WO2015034307A1 - 갑오징어뼈를 이용한 골이식재 및 이의 제조방법 - Google Patents

갑오징어뼈를 이용한 골이식재 및 이의 제조방법 Download PDF

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WO2015034307A1
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calcium phosphate
graft material
bone
hap
porous body
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이준
김범수
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주식회사 본셀바이오텍
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    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Definitions

  • the present invention relates to a bone graft material using cuttlefish bone and a method for producing the same, and more particularly, to a bone graft material including a coating layer containing a biodegradable polymer in a calcium phosphate-based porous body.
  • bones serve as a reservoir for calcium in the body's concentration of calcium ions and also have important physiological functions in the bone marrow to produce red and white blood cells.
  • Bone can be damaged by aging and other physiological reasons or in a variety of accidents. Representative examples of physiological damage include osteoporosis and osteoarthritis, osteoarthrosis, and avascular necrosis caused by interrupted blood supply to bones.
  • bone damage is treated mainly by mechanical and physical methods. In oral surgery or orthopedic surgery caused by accidents, diseases, infections, etc., bone regeneration and treatment of bone loss is the most important goal. One way to do this is to implant bones.
  • Bone transplantation may include transplanting bones of another person or animal, or transplanting patient's own tissues.However, transplantation of another person's tissue may cause immunological rejection, or if the damaged part is large, The disadvantage is that there is not enough material available. In order to overcome these disadvantages, research on bone graft material has been actively conducted. Bone graft substitutes (BGS) are the replacement of bone defects caused by various dental diseases or traumas, disease degeneration or loss of other tissues, thereby filling the space within the bone tissues and promoting the formation of new bone. Refers to the implant used to make it work.
  • Representative bone grafts include biomaterials composed of calcium phosphate (CaP), tricalcium phosphate (Ca 3 (PO 4 ) 2 , TCP) and hydroxyapatite (Ca 10 (PO). 4 ) 6 (OH) 2 , HAp) is known to have a chemical component similar to natural bone and dental tissues in physical properties and biocompatibility, and is very useful as a biomaterial.
  • TCP and HAp can be artificially synthesized by chemical methods, and recent studies have reported that biocompatible HAp, or TCP, can be produced from natural materials such as eggshells and corals.
  • cuttlefish bones CB
  • CB-HAp HAp
  • TCP CB-TCP
  • CB-BCP mixed biphasic calcium phosphate
  • the ideal condition for bone graft material is that blood vessels grow easily and blood supply should be improved, and bone cells should be connected in three dimensions so that they can easily proliferate. It is known that the pore size of 200-400 ⁇ m is suitable for blood circulation supply and infiltration of bone cells. Cuttlefish bone has the proper porosity that the internal structure satisfies the above porous conditions, and the components of cuttlefish bone are mostly composed of calcium carbonate, so many studies have been conducted to use it as a support for bone regeneration. . Nevertheless, cuttlefish bones are so weak that they are not actually used as materials for bone regeneration.
  • the present inventors have made intensive efforts to improve the physical properties of the bone support, and confirmed that the introduction of a coating layer containing a biodegradable polymer into the calcium phosphate-based porous body improved the compressive strength and performance as other bone graft materials, and completed the present invention. Was done.
  • One object of the present invention is to provide a bone graft material with improved physical strength.
  • Another object of the present invention to provide a method for producing a bone graft material that can improve the physical strength.
  • the present invention provides a bone graft material comprising a calcium phosphate-based porous body, and a coating layer containing a polymer on the surface of the porous body.
  • the bone graft material is a bone defect due to various dental diseases or trauma, disease degeneration or other tissue loss, to replace it to fill the space in the bone tissue and to promote the formation of new bone It refers to the implant to be used, it is a concept that includes all the bone substitutes, bone filler, bone support.
  • the polymer included in the coating layer of the present invention may be a biodegradable polymer, preferably the polymer is polycaprolactone, polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), polyphosphazene, polyanhydride, poly (Polypropylene fumarate), poly-dioxanone, poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA), collagen, chitosan, gelatin, fibrin, fibrinogen, chitin, hyaluronic acid, alginate, dextran, of these polymers It may be one or more selected from the group consisting of copolymers, and mixtures thereof, and more preferably polycaprolactone, but is not limited thereto.
  • Polycaprolactone has better tensile strength than other polymers and can impart appropriate physical strength to the calcium phosphate-based porous body of the present invention.
