpo, fazendo com que seja necessária uma administração frequente. Desta maneira, são muito desejáveis formulações de ácido hialurónico que mantenham os benefícios do ácido hialurónico sem alterar, tais como uma boa biocompatibilidade, mas que superem o problema de uma rápida depuração. As ditas formulações devem idealmente ter uma boa citocompatibilidade, benefício químico, reologia e outras propriedades, e possuem uma facilidade de administração.

Foram descritos previamente formas modificadas de ácido hialurónico. Por exemplo, um ácido hialurónico que tem um grau baixo de substituição, assim como seus produtos reticulados, são descritos na publicação de patente internacional N°. WO 2011/014432. Os hidrogéis e as composições descritas na anterior possuem propriedades pró-inflamatórias muito baixas juntamente com algumas outras características vantajosas, mas não tendem a experimentar uma rápida gelificação.

Uma rápida gelificação é uma característica geral dos géis formadores in situ. Os hidrogéis formadores in situ são composições que são líquidas após a formação e aplicação a um local de tratamento, mas que experimentam uma transição de fase para formar um hidrogel posteriormente. Podem ser utilizados géis biodegradáveis, formadores in situ injetáveis que representam uma alternativa atrativa aos hidrogéis proporcionados como tais, devido à facilidade de administração e à versatilidade em termos de tempos de gelificação, boa adesão, e similares.

Desta maneira, seria muito vantajoso formar uma composição que tenha as vantagens dos hidrogéis descritas na Publicação de Patente Internacional N° WO 2011/014432, mas com o benefício adicional e muito desejável de estar na forma de um gel formador in situ. O documento EP2177236 descreve a preparação de um hidrogel de gelificação rápida biocompatível. Os hidrogéis baseiam-se na mistura de uma macromolécula tiolada (componente A) , que pode ser, por exemplo, ácido hialurónico, com um reticulante que tem grupos reagentes com tiol (componente B) . Os grupos reagentes com tiol incluem grupos vinilsulfona. Descreve-se usualmente o componente B como um derivado de PEG.

SUMÁRIO São proporcionados no presente documento materiais para preparar uma composição precursora de hidrogel liquido eficaz para formar um hidrogel in situ. Os materiais precursores reagentes estão suficientemente moídos de tal maneira que pode ser realizada in situ uma transição de fase de liquido a sólido, por exemplo, em contacto direto com um tecido, em ausência de condições ou reagentes que poderiam ser prejudiciais por outra parte ao tecido no local em que é formada o gel. Os hidrogéis resultantes possuem boa resistência mecânica e podem ser preparados para ter tempos de gelificação variáveis.

Num primeiro aspeto geral, é proporcionado no presente documento um kit que compreende componentes que, após sua mistura e aplicação a um local de tratamento, resulta em uma formação in situ de hidrogel.

Em geral, o kit compreende (i) um primeiro recipiente que compreende uma solução aquosa de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona ("AH-VS") a uma concentração de entre cerca de 10-300 mg/ml, em que VS-HS tem entre cerca de 2 % - 70 % dos seus grupos hidroxilo substituídos com vinilsulfona, (ii) um segundo recipiente que compreende um polietilenoglicol funcionalizado com tiol que tem entre 2 e 8 grupos tiois, e (iii) um terceiro recipiente que compreende uma solução tampão 30 -1000 mM a um pH que varia entre cerca de 7-12 para proporcionar uma solução que tem uma concentração de AH-VS de 2-8 % (p/v) e uma concentração de polietilenoglicol funcionalizado com tiol de 2-8 % (p/v), em que os componentes, quando são combinados, são eficazes para formar um gel em segundos (por exemplo, 5 segundos) a 1 hora de mistura.

Em outro aspeto adicional, é proporcionado no presente documento uma composição liquida resultante da combinação de (i) uma solução aquosa de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona ("AH-VS") a uma concentração de entre cerca de 10-300 mg/ml, em que VS-HS tem entre cerca de 2 % 70 % dos seus grupos hidroxilo substituídos com vinilsulfona, (ii) um polietilenoglicol funcionalizado com tiol que tem de 2 a 8 grupos tiois, e (iii) uma solução tampão 30 -1000 mM a um pH que varia entre cerca de 7 -12, em que a concentração do polietilenoglicol funcionalizado com tiol na composição líquida varia entre cerca de 4- 300 mg/ml, ou entre 10-300 mg/ml, são eficazes para formar um gel em segundos (por exemplo, 5 segundos) a cerca de 1 hora de mistura.

Ainda num aspeto adicional, é proporcionado no presente documento um método para formar uma composição liquida capaz de formação de gel in situ. O método compreende: (i) adicionar um polietilenoglicol funcionalizado com tiol que tem de 2 a 8 grupos tiois, preferentemente em forma de pó, a uma solução aquosa de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona ("AH-VS") que tem uma concentração de entre cerca de 10-300 mg/ml, em que AH-VS tem entre cerca de 2 % - 70 % dos seus grupos hidroxilo substituídos com vinilsulfona, para dissolver deste modo o polietilenoglicol funcionalizado com tiol para formar uma solução que contém polietilenoglicol funcionalizado com tiol-ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona, e (ii) combinar a solução da etapa (i) com uma solução tampão 30-1000 mM a um pH que varia entre cerca de 7 - 12, para formar desta maneira uma composição líquida que tem uma concentração de AH-VS de 2-8 % (p/v) e uma concentração de polietilenoglicol funcionalizado com tiol de 2-8 % (p/v), onde a composição líquida é eficaz para formar um gel em segundos a cerca de 1 hora de combinação.

Ainda num aspeto adicional, é proporcionado no presente documento um método alternativo para formar uma composição líquida capaz de formação de gel in situ. 0 método compreende: (i) adicionar uma porção pequena de polietilenoglicol funcionalizado com tiol, por exemplo, de cerca de 0,1 % em peso a cerca de 4 % em peso (PEG a AH-VS funcionalizado com tiol em p/p), preferentemente em forma de pó, a uma solução aquosa de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona ("AH-VS") que tem uma concentração de entre cerca de 10-300 mg/ml, em que VS-HS tem entre cerca de 2 % - 70 % dos seus grupos hidroxilo substituídos com vinilsulfona, para formar desta maneira uma solução, (ii) esterilizando opcionalmente a solução da etapa (i) , (iii) adicionando à solução da etapa (i) ou a etapa (ii) se é realizada, a quantidade restante de polietilenoglicol funcionalizado com tiol, preferentemente em forma de pó, em que o polietilenoglicol funcionalizado com tiol tem entre 2 a 8 grupos tiois, e o polietilenoglicol funcionalizado com tiol é opcionalmente estéril, para dissolver desta maneira a quantidade restante de pó de polietilenoglicol funcionalizado com tiol para formar uma solução que contém polietilenoglicol funcionalizado com tiol-ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona, e (iv) misturar a solução que contém polietilenoglicol funcionalizado com tiol-ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona com uma solução tampão 30 -1000 mM a um pH que varia entre cerca de 7 - 12, para formar desta maneira uma composição líquida que tem uma concentração de AH-VS de 2-8 % (p/v) e uma concentração de polietilenoglicol funcionalizado com tiol de 2-8 % (p/v), para formar deste modo uma composição líquida eficaz para formar um gel em segundos a cerca de 1 hora de mistura.

Nos aspetos descritos anteriormente e as formas de realização relacionadas, qualquer uma ou mais da solução aquosa de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona ("AH-VS"), o polietilenoglicol funcionalizado com tiol, ou a solução tampão, pode ser estéril. São proporcionados também no presente documento hidrogéis formados in situ resultantes dos kits, a composição liquida, e os métodos anteriormente descritos, os métodos de aplicação a um local de tratamento, os métodos de utilização, e similares.

As formas de realização adicionais das composições, métodos, kits, utilizações e similares serão evidentes a partir da seguinte descrição, os exemplos, e as reivindicações. Como é possível apreciar a partir do anterior e da seguinte descrição, todas e cada uma das características descritas no presente documento, e todas e cada uma das combinações de duas ou mais das ditas características, se incluem no alcance da presente divulgação com a condição de que as características incluídas na dita combinação não sejam mutuamente inconsistentes. Além disso, podem ser excluídas de maneira específica qualquer característica ou combinação de características de qualquer forma de realização da presente invenção. Outros aspetos e vantagens adicionais da presente invenção são definidos na seguinte memória descritiva, particularmente quando se consideram juntamente com os exemplos e desenhos acompanhantes.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIG. 1 mostra reação do ácido hialurónico com a divinilsulfona em presença de uma base para formar ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona (AH-VS) . A FIG. 2 é um espetro de RMN ΤΗ do ácido hialurónico modificado com vinilsulfona (AH-VS) preparado como se descreve no Exemplo 1 (em D20) . Com base na RMN, foi determinado que o ácido hialurónico possuía um nível de substituição da vinilsulfona de cerca de 11 % por dissacárido. A FIG. 3 mostra um equipamento de pressão de rompimento utilizado para determinar a pressão de rompimento como se descreve no Exemplo 5.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Será descrito a partir de agora a presente invenção de maneira mais completa. A presente invenção pode, no entanto, ser realizada de muitas formas diferentes e não deve ser interpretada como que está limitada às formas de realização que são mostradas no presente documento; em seu lugar, são proporcionados estas formas de realização de maneira que esta divulgação seja extensa e completa, e transmitirão completamente o alcance da invenção aos peritos na especialidade.

Definições

Deve ser destacado que, como se utiliza na presente memória descritiva, as formas do singular "um", "uma" e "o" ou "a" incluem referência em plural a menos que o contexto dite claramente o contrário. Desta maneira, por exemplo, a referência a um polímero inclui um polímero individual assim como dois dos mesmos ou diferentes polímeros. A menos que seja especificamente indicado de outro modo, as definições dos termos usados no presente documento são definições normalizadas utilizadas nas técnicas da síntese orgânica, e ciências dos polímeros e farmacêutica.

Ao descrever e reivindicar a presente invenção, será utilizada a seguinte terminologia de acordo com as definições descritas a seguir.

Um "polímero biocompatível" é um polímero que tem produtos de degradação que são compatíveis com tecido vivo, ou que podem ter propriedades biológicas benéficas. 0 polímero biocompatível pode ser biocompatível por si mesmo e/ou pode ser sinergicamente biocompatível quando é utilizado juntamente com um princípio biologicamente ativo.

Entende-se que o termo "ácido hialurónico" refere-se a ácido hialurónico não modificado ou não derivatizado.

Os termos "derivado de ácido hialurónico" ou "ácido hialurónico derivatizado" ou "ácido hialurónico modificado" ou "ácido hialurónico substituído" referem-se a ácido hialurónico que foi derivatizado por meio de reação com, por exemplo, um ou mais resíduos químicos pequenos tais como divinilsulfona ou similares. 0 termo "reativo" refere-se a um grupo funcional (por exemplo, presente num polímero) que reage facilmente ou a uma taxa prática em condições convencionais de síntese orgânica. Isto se diferencia com aqueles grupos que não reagem ou requerem catalisadores fortes ou condições de reação não práticas para reagir (isto é, um grupo "não reativo" ou "inerte"). "Massa molecular" ou peso molecular, tal como são utilizados no presente documento, no contexto de um polímero solúvel em água tal como ácido hialurónico, refere-se a uma massa molecular média nominal de um polímero determinada por meio de dispersão de luz multiangular. Pode ser expressa a massa molecular tanto como uma massa molecular média em número como numa massa molecular média em peso. A menos que seja indicado de outro modo, todas as referências a massas moleculares no presente documento referem-se a uma massa molecular média em número. Em ausência de um valor de massa molecular, um polímero pode ser caracterizado também por sua viscosidade intrínseca ou inerente, que é um método viscosimétrico para medir a massa molecular. 0 termo "hidrogel" refere-se a uma rede ou um gel polimérico hidrófilo tridimensional que contém água em que a água é a fase contínua, por exemplo, em que o conteúdo de água é maior que 50 % (p/p).

Entende-se que o termo, "pulverização" tal como se utiliza no presente documento refere-se a uma composição atomizada.

Por "gelificação" entende-se a formação de um material num estado gelifiçado.

Uma composição "estéril" é aquela que está isenta de micróbios viáveis tal como foi determinado utilizando o ensaio de esterilidade USP. Veja-se "The United States Pharmacopeia", 30a Revisão, The United States Pharmacopeial Convention: 2008. O termo "esponja", tal como se utiliza no presente documento significa uma estrutura de hidrogel porosa. A expressão "solução aquosa solúvel" refere-se a uma composição ou composto que pode ser dissolvido num tampão aquoso tal como uma solução salina tamponada com fosfato a uma concentração de pelo menos 0,1 mg/ml a temperatura ambiente. O termo "fármaco" ou "agente farmaceuticamente ativo" ou "agente bioativo" ou "agente ativo" que são utilizados indistintamente, significa qualquer composto ou substância orgânica ou inorgânica que tem bioatividade e se adapta ou se utiliza para fins terapêuticos. Proteínas, hormonas, agentes anticancerosos, compostos químicos de molécula pequena e miméticos, oligonucleótidos, ADN, ARN e tratamentos génicos estão incluídos na definição mais ampla de "fármaco". Tal como se utiliza no presente documento, a referência a um fármaco, assim como a referência a outros compostos químicos no presente documento, entende-se que inclui o composto em qualquer de suas formas farmaceuticamente aceitáveis, que incluem isómeros tais como diastereómeros e enantiómeros, sais, solvatos, e polimorfos, formas cristalinas particulares, assim como misturas racémicas e isómeros puros dos compostos descritos no presente documento, desde que seja aplicável.

Um "fármaco insolúvel em água" ou um "fármaco que é pouco solúvel em água" é aquele que tem uma solubilidade aquosa abaixo de 10 mg/ml.

