CN102178980A - 天然高分子复合多孔纤维支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
天然高分子复合多孔纤维支架是一种具有球形孔洞与纳米纤维结构的天然高分子支架材料,其中球形孔尺寸为100微米-500微米,纤维结构孔尺寸为500纳米-20微米,天然高分子是明胶、丝素蛋白、玉米蛋白、藻酸盐、壳聚糖、透明质酸、葡聚糖中的一种或多种物质的混合物。该支架为块状结构,具有很高孔隙率、良好力学性能和孔隙连通结构,是一种可用于细胞生长及组织修复再生的生物医用材料。天然高分子复合多孔纤维支架的制备方法为:制备并筛选分级得不同直径分布范围的石蜡微球,装入模具预热,将天然高分子溶液倒入模具中浸没石蜡微球并进行冷冻,然后于不同溶剂中发生相分离并洗去致孔剂,将材料真空干燥后即可制得多孔纤维支架材料。
Description
技术领域
本发明是一种天然高分子复合多孔纤维支架及其制备方法,涉及一种可用于细胞生长支架及组织修复再生材料及其制备方法,属于生物医用材料领域。
背景技术
组织工程支架材料的制备方法是组织工程实现产业化的关键。多孔支架材料(特别是孔隙率高于90%)因其具有相互连通的孔结构,为材料外部和内部同时提供适于细胞的生长分化及其代谢产物与营养物质的交换的环境,被认为是最具有发展前景的组织工程支架材料。
致孔剂滤沥法是最常用的多孔支架制备方法,包括溶液浇铸-致孔剂滤沥法,挤出成型-致孔剂滤沥法等。胡平等通过在支架成型过程中加入致孔剂,并在支架成型后将致孔剂萃取出来,制备了一种组织和器官修复用多孔支架(ZL 00105638.7)。丁建东等采用溶液浇铸-粒子滤沥法,将具有双峰或多峰分布的致孔剂粒子与高分子溶液混合制备多孔支架(ZL 01126477.2)。致孔剂可以是多聚磷酸钠、氯化钠或氯化钾(ZL 200610016190.1),还有以冰颗粒作为致孔剂,通过冷冻干燥法制备多孔支架材料(200510122920.1、200610026086.0),更有以惰性气体等作为致孔剂制备可植入的多孔支架材料(US2006003179-A1)。相分离法一般通过将溶液冷却到溶剂熔点以下产生相分离,再由真空干燥制备多孔支架。US5723508-A提供了一种冷冻干燥乳液制备模压多孔支架的方法。相分离法也常与致孔剂滤沥法结合,胡平等对生物相容性聚合物聚(3-羟基丁酸酯)、3-羟基丁酸酯和3-羟基己酸酯共聚物、聚乳酸、乳酸和羟基乙酸共聚物,提出了一种通过相分离粒子滤沥制备多孔支架的方法(ZL00105637.9)。近年来研究者发现纤维织物常常具有通孔结构,且比表面积大,通过溶剂把纤维层粘接起来,可以形成三维多孔支架。WO2010044758-A1提供了一种用于骨组织工程的生物可吸收支架材料,其支架内部是多孔聚合物纤维,外部是可吸收纤维网。WO2007024125-A1、US2008233162-A1提供了一种由静电纺丝技术制备三维多孔纤维支架的方法,该支架可作为粘附细胞的植入材料用于组织修复再生。