  • polymers and other biopolymers that can be easily derived by those skilled in the art such as modified polymers and modified polymers of the aforementioned polymers are all included in the scope of the present invention.
  • the coating layer preferably contains 2 to 9% by weight of a polymer, but is not limited thereto. If the polymer is less than 2% by weight, there is no effect on the mechanical properties of the calcium phosphate-based porous body, and when the polymer is more than 9% by weight, the porosity of the support is greatly reduced, and due to the viscosity of the polymer, impregnation of the coating layer into the support is difficult. .
  • the weight of the polymer included in the coating layer may be 4 to 6% by weight.
  • the coating layer containing 4 to 6% by weight of the polymer has an ideal porosity as a bone support, and is effective in improving physical properties such as compressive strength of the calcium phosphate-based porous body, and also effective in bone cell growth.
  • the calcium phosphate porous body included in the bone graft material of the present invention may be hydroxyapatite (HAp), ⁇ -calcium phosphate ( ⁇ -TCP) or bicalcium phosphate (Biphasic calcium phosphate, BCP), preferably hydroxyapatite Can be.
  • the abnormal calcium phosphate (BCP) is a mixture of hydroxyapatite (HAp) and calcium triphosphate (TCP), it can be made in various ratios.
  • the calcium phosphate-based porous body is preferably manufactured from cuttlefish bone, but is not limited thereto. Any natural material capable of producing a calcium phosphate-based porous body such as an animal bone or coral is possible.
  • the calcium phosphate-based porous body of the present invention is not limited to those prepared from natural materials, and includes all chemically synthesized powders such as hydroxyapatite, calcium triphosphate, and the like produced by methods such as sintering and extrusion.
  • a calcium phosphate-based porous body may be prepared by hydrothermal treatment of cuttlefish bone. Specifically, after removing the thick outer wall of cuttlefish bone, the inner lamellae matrix is cut to an appropriate size and then hydrothermally treated. In the hydrothermal treatment, the cut cuttlefish bone is treated with a solution containing phosphate ions, and reacted at 100-300 ° C. for 6-48 hours, but is not limited thereto.
  • the solution containing phosphoric acid may preferably be a solution containing ammonium monophosphate, H 3 PO 4 (phosphoric acid), or KH 2 PO 4 , but is not limited thereto. It can be used.
  • H 3 PO 4 phosphoric acid
  • KH 2 PO 4 KH 2 PO 4
  • the present invention provides a method for producing a bone graft material, characterized in that to form a coating layer from the calcium phosphate-based porous body.
  • Another aspect of the invention relates to a bone graft material manufacturing method comprising the step of forming a coating layer on the calcium phosphate-based porous body.
  • the forming of the coating layer is preferably performed by immersing the calcium phosphate-based porous body in a vacuum in a solution in which a polymer is dissolved, but is not limited thereto.
  • the component contained in the coating layer formed on the surface of the calcium phosphate-based porous body may be a biodegradable polymer, and the polymer is preferably polycaprolactone, polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), or polyphosphazene.
  • Polyanhydride, poly (polypropylene fumarate), poly-dioxanone, poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA), collagen, chitosan, gelatin, fibrin, fibrinogen, chitin, hyaluronic acid, alginate , Dextran may be one or more selected from the group consisting of copolymers of these polymers, and mixtures thereof, but is not limited thereto.
  • polymers that can be easily derived by those skilled in the art such as modified polymers and modified polymers of the aforementioned polymers are all included in the scope of the present invention. More preferably, the component of the coating layer may be polycaprolactone.
  • the polymer included in the coating layer is preferably contained in 2 to 9% by weight of the coating layer, but is not limited thereto. In one embodiment of the present invention, if the polymer is less than 2% by weight did not affect the mechanical properties of the calcium phosphate-based porous body, when it exceeds 9% by weight, the porosity of the support is greatly reduced, and also due to the viscosity of the polymer Impregnation of the coating layer into the interior is difficult.
  • the weight of the polymer included in the coating layer may be 4 to 6% by weight based on the total weight of the coating layer.
  • the coating layer containing 4 to 6% by weight of the polymer has an ideal porosity as a bone support, and is effective in improving physical properties such as compressive strength of the calcium phosphate-based porous body, and also effective in bone cell growth.