Os termos "quantidade eficaz" ou "quantidade farmaceuticamente eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma composição (ou hidrogel ou polímero), tal como é proporcionado no presente documento, refere-se a uma quantidade não tóxica mas suficiente da composição que proporciona a resposta desejada, tal como evitar, diminuir, ou eliminar a dor num indivíduo. A quantidade exata requerida variará de um indivíduo a outro, dependendo da espécie, a idade, e o estado geral do indivíduo, a gravidade da condição patológica que está a ser tratada, o fármaco ou fármacos concretos utilizados específicos da composição, o modo de administração, e similares. Um perito normal na especialidade pode determinar uma quantidade "eficaz" adequada em qualquer indivíduo utilizando experimentação rotineira. "Opcional" ou "opcionalmente" significa que a circunstância que se descreve a seguir pode ocorrer ou não, de tal maneira que a descrição inclui casos em que a circunstância ocorre e casos em que não ocorre. 0 termo "substancialmente" em referência a determinada característica ou entidade significa até um grau significativo ou quase completamente (isto é, até um grau de 85 % ou mais) em referência à caracteristica ou entidade.

Entende-se que o termo "cerca de", particularmente em referência a uma quantidade dada, abrange desvios de mais ou menos cinco por cento.

Podem ser encontradas também definições adicionais nas seções que seguem.

Descrição geral 0 presente pedido baseia-se, pelo menos em parte, no descobrimento dos inventores de uma composição formadora de gel in situ. As composições precursoras proporcionadas no presente documento demonstram uma rápida gelificação, assim como propriedades adesivas benéficas, e boa biocompatibilidade. Utilizando reagentes que têm um grau concreto de modificação polimérica, concentrações eficazes para favorecer a formação de soluções homogéneas (isto é, solução) e rápida gelificação, assim como condições de pH concretas, os inventores proporcionaram métodos, composições líquidas precursoras formadoras de gel, kits, e os hidrogéis resultantes, entre outras cosas, que têm numerosas características benéficas, que se van a descrever com mais detalhe a seguir.

Os hidrogéis descritos no presente documento são formados geralmente por meio de reação do ácido hialurónico que tem um grau concreto de modificação da vinilsulfona com um polietilenoglicol funcionalizado com tiol. Os hidrogéis resultantes são formados in situ em condições suaves -sem necessidade de iniciadores ou aceleradores ou outros aditivos prejudiciais. As características da composição, os métodos relacionados, as utilizações, e os kits, e similares serão descritos agora com mais detalhe a seguir. Métodos para preparar composições precursoras eficazes para formar em géis in situ Reagentes/Componentes Ácido hialurónico modificado com vinilsulfona

Na preparação dos presentes géis formadores in situ, um dos reagentes utilizados é o ácido hialurónico modificado por meio de reação com divinilsulfona. Veja-se, por exemplo, a Fig. 1, que proporciona um esquema de reação geral para preparar ácido hialurónico modificado com vinilsulfona. 0 ácido hialurónico (AH) é um polissacárido linear de origem natural composto de unidades de dissacáridos alternantes de N-acetil-D-glicosemina e ácido D-glucurónico unidas por meio de ligações β l->3 glucuronídicas e β 1- >4 glicoseminídicos alternantes, de tal maneira que a unidade de repetição é (l->4)-β-D-GlcA-(l->3)-β-D-GlcNAc. 0 ácido hialurónico para utilização na preparação de uma ou mais composições formadoras de hidrogéis in situ é derivatizada com vinilsulfona. Veja-se, por exemplo, Exemplos 1, 2, e 3, que descreve a preparação de ácido hialurónico modificado com vinilsulfona que tem níveis variáveis de substituição, 11 %, 14 %, e 20 %, respetivamente. Os grupos hidroxilo do ácido hialurónico são transformados em grupos (2-(vinilsulfonil)etoxi) por meio de reação com divinilsulfona em presença de uma base. O ácido hialurónico ativado resultante é ácido (2-(vinilsulfonil)etoxi)hialurónico ou AH-VS. Por conveniência, o material é denominado normalmente no presente documento ácido hialurónico modificado com vinilsulfona ou simplesmente "AH-VS". Para preparar estas composições de gelificação rápida, a extension da substituição da vinilsulfona no ácido hialurónico pode variar em qualquer caso de 2 % a 70 %, embora se prefieren normalmente níveis menores de modificação polimérica neste intervalo. O ácido hialurónico modificado com vinilsulfona ilustrativo poseerá um nível de substituição da vinilsulfona que variará desde 7 % a cerca de 35 %, ou de forma mais preferente de 10 % a 25 %.

Um grau de modificação ou substituição de 2 % significa que uma média de 2 % de unidades dissacáridas do ácido hialurónico contém um grupo vinilsulfona. Especificamente, numa forma de realização preferida, o ácido hialurónico tem de cerca de 10 % a cerca de 25 % dos seus grupos hidroxilo derivatizados por meio de uma reação de adição com divinilsulfona. Os grupos hidroxilo do ácido hialurónico são transformados em grupos (2-(vinilsulfonil)etoxi). O ácido hialurónico ativado resultante é denominado geralmente no presente documento ácido (2-(vinilsulfonil)etoxi)hialurónico ou AH-VS. Em particular, o ácido hialurónico pode ter um grau de conversão de grupos hidroxilo a grupos 2-vinilsulfononil)etoxi num intervalo entre qualquer duas das anteriores percentagens: por exemplo, entre 10 %-35 %, por exemplo, entre 11 %-35 %, ou entre 12-35 %, e assim sucessivamente. Em particular, o ácido hialurónico pode ter um grau de substituição da vinilsulfona selecionado a partir das seguintes percentagens: 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, e 35 %, juntamente com os intervalos resultantes de todas e cada uma das combinações de números inteiros proporcionadas, por exemplo, entre 10-15 %, entre 15-20 %, entre 20-25 %, e assim sucessivamente. Numa forma de realização mais especifica, o ácido hialurónico tem um grau de conversão de grupos hidroxilo a grupos (2-(vinilsulfonil) etoxi) de cerca de 10 - 25 % por unidade de repetição de dissacárido.

O grau de substituição/modificação de ácido hialurónico pode ser determinado por meio de gualguer de numerosos métodos adeguados, por exemplo, RMN, UV, ou IR, ou análise elemental. Um método preferido para calcular a percentagem de substituição de um polímero tal como ácido hialurónico é RMN, por exemplo, RMN de protões. Veja-se, por exemplo, o Exemplo 1 em gue foi determinado o grau de modificação do ácido hialurónico com base na relação de áreas máximas relativas correspondentes à vinilsulfona e ao grupo acetamida metilo do ácido hialurónico no espetro de RMN O ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona terá normalmente uma massa molecular média no intervalo de cerca de 10.000 a 2.000.000 daltons. A massa molecular ilustrativa varia entre cerca de 15.000 a 1.000.000 daltons, ou entre cerca de 20.000 a 200.000 daltons. Os intervalos de pesos moleculares adequados adicionais incluem de cerca de 30.000 daltons a cerca de 100.000 daltons, ou de cerca de 40.000 daltons a 80.000 daltons. Os pesos moleculares de ácido hialurónico são geralmente valores de massa molecular média, que podem ser determinados, por exemplo, por meio de cromatografia de exclusão por dispersão de luz laser multiangular (MALLS-SEC). Dependendo de sua fonte, o ácido hialurónico pode ter uma polidispersidade (Mw/Mn) de até ao redor de 3, ou mais preferentemente, até ao redor de 2. Em geral, o material de partida do ácido hialurónico terá uma distribuição de pesos moleculares mais para estreita, com valores menores de cerca de 2,5, mais preferentemente menores de cerca de 2. As polidispersidades ilustrativas do ácido hialurónico variam de cerca de 1,02 a cerca de 2,5, em que o ácido hialurónico de partida pode ter uma polidispersidade de cerca de 1,02, 1,05, 1, 1, 1,2, 1,3, 1,3, 1,5, 1, 6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4 ou 2,5, ou inclusive mais .

Como alternativa, um material de partida de ácido hialurónico adequado para a derivatização pode ter uma viscosidade intrínseca, normalmente em centipoise, a uma concentração específica em água, que corresponde a qualquer uma ou mais dos intervalos de pesos moleculares proporcionados anteriormente. AH-VS, que tem qualquer combinação de características descritas anteriormente (extensão da modificação, massa molecular, etc., é adequado para a utilização nas composições, kits, métodos e utilizações proporcionados no presente documento.

Polietilenoglicol (PEG) funcionalizado com tiol

Os PEG funcionalizados com tiol para utilização na formação do gel in situ podem ser lineares, ramificados (que têm dois braços poliméricos), ou de braços múltiplos (por exemplo, que têm 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais braços poliméricos que se estendiam desde um núcleo central) . As moléculas do núcleo ilustrativas para PEG de braços múltiplos incluem eritritol, pentaeritritol, trimetilolpropano, glicerol, dímero de glicerol (3,3'-oxidipropano-1,2-diol), oligómeros de glicerol, sorbitol, hexaglicerol, e similares. PEG-tiois de braços múltiplos como os anteriores possuem braços de polietilenoglicol que emanam da molécula do núcleo central e possuem dois ou mais grupos tiol terminais. Os PEG funcionalizados com tiol podem ser preparados por meio de derivatização de material de partida de PEG comercialmente disponível ou pode ser adquirido diretamente de fornecedores tais como Pierce (Thermo Fischer Scientific), Laysan Bio, Inc. (Arab, Alabama), SunBio (PEG=SHOP, Coreia), e similares.

Urn PEG funcionalizado com tiol compreende dois ou mais grupos tiol. Os ditos grupos tiol reagirão com uma vinilsulfona tal como ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona. Os PEG funcionalizados com tiol ilustrativos incluem PEG-ditiol (HS-PEG-SH ou HS-CH2CH2-(OCH2CH2) nSH) , PEG-tritiol de 3 braços (núcleo de glicerina), PEG-tetratiol de 4 braços (núcleo de pentaeritritol), ou PEG-octatiol de 8 braços (núcleo de hexaglicerina). Os anteriores reagentes de PEG de múltiplos braços podem ter também alguns dos braços funcionalizados com tiol. Os reagentes de tiol adequados adicionais que têm PEG como molécula central estão disponíveis de Laysan Bios (Arab, Alabama) e SunBio (PEG-SHOP, Coreia), assim como os ditiois aromáticos tais como os disponíveis de NanoScience. Os tiois de PEG preferidos terão numerosos grupos tiol selecionados entre 2, 3, 4, 5, 6, 7, e 8. São adequadas também as moléculas de polietilenoglicol que têm 2-8 grupos tiol pendentes substituídos na cadeia de polietilenoglicol linear. A massa molecular do PEG tiol é normalmente menor que a do ácido hialurónico modificado com vinilsulfona. Em geral, a massa molecular do PEG tiol varia desde cerca de 200 a cerca de 20.000 daltons. A massa molecular ilustrativo adicional varia para o reticulante de PEG tiol está entre cerca de 1000 a cerca de 10.000 daltons (por exemplo, que tem uma massa molecular de cerca de 1 kD, 2 kD, 3 kD, 4 kD, 5 kD, 6 kD, 7 kD, 8 kD, 9 kD, ou 10 kD, em que kD é igual a kilodalton) ou inclusive entre cerca de 1.000 a 5.000 daltons. Desta maneira, Os PEG tiois que têm uma massa molecular compreendida entre qualquer das massas moleculares anteriores são adequados para a utilização na formação dos presentes hidrogéis. Por exemplo, o PEG tiol pode ter uma massa molecular entre cerca de 500 a 10.000 daltons, ou entre cerca de 1.000 e 10.000 daltons, ou entre cerca de 2.000 e 9,000 daltons, ou entre cerca de 3,000 e 8,0000 daltons, e assim sucesivamente. As massas moleculares ilustrativas para um reticulante tal como PEG ditiol, ou qualquer dos outros reticulantes adequados descritos anteriormente, incluem cerca de 3350, 3400, e 5000 daltons, entre outros.

Os PEG tiois que têm qualquer combinação de características tal como foi descrito anteriormente (arquitetura, por exemplo, linear ou ramificado, número de grupos tiois, massa molecular, etc., são adequados para a utilização nas composições, kits, métodos, e utilizações proporcionados no presente documento.

Agentes bioativos

Os hidrogéis, precursores de hidrogéis, e as composições relacionadas e/ou os kits proporcionados no presente documento podem compreender opcionalmente um agente bioativo. Os agentes bioativos incluem moléculas pequenas, proteínas, anticorpos, células, fatores de crescimento, etc., tais como os descritos a seguir.