模仿细胞外基质的组成结构和生物功能,以生物相容性和降解性好的天然高分子蛋白质、多糖或含蛋白质的共混物构建的组织工程支架,具有其它材料不可比拟的优越性。天然高分子中很多蛋白,如弹性蛋白和胶原蛋白,是细胞外基质的主要成分,是组织支架的重要调节蛋白,影响细胞的粘附、生长、繁殖。纤维蛋白原是凝血系统的重要成分之一,纤维蛋白原在体内经凝血酶作用转变为纤维蛋白发挥其凝血和止血功能,并参与体内一系列病理、生理过程,如炎症、组织损伤、修复等。谷物蛋白则来源广泛、价廉易得,更适合于广泛应用,是近年来倍受关注的一类天然高分子生物材料。透明质酸是以游离形式广泛分布于结缔组织的细胞外基质中的天然高分子多糖,也是细胞外基质的主要成分之一,不仅在维持组织形态和保持组织抗压缩性及张力方面具有重要作用,还对细胞具有多种作用,如保护细胞,影响细胞移动、增殖和分化,影响细胞的吞噬功能,屏蔽细胞膜上的机械感受器等。甲壳素及其衍生物是一种天然高分子线形多糖,具有良好的生物相容性、生物降解性、抗菌性、促使伤口愈合等特性。因此,构建以天然高分子蛋白质、多糖或含蛋白质的共混物为主要成分的多孔支架,并且该支架存在纳米纤维结构以模拟细胞外基质的微观结构,本发明的基于组成和结构仿生的天然高分子复合多孔纤维支架,是较理想的组织工程支架材料。
发明内容
技术问题:本发明的目的是提供一种具有球形孔洞与纳米纤维结构的天然高分子复合多孔纤维支架,是一种具有很高孔隙率、良好力学性能和孔隙连通结构的天然高分子复合多孔纤维支架。
技术方案:本发明的天然高分子复合多孔纤维支架具有两种孔径分布范围的孔洞,球形孔洞的尺寸为100微米-500微米,纤维结构孔洞的尺寸为500纳米-20微米;复合成该支架的天然高分子包括明胶、丝素蛋白、玉米蛋白、藻酸盐、壳聚糖、透明质酸、葡聚糖中的一种或多种物质的混合物。
该支架为块状结构,厚度为2毫米-100毫米。该复合多孔纤维支架还包括支架有机成分的添加剂,该添加剂是钙磷盐、二氧化硅、二氧化钛、氧化铝、氧化锌、氧化钾、氧化镁、氧化钙或碳纤维中的一种或多种物质的混合物,添加剂的含量为有机成分质量的0.01%-10%。该复合多孔纤维支架还包括支架有机成分的添加剂,该添加剂是纤维蛋白、细胞生长因子、骨生长因子、维生素、多肽或酶中的一种或多种物质的混合物,添加剂的含量为有机成分质量的0.01%-10%。
该支架用作组织修复再生材料或凝血材料。
本发明的的天然高分子复合多孔纤维支架的制备方法依次包括下列步骤:
1.)将质量浓度0.1%-1%的聚乙烯醇水溶液倒入熔化的石蜡中,高速搅拌后经标准筛分级得不同直径分布范围的石蜡微球;
2.)将步骤1)制备的石蜡微球装入模具,预热1-6小时,将质量浓度0.1%-30%的天然高分子溶液倒入模具中浸没石蜡微球,随后置于超低温冰箱中冷冻24小时;
3.)取出冻结成块的石蜡微球和天然高分子混合物,浸泡于溶剂中,浸泡时间为24小时以上,且每隔8小时更换一次溶剂;
4.)将所得材料真空干燥后浸泡在正己烷中以洗去材料中的石蜡微球,浸泡时间为24小时以上,将材料真空干燥后即可制得复合多孔纤维支架材料。
所述步骤3)中的溶剂是甲醇、乙醇、异丙醇、水或二氧六环中的一种或多种。
有益效果:本发明与现有技术相比,具有如下优点:
(1)本发明通过调整致孔剂石蜡微球的直径和天然高分子溶液的浓度,得到具有球形孔洞与纳米纤维结构的天然高分子复合多孔纤维支架。
(2)本发明提供的天然高分子复合多孔纤维支架中球形孔洞保证了支架的孔隙连通结构,纳米纤维结构则模拟了细胞外基质的微观结构,在组成和结构上进行仿生,是较理想的组织工程支架材料。
(3)本发明提供的天然高分子复合多孔纤维支架在具有很高孔隙率的同时保持了良好的力学性能和孔隙连通结构,适于细胞的生长分化及其代谢产物与营养物质的交换,可以用于细胞、组织培养。
(4)本发明提供的天然高分子复合多孔纤维支架可以含有无机成分钙磷盐、二氧化硅、二氧化钛、碳纤维等,可以明显改善支架的生物相容性和力学性能等,是较理想的组织修复再生材料,特别是硬组织修复再生材料和创伤凝血材料。