  • the calcium phosphate-based porous body is hydroxyapatite (HAp), ⁇ -calcium phosphate ( ⁇ -TCP), bicalcium phosphate (Biphasic calcium phosphate, BCP), or a complex of calcium carbonate
  • HAp hydroxyapatite
  • ⁇ -TCP ⁇ -calcium phosphate
  • BCP bicalcium phosphate
  • the calcium phosphate-based porous body may be made of cuttlefish bone, but is not limited thereto, and may generate a calcium phosphate-based porous body such as an animal's bone or coral. All natural materials are possible.
  • the calcium phosphate-based porous body of the present invention is not limited to being manufactured from natural materials, and the like, such as sintering and extrusion of chemically synthesized hydroxyapatite (HAp), calcium triphosphate (TCP, bicalcium phosphate (BCP), etc.). It also includes all manufacturing by the method.
  • HHP chemically synthesized hydroxyapatite
  • TCP calcium triphosphate
  • BCP bicalcium phosphate
  • a calcium phosphate-based porous body can be produced by hydrothermal treatment of cuttlefish bone. Specifically, after removing the thick outer wall of cuttlefish bone, the inner lamellae matrix is cut to an appropriate size and then hydrothermally treated. Preferably, the hydrothermal treatment is performed by treating the cut cuttlefish bone with a solution containing phosphate ions and reacting at 100-300 ° C. for 6-48 hours, but not always limited thereto.
  • the solution containing phosphoric acid may preferably be a solution containing ammonium monophosphate, H 3 PO 4 (phosphoric acid), or KH 2 PO 4 , but is not limited thereto, and any material capable of supplying phosphoric acid may be used. It can be used.
  • the bone graft material and the method for producing a bone graft material according to the invention comprising a biodegradable polymer in the calcium phosphate-based porous body composed of the most similar components to the human bone, in particular the calcium phosphate-based porous body derived from cuttlefish bone having a suitable porosity
  • a coating layer it does not significantly affect the porosity of the ideal bone graft material and has an effect of improving the compressive strength.
  • the degree of cell adhesion and differentiation into osteoblasts is further improved, and the biocompatibility is excellent as it does not affect the toxicity. Therefore, the bone graft material according to the present invention can be utilized in various ways as a bone substitute due to the characteristics having a strong physical strength and porous structure.
  • A is an SEM image of raw cuttlefish bone (CB)
  • B is an SEM image of cuttlefish bone (CB-HAp) converted to hydroxyapatite by hydrothermal action.
  • C represents the XRD pattern of CB-HAp.
  • CB-HAp cuttlefish bone
  • a and B each shows the results of MTT assay (A), DNA content analysis (B) of MG-63 cells cultured on uncoated CB-HAp support and PCL-coated CB-HAp support.
  • C is a fluorescence image showing the degree of viability / toxicity three days after seeding of cells.
  • FIG. 5 is a graph showing alkaline phosphatase (ALP) activity of MG-63 cells cultured on CB-HAP and CB-HAp coated with 1, 5, and 10% (w / v) PCL.
  • the data show the mean ( ⁇ SD) of three samples, indicating significant differences from Cp-HAp untreated * p ⁇ 0.05 and ** p ⁇ 0.01.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of quantitative analysis of real-time PCR. Expression of each osteoblast marker gene was based on 18S and relative expression levels were based on cells cultured on uncoated scaffolds. The data show the mean ( ⁇ SD) of three samples, with * p ⁇ 0.05 and ** p ⁇ 0.01 indicating significant difference from uncoated CB-HAp.
  • CB Cuttlefish bone extracted from cuttlefish (Sepia esculenta, West Korea) was washed with water and dried.
  • the internal CB matrix (lamellae portion) was cut into cylindrical shaped pieces of about 10 mm diameter and 10 mm length using a trephine bar.
  • HAp hydroxyapatite
  • a known hydrothermal reaction method (Rocha JH et al., J Biomed Mater Res A 2006; 77: 160-168) was used with a slight modification.
  • the CB pieces were placed in a Teflon-lined stainless pressure vesse and sealed. The pressure vessel was placed in an electric furnace and heat treated at 200 ° C. for 24 hours.
  • the resulting HAp was washed with distilled water for further experiments and then dried at 100 ° C.
  • Production Example 2 Coating treatment of polycaprolactone (PCL) on a hydroxyapatite support
  • PCL pellets (molecular weight 10,000; Sigma-Aldrich St. Louis, Mo.) were dissolved in dichloromethane to 1, 5 and 10% (w / v), respectively.
  • the prepared CB-HAp support was immersed in the PCL solution for 5 minutes in vacuum to allow complete infiltration into the porous support structure. Then excess solution was removed by centrifugation for 300 rpm, 30 seconds.