Os agentes bioativos que podem ser incluídos nos kits, composições, e combinações proporcionadas no presente documento incluem agentes antimicrobianos, antibióticos, analgésicos, antibióticos, agentes antiproliferativos/antimitóticos que incluem produtos naturais tais como alcaloides da vinca (por exemplo, vinblastina, vincristina, e vinorelbina), paclitaxel, epidipodofilotoxinas (por exemplo, etopósido, tenipósido), antibióticos (dactinomicina (actinomicina D) daunorubicina, doxorubicina e idarubicina), antraciclinas, mitoxantrona, bleomicinas, plicamicina (mitranmicina) e mitomicina, enzimas (L-asparaginasa); agentes alquilantes antiproliferativos/antimitóticos tais como mostardas de azoto (mecloretamina, ciclofosfamida e análogos, melfalan, clorambucilo), etileniminas e metilmelaminas (hexametilmelamina e tiotepa), alquil sulfonatos-busulfán, nitrosoureias (carmustina (BCNU) e análogos, estreptozocina), trazenos - dacarbazinina (DTIC); antimetabolitos antiproliferativos/antimitóticos tais como análogos de ácido fólico (metotrexato), análogos de pirimidina (fluorouracilo, floxuridina, e citarabina), análogos de purina e inibidores relacionados (mercaptopurina, tioguanina, pentostatina e 2-clorodesoxiadenosina [cladribina]); complexos de coordenação do platino (cisplatino, carboplatino) , procarbazina, hidroxiureia, mitotano, aminoglutetimida; hormonas (por exemplo, estrógeno); anticoagulantes (heparina, sais de heparina sintética e outros inibidores de trombina); agentes fibrinoliticos (tais como ativadores do plasminógeno tissular, estreptoquinase e uroquinase), aspirina, dipiridamol, ticlopidina, clopidogrel, abciximab; agentes antimigratórios; agentes antisecretórios (tais como brefeldina A) ; agentes anti-inflamatórios tais como esteroides adrenocortiçais (hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, acetato de cortisona, pivalato de tioxortol, prednisolona, metilprednisolona, prednisona, triamcinolona acetonida (ou qualquer outra sal farmaceuticamente aceitável de triamcinolona), álcool de triamcinolona, mometasona, amcinonida, budesonida, desonida, fluocinonida, fluocinolona acetónido, halcinonida, betametasona, fosfato sódico de betametasona, dexametasona, fosfato sódico de dexametasona, e fluocortolona, hidrocortisona-17-butirato, hidrocortisona-17-valerato, dipropionato de aclometasona, valerato de betametasona, dipropionato de betametasona, prednicarbato, clobetasona-17-butirato, clobetasol-17-propionato, caproato de fluocortolona, pivolato de fluocortolona, e acetato de fluoprenideno. dipropionato de beclometasona monohidratado, flunisolida, fluticasona propionato, furoato de mometasona monohidratado, acetoneto de triamcinolona, fluticasona, furoato, agentes não esteroideos (derivados de ácido salicilico, por exemplo, aspirina); derivados de para-aminofenol, isto é, acetominofeno; indol e ácidos indenoacéticos (indometacina, sulindaco, e etodolac), ácidos heteroaril acéticos (tolmetina, diclofenaco, e ketorolaco), ácidos arilpropiónicos (ibuprofeno e derivados), ácidos antranilicos (ácido mefenámico e ácido meclofenámico), ácidos enólicos (piroxicam, tenoxicam, fenilbutazona, e oxipentatrazona), nabumetona, compostos de oro (auranofina, aurotioglicose, tiomalato de ouro sódio); imunosupressores (ciclosporina, tacrolimus (FK-506), sirolimus (rapamicina), azatioprina, mofetilo de micofenolato); proteínas de fatores de crescimento mitógenos ou morfogénicos, péptidos ou miméticos; factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento de fibroblastos (FGF), membros da superfamília do fator-β de crescimento transformante (TGF-β) que incluem os TGF-β e as proteínas morfogénicas óseas (BMP) tais como BMP-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8; insulina e fatores de crescimento de tipo insulina (IGF), fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fatores de crescimento epidérmico (EGF), proteínas hedgehog (SHH e IHH), ativinas, inhibinas, fatores do osso desmineralizado (DBM) e fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGF) , fatores de crescimento hematopoético (G-CSF, CSF-1, GM-CSF, eritropoietina, citoquinas e linfoquinas que incluem a família da interleuquinas (IL-1 a 34)), interferões, fatores de crescimento nervoso (NGF), anticorpos neutralizantes, antagonistas ou agonistas, agonistas ou antagonistas do recetor do fator de crescimento, dadores de óxido nítrico; oligonucleótidos antisense, fatores de transcrição, mediadores da cascata de sinalização, e combinações dos mesmos.

Os antibióticos incluem antibióticos da família da lincomicina (em referência a uma classe de agentes antibióticos recuperados originalmente de Streptomyces lincolnensis) ; Os antibióticos da família da tetraciclina (em referência a uma classe de agentes antibióticos recuperados originalmente de Streptomyces aureofaciens); antibióticos baseados em enxofre tais como as sulfonamidas; e assim sucessivamente. Os antibióticos ilustrativos da família da lincomicina incluem a própria lincomicina (6,8-didesoxi-6-[[(1-metil-4-propil-2-pirrolidinil)-carbonil]amino-]-1-tio-L-treo-D-galacto-octopiranósido), clindamicina, o derivado 7-desoxi, 7-cloro de lincomicina (por exemplo, 7-cloro-6,7,8-tridesoxi-6-[[(l-metil-4-propil-2-pirrolidinil)carbonil]amino]-1-tio-L-treo-D-galacto-octopiranósido), e seus sais e ésteres farmaceuticamente aceitáveis. Os antibióticos ilustrativos da família da tetraciclina incluem a própria tetraciclina 4-(dimetilamino)-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octahidro-3,6,12,12a-pentahidroxi-6-metil-l,1l-dioxo-2-naftacenocarboxamida), clortetraciclina, oxitetraciclina, tetraciclina, demeclociclina, rolitetraciclina, metaciclina e doxiciclina e seus sais e ésteres farmaceuticamente aceitáveis, particularmente os sais de adição tais como o sal de cloridrato. Os antibióticos baseados em enxofre ilustrativos incluem, mas não se limitam a, as sulfonamidas sulfacetamida, sulfabenzamida, sulfadiazina, sulfadoxina, sulfamerazina, sulfametazina, sulfametizol, sulfametoxazol, e seus sais e ésteres farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, sulfacetamida de sódio. Os antimicrobianos e/ou antibióticos incluem além disso compostos tais como eritromicina, bacitracina, neomicina, penicilina, polimixina B, tetraciclinas, viomicina, cloromicetina e estreptomicinas, cefazolina, ampicilina, tobramicina, tobramicina, clindamicina e gentamicina.

Os analgésicos incluem compostos tais como lidocaína, benzocaína, e marcaína.

Um hidrogel que é proporcionado no presente documento pode incluir também células vivas. As células vivas ilustrativas incluem citoblastos, citoblastos parenquimais, células derivadas do sangue, e células da médula óssea.

Os agentes bioativos adicionais incluem, mas não se limitam a aqueles que inibem um ou uma combinação de processos que incluem, mas que não se limitam à divisão celular, a secreção celular, a migração celular, adesão celular, produção e/ou libertação de citoquinas, quimioquinas (ou outro ativador inflamatório), angiogénese, e/ou formação e/ou libertação de radicais livres, e/ou da cascata de coagulação. Em particular, as composições proporcionadas no presente documento podem implicar proporcionar a alteração de processos celulares e/ou não celulares implicados no desenvolvimento e/ou a manutenção de aderências cirúrgicas. De maneira adicional, as presentes composições podem proporcionar a alteração farmacológica de processos celulares e/ou não celulares no desenvolvimento e/ou o manutenção da restenose. Desta maneira, os agentes bioativos adicionais incluem, mas não se limitam a aqueles que inibem um ou uma combinação de processos que incluem, mas que não se limitam à divisão celular, a secreção celular, a migração celular, adesão celular, produção e/ou libertação de citoquinas, quimioquinas (ou outro ativador inflamatório), angiogénese, e/ou a formação e/ou libertação de radicais livres. De maneira adicional, os agentes bioativos para utilização no presente documento podem inibir ou afetar outros processos implicados no processo de cicatrização. As composições proporcionadas no presente documento podem ser também eficazes para produzir a alteração farmacológica de processos celulares e/ou não celulares que aumentam o desenvolvimento da fibrose. Desta maneira, os agentes bioativos adicionais incluem, mas não se limitam a aqueles que aumentam um ou uma combinação de processos que incluem, mas que não se limitam à divisão celular, a secreção celular, a miqração celular, adesão celular, produção e/ou libertação de citoquinas, quimioquinas (ou outro ativador inflamatório), angiogénese, e/ou a formação e/ou libertação de radicais livres. Os agentes bioativos adicionais podem aumentar ou afetar outros processos implicados no processo de cicatrização de tal maneira que as composições proporcionadas no presente documento podem ser agentes hemostáticos e/ou agentes de prevenção das aderências, de tal maneira que a adição de um fármaco pode tornarr efetivo um aumento ou diminuição da fibrose, e/ou dar como resultado um aumento do tecido e/ou um aumento ou redução das aderências cirúrgicas dependendo do mecanismo do fármaco. Por exemplo, um fármaco que diminui a fibrose se espera que reduza as aderências cirúrgicas. Além disso, a formulação carregada do fármaco pode aumentar as propriedades vedantes e/ou hemostáticas da formulação, especialmente quando o agente age para aumentar a fibrose. De maneira adicional, as composições proporcionadas no presente documento podem implicar proporcionar a alteração farmacológica de processos celulares e/ou não celulares implicados no desenvolvimento e/ou o manutenção de aderências cirúrgicas ou restenose ou em mais termos generais um ou mais processos implicados na fibrose. Desta maneira, os agentes farmacológicos adicionais incluem, mas não se limitam a aqueles que inibem um ou uma combinação de processos que incluem, mas que não se limitam à divisão celular, a secreção celular, a migração celular, adesão celular, produção da matriz extracelular, citoquinas (por exemplo, TNF alfa, IL-1, IL-6), ou outro ativador inflamatório, por exemplo, produção e/ou libertação de quimioquinas (por exemplo, MCP-1 ou IL-8)), angiogénese, e/ou a formação e/ou libertação de radicais livres. Os agentes que inibem a fibrose, a adesão ou a estenose adequados são descritos detalhadamente em, por exemplo, os documentos W02004,060346, WO 2005/051452, WO 2006/13547, e no documento WO 2007/089878, e são determinados também facilmente com base nos modelos (animais) in vitro e in vivo tais como são proporcionados em, por exemplo, o documento W02004/060346.

Em outras formas de realização, o agente ativo pode ser um agente fibrosante, um agente que induz a fibrose e/ou um agente que induz a adesão, os exemplos representativos dos quais se podem encontrar, sem limitação, nas publicações internacionais Nos WO 2005/046746, WO 2005/046747, e no documento WO 2006/124021.

Os fármacos adicionais adequados para a utilização incluem aqueles que são mostrados em detalhe em, por exemplo, o documento W02004/060346. Por exemplo, as composições ilustrativas podem compreender um qualquer ou mais dos seguintes: um inibidor do ciclo celular; paclitaxel; doxorubicina; mitoxantrona; podofilotoxina (por exemplo, etopósido); um agente imunomodulador, everolimus; tacrolimus; biolimus; um antagonista da proteína 90 de choque térmico; geldanamicina; um inibidor da HMG-CoA reductasa; simvastatina; um inibidor de IMPDH; ácido micofenólico; l-alfa-25 dihidroxi vitamina D3; um agente antimicótico tal como sulconizol; um inibidor da quinase P38 MAP tal como SB220025; um componente da matriz extracelular tal como fibronectina; colagénio; fibrina; fibrinógeno; polilisinas; quitosano; N-carboxibutilquitosano; uma proteína RGD; uma citoquina inflamatória selecionada a partir do grupo que consiste em TGFb, PDGF, VEGF, bFGF, TNFa, NGF, GM-CSF, IGF-a, IL-1, IL-8, IL-6, e uma hormona do crescimento; um fator de crescimento do tecido conectivo (CTGF); uma proteína morfogénica ósea (BMP) selecionada entre BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, ou BMP-7; bleomicina; um análogo ou derivado de bleomicina; um agente proliferativo que estimula a proliferação celular; dexametasona e sus análogos e derivados; 17- beta -estradiol e sus análogos e derivados; estradiol e sus análogos e derivados; dietilestibesterol e sus análogos e derivados; ciclosporina A e sus análogos e derivados; ácido retinoico todo trans (ATRA) e sus análogos e derivados. Os agentes bioativos adicionais que podem ser utilizados na presente divulgação são mostrados nos documentos WO 2005/046746, WO 2005/046747, WO 2006/124021, W02004/060346, WO 2005/051452, WO 2006/13547, e no documento WO 2007/089878.

Em particular, o fármaco pode ser uma ou mais proteínas hemostáticas, que incluem sem limitação, trombina, fibrina, fibrinógeno, fatores sanguíneos, fatores de coagulação (por exemplo, Fatores VIII e XIII).

Numa forma de realização preferida, a composição precursora de hidrogel compreende um corticosteroide. Os exemplos de corticosteroides adequados incluem hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, acetato de cortisona, pivalato de tioxortol, prednisolona, metilprednisolona, prednisona, triamcinolona, sais de triamcinolona tais como triamcinolona acetonida, triamcinolona benetonida, triamcinolona furetonida, triamcinolona hexacetonida, diacetato de triamcinolona, álcool de triamcinolona, mometasona, amcinonida, budesonida, desonida, fluocinonida, fluocinolona acetonida, halcinonida, betametasona, fosfato sódico de betametasona, dexametasona, fosfato sódico de dexametasona, fluocortolona, hidrocortisona-17-butirato, hidrocortisona-17-valerato, dipropionato de aclometasona, valerato de betametasona, dipropionato de betametasona, prednicarbato, clobetasona-17-butirato, clobetasol-17-propionato, caproato de fluocortolona, pivolato de fluocortolona, acetato de fluprednideno, dipropionato de beclometasona monohidratado, flunisolida, propionato de fluticasona, furoato de mometasona monohidratado, e furoato de fluticasona.