(5)本发明提供的天然高分子复合多孔纤维支架具有良好的生物降解性,在其有机成分中加入细胞生长因子等添加剂,具有优异的细胞亲和性与生物相容性。
(6)本发明提供的天然高分子复合多孔纤维支架制备方法中多采用醇、水等无毒无害溶剂,符合环境保护要求,适合于产业化生产。
附图说明
图1复合多孔纤维支架的照片。
图2复合多孔纤维支架的扫描电镜照片,放大倍数:×50。
图3复合多孔纤维支架的扫描电镜照片,放大倍数:×1000。
图4复合多孔纤维支架的扫描电镜照片,放大倍数:×10000。
具体实施方式
本发明的一种天然高分子复合多孔纤维支架具有两种孔径分布范围的孔洞,球形孔洞的尺寸为100微米-500微米,纤维结构孔洞的尺寸为500纳米-20微米。该支架为块状结构,厚度为2毫米-100毫米。天然高分子复合多孔纤维支架的制备方法依次包括下列步骤:
1)将质量浓度0.1%-1%的聚乙烯醇水溶液倒入熔化的石蜡中,高速搅拌后经标准筛分级得不同直径分布范围的石蜡微球。
2)将步骤1)制备的石蜡微球装入模具,预热1-6小时。将质量浓度0.1%-30%的天然高分子溶液倒入模具中浸没石蜡微球,随后置于超低温冰箱中冷冻24小时。
3)取出冻结成块的石蜡微球和天然高分子混合物,可首先进行交联或不交联,然后浸泡于溶剂中,溶剂是甲醇、乙醇、异丙醇、水、二氧六环中的一种或多种,浸泡时间为24小时以上,且每隔8小时更换一次溶剂。
4)将所得材料真空干燥后浸泡在正己烷中以洗去材料中的石蜡微球,浸泡时间为24小时以上。将材料真空干燥后即可制得复合多孔纤维支架材料。
天然高分子复合多孔纤维支架的有机成分为明胶、丝素蛋白、玉米蛋白、藻酸盐、壳聚糖、透明质酸、葡聚糖中的一种或多种物质的混合物。支架的无机成分为钙磷盐、二氧化硅、二氧化钛、氧化铝、氧化锌、氧化钾、氧化镁、氧化钙、碳纤维中的一种或多种物质的混合物。有机成分的添加剂是纤维蛋白、细胞生长因子、骨生长因子、维生素、多肽、酶中的一种或多种物质的混合物,添加剂的含量为有机成分质量的0.01%-10%。该支架可用于细胞生长支架及组织修复再生材料。
实施例1
称取熔点为55℃的块状石蜡10g,量取浓度0.5%的聚乙烯醇溶液100~200ml,将上述两种物品置入温度设置为80℃的烘箱中,保持一段时间,直至石蜡完全溶化,聚乙烯醇溶液温度稳定后,将聚乙烯醇溶液倒入盛有液体石蜡的烧杯中,高速搅拌,使石蜡分散成无数的石蜡小液滴。然后迅速倒入适量的冰水中,使石蜡小液滴速凝形成石蜡微球颗粒。用蒸馏水冲洗石蜡颗粒4~5遍,除去其中杂质。把所得石蜡颗粒经过国家标准筛分级,然后在真空干燥箱中干燥后密封保存备用。
称取一定量的明胶溶于50%(v/v)的乙醇/水溶液中,配制质量浓度为10%(w/v,g/ml)的明胶溶液。用恒温磁力搅拌器不断搅拌,直至溶液呈均匀透明液体。将制备的直径大小为150-300μm的石蜡微球装入模具中,在40℃的恒温培养箱中预热2-4小时,使石蜡微球粘连成一整块。将配制好的明胶溶液倒入预热后的模具中,使其浸没石蜡微球。然后把装有石蜡微球和明胶溶液混合物的模具置于超低温冰箱中,在-80℃的温度下冷冻24小时。取出冻结成块的石蜡微球和明胶溶液混合物,浸泡于冰乙醇(-18℃)中12小时,而后在常温下浸泡于1,4-二氧六环中24小时,且每隔8小时更换1,4-二氧六环一次。将所得材料真空干燥后浸泡在正己烷中,浸泡时间为24小时以上,且每8小时更换一次正己烷。最后,将材料真空干燥后即可得呈海绵状的明胶多孔纤维支架材料(附图1),用扫描电镜观察支架,发现其具有球形孔洞与纳米纤维结构(附图2-图4)。