  • PCL coated samples were dried in an oven at 40 ° C. for 6 hours and then again for 7 days at room temperature to volatilize the organic solvent.
  • X-ray diffraction (XRD) analysis was performed with CuKa radiation at a scan rate of 0.02 / min (2h), 50 kV, and 30 mA of 20-50 ° to characterize the composition of the converted components.
  • Microstructure and surface morphology of native CB, CB-HAp, and PCL-coated CB-HAp were analyzed by scanning electron microscopy (JOM-6360; JEOL, Tokyo, Japan).
  • A is an SEM image of the microstructure of a native CB lamellae. This structure consists of parallel sheets and was supported by numerous pillars. The average spacing between lamellae was about 500 micrometers and the spacing between pillars was about 150 micrometers. The thickness of the lamellas was slightly thicker than that of the pillars. In the high-resolution SEM image, the wave shape was observed on the surface of the column, and some soft and thin layers were observed in the lamellar structure.
  • FIG. 1 (B) shows the microstructure of CB converted to HAp by hydrothermal treatment.
  • the porous structure of CB-HAp was maintained during HAp conversion.
  • Higher resolution images showed that the characteristic wave shape of the pillar surface of natural CB disappeared with hydrothermal treatment and instead had a rough surface feature.
  • XRD analysis of the conversion of HAp is shown in Figure 1 (C).
  • XRD pickies of CB-HAp were almost identical to those of standard HAp.
  • Figure 2 (B) shows the SEM shape of the porous CB-HAp after coating with porous CB-HAp and PCL.
  • CB-HAp was coated with 1% PCL (w / v) solution
  • little PCL layer was observed in the surface of the structure and in the sunken area between the column and parallel sheet structures.
  • the roughness of the surface was not significantly different compared to the uncoated CB-HAp.
  • a thin layer covered the entire surface.
  • concentrations (10% PCL (w / v) a thick layer covered the surface with a large thickness and many pores were blocked. The thicker the layer due to the PCL coating, the more the result of the cover of the polycrystalline structure of the surface was observed.
  • Ws indicates the weight of the support
  • Wp indicates the weight of the support filled with ethanol in the pores
  • the compressive strength of natural CB was 1.63 ⁇ 0.13 MPa, and during the conversion by hydrothermal reaction to HAp, the strength decreased slightly to 1.11 ⁇ 0.26 MPa. There was little change in compressive strength with 1% PCL coating. In contrast, however, the 5 and 10% PCL coatings significantly increased their compressive strengths to 2.32 ⁇ 0.44 and 3.67 ⁇ 0.46 MPa, respectively (see Table 1).
  • the total porosity of natural CB was 89.2 ⁇ 2.3% and there was almost no change by hydrothermal reaction.
  • the CB-HAp support was coated with 1 and 5% PCL, there was no significant change in total porosity.
  • the total porosity of CB-HAp supports coated with 10% PCL was markedly reduced by about 20% (see Table 1).
  • Table 1 Compressive strength and porosity of HAp modified by hydrothermal action coated with natural cuttlefish bone (Raw CB) and PCL polymer Raw CB CB-HAp CB-HAp / 1% PCL CB-HAp / 5% PCL CB-HAp / 10% PCL Compressive strength (MPa) 1.63 ⁇ 0.13 1.11 ⁇ 0.26 1.25 ⁇ 0.56 2.32 ⁇ 0.44 a 3.67 ⁇ 0.46 a Porosity (%) 89.2 ⁇ 2.3 91.3 ⁇ 1.9 89.6 ⁇ 2.7 88.6 ⁇ 1.3 76.8 ⁇ 3.2 a
  • Data is for mean ⁇ standard deviation (SD) for four samples.
  • MG-63 cells were used to assess the biocompatibility of PCL coated CB-HAp supports.
  • MG-63 cells were purchased from Korea Cell Line Bank (Seoul, Korea). Cells were cultured in DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium (Gibco-BRL, Gaithersbug, MD) containing 10% FBS (fetal bovine serum (Gibco-BRL)) and 1% penicillin / streptomycin in a 5% CO 2 , 37 ° C incubator. Maintained.
  • Osteoblast differentiation of MG-63 cells was induced by culture in the presence of osteoblast stimulant (OS; 10 mM b-glycerophosphate, 50 mg / mL ascorbic acid, and 100 nM dexamethasone; Sigma-Aldrich).
  • OS osteoblast stimulant
  • Medium and OS were changed every 2 days.