Um composto preferido para utilização numa formulação de hidrogel que é proporcionado no presente documento é triamcinolona (11β,16α)-9-fluoro-ll,16,17,21- tetrahidroxipregna-1,4-dieno-3,20-diona), ou um de seus sais, éster, ou solvato do mesmo. É mostrado a seguir a estrutura de triamcinolona acetonida. H\ / / i,Kl' \

hev I |.j ^ triamcinoiona acetonida cr ^ ^ 0 agente bioativo será misturado normalmente, será suspenso em, ou será capturado numa composição formadora de hidrogel in situ que é proporcionads no presente documento. Como alternativa, o agente bioativo pode estar na forma de um conjugado polimérico, ou, se pode unir covalentemente, de uma maneira libertável, a um componente utilizado para preparar o hidrogel, por exemplo, o ácido hialurónico modificado ou o PEG funcionalizado com tiol. Método de preparação dos hidrogéis in situ

As composições de gelificação rápida proporcionadas no presente documento são formadas normalmente fazendo reagir o ácido hialurónico modificado com vinilsulfona e o PEG tiol em condições eficazes para formar um gel de formação rápida. Em geral, as quantidades relativas de reagentes e grupos reagentes, juntamente com as condições de reação, são ajustadas para proporcionar uma reação ótima. A solução precursora de hidrogel preparou-se em condições suaves e controladas, sem necessidade de fontes de energia externas. Vejam-se, por exemplo, os exemplos 1-21. Um ou mais componentes do kit e/ou a composição liquida estão preferentemente em forma estéril. Numa forma de realização preferida, o AH-VS é estéril. Numa forma de realização preferida mais adicional, o polietilenoglicol funcionalizado com tiol e o tampão são também estéreis. Método 1

As composições precursoras são preparadas geralmente como segue, embora se apreciará que um perito na especialidade pode modificar adequadamente os métodos descritos para chegar às composições, kits, materiais, e hidrogéis proporcionados no presente documento, com base na presente divulgação. No primeiro método ilustrativo, o ácido hialurónico modificado com vinilsulfona que foi descrito anteriormente é dissolvido geralmente num meio aquoso tal como água, solução salina, ou similares. Isto é, pode ser utlizado qualquer AH-VS que tenha as caracteristicas descritas no presente documento. Por exemplo, um ácido hialurónico modificado com vinilsulfona ilustrativo possui um 11 % de substituição da vinilsulfona e possui uma massa molecular de 100 kilodaltons. O meio aquoso terá geralmente um pH que variará entre cerca de 5-7, e pode, em determinados casos, ser levemente ácido. Idealmente, é proporcionado o ácido hialurónico modificado com vinilsulfona como uma solução muito concentrada na extensão possível com base em sua solubilidade aquosa, para permitir uma gelificação rápida. Normalmente, o AH-VS é proporcionado como uma solução a uma concentração de cerca de 10-300 mg/ml. Os intervalos ilustrativos adicionais de concentrações adequadas incluem os seguintes: entre cerca de 15-250 mg/ml, ou inclusive de forma mais preferente entre cerca de 20-200 mg/ml. Por exemplo, o AH-VS pode possuir uma concentração selecionada a partir de: 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 125 mg/ml, 150 mg/ml, 175 mg/ml, 200 mg/ml, 225 mg/ml, 250 mg/ml, ou 300 mg/ml. De maneira adicional, o AH-VS pode possuir uma concentração compreendida num intervalo derivado de uma combinação de quaisquer duas das concentrações anteriores, por exemplo, entre 15 mg/ml e 125 mg/ml, ou entre 20 mg/ml e 150 mg/ml, e assim sucessivamente. Uma concentração elevada é vantajosa com respeito a uma formação de gel rápida da composição precursora resultante após a mistura.

Uma vez dissolvida, a solução aquosa resultante de ácido hialurónico modificado com vinilsulfona é esterilizada a seguir normalmente. Pode ser realizada a esterilização de qualquer das etapas de esterilização descritas no presente documento, por exemplo, tratamento térmico, esterilização por meio de vapor a alta pressão (por exemplo, esterilização por meio de autoclave), esterilização por meio de óxido de etileno gás (EOG) , esterilização supercritica por meio de dióxido de carbono, esterilização por radiação ou filtração estéril. As fontes de radiação incluem raios a, raios β, raios γ, feixes de neutrões, feixes de eletrões, e raios X. Em determinadas formas de realização, é utilizada a esterilização por meio de raios γ ou a esterilização por feixes de eletrões, em particular para sólidos. Numa solução preferida para esterilizar a solução de AH-VS, a esterilização é por meio de autoclave. Embora possa ser feita referência a um qualquer ou mais componentes do kit ou às composições proporcionadas no presente documento em forma estéril, deve ser entendido que os ditos componentes podem ser ou não estéreis. A seguir adiciona-se o PEG funcionalizado com tiol à solução de ácido hialurónico funcionalizado com vinilsulfona estéril, preferentemente como um pó estéril. Em geral, a quantidade de PEG funcionalizado com tiol com respeito ao ácido hialurónico funcionalizado com vinilsulfona está no intervalo de cerca de 1:1 (p/p) a cerca de 2:1 (p/p). Os componentes são misturados até que o PEG tiol é dissolvido. Embora o PEG funcionalizado com tiol possa ser adicionado como uma solução aquosa, é adicionado preferentemente como um sólido devido a sua elevada solubilidade num meio aquoso, devido a que a adição em forma sólida evita uma diluição adicional da mistura de reação, que pode atrasar os tempos de gelificação. A solução de ácido hialurónico-vinilsulfona-PEG funcionalizado com tiol resultante é misturada a seguir com tampão para formar uma composição precursora de gelificação rápida. 0 tampão está geralmente a um pH entre cerca de 7-12. Preferentemente, o tampão está a um pH de entre cerca de 7,5 a 11, ou inclusive de forma mais preferente entre cerca de 8,0 a 10,5. Os pH ilustrativos da solução tampão incluem 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, e 12, ou qualquer outro pH no intervalo anterior. Os tampões adequados incluem tampões básicos tais como fosfato de sódio, carbonato de sódio, imidizol, tris, HEPES, ácido bórico, MOPS, e similares. Um tampão preferido é fosfato de sódio. A solução tampão terá geralmente uma concentração num intervalo de entre cerca de 30 e 1000 milimolar (mM) . Preferentemente, a concentração do tampão é de cerca de 35 e 800 mM, ou inclusive de forma mais preferente entre cerca de 40-600 mM. O Exemplo 4 demonstra o efeito do tampão (por exemplo, pH e concentração) após a gelificação. Como pode ser observado, foram preparadas soluções que experimentaram a gelificação em menos de 2 minutos a partir da mistura (os tempos variaram de imediato a 1 minuto 40 segundos). A concentração do reativo de PEG-tiol na composição precursora formadora de hidrogel in situ resultante estará normalmente no intervalo de cerca de 10 a 600 mg/ml. As concentrações ilustrativas são entre cerca de 15-500 mg/ml ou de forma mais preferente entre cerca de 20 a 400 mg/ml. A solução precursora resultante forma geralmente um gel em segundos (por exemplo, 5 segundos) a cerca de 1 hora de mistura. Preferentemente, a solução formará um gel num lapso de tempo de cerca de 15 minutos (isto é, onde for num lapso de tempo entre cerca de 5 segundos a 15 minutos depois da mistura, ou num lapso de tempo de 30 segundos a 15 minutos depois da mistura), ou inclusive mais preferentemente, num lapso de tempo de cerca de 10 minutos, ou inclusive mais preferentemente, num lapso de tempo de cerca de 5 minutos, ou inclusive mais preferentemente, num lapso de tempo de cerca de 3 minutos da mistura.

Foram preparadas composições de gelificação rápida utilizando PEG-ditiol linear e PEG tetratiol de 4 braços como se descreve no Exemplo 7. Cada uma das composições testadas gelificou num lapso de tempo de um minuto enquanto que as pressões de rompimento (que indicavam a concentração do gel) variaram de cerca de 0,450 a 0, 685 PSI (3,1 a 4,72 kPa) . Método 2

Numa abordagem levemente modificada do método 1, foi adicionada uma pequena quantidade de PEG-tiol solúvel à solução de ácido hialurónico modificado com vinilsulfona para diminuir o tempo requerido para a solução. O PEG-tiol solúvel que foi adicionado é preferentemente estéril.

Como se descreve para o método 1 anterior, o ácido hialurónico modificado com vinilsulfona foi dissolvido geralmente num meio aquoso tal como água, solução salina, ou similares. O meio aquoso terá geralmente um pH que variará entre cerca de 5-7, e pode, em determinados casos, ser levemente ácido. Idealmente, é proporcionado o ácido hialurónico modificado com vinilsulfona como uma solução muito concentrada na extensão possível com base em sua solubilidade aquosa, para permitir uma gelificação rápida. Normalmente, o AH-VS é proporcionado como uma solução a uma concentração de cerca de 10-300 mg/ml. Os intervalos ilustrativos adicionais de concentrações adequadas incluem os seguintes: entre cerca de 15-250 mg/ml, ou inclusive de forma mais preferente entre cerca de 20-200 mg/ml. Uma concentração elevada é vantajosa com respeito a uma formação de gel rápida da composição precursora resultante após a mistura.

Uma porção pequena do PEG funcionalizado com tiol, por exemplo, entre cerca de 0,1 % em peso a cerca de 4 % em peso (PEG funcionalizado com tiol em p/p a AH-VS) foi adicionado a seguir à solução de ácido hialurónico funcionalizado com vinilsulfona, preferentemente como um pó. As quantidades ilustrativas adicionais de PEG funcionalizado com tiol que podem ser adicionadas incluem de cerca de 0,1 % em peso a cerca de 3,5 % em peso, ou de cerca de 0,1 % em peso a 2,5 % em peso (PEG a AH-VS funcionalizado com tiol em p/p), Os componentes foram misturados até que foram dissolvidos. A solução resultante que continha ácido hialurónico funcionalizado com vinilsulfona e uma porção da quantidade total do PEG funcionalizado com tiol que vai ser adcionado foi esterilizado a seguir normalmente como foi descrito anteriormente. Numa solução preferida, a solução foi esterilizado em autoclave. À solução resultante, esterilizada normalmente, foi adicionado a seguir a quantidade restante de PEG funcionalizado com tiol, de novo preferentemente como um pó estéril. Os componentes foram misturados até que foi dissolvido o PEG tiol. Como no método 1, embora possa ser adicionado o PEG funcionalizado com tiol como uma solução aquosa, é adicionado preferentemente como um sólido devido a sua elevada solubilidade num meio aquoso, devido a que a adição em forma sólida evita uma diluição adicional da mistura de reação, que pode atrasar os tempos de gelificação. A solução de ácido hialurónico-vinilsulfona-PEG funcionalizado com tiol resultante foi misturada a seguir tal como foi descrito anteriormente no método 1 para formar uma composição precursora de gelificação rápida.

Em ambos os métodos, em geral, as concentrações do ácido hialurónico funcionalizado com vinilsulfona e do PEG funcionalizado com tiol na solução precursora de gelificação rápida líquida final, após um intervalo adicional de tampão, de cerca de 2 % a 8 % em peso/volume. A seguir podem ser selecionadas as concentrações ilustrativas de cada reativo entre cerca de 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 % e 8 % em peso/volume, incluindo todos os intervalos existentes entre os mesmos. Numa forma de realização preferida, a concentração do ácido hialurónico funcionalizado com vinilsulfona e do PEG funcionalizado com tiol na solução precursora de gelificação rápida líquida final, após a adição de tampão, varia de cerca de 2 % a cerca de 6 % em peso/volume.

Numa ou mais formas de realização específicas, a composição precursora de gelificação rápida contém um agente ativo que foi descrito anteriormente. As classes preferidas de agentes bioativos incluem esteroides, fatores de crescimento, agentes antiproliferativos, e antibióticos. Uma classe particularmente vantajosa de agentes ativos para a incorporação nas presentes composições são os corticosteroides. Os corticosteroides ilustrativos incluem, mas não se limitam aos seguintes: triamcinolona sais de triamcinolona tais como triamcinolona acetonida, triamcinolona hexacetonida, triamcinolona benetonida, triamcinolona furetonida, e diacetato de triamcinolona e similares, e metilprednidolona. Em geral, a composição precursora de gelificação rápida contém entre cerca de 0,01 % em peso e cerca de 20 % em peso de agente bioativo, dependendo da sua potência, com base na composição global. As quantidades ilustrativas de agentes bioativos contidas no hidrogel formador in situ estão entre cerca de um 10 % a cerca de um 20 % em peso, por exemplo, para um agente bioativo menos potente, e entre cerca de 0,01 % a cerca de 5 %, ou de cerca de 0,01 % a cerca de 5 %, ou de cerca de 0,01 % a cerca de 3 %, ou de cerca de 0,1 a cerca de 2 % de agente bioativo, ou inclusive de cerca de 0,1 a cerca de 1 % de agente bioativo, por exemplo, para um agente bioativo mais potente tal como triamcinolona acetonida. 0 agente bioativo pode ser misturado com um dos reagentes (supondo características de não estabilidade ou reatividade) do componente do tampão, ou alternativamente, adicionado no tempo de mistura. Isto é, pode ser incorporado um agente bioativo em qualquer etapa durante a preparação do precursor na composição formadora de gel in situ. A composição formadora precursora de gel pode conter adicionalmente um ou mais aditivos tais como conservantes, desespumantes, agentes formadores de poros, plastificantes, potenciadores da penetração, colorantes, agentes humectantes, agentes de nivelação, agentes hidratantes, espessantes, cargas, agentes opacificantes, e absorventes, embora qualquer do ditos aditivos deve ser biocompativel e quando se inclui na composição precursora, deve ser administrável por meio de qualquer meio descrito no presente documento.

Kits

Os componentes anteriores podem ser fornecidos na forma de um kit, por exemplo, para utilização num ambiente clinico. Por exemplo, de tal maneira que um kit pode conter, num primeiro recipiente, uma solução aquosa estéril ou não estéril de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona como foi descrito anteriormente. Como alternativa, o ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona pode ser fornecido como um sólido (por exemplo, como um pó) , que é dissolvido a seguir num meio aquoso para proporcionar uma solução de AH-VS compreendida nos intervalos de concentração que foram mostrados anteriormente que poderia ser proporcionados também geralmente com o kit. Na última forma de realização, poderia ser proporcionado também um volume adequado do meio aquoso para proporcionar uma solução de AH-VS compreendida nos intervalos de concentração que são mostrados anteriormente com o kit. 0 PEG funcionalizado com tiol está compreendido também no kit num segundo recipiente, proporcionado preferentemente como um sólido em forma estéril. Pode ser proporcionado também o PEG funcionalizado com tiol no segundo recipiente como uma solução aquosa, embora tenha sido descrito anteriormente, é preferível a forma sólida de tal maneira que não dilui adicionalmente os reagentes após a mistura. É proporcionado adicionalmente num terceiro recipiente uma solução tampão estéril ou não estéril, por exemplo, que contém um tampão que foi descrito anteriormente, por exemplo, uma solução tampão 30-1000 mM a um intervalo de pH que varia entre cerca de 7-12.