实施例2
按实施例1所述方法制备石蜡微球。
称取一定量的明胶溶于20%(v/v)的乙醇/水溶液中,配制质量浓度为5%,10%,15%,20%,25%(w/v,g/ml)的明胶溶液。将制备的直径大小为300-500μm的石蜡微球装入模具中,在40℃的恒温培养箱中预热6小时。将配制好的明胶溶液倒入预热后的模具中,使其浸没石蜡微球。然后把装有石蜡微球和明胶溶液混合物的模具置于超低温冰箱中,在-80℃的温度下冷冻24小时。取出冻结成块的石蜡微球和明胶溶液混合物,浸泡于冰乙醇(-18℃)中12小时,而后在常温下浸泡于1,4-二氧六环中24小时,且每隔8小时更换1,4-二氧六环一次。将所得材料真空干燥后浸泡在正己烷中,浸泡时间为48小时,且每8小时更换一次正己烷。测得明胶多孔纤维支架材料的孔隙率(表1)。
表1不同明胶溶液浓度制得的多孔纤维支架材料的孔隙率
实施例3
按实施例1所述方法制备石蜡微球。
称取一定量的玉米蛋白溶于65%(v/v)的乙醇/水溶液中,配制质量浓度为20%(w/v,g/ml)的玉米蛋白溶液10mL,加入0.5g羟基磷灰石,超声分散均匀。将制备的直径大小为300-500μm的石蜡微球装入模具中,在40℃的恒温培养箱中预热2-4小时。将配制好的玉米蛋白-羟基磷灰石溶液倒入预热后的模具中,使其浸没石蜡微球。然后把装有石蜡微球和玉米蛋白羟基磷灰石混合物的模具置于超低温冰箱中,在-80℃的温度下冷冻48小时。取出冻结成块的石蜡微球和玉米蛋白-羟基磷灰石混合物,浸泡于冰水(-18℃)中36小时,且每隔8小时更换一次冰水。将所得材料真空干燥后浸泡在正己烷中,浸泡时间为24小时以上,且每8小时更换一次正己烷。经真空干燥后即可得具有球形孔洞与纳米纤维结构的玉米蛋白-羟基磷灰石多孔纤维支架材料。
实施例4
按实施例1所述方法制备石蜡微球。
配制质量浓度为10%(w/v,g/ml)的透明质酸(平均分子量为10万)水溶液。将制备的直径大小为300-500μm的石蜡微球装入模具中,在40℃的恒温培养箱中预热6小时。将配制好的透明质酸水溶液倒入预热后的模具中,使其浸没石蜡微球。然后把装有石蜡微球和透明质酸水溶液的模具置于超低温冰箱中,在-80℃的温度下冷冻24小时。取出冻结成块的石蜡微球和透明质酸混合物,浸泡于冰乙醇(-18℃)中48小时,且每隔8小时更换一次冰乙醇。而后在常温下浸泡于1,4-二氧六环中24小时,且每隔8小时更换1,4-二氧六环。将所得材料真空干燥后浸泡在正己烷中,浸泡时间为48小时以上,且每8小时更换一次正己烷。经真空干燥后即可得具有球形孔洞与纳米纤维结构的透明质酸多孔纤维支架材料。
实施例5
按实施例1所述方法制备石蜡微球。
取桑蚕茧用0.1%Na2CO3溶液以1∶50的浴比(80g桑蚕茧、4gNa2CO3、4000mL去离子水)在100℃下煮沸30分钟,重复三次,在通风处晾干得脱除丝胶的丝素蛋白。以10%CaCl2的乙醇/水(v/v,8/2)溶液为溶剂溶解丝素蛋白,所得丝素-氯化钙溶液以去离子水透析48小时,每6小时更换一次去离子水。经旋转蒸发制得质量浓度约8%的丝素蛋白水溶液,加入1.5mL 0.05mg/mL骨形态发生蛋白(BMP-2)的磷酸盐缓冲液(PBS),搅拌均匀。
