CN102492164B - 多孔丝素支架的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了一种多孔丝素支架的制备方法，包括如下步骤：(1)制备丝素溶液；(2)制备丝素支架模板：将致孔剂微球分散在溶剂中并使得致孔剂微球有序排列，然后通过干燥处理获得丝素支架模板，所述致孔剂微球为尺寸均匀的PS微球或PMMA微球；(3)将丝素溶液注入到丝素支架模板中，然后通过干燥固化获得支架；(4)去除支架中的致孔剂微球，干燥后得到多孔丝素支架。本发明采用尺寸均匀的PS微球或PMMA微球作为致孔剂以制备丝素支架模板，由于PS微球或PMMA微球尺寸的可控性，所以可以对多孔丝素支架中的孔及孔隙进行调控，而且所获得孔的有序度高，孔隙间的连通性较好。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物材料，尤其涉及一种多孔丝素支架的制备方法，应用于组织工程和组织修复。
背景技术
随着组织工程发展，组织器官缺损的治疗从器官移植进入器官制造的新时代。我国是蚕丝大国，蚕丝的来源丰富，蚕丝经过脱胶制得的丝素蛋白具有无毒、无刺激、良好的生物相容性、独特的力学性等优点，在生物医学领域有着广阔的应用前景，基于细胞大小和迁移的需要，孔径大于100μm大小可控，且孔与孔之间相互联通是组织工程对支架材料的基本要求，科研工作者相继研发报道出了一系列多孔丝素支架的制备技术，目前用丝素纤维制备再生丝素溶液报道较多的是利用冷冻干燥法、反复冻融、颗粒沥滤致孔法将丝素溶液制备成丝素多孔支架材料。
David L.Kaplan等研究团队对用丝素溶液制备三维多孔支架研究较多，曾报道过利用不同粒径的NaCl颗粒作为致孔剂结合冷冻干燥技术、及有机溶剂(六氟异丙醇)的作用，制备了具有不同孔径大小的多孔丝素蛋白支料。所制备的支架材料的孔径随加入的盐颗粒致孔颗粒大小而变化，孔隙率在90％以上。
Lorenz Meinel等，也是采用粒子沥滤配合冷冻干燥法制备多孔丝素支架，以200-300μm石蜡颗粒为致孔剂熔融建模后再填充丝素溶液冻干，接着经过甲醇或水蒸气处理丝素向β-折叠结构转变，最后用正己烷浸泡处理将致孔剂滤出得到空隙率到90％以上多孔丝素支架。
上述技术的缺点在于：很难控制颗粒孔隙间的连通性，而且因致孔剂的多分散性使得丝素不均匀渗透最终导致力学性能变差。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明解决的技术问题是提供一种多孔丝素支架的制备方法，利用该制备方法获得的多孔丝素支架的孔的尺寸及孔隙易调控，而且孔的有序度高、空隙间连通性好。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是这样实现的：一种多孔丝素支架的制备方法，尤其是，包括如下步骤：
(1)制备丝素溶液；
(2)制备丝素支架模板：将致孔剂微球分散在溶剂中并使得致孔剂微球有序排列，然后通过干燥处理获得丝素支架模板，所述致孔剂微球为尺寸均匀的PS微球或PMMA微球；
(3)将丝素溶液注入到丝素支架模板中，然后通过干燥固化获得支架；
(4)去除支架中的致孔剂微球，干燥后得到多孔丝素支架。
优选的，在上述多孔丝素支架的制备方法中，所述步骤(3)中，丝素溶液在注入到丝素支架模板中之前需要经醇处理。
优选的，在上述多孔丝素支架的制备方法中，所述醇为正丁醇。
优选的，在上述多孔丝素支架的制备方法中，所述步骤(3)中还包括通过抽真空或加电场方法使丝素溶液进入致孔剂微球空隙中的过程。
优选的，在上述多孔丝素支架的制备方法中，所述步骤(2)中致孔剂微球的有序排列是通过离心、超声或致孔剂微球的自组装来实现。
优选的，在上述多孔丝素支架的制备方法中，所述步骤(4)中通过将支架浸泡在四氢呋喃中去除致孔剂微球。
优选的，在上述多孔丝素支架的制备方法中，所述步骤(2)中，致孔剂微球在有序排列后还包括加热熔融的过程。
优选的，在上述多孔丝素支架的制备方法中，所述加热熔融的过程中，加热的温度为35～80℃，加热时间为0.5～8小时。
本发明提供了一种多孔丝素支架的制备方法，采用尺寸均匀的PS微球或PMMA微球作为致孔剂以制备丝素支架模板，由于PS微球或PMMA微球尺寸的可控性，所以可以对多孔丝素支架中的孔及孔隙进行调控，而且所获得孔的有序度高，孔隙间的连通性较好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中多孔丝素支架制备方法的方框图；