De acordo com os métodos anteriormente descritos, numa forma de realização alternativa, o primeiro recipiente pode conter uma solução aquosa estéril ou não estéril de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona combinado com uma pequena quantidade de PEG funcionalizado com tiol, por exemplo, de cerca de 0,1 % em peso a cerca de 4 % em peso (PEG a AH-VS funcionalizado com tiol em p/p) , ou entre cerca de 0,1 % em peso a 3,5 % em peso, ou entre cerca de 0,1 % em peso a 2,5 % em peso (PEG a AH-VS funcionalizado com tiol em p/p). O kit pode compreender além disso um agente bioativo que será embalado e misturado geralmente por separado com outros componentes de kit imediatamente antes de sua utilização. O dito agente bioativo é proporcionado preferentemente embora não de forma necessária como um sólido. São incluídas também no kit instruções para a mistura e posterior utilização.

Os recipientes que foram descritos anteriormente incluem qualquer recipiente para embalagem adequado, farmaceuticamente aceitável para alojar os componentes anteriores. Por exemplo, os recipientes adequados incluem vidro, plástico, recipientes formados por folha e filme tais como embalagens de tipo blister, frascos, bolsas, ampolas, viais, seringas (simples, duplas e múltiplas), pipetas, aplicadores, tubos e similares.

Os componentes anteriores, por exemplo, podem cada um ser embalado numa seringa, que geralmente é vedado, por exemplo, com uma tampo ventilada. A seringa pode estar feita de plástico (por exemplo, polipropileno, policarbonato, poliestireno) ou vidro ou qualquer outro material farmaceuticamente aceitável. 0 volume da seringa pode variar de 0,5 ml a 20 ml, sendo os volumes preferíveis 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml e 7 ml. A seringa pode a seguir ser colocada num recipiente, tal como uma folha de tipo bolsa que a seguir é vedada. A bolsa pode ser vedada a vácuo, ser vedada com um gás inerte tal como azoto ou árgon, ou preenchida após um ou mais ciclos de preenchimento contra vácuo em que o gás de preenchimento é um gás inerte tal como azoto ou árgon. Para a bolsa vedada após um ou mais ciclos de preenchimento contra vácuo, o ciclo pode ser ajustado de tal maneira que a bolsa é vedada finalmente tanto com vácuo como com gás inerte. A bolsa pode conter opcionalmente um dessecador e/ou um sequestrante de oxigénio. Método de aplicação

Os componentes descritos no presente documento podem ser aplicados a qualquer de numerosos locais do corpo. Os locais ilustrativos incluem a pele, membranas mucosas, cavidades do corpo, superfícies internas de ossos, locais de tecidos, orifícios, artérias, veias, condutos, e similares. A composição de gelificação rápida proporcionada no presente documento, ou alternativamente, seus componentes, pode ser aplicada a um local de tratamento utilizando, por exemplo, uma seringa (com ou sem uma agulha) , um cateter, um trocar, um dispositivo de pulverização auxiliado por gás, um aplicador para pulverização manual, um aplicador endoscópico auxiliado por gás, ou similares. Os dispositivos para pulverização ilustrativos incluem o Conjunto para Pulverização EASY SPRAY (Baxter AG, E.U.A.), FibriJet (Micromedics Inc. E.U.A.) e assim sucessivamente. A série FibriJet inclui um kit aplicador para atomização normalizado (Aplicador para pulverização manual FibriJet®) assim como um kit aplicador para atomização auxiliado por gás (Aplicador para pulverização auxiliado por gás FibriJet®), ambos adequados para aplicar a composições indivíduo de gelificação rápida.

Utilizações

As composições de gelificação rápida descritas no presente documento podem ser utilizadas em numerosas aplicações, por exemplo, para o desenvolvimento embrionário, organização de tecidos, cicatrização de feridas, angiogénese e tumorigénese. Veja-se D. D. Allison e K. J. Grande-Alien, Tissue Engineering, Vol. 12, Número 8, 2131-2140 (2006); G. D. Prestwich et ao, Tissue Engineering, Vol. 12, Número 8, 2171-2180 (2006); G. D. Prestwich et ao, Tissue Engineering, Vol. 12, Número 12, 3405-3416 (2006).

Por exemplo, a gelificação rápida, as composições pulverizáveis proporcionadas no presente documento, que contêm opcionalmente um ou mais agentes bioativos, podem ser utilizados como composições adesivas, por exemplo, como adesivos e precintos de tecidos que podem ser utilizados para diversas aplicações, incluindo a prevenção do sangrado, o recobrimenro de feridas abertas, e outras aplicações biomédicas. Por exemplo, as composições indivíduo podem ser utilizadas para prevenir as aderências cirúrgicas nas regiões lombar, durai, nasal, sinusal, abdominal, tendinal, e nas regiões das articulações do corpo. Estas composições podem ser utilizadas em, por exemplo, incisões cirúrgicas para apósitos ou tecidos lacerados traumaticamente, atraso do fluxo sanguíneo tal como o das feridas, prevenção da restenose ou da coagulação sanguínea, administração de fármacos; apósitos para queimaduras, para efetuar a homeostasia, e para adicionar reparação e recrescimento ao tecido vivo. As composições podem ser utilizadas para suplementar ou induzir e regenerar órgãos ou tecidos danificados num indivíduo mamífero, tal como um ser humano. A composição é decomposta ou absorvida, ou alternativamente, permanece no indivíduo (por exemplo, o indivíduo mamífero) sem ter influâncias adversas sobre o indivíduo quando se inclui ou contém no anterior. Quando é utilizado como um vedação, a composição de gelificação rápida é útil nas seguintes regiões do corpo: vascular, durai, pulmonar, do intestino, da bexiga, intestino, ocular, e tópica. Por exemplo, quando é utilizado como vedação vascular, a composição indivíduo pode ser utlizado como uma vedação veia a veia, uma vedação artéria a veia, uma vedação veia a artéria, uma vedação veia a polímero sintético, uma vedação artéria a polímero sintético, uma vedação polímero sintético a artéria, e uma vedação polímero sintético a veia. As composições podem ser utilizadas também para artroscopias ou cirurgia aberta de articulações, por exemplo, para reparar o tecido da articulação (isto é, cartilagem).

Quando a meta é que a composição se adira à superfície de um tecido, a composição deve ter suficiente força adesiva e suficiente força coesiva de tal maneira que pode ser produzida a adesão ao tecido sem que a composição se rompa, ou rasgue e caia para fora do tecido ao qual vai ser aplicada. a força adesiva da composição refere-se à capacidade da composição de permanecer unida à superfície à qual se ai ser aplicada, enquanto que a força coesiva da composição refere-se à capacidade da composição de permanecer como uma entidade individual quando se aplicam forças externas à composição. Para medir a combinação de força adesiva e coesiva, pode ser realizada um ensaio de queimadura (veja-se, por exemplo, Exemplo 5). Se uma composição possui uma pressão de estouro de menos de 0,2 PSI (1,38 kPa), então, a composição se caracteriza como que tem uma força coesiva/adesiva relativamente débil Quanto maior seja a força de estouro apresentada pela composição, maior será a força adesiva/coesiva da composição. As composições de hidrogel proporcionadas no presente documento apresentam boa força adesiva e coesiva.

As composições de gelificação rápida indivíduo podem ser utilizadas também como recheios de tecidos, recheios dérmicos, agentes de carga, por exemplo, como agentes de volume uretrais ou esofágicos, e agentes embólicos assim como agentes para reparar defeitos/lesões da cartilagem e agentes para potenciar a reparação e/ou o crescimento do osso.

As composições de gelificação rápida objeto podem ser utilizadas também como veículos de administração de fármacos, por exemplo, para administrar localmente um agente bioativo por via tópica, intramuscular, intraarticular, subcutânea, à região ocular, intradérmica, para tratar defeitos em ossos, defeitos em cartilagens, orifícios em tecidos e para os lumens nos corpos.

As composições objeto podem ser utilizadas também no tratamento da osteoartrite ou da artrite reumatoide, ou para outros distúrbios artríticos inflamatórios tais como gota ou doença por deposição de pirofosfato de cálcio (por exemplo, por meio de injeção no espaço intraarticular de uma articulação) , ou na redução ou a prevenção de aderências que podem ser formadas após um procedimento cirúrgico.

Será descrito agora o presente pedido juntamente com determinadas formas de realização. A presente divulgação cobre todas as alternativas, modificações, e os equivalentes que se incluem no alcance das reivindicações. Desta maneira, o seguinte ilustrará a prática do presente pedido, para os fins de ilustração de determinadas formas de realização e se apresenta para proporcionar o que acredita-se que é uma descrição útil e facilmente compreensível de seus procedimentos e aspetos conceituais. Aspetos e formas de realização ilustrativas

Os seguintes são aspetos e formas de realização ilustrativas de acordo com os ensinamentos proporcionadas no presente documento.

Aspeto 1. Num primeiro aspeto, a presente divulgação proporciona um kit que compreende: (i) um primeiro recipiente que compreende uma solução aquosa de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona ("AH-VS") a uma concentração de entre cerca de 10-300 mg/ml, em que AH-VS tem entre cerca de 2 % - 70 % dos seus grupos hidroxilo substituídos com vinilsulfona, (ii) um segundo recipiente que compreende um polietilenoglicol funcionalizado com tiol que tem entre 2 e 8 grupos tiois, e (iii) e um terceiro recipiente que compreende uma solução tampão 30 -1000 mM a um pH que varia entre cerca de 7 -12, numa quantidade eficaz, quando é misturado com o conteúdo do primeiro e o segundo recipientes, para proporcionar uma solução que tem uma concentração de AH-VS de 2-8 % (p/v) e uma concentração de polietilenoglicol funcionalizado com tiol de 2-8 % (p/v), onde os componentes do primeiro, segundo e terceiro recipientes, quando são combinados, são eficazes para formar um gel num lapso de tempo de cerca de 5 segundos a 1 hora de mistura. (Um qualquer ou mais do AH-VS, o polietilenoglicol funcionalizado com tiol, e a solução tampão pode estar em forma estéril).

Aspeto 2. Num segundo aspeto, a presente divulgação proporciona uma composição líquida que pode formar um hidrogel após a mistura de seus componentes. A formulação líquida é formada a partir da combinação de (i) uma solução aquosa de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona ("AH-VS") a uma concentração de entre cerca de 10-300 mq/ml, em que AH-VS tem entre cerca de 2 % - 70 % dos seus qrupos hidroxilo substituídos com vinilsulfona, (ii) um polietilenoqlicol funcionalizado com tiol que tem de 2 a 8 qrupos tiois, e (iii) uma solução tampão 30 -1000 mM a um pH que varia entre cerca de 7 -12, em que a concentração do polietilenoqlicol funcionalizado com tiol na composição líquida varia entre cerca de 4-300 mq/ml, e a composição líquida pulverizável é eficaz para formar um qel em cerca de 5 sequndos a cerca de 1 hora de mistura de componentes (i), (ii) e (iii) . (Um qualquer ou mais do AH-VS, o polietilenoqlicol funcionalizado com tiol, e a solução tampão pode estar em forma estéril).

Aspeto 3. Num terceiro aspeto, é proporcionado um método para formar uma composição líquida pulverizável capaz de formação de qel in situ. Compreendendo o método as etapas de: (i) adicionar um polietilenoqlicol funcionalizado com tiol que tenha entre 2 e 8 qrupos tiol a uma solução aquosa de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona ("AH-VS") que tem uma concentração de entre cerca de 4-300 mq/ml, em que o AH-VS tem entre cerca de 2 % - 70 % dos seus qrupos hidroxilo substituídos com vinilsulfona, para dissolver deste modo o polietilenoqlicol funcionalizado com tiol para formar uma solução que contém polietilenoqlicol funcionalizado com tiol-ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona, e (ii) combinar a solução da etapa (i) com uma solução tampão 30-1000 mM a um pH que varia entre cerca de 7 - 12, para formar desta maneira uma composição líquida que tem uma concentração de AH-VS de 2-8 % (p/v) e uma concentração de polietilenoglicol funcionalizado com tiol de 2-8 % (p/v), onde a composição líquida é eficaz para formar um gel em cerca de 5 segundos a cerca de 1 hora de mistura.

Aspeto 4. Num quarto aspeto, é proporcionado um método para formar uma composição líquida capaz de formação de gel in situ, em que o método compreende as etapas de: (i) adicionar uma porção de uma quantidade global de polietilenoglicol funcionalizado com tiol, preferentemente em forma estéril, a uma solução aquosa de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona ("AH-VS") que tem uma concentração de entre cerca de 10-300 mg/ml, em que AH-VS tem entre cerca de 2 % -70 % dos seus grupos hidroxilo substituídos com vinilsulfona, para formar desta maneira uma solução, (ii) esterilizar preferentemente a solução da etapa (i) , (iii) adicionar à solução da etapa (i) ou a ou a etapa (ii) se é realizada, a quantidade restante de polietilenoglicol funcionalizado com tiol, em que o polietilenoglicol funcionalizado com tiol tem entre 2 a 8 grupos tiois, para dissolver desta maneira a quantidade restante de pó de polietilenoglicol funcionalizado com tiol para formar uma solução que contém polietilenoglicol funcionalizado com tiol-ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona, e (iv) misturar a solução que contém polietilenoglicol funcionalizado com tiol-ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona com uma solução tampão 30 - 1000 mM preferentemente estéril a um pH que varia entre cerca de 7 - 12, para formar desta maneira uma composição líquida que tem uma concentração de AH-VS de 2-8 % (p/v) e uma concentração de polietilenoglicol funcionalizado com tiol de 2-8 % (p/v), onde a composição líquida é eficaz para formar um gel num lapso de tempo de cerca de 5 segundos a cerca de 1 hora de mistura.