  • CB-HAp 5 mm diameter and 2 mm high supports were used.
  • the supports were sterilized for 30 minutes with 70% alcohol and washed three times (10 minutes each) with 1 ⁇ phosphate-buffered saline (PBS). The cells were then seeded on the support at a density of 5 ⁇ 10 4 (cell / ml) for each support.
  • cells were incubated for 2 hours to allow initial cell adhesion and then rinsed with medium. At various time intervals, cell constructs were used for analysis of cell proliferation, DNA content, viability / toxicity, cell adhesion, and osteoblast differentiation.
  • MTS and DNA content analysis was performed at 1, 6, 12, and 18 day intervals to determine the extent of proliferation of cells growing on uncoated CB-HAp and PCL coated CB-HAp scaffolds.
  • CellTiter96VR Aqueous One solution (Invitrogen, Carlsbad, CA) was used to measure the degree of cell proliferation.
  • MG-63 cells were inoculated on CB-HAp and PCL-coated CB-HAP scaffolds and then cultured.
  • FIG. 3 (A) The results of the MTS analysis are shown in FIG. 3 (A).
  • the cells grew well during the overall incubation time and there was no significant difference in the extent of their proliferation between uncoated CB-HAp and CB-HAp coated with 1% PCL. In contrast, however, 5% and 10% PCL showed higher visual density values than the other groups.
  • 5% and 10% PCL showed higher visual density values than the other groups.
  • Live / Dead Viability / Toxicity Kit (INvitrogen) was used as protocol. After inoculation of the cells, the cells were incubated for 3 days, and phenol red and serum were removed by washing with OBS for 30 minutes. Live / Dead After addition of viability / toxic solution and incubation for 30 min in a CO 2 incubator, samples were observed using an inverted fluorescence microscope (DM IL LED Fluo; Leica Microsystems, Wetzlar, Germany).
  • FIG. 4 is an SEM micrograph showing the adherence form of MG-63 cells. These cells adhered to the surface of the C support and spread to the internal structure of CB-HAp and CB-HAp coated with 1 and 5% PCL. When incubated in CB-HAp coated with 10% PCL, almost all cells grew only on the surface of the support.
  • osteoblast differentiation was evaluated by alkaline phosphatase (ALP) activity analysis using p-nitrophenylphosphate as a substrate. Activity was averaged by determining the total protein amount with a BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL). Cells were inoculated and incubated for 5 days in medium containing OS. The incubated support was washed with PBS and then cut into small pieces. The detached cells were detached from the support and pieces were sonicated in 1% Triton X-100 / PBS for 10 minutes in an ice box to obtain protein. The samples were then centrifuged at 12,000 rpm to remove debris from the support and then the supernatant was used for ALP activity analysis.
  • ALP alkaline phosphatase
  • qRT quantitative real-time

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Abstract

본 발명은 갑오징어뼈를 이용한 골이식재 및 상기 골이식재의 제조방법에 관한 것으로, 인산칼슘계 다공체에 코팅층을 형성하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 골이식재는 인산칼슘계 다공체에 생분해성 폴리머를 포함하는 코팅층을 포함함으로써, 특히 갑오징어뼈로부터 유래한 골지지체의 단점이었던 압축 강도를 더욱 개선시켰으며, 또한 골세포의 분화 및 증식 효과가 더욱 우수하여 골이식재로서 활용도가 높다.