图2为本发明实施例中多孔丝素支架制备流程的示意图；
图3为本发明实施例1制备的丝素支架模板在电子显微镜下的示意图；
图4为本发明实施例1制备的丝素支架模板在电子显微镜下的放大示意图；
图5为本发明实施例1制备的多孔丝素支架在电子显微镜下的截面示意图；
图6为本发明实施例2制备的丝素支架模板在电子显微镜下的示意图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
参图1所示，本发明实施例公开了一种多孔丝素支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备丝素溶液；
(2)制备丝素支架模板：将致孔剂微球分散在溶剂中并使得致孔剂微球有序排列，然后通过干燥处理获得丝素支架模板，所述致孔剂微球为尺寸均匀的PS微球或PMMA微球；
(3)将丝素溶液注入到丝素支架模板中，然后通过干燥固化获得支架；
(4)去除支架中的致孔剂微球，干燥后得到多孔丝素支架。
步骤(1)中丝素溶液的制备，可以采用现有技术中的常规手段。丝素溶液可以指的是丝素蛋白溶液，也可以为丝素蛋白溶液与胶原蛋白溶液的混合体。
丝素蛋白溶液的制备原理：将蚕丝经脱胶、溶解、透析而得到一定质量浓度的丝素蛋白溶液。
胶原蛋白溶液的制备原理：将胶原溶解到一定质量浓度的乙酸溶液中，从而获得一定质量浓度的胶原蛋白溶液。
优选的，在上述多孔丝素支架的制备方法中，所述步骤(2)中，溶剂优选为乙醇，其目的是为了使得致孔剂微球均匀分散。易于想到，本发明实施例中，溶剂不限于乙醇，也可以为其他溶剂，比如水。
优选的，在上述多孔丝素支架的制备方法中，所述步骤(2)中，致孔剂微球的有序排列是通过离心、超声或致孔剂微球的自组装来实现。其具体可以描述如下：对于几个微米、尺寸均匀的致孔剂微球，微球可以在毛细压力和静电斥力的作用下实现排列均匀的自组装；对于直径为几十个微米及以上的致孔剂微球，要借助外力(如：超声、离心手段)来实现。
优选的，在上述多孔丝素支架的制备方法中，所述步骤(3)中，丝素溶液在注入到丝素支架模板中之前需要经醇处理。醇处理可以避免致孔剂微球在固化(通常手段为冷冻)的过程中丝素形成片状结构，而是将其保持为球形小孔。所述醇优选为正丁醇。所述步骤(4)中还包括去除正丁醇的过程。
优选的，在上述多孔丝素支架的制备方法中，所述步骤(3)中还包括通过抽真空或加电场方法使丝素溶液进入致孔剂微球空隙中的过程。
优选的，在上述多孔丝素支架的制备方法中，所述步骤(4)中通过将支架浸泡在四氢呋喃中去除致孔剂微球。四氢呋喃可以用以溶解PS微球或PMMA微球。PS微球或PMMA微球的去除也可以采用现有技术中的其他物质进行溶解。
优选的，在上述多孔丝素支架的制备方法中，所述步骤(2)中，致孔剂微球在有序排列后还包括加热熔融的过程。熔融可以让致孔剂微球能有一定的粘连，这样便于在相邻微球之间形成连通的孔洞，即可以使制成的孔之间连通。
优选的，在上述多孔丝素支架的制备方法中，所述加热熔融的过程中，加热的温度为35～80℃，加热时间为0.5～8小时。
PS微球或PMMA微球可以自己制备，也通过在市场上采购获得。
参图2所示，多孔丝素支架的制备流程可以描述如下：
(1)标号1：将致孔剂微球分散在溶液中；
(2)标号2：经过超声、离心、自组装等手段使得致孔剂微球排列比较规整，干燥后制得模板；
(3)标号3：往模板中浇注丝素溶液；
(4)标号4：：丝素溶液与致孔剂微球一同干燥固化；
(5)标号5：去除致孔剂，干燥后获得多孔丝素支架。
为了进一步说明本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1
1、制备丝素溶液：将蚕丝用0.5％(w/w)的NaHCO3沸煮45min脱胶，用蒸馏水洗涤4-5次，然后浸入10 M LiBr溶液中在40-80℃下溶解1h，最后用透析袋(MWCO 6-8000)透析3天，除杂后获得丝素溶液，放在4℃冰箱中保存备用。
2、制备丝素支架模板：
2.1、分散聚合法制备PS微球。将2.50g聚乙烯吡咯烷酮溶解于27ml无水乙醇中，加入四口烧瓶中。通氮气，机械搅拌30min。称取偶氮二异丁腈0.35g，溶解于10.00g苯乙烯中，再量取1ml去离子水，将上述溶液缓慢加入到反应器中。升温至70℃聚合，反应10h。产物经离心分离、多次水洗、干燥，获得直径约为3μm的PS微球。