Forma de realização 1. Numa forma de realização dirigida a um qualquer ou mais dos Aspetos 1-4, o ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona possui entre cerca de 7 % - 35 %, ou de 10 % a 25 %, dos seus grupos hidroxilo substituídos com vinilsulfona.

Forma de realização 2. Numa segunda forma de realização dirigida a um qualquer ou mais dos Aspetos 1-4, e também combinável com a Forma de realização 1, o polietilenoglicol funcionalizado com tiol possui numerosos grupos tiol selecionados entre 2, 3, 4, 5, 6, 7, e 8.

Forma de realização 3. Numa terceira forma de realização dirigida a um qualquer ou mais dos Aspetos 1-4, e também combinável com a forma de realização e/ou a Forma de realização 2, o polietilenoglicol funcionalizado com tiol possui numerosos grupos tiol selecionados entre 2, 3, e 4 .

Forma de realização 4. Numa quarta forma de realização dirigida a um qualquer ou mais dos Aspetos 1-4, e também combinável com um qualquer ou mais dos Aspetos 1-3, O ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona tem uma massa molecular média no intervalo de cerca de 10.000 a 2.000.000 daltons, ou de cerca de 15.000 daltons a 1.000.000 daltons, ou de cerca de 20.000 daltons a 200.000 daltons.

Forma de realização 5. Numa quinta forma de realização dirigida a um qualquer ou mais dos Aspetos 1-4, e também combinável com um qualquer ou mais dos Aspetos 1-3, o ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona tem uma massa molecular média de cerca de 100.000 daltons.

Forma de realização 6. Numa sexta forma de realização dirigida a um qualquer ou mais dos Aspetos 1-4, e também combinável com um qualquer ou mais dos Aspetos 1-5, o polietilenoglicol funcionalizado com tiol é linear.

Forma de realização 7. Numa sétima forma de realização dirigida a um qualquer ou mais dos Aspetos 1-4, e também combinável com um qualquer ou mais dos Aspetos 1-6, o polietilenoglicol funcionalizado com tiol está ramificado.

Forma de realização 8. Numa oitava forma de realização dirigida a um qualquer ou mais dos Aspetos 1-4, e também combinável com qualquer uma ou mais das Formas de realização 1-7, o polietilenoglicol funcionalizado com tiol tem uma massa molecular média de entre cerca de 1.000 a cerca de 10.000 daltons.

Forma de realização 9. Numa nona forma de realização dirigida a um qualquer ou mais dos Aspetos 1-4, e também combinável com qualquer uma ou mais das Formas de realização 1-8, a massa molecular do polietilenoglicol funcionalizado com tiol é menor que a massa molecular do ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona.

Forma de realização 10. Numa décima forma de realização dirigida a um qualquer ou mais dos Aspetos 1-4, e também combinável com qualquer uma ou mais das Formas de realização 1-9, a solução aquosa de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona ("AH-VS") tem uma concentração que varia entre cerca de 20-200 mg/ml.

Forma de realização 11. Numa décimo primeira forma de realização dirigida a um qualquer ou mais dos Aspetos 1-4, e também combinável com qualquer uma ou mais das Formas de realização 1-10, o polietilenoglicol funcionalizado com tiol está na forma de um pó.

Forma de realização 12. Numa décimo segunda forma de realização dirigida a um qualquer ou mais dos Aspetos 1-4, e também combinável com qualquer uma ou mais das Formas de realização 1-11, a quantidade de polietilenoglicol funcionalizado com tiol com respeito ao ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona varia desde cerca de 1:1 (em p/p) a cerca de 0,4:1 (em p/p) .

Forma de realização 13. Numa décimo terceira forma de realização dirigida a um qualquer ou mais dos Aspetos 1-4, e também combinável com qualquer uma ou mais das Formas de realização 1-12, a solução tampão está a um pH que varia entre cerca de 8,0 a 10,5.

Forma de realização 14. Numa décimo quarta forma de realização dirigida ao Aspeto 1, e combinável com qualquer uma ou mais das Formas de realização 1-13, um do primeiro, segundo ou terceiro recipientes compreende ainda um agente bioativo.

Forma de realização 15. Numa décimo quinta forma de realização dirigida ao Aspeto 1, e combinável com qualquer uma ou mais das Formas de realização 1-13, o kit compreende um quarto recipiente que compreende um agente bioativo.

Forma de realização 16. Numa décimo sexta forma de realização dirigida ao Aspeto 2, e combinável com qualquer uma ou mais das Formas de realização 1-13, a composição líquida compreende ainda um agente bioativo.

Forma de realização 17. Numa décima sétima forma de realização dirigida a um qualquer ou mais dos Aspetos 14-16, o agente bioativo é um corticosteroide, por exemplo, triamcinolona ou um sal ou éster de triamcinolona farmaceuticamente aceitável tal como triamcinolona acetonida ou triamcinolona hexacetonida.

Forma de realização 18. Numa décimo oitava forma de realização dirigida ao Aspeto 1, e combinável com qualquer uma ou mais das Formas de realização 1-15, 17, o primeiro recipiente compreende entre cerca de 0,1 % em peso a cerca de 3,5 por cento em peso do polietilenoglicol funcionalizado com tiol com respeito ao ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona (em p/p).

Forma de realização 19. Numa décimo nona forma de realização dirigida a um qualquer ou mais dos Aspetos 1-4, e combinável com qualquer uma ou mais das Formas de realização 1-18, a concentração do polietilenoglicol funcionalizado com tiol na composição líquida varia entre cerca de 10-300 mg/ml, ou entre cerca de 6-250 mg/ml, ou entre cerca de 8-200 mg/ml.

Forma de realização 20. Numa vigésima forma de realização dirigida ao Aspeto 3, e combinável com qualquer uma ou mais das Formas de realização 1-13 e/ou 19, é adicionado um agente bioativo à solução que contém polietilenoglicol funcionalizado com tiol-ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona da etapa (i) , ou à solução tampão da etapa (ii) antes da combinação, ou à composição liquida formada na etapa (ii).

Forma de realização 21. Nesta forma de realização dirigida à Forma de realização 20, o agente bioativo é um corticosteroide, por exemplo, é triamcinolona ou um sal ou éster de triamcinolona farmaceuticamente aceitável tal como traiamcinolona acetonida ou triamcinolona hexacetonina.

Forma de realização 22. Nesta forma de realização dirigida ao Aspeto 4, e combinável com qualquer uma ou mais das Formas de realização 1-13, a porção de polietilenoglicol funcionalizado com tiol da etapa (i) compreende entre cerca de 0,1 % em peso a cerca de 3,5 por cento em peso de polietilenoglicol funcionalizado com tiol com respeito ao ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona (em p/p).

Forma de realização 23. Nesta forma de realização dirigida ao Aspeto 4, e combinável com qualquer uma ou mais das Formas de realização 1-13 e/ou 22, é adicionado um agente bioativo à solução da etapa (i) , ou à solução que contém polietilenoglicol funcionalizado com tiol-ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona da etapa (iii), ou à solução tampão da etapa (iv) antes da mistura, ou à composição liquida formada na etapa (iv) .

Forma de realização 24. Nesta forma de realização relacionada com a Forma de realização 23, o agente bioativo é um corticosteroide, por exemplo, é triamcinolona ou um sal ou éster de triamcinolona farmaceuticamente aceitável tal como traiamcinolona acetonida ou triamcinolona hexacetonina.

Forma de realização 25. Nesta forma de realização, é proporcionado no presente documento um kit ou composição líquida pulverizável de acordo com as Aspetos 1 e/ou 2, e combinável com qualquer uma ou mais das Formas de realização 1-19, para utilização na aplicação a um local do corpo.

Forma de realização 26. Nesta forma de realização relacionada com a Forma de realização 25, o kit ou composição líquida pulverizável pode ser utlizado para o desenvolvimento embrionário, a organização de tecidos, aplicações de precintado de tecidos, cicatrização de feridas, angiogénese, tumorigénese, para a prevenção de aderências cirúrgicas, ou o tratamento da osteoartrite ou a artrite reumatoide, para artroscopias ou cirurgia aberta de articulações para reparar o tecido da articulação (isto é, cartilagem), e para efetuar a homeostasia.

Exemplos

Os seguintes exemplos são propostos para proporcionar aos peritos na especialidade uma completa divulgação e descrição de como os compostos, composições, e métodos proporcionados no presente documento são realizados e avaliados, e está previsto que sejam meramente ilustrativos. São numerosas as variações e as combinações das condições de reação, por exemplo, concentrações de componentes, solventes desejados, misturas de solventes, temperaturas, pressões, e outros parâmetros e condições de reação que podem ser utilizados para otimizar características do produto tais como a pureza, rendimento, e similares.

Materiais

Espectrómetro de RMN 1H: 400 MHz

Polietilenoglicol ditiol, HS- (CH2CH20) nCH2CH2SH, "PEG-(SH)2", PM=3350 PEG(SH)4= C ( (CH20 (CH2CH20) nCH2CH2SH) 4, PM=10.000, núcleo de pentaeritritol (Sunbio PEG-SHOP)

Exemplo 1 Síntese de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona (HA-VS) (Pm = 100 K)

modificação dos grupos AH-OH Foram pesados 5 g de ácido hialurónico (AH) [Pm= 100 K, Shesiedo] num balão de 1 1. Foram adicionados 500 ml de água estéril filtrada ao AH. Um agitador vertical com uma paleta em forma de âncora foi utilizado para agitar a mistura durante 16,5 h, momento em que foi dissolvido o AH. Foram adicionados 333 ml de uma solução 0,25 N de NaOH (13,9 ml de NaOH 6 N adicionados a 319 ml de água desionizada) à solução AH de agitação. Depois de cerca de 1 min, foram adicionados rapidamente 150 ml de solução de divinilsulfona (18 ml de divinilsulfona dissolvidos em 132 ml de água desionizada) à solução de agitação. Depois de 2 minutos (medidos desde a finalização da adição da solução da divinilsulfona) , foi ajustado o pH da solução a entre 5 e 6 adicionando rapidamente 13,7 ml de HC1 6 N. A seguir a solução de reação foi submetida a diálise utilizando um sistema de filtração em fluxo tangencial (sistema spectrapor, cartucho P/N M6-100S-301-01P). O volume total foi de 11 vezes o volume da solução original. Uma vez que foi concluída a etapa de purificação, a solução foi concentrada até cerca de 400 ml. O AH funcionalizado

com vinilsulfona (AH-VS) foi eliminado do sistema TFF e foi colocado um recipiente de vidro que foi congelado a seguir utilizando gelo seco/acetona. A seguir o material foi liofilizado. Uma vez seco, o material foi colocado (4,6 g) em bolsa de alumínio e foi vedado termicamente. Uma amostra de AH modificado foi enviada para análise por meio de RMN 3H 0 espetro de RMN 3Η (FIG. 2) mostrou que a AH tinha um nível de substituição da vinilsulfona de cerca de 11 %. Exemplo 2 Síntese de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona (HA-VS): iv = 1. 3 m3/kg

Foram pesados 20 g de ácido hialurónico (AH) [viscosidade intrínseca (VI) 1,3 m3/kg, Shesiedo] num balão de 4 1. Foram adicionados 2000 ml de água estéril filtrada ao AH. Um agitador vertical com uma paleta em forma de âncora foi utilizado para agitar a mistura durante 16,5 h, momento em que foi dissolvido o AH. Foram adicionados 1335 ml de uma solução 0,25 N de NaOH (55,6 ml de NaOH 6 N adicionados a 1280 ml de água desionizada) à solução AH de agitação. Depois de cerca de 1 min, foi adicionado rapidamente uma solução de divinilsulfona (72 ml de divinilsulfona dissolvidos em 530 ml de água desionizada) à solução de agitação. Depois de 2 minutos (medidos desde a finalização da adição da solução da divinilsulfona), foi ajustado o pH da solução a entre 5 e 6 adicionando rapidamente 55 ml de HC1 6 N. A seguir a solução de reação foi submetida a diálise utilizando um sistema de filtração em fluxo tangencial (sistema spectrapor, cartucho P/N M6-100S-301-01P) . O volume total foi de 11 vezes o volume da solução original. Uma vez que foi concluída a etapa de purificação, a solução foi concentrada até cerca de 2600 ml. O AH funcionalizado com vinilsulfona (AH-VS) foi eliminado do sistema TFF e foi colocado numa bandeja de aço inoxidável. A seguir o material foi liofilizado utilizando um liofilizador Millrock. Uma vez seco, o material (20,15 g) foi colocado em bolsas de alumínio que foram vedadas termicamente. Uma amostra de AH modificado foi enviada para análise por meio de RMN ΤΗ O espetro RMN ΤΗ mostrou que a AH tinha um nível de substituição de vinilsulfona de cerca de 14 %.