Description

갑오징어뼈를 이용한 골이식재 및 이의 제조방법
본 발명은 갑오징어뼈를 이용한 골이식재 및 이의 제조방법에 관한 것으로 구체적으로 인산칼슘(calcium phosphate)계 다공체에 생분해성 폴리머를 함유하는 코팅층을 포함하는 골이식재 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
뼈는 인체를 지탱하며 동작을 수행하는 기계적 기능 이외에도 체내의 칼슘 이온 농도를 조절하는데 칼슘의 저장고 역할을 하며 골수에서 인체에 필요한 적혈구 및 백혈구를 생산하는 중요한 생리적 기능도 보유하고 있다. 뼈는 노화 및 다른 생리적인 이유로 손상되거나 여러 가지 사고로 손상될 수 있다. 생리적 손상의 대표적인 예로는 골다공증(osteoporosis) 및 관절염으로 인한 손상(osteoarthritis, osteoarthrosis) 등이 있으며, 뼈에 혈액공급이 중단되어 발생하는 무혈성 괴사증도 있다. 현재 뼈의 손상은 주로 기계적 물리적인 방법으로 치료한다. 사고, 질병, 전염 등으로 야기된 구강외과 또는 정형 외과적 수술에 있어서 뼈 손실에 대한 뼈의 재생 및 치료는 가장 중요한 목표이다. 이를 위한 하나의 방편으로 뼈를 이식하는 방법을 들 수 있다. 뼈의 이식은 타인이나 동물의 뼈를 이식하는 방법, 환자 자신의 조직을 이식하는 방법 등이 있으나, 타인의 조직을 이식할 경우 면역학적 거부반응이 발생되거나, 손상부위가 클 경우 환자 몸에서 사용할 수 있는 재료가 충분하지 않다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 골이식재에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 골이식재(Bone graft substitute, BGS)란 여러가지 치과질환 또는 외상, 질병에 의한 퇴화 또는 기타 조직의 손실로 인하여 뼈조직의 결손부가 생긴 경우, 이를 대체하여 뼈조직 내의 공간을 충진시키고 신생골의 형성을 촉진시키기 위하여 사용하는 이식재를 말한다. 대표적인 골이식재로 인산칼슘(calcium phosphate, CaP) 성분으로 구성된 생체재료를 들 수 있으며, 이러한 인산칼슘 성분의 생체재료 중 tricalcium phosphate (Ca3(PO4)2, TCP)와 hydroxyapatite (Ca10(PO4)6(OH)2, HAp)는 물성이나 생체친화성에 있어서 천연의 뼈나 치아 조직과 유사한 화학적 성분을 가지는 것으로 알려져 있어, 생체 재료로서 매우 유용하게 사용되고 있다. TCP와 HAp는 화학적 방법을 통해 인공적으로 합성할 수 있으며, 또한 최근 연구에서는 달걀껍질, 산호와 같은 천연 물질에서 생체적합적 HAp, 또는 TCP를 제조할 수 있음이 보고되었다. 특히 갑오징어뼈(cuttlefish bones, CB)를 HAp (CB-HAp), TCP (CB-TCP) 또는 이들이 혼합된 이상인산칼슘(Biphasic calcium phosphate, CB-BCP)로 변환할 수 있음이 알려졌다.
이상적인 골이식재의 조건은 혈관이 쉽게 자라서 혈행공급이 좋아져야 하며, 골세포들도 쉽게 증식할 수 있도록 3차원적으로 연결되어 있어야 한다. 혈행 공급과 골세포의 침윤을 위해서는 200-400μm 크기의 정도의 기공크기가 적당한 것으로 알려져 있다. 갑오징어뼈는 내부구조가 위의 다공 조건을 만족하는 적절한 다공성의 특성을 가지고 있으며, 또한 갑오징어뼈의 구성성분은 대부분 칼슘 카보네이트로 이루어져 있어, 골 재생용 지지체로서 사용하고자 많은 연구들이 진행되고 있다. 그럼에도 불구하고 갑오징어뼈는 그 강도가 약하여 실제로는 뼈 재생을 위한 재료로서 활용되지 못하는 실정이다.
이에 본 발명자들은 골지지체의 물리적 성질을 개선하기 위해 예의 노력한 결과, 인산칼슘계 다공체에 생분해성 고분자를 포함하는 코팅층의 도입이 압축 강도 및 기타 골이식재로서의 성능을 향상시키는 것을 확인하고서 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 일 목적은 물리적 강도가 개선된 골이식재를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 물리적 강도를 개선시킬 수 있는 골이식재의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 일 목적을 해결하기 위해, 본 발명은 인산칼슘(calcium phosphate)계 다공체, 및 다공체의 표면에 폴리머를 함유하는 코팅층을 포함하는 골이식재를 제공한다.
본 발명에 있어서, 골이식재란 여러가지 치과질환 또는 외상, 질병에 의한 퇴화 또는 기타 조직의 손실로 인하여 뼈조직의 결손부가 생긴 경우, 이를 대체하여 뼈조직 내의 공간을 충진시키고 신생골의 형성을 촉진시키기 위하여 사용하는 이식재를 말하는 것으로, 골대체제, 골충전제, 골지지체 등을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명의 코팅층에 포함되는 폴리머는 생분해성 폴리머일 수 있으며, 바람직하게는 상기 폴리머는 폴리카프로락톤, 폴리락틱산(PLA), 폴리글리콜릭산(PGA), 폴리포스파젠, 폴리언하이드라이드, 폴리(폴리프로필렌 푸마레이트), 폴리-디옥사논, 폴리(락틱-코-글리콜릭 산)(PLGA), 콜라겐, 키토산, 젤라틴, 피브린, 피브리노겐, 키틴, 히알루론산, 알지네이트, 덱스트란, 이들 고분자들의 공중합체, 및 이들의 혼합물로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 폴리카프로락톤일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 폴리카프로락톤은 다른 고분자보다 인장강도가 좋아 본 발명의 인산칼슘계 다공체에 적절한 물리적 강도를 부여할 수 있다. 또한 상기 언급한 고분자들의 개질체, 변형 고분자 등 통상의 기술자가 쉽게 도출할 수 있는 고분자들 및 기타 생체고분자들은 모두 본 발명의 범주에 포함된다.