将制备的直径大小为150-300μm的石蜡微球装入模具中,在40℃的恒温培养箱中预热4小时。将丝素蛋白-骨形态发生蛋白水溶液倒入预热后的模具中,使其浸没石蜡微球。然后把装有石蜡微球和丝素蛋白-骨形态发生蛋白混合物的模具置于超低温冰箱中,在-80℃的温度下冷冻24小时。取出冻结成块的石蜡微球和丝素蛋白-骨形态发生蛋白混合物,浸泡于冰乙醇(-18℃)中48小时,且每隔8小时更换一次冰乙醇。而后在常温下浸泡于1,4-二氧六环中24小时,且每隔8小时更换1,4-二氧六环。将所得材料真空干燥后浸泡在正己烷中,浸泡时间为48小时以上,且每8小时更换一次正己烷。经真空干燥后即可得具有球形孔洞与纳米纤维结构的丝素蛋白-骨形态发生蛋白多孔纤维支架材料。
实施例6
按实施例1所述方法制备直径大小为150-300μm的石蜡微球,在预热时间均为2h的条件下,以10%(w/v,g/ml)的明胶溶液浓度制得的多孔纤维支架材料,在此条件下制备出的多孔材料具有较高的连通性和孔隙率,并且此材料有较为适合的柔软性和弹性。采用可吸收明胶海绵作为对照材料,分别对兔耳静脉、兔耳动脉、兔肝脏部位的出血模型进行止血实验,以平均止血时间作为评价项目,可得如表2所示的实验结果。两组材料在不同部位的止血时间相比较,其p值均小于0.05,视为实验结果有显著差异。使用明胶多孔纤维支架材料进行止血时,可比明胶海绵的止血时间缩短近一倍,具有更为良好的止血效果。
表2两种止血材料在兔耳静脉、动脉、肝脏的止血时间
Claims (7)
1.一种天然高分子复合多孔纤维支架,其特征在于该支架具有两种孔径分布范围的孔洞,球形孔洞的尺寸为100微米-500微米,纤维结构孔洞的尺寸为500纳米-20微米;复合成该支架的天然高分子包括明胶、丝素蛋白、玉米蛋白、藻酸盐、壳聚糖、透明质酸、葡聚糖中的一种或多种物质的混合物。
2.根据权利要求1所述的天然高分子复合多孔纤维支架,其特征在于该支架为块状结构,厚度为2毫米-100毫米。
3.根据权利要求1所述的天然高分子复合多孔纤维支架,其特征在于该复合多孔纤维支架还包括支架有机成分的添加剂,该添加剂是钙磷盐、二氧化硅、二氧化钛、氧化铝、氧化锌、氧化钾、氧化镁、氧化钙或碳纤维中的一种或多种物质的混合物,添加剂的含量为有机成分质量的0.01%-10%。
4.根据权利要求1所述的天然高分子复合多孔纤维支架,其特征在于该复合多孔纤维支架还包括支架有机成分的添加剂,该添加剂是纤维蛋白、细胞生长因子、骨生长因子、维生素、多肽或酶中的一种或多种物质的混合物, 添加剂的含量为有机成分质量的0.01%-10%。
5.根据权利要求1所述的天然高分子复合多孔纤维支架,其特征在于该支架用作组织修复再生材料或凝血材料。
6.一种如权利要求1所述的天然高分子复合多孔纤维支架的制备方法,其特征在于:所述方法依次包括下列步骤:
1.)将质量浓度0.1%-1%的聚乙烯醇水溶液倒入熔化的石蜡中,高速搅拌后经标准筛分级得不同直径分布范围的石蜡微球;
2.)将步骤1)制备的石蜡微球装入模具,预热1-6小时,将质量浓度0.1%-30%的天然高分子溶液倒入模具中浸没石蜡微球,随后置于超低温冰箱中冷冻24小时;
3.)取出冻结成块的石蜡微球和天然高分子混合物,浸泡于溶剂中,浸泡时间为24小时以上,且每隔8小时更换一次溶剂;
4.)将所得材料真空干燥后浸泡在正己烷中以洗去材料中的石蜡微球,浸泡时间为24小时以上,将材料真空干燥后即可制得复合多孔纤维支架材料。
7. 根据权利要求6所述的天然高分子复合多孔纤维支架的制备方法,其特征在于步骤3)中的溶剂是甲醇、乙醇、异丙醇、水或二氧六环中的一种或多种。
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