Exemplo 3 Síntese de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona (ha-vs)

Foram pesados 20 g de ácido hialurónico (AH) [Pm = 900 K, Novozymes] num balão de 41. Foram adicionados 2000 ml de água estéril filtrada ao AH. Um agitador vertical com uma paleta em forma de âncora foi utilizado para agitar a mistura durante 16,5 h, momento em que foi dissolvido o AH. Foram adicionados 1335 ml de uma solução 0,25 N de NaOH (55, 6 ml de NaOH 6 N adicionados a 1280 ml de água desionizada) à solução AH de agitação. Depois de cerca de 1 min, foi adicionado rapidamente uma solução de divinilsulfona (72 ml de divinilsulfona dissolvidos em 528 ml de água desionizada) à solução de agitação. Depois de 2 minutos (medidos desde a finalização da adição da solução da divinilsulfona) , foi ajustado o pH da solução a entre 5 e 6 adicionando rapidamente 56 ml de HC1 6 N. A seguir a solução de reação foi submetida a diálise utilizando um sistema de filtração em fluxo tangencial (sistema spectrapor, cartucho P/N M6-100S-301-01P). O volume total foi de 11 vezes o volume da solução original. Uma vez que foi concluída a etapa de purificação, a solução foi concentrada até cerca de 2500 ml. O AH funcionalizado com vinilsulfona (AH-VS) foi eliminado do sistema TFF e foi colocado numa bandeja de aço inoxidável. A seguir o material foi liofilizado utilizando um liofilizador

Millrock. Uma vez seco, o material (17,5 g) foi colocado em bolsas de alumínio que foram vedadas termicamente. Uma amostra de AH modificado foi enviada para análise por meio de RMN ΤΗ 0 espetro RMN ΤΗ mostrou que a AH tinha um nível de substituição de vinilsulfona de cerca de 20 %.

Exemplo 4

Formação do gel - efeitos do tampão 0 pH de 1 ml de 25 mg/ml de AH-VS (Exemplo 3) foi ajustado de pH 6,5 a pH 9,5 com diversas quantidades de tampão fosfato de sódio pH 8 ou tampão fosfato de sódio pH 9,5 num tubo de amostras. Foi adicionado (pó) seco PEG(SH)2 à solução de AH-VS. As soluções foram misturados e foi medido o tempo de formação do gel por meio da carência visual do fluxo de solução. O quadro seguinte resume as amostras testadas.

Exemplo 5

Ensaio da pressão de estouro

Foram realizados os ensaios da pressão de estouro utilizando a configuração que é mostrado na Fig. 3.

Para simular o tecido, foi utilizado tripas de salsichas colagénio. A tripa de salsichas foi colocada sobre a parte superior do equipamento da pressão de estouro e foi mantido no lugar utilizando um anel de tipo O de borracha. Foi realizada um orifício na tripa de salsichas utilizando uma agulha de calibre 18. O material de gelificação in situ foi colocado na parte superior da tripa de tal maneira que o orifício (realizado com a agulha de calibre 18) foi coberto com material. Transcorridos 5 minutos, o calibre (Modelo Omega: DPG5500B-05G) foi posto em zero e a bomba foi ligada a um caudal de 100 ml/min. A pressão de estouro foi medido como a pressão máxima sobre a manométrica exatamente antes de que a água flua rapidamente através do gel formado.

Exemplo 6

Gelificação de AH frente a IHS PEG SE (AH frente a uma substituição do 14 %)

Foram pesados 125 mg de AH-VS (Exemplo 2) numa seringa de 10 ml. O HA-VS foi dissolvido adicionando 5 ml de H20 na seringa e foram misturados durante a noite numa placa giratória. Foram transferidos 2,5 ml de AH-VS a uma nova seringa de 10 ml. A seguir foi esterilizado em autoclave esta seringa de 10 ml a 250 °F (121,1 °C) durante 15 min. Foram pesados 40 mg de PEG(SH)2 numa seringa de 10 ml. Foi pesada uma segunda alíquota de 40 mg de PEG(SH)2 numa segunda seringa de 10 ml. Foi realizada a gelificação com 1,5 ml de AH-VS sem esterilização em autoclave e com esterilização em autoclave utilizando o seguinte procedimento. A seringa que continha o AH-VS foi ligada à seringa que continha o PEG(SH)2 utilizando um conector luer. Foi transferida o AH-VS à seringa de PEG(SH)2 empurrando o êmbolo. O conteúdo das seringas foram movidos para frente e para trás várias vezes até que o PEG(SH)2 foi dissolvido. Foram adicionados à mistura 100 ui de tampão fosfato de sódio a 1 M, pH 8,5. O tempo de gelificação para ambas as condições foi de cerca de 30 segundos.

Exemplo 7

Gelificação utilizando PEG di e tetrafuncionalizados

Foram pesados 150 mg de AH-VS (Exemplo 2) numa seringa de 10 ml. O HA-VS foi dissolvido adicionando 6 ml de H20 na seringa e foram misturados durante a noite numa placa giratória. Foi realizada a gelificação com 1,5 ml de AH-VS e qualquer de 40 mg de PEG(SH)2, ou 40 mg de PEG(SH)4 .

Foram adicionados 100 μΐ de um tampão de fosfato de sódio a 1 M, pH 8,5 a cada amostra para completar a gelificação. Cada solução foi aplicada à tripa de salsicha para ensaiar a pressão de estouro (Exemplo 5). Cada produto tinha gelifiçado em 1 minuto. A força de estouro foi medido.

Exemplo 8

Gelificação de AH-VS esterilizado com um feixe de eletrões

Foram dissolvidos 0,4 g de ácido ascórbico e 0,4 g de PEG 4000 em 50 ml de H20. Foi ajustado a solução a pH 6,14 utilizando NaOH 6 N seguido por a transferência da solução a 1,25 g de AH-VS liofilizado (Exemplo 2) . Após misturar vigorosamente, aliquotas de 3 ml foram transferidas a um molde de esponja de Teflon, e foram liofilizadas para formar esponjas. As esponjas foram colocadas em seringas de 5 ml e foram enviadas para a esterilização por meio de feixes de e a 46 kGy. Foi realizada a gelificação dissolvendo 1/2 da esponja esterilizada numa solução de PEG(SH)2 (40 mg em 750 ul de H20) . 750 ul de fosfato de sódio 150 mM, pH 8,4, foram adicionados à solução de HA-VS/PEG(SH)2 . A concentração de AH-VS resultante foi de 25 mg/ml. A seguir foi medido o tempo até a gelificação. O tempo de gelificação para uma esponja sem feixes de eletrões foi de 52 segundos, e de 4 minutos a 50 segundos para uma esponja com feixes de eletrões. O tempo de gelificação diminuiu desde 4 minutos a 50 segundos quando uma concentração de AHS com feixes de eletrões aumentou a 60 mg/ml.

Exemplo 9 Gelificação 1

Foi pesado AH-VS (Exemplo 1) numa seringa de 10 ml e foi dissolvido em H20 para formar uma solução de 41 mg/ml. Foram adicionados 40 mg de PEG(SH)2 a 1,5 ml da solução de HA-VS. Foram misturados o AH-VS e o PEG(SH)2. Uma vez que o PEG(SH)2 se dissolveu, foram adicionados 100 μΐ de fosfato de sódio 1 M, pH 8,5, e foram misturados na mistura. Formou-se um gel transparente num lapso de tempo de 5 minutos.

Exemplo 10 Gelificação 2

Foi pesado AH-VS (Exemplo 1) numa seringa de 1 ml e foi dissolvido em H20 para formar uma solução de 60 mg/ml. Foram adicionados 10 mg de PEG(SH)2 a 0,2 ml da solução de HA-VS. Foram misturados o AH-VS e o PEG(SH)2. Uma vez que o PEG(SH)2 se dissolveu, foram adicionados 15 μΐ de fosfato de sódio 1 M, pH 8,5. Foram adicionados e foram misturados na mistura. A mistura se gelificou em 40 segundos.

Exemplo 11 Gelificação 3

Foi pesada o AH-VS (Exemplo 1) numa seringa de 1 ml e foi dissolvido em H20 para formar uma solução de 60 mg/ml. Foram adicionados 10 mg de PEG(SH)2 a 0,4 ml da solução de HA-VS. Foram misturados o AH-VS e o PEG(SH)2. Uma vez que o PEG(SH)2 se dissolveu, foram adicionados 26,7 μΐ de fosfato de sódio 1 M, pH 8,5. Foram adicionados e foram misturados na mistura. A mistura gelificou em 1 minuto 30 segundos. Exemplo 12 Gelificação 4

Foi pesado AH-VS (Exemplo 1) numa seringa de 3 ml e foi dissolvido em H20 para formar uma solução de 60 mg/ml. Foram adicionados 75 mg de PEG(SH)2 a 1,5 ml da solução de HA-VS. Foram misturados o AH-VS e o PEG(SH)2. Uma vez que o PEG (SH)2 se dissolveu, foram adicionados 115 μΐ de fosfato de sódio 1 M, pH 8,5. Foram adicionados e foram misturados na mistura. A seguir na tripa de salsichas foi extrudado (Exemplo 5) . A mistura gelificou num lapso de tempo de 2 minutos e foi medido a pressão de estouro (exemplo 5) como 1,24 PSI (8,55 kPa).

Exemplo 13 Gelificação 5

Foi pesado AH-VS (Exemplo 1) numa seringa de 3 ml e foi dissolvido em H20 para formar uma solução de 120 mg/ml.

Foram adicionados 75 mg de PEG(SH)2 a 0,75 ml da solução de HA-VS. Foram misturados o AH-VS e o PEG(SH)2. Uma vez que dissolvido o PEG(SH)2 se dissolveu, foram adicionados 750 μΐ de fosfato de sódio 150 mM, pH 8,8, e foram misturados na mistura. A mistura gelificou em 1 minuto 40 segundos.

Exemplo 14 Gelificação 6

Foi pesado o AH-VS (Exemplo 1) numa seringa de 3 ml e foi dissolvido em H20 para formar uma solução de 120 mg/ml.

Foram adicionados 75 mg de PEG(SH)2 a 0,75 ml da solução de HA-VS. Foram misturados o AH-VS e o PEG(SH)2. Uma vez que o PEG(SH)2 se dissolveu, foram adicionados 750 μΐ de fosfato de sódio 300 mM, pH 8,8 e foram misturados na mistura. A mistura se gelificou em 40 segundos. A massa molecular do AH-VS foi medida a 100 kDa por meio de GPC.

Exemplo 15

Gelificação 7 AH-VS esterilizado em autoclave

Foi pesado o AH-VS (Exemplo 1) numa seringa de 3 ml e foi dissolvido em H20 para formar uma solução de 120 mg/ml. A seguir foi esterilizado em autoclave a solução a 250 °F (121,1 °C) durante 15 min. Uma vez arrafecido a temperatura ambiente, foram adicionados 75 mg de PEG(SH)2 a 0,75 ml da solução de AH-VS. Foram misturados o AH-VS e o PEG(SH)2. Uma vez que o PEG(SH)2 se dissolveu, foram adicionados 750 μΐ de fosfato de sódio 300 mM, pH 8,8 e foram misturados na mistura. A mistura se gelificou em 60 segundos.

Após o esterilizado em autoclave, foi medida a massa molecular do AH-VS a 76 kDa por meio de GPC.

Exemplo 16

Adição de PEG(SH)2 a AH-VS antes de esterilizar em autoclave

Foi adicionado o PEG(SH)2 a AH-VS (120 mg/ml) (Exemplo 1) a 0, 0,02, 0,2, 0,4, 0,7, 1,0, 1,3, 2,0, 5,0, e 10 mg por ml de AH-VS. Após misturar vigorosamente, foi esterilizado em autoclave o AH-VS/PEG durante 15 min a 250 °F (121,1 °C) . A seguir foi realizada a gelificação com 107 mg de PEG(SH)2 por ml de AH-VS utilizando fosfato de sódio 0,3 M, pH 8,8, e carbonato de sódio a 0,15 M, pH 9,25. Os materiais gelificaram em 2 minutos. Os géis fora submetidos a ensaios da força de estouro

Exemplo 17

Gelificação 8 efeito do tampão

Foram esterilizados em autoclave 120 mg/ml de AH-VS (Exemplo 1) a 250 °F (121 °C) durante 15 minutos. As gelificações foram realizadas utilizando relações 0,9/1 (g/g) de HA-VS/PEG (SH)2 com os seguintes tampões: (1) fosfato de sódio a 0,3 M, pH 8,8, (2) carbonato de sódio a 0,2 M, pH 9,25, e (3) carbonato de sódio a 0,3 M, pH 9,4. As soluções gelificaram num lapso de tempo de 3 minutos e a pressão de estouro foi medida (Exemplo 5).

Exemplo 18

Gelificação 9 - Efeito do tampão

Foram dissolvidos três gramas de AH-VS (Exemplo 1) em 25 ml de H20 para formar 120 mg/ml de uma solução de AH-VS. Foram adicionados 60 μΐ de 100 mg/ml de PEG(SH)2 a 6 ml de 120 mg/ml de AH-VS a 1 mg de PEG por 120 mg de uma relação de AH-VS ratio. Foram esterilizados em autoclave 120 mg/ml de AH-VS com e sem PEG(SH)2. Foi realizada a gelificação de ambos géis utilizando 108 mg de PEG(SH)2 com fosfato de sódio 0,3 M, pH 8,8, e carbonato de sódio 0,15 M, pH 9,25, e carbonato de sódio 0,3 M, pH 9,4.

Exemplo 19

Gelificação 10 - Pulverização auxiliada por gás

Foram esterilizados em autoclave 120 mg/ml de AH-VS (Exemplo 1) com uma relação de PEG/HA-VS de 1 mg/120 mg. Foi distribuído em alíquotas AH-VS numa seringa de 3 ml e foi misturado com PEG(SH)2 como foi detalhado na seguinte quadro, a seguir foi distribuído em alíquotas uma solução tampão numa segunda seringa de 3 ml como foi definido na seguinte quadro. A seringa de AH-VS/PEG(SH)2 e a seringa com o tampão correspondente foram ligados a um dispositivo de pulverização auxiliado por gás (Fibrijet Part n° SA-3652, Micromedics). O porto de gás do dispositivo de pulverização auxiliado por gás foi ligado a um tanque de C02 por meio de um regulador (Tissomat, Baxter). A pressão de saída do regulador foi configurada a 20 PSI(137,9 kPa) a seguir foram pulverizadas as soluções numa tripa de salsichas ativando o fornecimento de gás e deprimindo os êmbolos da seringa AH-VS/PEG(SH) 2 e simultaneamente a seringa do tampão correspondente. Os materiais gelifiçaram na tripa de salsichas num lapso de tempo de 1 minuto. Foi avaliada a adesividade de cada filme à tripa de salsichas tocando fisicamente o filme e a adesividade dos filmes foi classificada entre si sendo o número 1 mais fraco e sendo o número 4 mais forte.