또한 상기 코팅층은 폴리머가 2 내지 9 중량%로 함유되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 폴리머가 2 중량% 미만일 경우 인산칼슘계 다공체의 기계적 물성에 영향이 없으며, 9 중량%를 초과할 경우, 지지체의 기공율이 크게 감소하며, 또한 폴리머의 점성으로 인해 지지체 내부로의 코팅층의 함침이 어렵다.
더욱 바람직하게는 상기 코팅층에 포함되는 폴리머의 중량은 4 내지 6중량% 일 수 있다. 상기 4 내지 6 중량%의 폴리머를 함유하는 코팅층의 경우, 뼈지지체로서 이상적인 기공율을 가지며, 인산칼슘계 다공체의 압축강도와 같은 물리적 특성의 개선에 효율적이며, 또한 골세포의 성장에도 효과적이다.
본 발명의 골이식재에 포함되는 인산칼슘계 다공체는 하이드록시아파타이트(HAp), β-삼인산칼슘(β-TCP) 또는 이상인산칼슘(Biphasic calcium phosphate, BCP)일 수 있으며, 바람직하게는 하이드록시아파타이트일 수 있다. 상기 이상인산칼슘(BCP)은 하이드록시아파타이트(HAp)와 삼인산칼슘(TCP)가 혼합된 것으로, 다양한 비율로 이루어질 수 있다. 또한 상기 인산칼슘계 다공체는 갑오징어뼈로부터 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 동물의 뼈, 산호 등 인산칼슘계 다공체를 생성할 수 있는 천연물질은 모두 가능하다. 천연물질, 특히 갑오징어뼈를 이용하여 인산칼슘계 다공체를 제조할 경우, 저렴한 가격으로 쉽게 구할 수 있다. 또한 갑오징어뼈가 본래 가지고 있는 내부 다공성구조로 인해 골지지체로서 적절한 다공도를 가지며, β-삼인산칼슘, 또는 하이드록시아파타이트, 또는 BCP 등으로 변환할 경우에도 그 다공도가 유지되어 골이식재로서 특히 바람직하다. 그러나 본 발명의 인산칼슘계 다공체는 천연물질로부터 제조되는 것에 한정되지 않으며, 화학적으로 합성된 하이드록시아파타이트, 삼인산칼슘 등의 분말을 소결 및 압출 등의 방법을 통해 제조된 것도 모두 포함한다.
갑오징어뼈를 이용하여 인산칼슘계 다공체를 제조할 경우, 갑오징어뼈를 열수처리하는 것을 통해 인산칼슘계 다공체를 제조할 수 있다. 구체적으로는 갑오징어뼈의 두꺼운 외부 벽을 제거한 후, 내부 라멜라 매트릭스(lamellae matrix)를 적절한 크기로 절단한 후, 열수처리한다. 상기 열수처리는 절단된 갑오징어뼈를 인산이온을 포함하는 용액으로 처리하여, 100-300℃에서 6-48시간 동안 반응시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 인산을 포함하는 용액은 바람직하게는 제 1인산암모늄, H3PO4 (phosphoric acid), KH2PO4를 포함하는 용액일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 인산을 공급할 수 있는 물질들은 모두 사용가능하다. 또한 동물의 뼈, 산호 등 천연물질을 이용하여 인산칼슘계 다공체로 변환할 경우에도 상기의 열수처리를 통해 이루어질 수 있다.
상기 본 발명의 다른 목적을 해결하기 위해, 본 발명은 인산칼슘계 다공체로부터 코팅층을 형성하는 것을 특징으로 하는 골이식재를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양상은 인산칼슘계 다공체에 코팅층을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 골이식재 제조방법에 관한 것이다.