2.2、将PS微球分散在乙醇溶液中，通过自组装方式使得PS微球有序排列，50℃烘干6h，获得丝素支架模板。
3、将丝素溶液注入到丝素支架模板中，抽真空处理，然后通过干燥获得支架。
4、将支架在乙醇溶液中浸泡1h，再用四氢呋喃浸泡12h，然后用去离子水清洗、晾干，获得多孔丝素支架。
参图3和图4所示，分别为实施例1制备的丝素支架模板在电子显微镜下的示意图以及实施例1制备的丝素支架模板在电子显微镜下的放大示意图。由图3和和图4可看出，在实施例1制备的丝素的支架模板中，PS微球有序排列。
参图5所示，为实施例1制备的多孔丝素支架在电子显微镜下的截面示意图。由图5可以看出，在实施例1制备的多孔丝素支架中，孔的排列有序度高，每个孔的侧壁穿透有三个微孔，微孔实现了邻近之间孔的连通。
实施例2
1、制备丝素溶液：将蚕丝用0.5％(w/w)的NaHCO3沸煮45min脱胶，用蒸馏水洗涤4-5次，然后浸入10 M LiBr溶液中在40-80℃下溶解1h，最后用透析袋(MWCO 6-8000)透析3天，除杂后获得丝素溶液，放在4℃冰箱中保存备用。
2、制备丝素支架模板：将尺寸均匀的PMMA微球分散在乙醇溶液中，超声10s，35℃烘干8h，获得丝素支架模板。
3、将丝素溶液注入到丝素支架模板中，抽真空处理，然后通过冻干获得支架。
4、将支架在乙醇溶液中浸泡1h，再用丙酮或四氢呋喃浸泡24h，然后用去离子水清洗、冻干，获得多孔丝素支架。
参图6所示，为实施例2制备的丝素支架模板在电子显微镜下的示意图。由图6可以看出，PMMA微球排列有序。
实施例3
1、制备丝素溶液：将蚕丝用0.5％(w/w)的NaHCO3沸煮45min脱胶，用蒸馏水洗涤4-5次，然后浸入10 M LiBr溶液中在40-80℃下溶解1h，最后用透析袋(MWCO 6-8000)透析3天，除杂后获得丝素溶液，放在4℃冰箱中保存备用。
2、制备丝素支架模板：将直径为136μm且尺寸均匀的PS微球分散在乙醇溶液中，超声10s，100rpm离心10min，80℃烘干0.5h，获得丝素支架模板。
3、将丝素溶液注入到丝素支架模板中，抽真空处理，然后通过冻干获得支架。
4、将支架在乙醇溶液中浸泡1h，再用四氢呋喃浸泡24h，然后用去离子水清洗、冻干，获得多孔丝素支架。
实施例1所获得的多孔丝素支架孔径较小。实施例2、3所获得的多孔丝素支架孔径较大。
综上所述，本发明提供的一种多孔丝素支架的制备方法，采用尺寸均匀的PS微球或PMMA微球作为致孔剂以制备丝素支架模板，由于PS微球或PMMA微球尺寸的可控性，所以可以对多孔丝素支架中的孔及孔隙进行调控，而且所获得孔的有序度高，孔隙间的连通性较好。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (6)
1.一种多孔丝素支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备丝素溶液；
（2）制备丝素支架模板：将致孔剂微球分散在溶剂中并使得致孔剂微球有序排列，然后通过干燥处理获得丝素支架模板，所述致孔剂微球为尺寸均匀的PS微球或PMMA微球；
（3）将丝素溶液注入到丝素支架模板中,然后通过干燥固化获得支架；
（4）去除支架中的致孔剂微球，干燥后得到多孔丝素支架，
所述步骤（2）中致孔剂微球的有序排列是通过离心、超声或致孔剂微球的自组装来实现，
所述步骤（4）中通过将支架浸泡在四氢呋喃中去除致孔剂微球。
2.根据权利要求1所述的多孔丝素支架的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，丝素溶液在注入到丝素支架模板中之前需要经醇处理。
3.根据权利要求2所述的多孔丝素支架的制备方法，其特征在于，所述醇为正丁醇。
4.根据权利要求1所述的多孔丝素支架的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中还包括通过抽真空或加电场方法使丝素溶液进入致孔剂微球空隙中的过程。
5.根据权利要求1所述的多孔丝素支架的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，致孔剂微球在有序排列后还包括加热熔融的过程。
6.根据权利要求5所述的多孔丝素支架的制备方法，其特征在于，所述加热熔融的过程中，加热的温度为35～80℃，加热时间为0.5～8小时。
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