Exemplo 20

Efeito da substituição de AH-VS

Foram realizados a gelificação e força de estouro de AH-VS (Mm aprox. 600 kD) com uma substituição do 2 %, 6 %, 14 % (Exemplo 2), e 20 % (Exemplo 3) respetivamente. Foi dissolvido o AH-VS durante a noite a 25 mg/ml em H20 desionizada numa seringa de 3 ml, e a seguir foi esterilizado em autoclave (250 °F (121,1 °C) 15 minutos): 2 ml de cada solução de AH-VS foram misturados com 53 mg de PEG (SH) 2 seco, e a seguir foi misturado com 133 μΐ de carbonato de sódio 0,3 M, pH 9,4. O material misturado foi extrudado numa tripa de salsichas (Exemplo 5). Transcorridos 5 minutos, os materiais que utilizavam o AH-VS substituído a 2 % e o AH-VS substituído a 6 % não gelifiçaram completamente neste ponto de tempo. Os materiais que utilizavam o AH-VS substituído a 14 % e o AH-VS substituído a 20 % tinham gelificado num lapso de tempo de 5 minutos (os materiais tinham gelificado num lapso de tempo de 1 minuto) . Foi medida a força de estouro das amostras gelificadas.

Exemplo 21

Pulverização auxiliada por gás

Foram esterilizados em autoclave 50 mg/ml de AH-VS substituído ao 14 % (Exemplo 2) e AH-VS substituído ao 20 % (Exemplo 3) (250 F, (121,1 °C, 15 minutos) respetivamente. A seguir preparou-se cada amostra para a pulverização auxiliada por gás como segue: o AH-VS foi distribuído em alíquotas numa seringa de 3 ml e a seguir foi misturado com PEG(SH)2 como foi detalhado na seguinte quadro. A seguir uma solução tampão foi distribuída em alíquotas numa segunda seringa de 3 ml como foi definido na seguinte quadro. A seringa de AH-VS/PEG(SH)2 e a seringa com o tampão correspondente foram ligadas a um dispositivo de pulverização auxiliado por gás (Fibrijet Part n° SA-3652, Micromedics). O porto de gás do dispositivo de pulverização auxiliado por gás foi ligada a um tanque de C02 por meio de um regulador (Tissomat, Baxter). A pressão de saída do regulador foi configurada a 20 PSI (137,9 kPa) . a seguir foram pulverizadas as soluções numa tripa de salsichas ativando o fornecimento de gás e deprimindo os êmbolos da seringa AH-VS/PEG(SH)2 e simultaneamente a seringa do tampão correspondente. Os materiais gelifiçaram na tripa de salsichas num lapso de tempo de 1 minuto. Foi avaliada a adesividade de cada filme à tripa de salsichas tocando fisicamente a filme e a adesividade das películas foi classificada entre si sendo o número 1 mais fraco e sendo o número 2 mais forte.

Quadro 9. % de AH PEG(SH)2 TAMPÃO PH DO FILME CLASSIFICAÇÃO CICLO „ Λ

__VS SUB (MG)__(Μ) TAMPAO UNIFORME DE ADERÊNCIAS 1 __14__53__0,3 9,4__Sim__2_ 2 20 53 0,3 8,4 Sim 1

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 2011014432 A [0003] [0005] • EP 2177236 A [0006] • WO 2004060346 A [0056] [0058] • WO 2005051452 A [0056] [0058] • WO 200613547 A [0056] [0058] • WO 2007089878 A [0056] [0058] • WO 2005046746 A [0057] [0058] • WO 2005046747 A [0057] [0058] • WO 2006124021 A [0057] [0058]

Documentos de não patente citados na descrição • STERN R. Eur J Cell Biol, 2004, vol. 83 (7), 317-25 [0002] • The United States Pharmacopeia. The United States

Pharmacopeial Convention, 2008 [0029] • D. D. ALLISON ; K. J. GRANDE-ALLEN. Tissue

Engineering, 2006, vol. 12 (8), 2131-2140 [0090] • G. D. PRESTWICH et al. Tissue Engineering, 2006, vol. 12 (8), 2171-2180 [0090] • G. D. PRESTWICH et al. Tissue Engineering, 2006, vol. 12 (12), 3405-3416 [0090]

Lisboa, 20 de Maio de 2015

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um kit que compreende: (i) um primeiro recipiente que compreende uma solução aquosa de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona ("AH-VS") a uma concentração de 10 300 mg/ml, em que AH-VS é ácido (2- (vinilsulfonil)etoxi)hialurónico, e o AH-VS tem entre 2 % - 70 % dos seus grupos hidroxilo transformados em grupos 2-(vinilsulfonil)etoxi, (ii) um segundo recipiente que compreende um polietilenoglicol funcionalizado com tiol que tem de 2 a 8 grupos tiol, e (iii) um terceiro recipiente que compreende uma solução tampão 30 -1000 mM a um pH que varia entre 7-12, numa quantidade eficaz, quando é misturado com o conteúdo do primeiro e o segundo recipientes, para proporcionar uma solução que tem uma concentração de AH-VS de 2-8 % (p/v) e uma concentração de polietilenoglicol funcionalizado com tiol de 2 - 8 % (p/v), onde os componentes do primeiro, segundo e terceiro recipientes, quando são combinados, são eficazes para formar um gel num lapso de tempo de cerca de 5 segundos a 1 hora de mistura.
2. O kit de acordo com a reivindicação 1, em que o ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona tem entre 7 % -35 %, ou de 10 % a 25 %, dos seus grupos hidroxilo substituídos com vinilsulfona.
3. O kit de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que o polietilenoglicol funcionalizado com tiol tem um número de grupos tiol selecionado a partir do grupo que consiste em 2, 3 e 4.
4. 0 kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona tem uma massa molecular média que varia de 15.000 a 1.000.000 daltons ou de 20.000 a 200.000 daltons.
5. O kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o polietilenoglicol funcionalizado é linear ou ramificado.
6. O kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o polietilenoglicol funcionalizado com tiol tem uma massa molecular média de 1.000 a 10.000 daltons.
7. O kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a massa molecular do polietilenoglicol funcionalizado com tiol é menor que a massa molecular do ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona.
8. O kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a solução aquosa de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona ("AH-VS") tem uma concentração que varia entre 20 - 200 mg/ml.
9. O kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o polietilenoglicol funcionalizado com tiol está na forma de um pó.
10. O kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a quantidade de polietilenoglicol funcionalizado com tiol com respeito ao ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona varia desde cerca de 1:1 (em p/p) a cerca de 0,4:1 (em p/p).
11. O kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que qualquer do primeiro, segundo ou terceiro recipientes compreende ainda um agente bioativo, ou o kit compreende ainda um quarto recipiente que compreende um agente bioativo.
12. 0 kit de acordo com a reivindicação 11, em que o agente bioativo é um corticosteroide selecionado a partir de triamcinolona, triamcinolona acetonida e triamcinolona hexacetonida.
13. 0 kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o primeiro recipiente compreende ainda de 0,1 % em peso a 3,5 por cento em peso do polietilenoglicol funcionalizado com tiol com respeito ao ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona (em p/p).
14. O kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que um ou mais dos componentes do kit são estéreis.
15. Uma composição liquida formada a partir da combinação de (i) uma solução aquosa de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona ("AH-VS"), (i i) um polietilenoglicol funcionalizado com tiol, e (iii) uma solução tampão 30 -1000 mM, em que a solução aquosa de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona ("AH-VS")/· o polietilenoglicol funcionalizado com tiol e a solução tampão são como foi definido qualquer uma das reivindicações 1 a 10 em que a concentração do polietilenoglicol funcionalizado com tiol na composição liquida varia entre 4-300 mg/ml, a composição liquida compreende opcionalmente ainda um agente bioativo, e a composição liquida é eficaz para formar um gel num lapso de tempo de cerca de 5 segundos a cerca de 1 hora da mistura de componentes (i), (ii) e (iii).
16. A composição líquida de acordo com a reivindicação 15, em que o agente bioativo é um corticosteroide selecionado a partir de triamcinolona, triamcinolona acetonida e triamcinolona hexacetonida.
17. A composição líquida de acordo com a reivindicação 15 ou a reivindicação 16, em que um ou mais dos componentes da composição são estéreis.
18. Um hidrogel formado a partir da composição líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17.
19. Um método para formar uma composição líquida capaz de formação de gel in situ, que compreende: (i) adicionar um polietilenoglicol funcionalizado com tiol que tenha entre 2 e 8 grupos tiol a uma solução aquosa de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona ("AH-VS") que tem uma concentração de entre 4 - 300 mg/ml, em que AH-VS é ácido (2-(vinilsulfonil)etoxi)hialurónico, e o AH-VS tem de 2 % a 70 % dos seus grupos hidroxilo transformados em grupos 2-(vinilsulfonil)etoxi, para dissolver deste modo o polietilenoglicol funcionalizado com tiol para formar uma solução que contém polietilenoglicol funcionalizado com tiol-ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona, e (ii) combinar a solução da etapa (i) com uma solução tampão 30 - 1000 mM a um pH que varia entre 7 - 12, para formar desta maneira uma composição líquida que tem uma concentração de AH-VS de 2-8 % (p/v) e uma concentração de polietilenoglicol funcionalizado com tiol de 2-8 % (p/v), em que a composição líquida é eficaz para formar um gel num lapso de tempo de cerca de 5 segundos a cerca de 1 hora de combinação.
20. O método de acordo com a reivindicação 19, em que: (i) o ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona tem de 7 % a 35 % ou de 10 % a 25 % dos seus grupos hidroxilo substituídos com vinilsulfona; e/ou (ii) o ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona tem uma massa molecular média que varia de 10.000 a 2.000.000 daltons; ou de 20.000 a 1.000.000 daltons, ou de 20.000 a 200.000 daltons; ou tem uma massa molecular média de 100.000 daltons, e/ou (iii) a solução aquosa de ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona ("AH-VS") tem uma concentração que varia entre cerca de 20-200 mg/ml; e/ou (iv) a massa molecular do polietilenoglicol funcionalizado com tiol é menor que a massa molecular do ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona; e/ou (v) a quantidade de polietilenoglicol funcionalizado com tiol com respeito ao ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona varia de 1:1 (em p/p) a 0,4:1 (em p/p), e/ou (vi) a solução tampão tem um pH que varia de 8,0 a 10,5 .
21. O método de acordo com qualquer da reivindicação 19 ou reivindicação 20, que compreende ainda adicionar um agente bioativo à solução que contém polietilenoglicol funcionalizado com tiol-ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona da etapa (i) , ou à solução tampão da etapa (ii) antes da combinação, ou à composição líquida formada na etapa (ii) .
22. O método de acordo com a reivindicação 20, que compreende: (a) adicionar uma porção de uma quantidade total do polietilenoglicol funcionalizado com tiol a uma solução aquosa do ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona ("AH-VS") que tem uma concentração de entre 10 - 300 mq/ml, para formar desta maneira uma solução, (b) esterilizar opcionalmente a solução da etapa (a), (c) adicionar à solução da etapa (a) ou a etapa (b) se é realizada, a quantidade restante de polietilenoqlicol funcionalizado com tiol, para dissolver desta maneira a quantidade restante de polietilenoqlicol funcionalizado com tiol para formar uma solução que contém polietilenoqlicol funcionalizado com tiol-ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona, e (d) misturar a solução que contém polietilenoqlicol funcionalizado com tiol-ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona com a solução tampão 30 - 1000 mM a um pH que varia entre 7 - 12, para formar desta maneira a composição liquida.
23. O método de acordo com a reivindicação 22, em que a porção de polietilenoqlicol funcionalizado com tiol da etapa (a) compreende de 0,1 % em peso a cerca de 3,5 por cento em peso de polietilenoqlicol funcionalizado com tiol com respeito ao ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona (em p/p).
24. O método de acordo com a reivindicação 22 ou a reivindicação 23, que compreende (b) esterilizar a solução da etapa (a) e/ou em que um ou ambos do poliet ilenoqlicol funcionalizado com tiol da etapa (c) e a solução tampão são estéreis.
25. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, que compreende ainda adicionar um aqente bioativo à solução da etapa (a), ou à solução que contém o polietilenoglicol funcionalizado com tiol-ácido hialurónico derivatizado com vinilsulfona da etapa (c) , ou à solução tampão da etapa (d) antes da mistura, ou à composição líquida formada na etapa (d).
26. 0 método de acordo com a reivindicação 21 ou a reivindicação 25, em que o agente bioativo é um corticosteroide selecionado a partir de triamcinolona, triamcinolona acetonida e triamcinolona hexacetonida.
27. 0 kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou a composição líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, para utilização na aplicação a um local do corpo.
28. 0 kit ou a composição liquida para a utilização de acordo com a reivindicação 27, para utilização no desenvolvimento embrionário, a organização de tecidos, cicatrização de feridas, angiogénese, tumorigénese, a prevenção de aderências cirúrgicas, ou o tratamento da osteoartrite ou a artrite reumatoide.
29. 0 kit ou a composição líquida para a utilização de acordo com a reivindicação 27, para utilização em artroscopia ou cirurgia aberta de articulações para reparar o tecido da articulação (isto é, cartilagem), para utilização em aplicações de precintado de tecidos ou para utilização para efetuar a hemostasia. Lisboa, 20 de Maio de 2015