상기 코팅층을 형성하는 단계는 상기 인산칼슘계 다공체를 폴리머가 용해된 용액에 진공상태에서 침지 처리하는 것으로 이루어지는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 상기 인산칼슘계 다공체 표면에 형성되는 코팅층에 함유되는 성분은 생분해성 폴리머일 수 있으며, 상기 폴리머는 바람직하게는 폴리카프로락톤, 폴리락틱산(PLA), 폴리글리콜릭산(PGA), 폴리포스파젠, 폴리언하이드라이드, 폴리(폴리프로필렌 푸마레이트), 폴리-디옥사논, 폴리(락틱-코-글리콜릭 산)(PLGA), 콜라겐, 키토산, 젤라틴, 피브린, 피브리노겐, 키틴, 히알루론산, 알지네이트, 덱스트란, 이들 고분자들의 공중합체, 및 이들의 혼합물로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 언급한 고분자들의 개질체, 변형 고분자 등 통상의 기술자가 쉽게 도출할 수 있는 고분자들은 모두 본 발명의 범주에 포함된다. 상기 코팅층의 성분으로 더욱 바람직하게는 폴리카프로락톤일 수 있다.
상기 코팅층에 포함되는 폴리머는 코팅층의 2 내지 9 중량%로 함유되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서 폴리머가 2 중량% 미만일 경우 인산칼슘계 다공체의 기계적 물성에 영향이 없었으며, 9 중량%를 초과할 경우, 지지체의 기공율이 크게 감소하였고, 또한 폴리머의 점성으로 인해 지지체 내부로의 코팅층의 함침이 어렵다.
더욱 바람직하게는 상기 코팅층에 포함되는 폴리머의 중량은 코팅층 총 중량 기준 4 내지 6 중량% 일 수 있다. 상기 4 내지 6 중량%의 폴리머를 함유하는 코팅층의 경우, 뼈지지체로서 이상적인 기공율을 가지며, 인산칼슘계 다공체의 압축강도와 같은 물리적 특성의 개선에 효율적이며, 또한 골세포의 성장에도 효과적이다.
본 발명의 골이식재의 제조방법에 있어서, 상기 인산칼슘계 다공체는 하이드록시아파타이트(HAp), β-삼인산칼슘(β-TCP), 이상인산칼슘(Biphasic calcium phosphate, BCP), 또는 탄산칼슘의 복합체일 수 있으며, 바람직하게는 하이드록시아파타이트일 수 있다.또한 상기 인산칼슘계 다공체는 갑오징어뼈를 이용하여 만드는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 동물의 뼈, 산호 등 인산칼슘계 다공체를 생성할 수 있는 천연물질은 모두 가능하다. 또한 본 발명의 인산칼슘계 다공체는 천연물질로부터 제조되는 것에 한정되지 않고, 화학적으로 합성된 하이드록시아파타이트(HAp), 삼인산칼슘(TCP, 이상인산칼슘(BCP) 등의 분말을 소결 및 압출 등의 방법을 통해 제조하는 것도 모두 포함한다.
갑오징어뼈를 이용하여 인산칼슘계 다공체를 제조할 경우, 갑오징어뼈를 열수처리하는 것에 의해 인산칼슘계 다공체를 제조할 수 있다. 구체적으로는 갑오징어뼈의 두꺼운 외부 벽을 제거한 후, 내부 라멜라 매트릭스(lamellae matrix)를 적절한 크기로 절단한 후, 열수처리한다. 상기 열수처리는 절단된 갑오징어뼈를 인산 이온을 포함하는 용액으로 처리하여, 100-300℃에서 6-48시간 동안 반응시키는 것에 이루어지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 인산을 포함하는 용액은 바람직하게는 제 1인산암모늄, H3PO4 (phosphoric acid), KH2PO4를 포함하는 용액일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 인산을 공급할 수 있는 물질은 모두 사용가능하다.
또한 갑오징어 뼈 이외의 동물의 뼈, 산호 등을 이용하여 인산칼슘계 다공체로 변환할 경우에도 상기의 열수처리를 통해 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 골이식재 및 골이식재의 제조방법에 따르면, 인체뼈와 가장 유사한 성분으로 구성된 인산칼슘계 다공체, 특히 알맞은 다공성을 가지는 갑오징어뼈에서 유래된 인산칼슘계 다공체에 생분해성 폴리머를 포함하고 있는 코팅층을 도입함으로써, 이상적인 골이식재의 조건인 다공도에 크게 영향을 주지 않는 동시에 압축강도를 향상시키는 효과를 가진다. 또한 세포 부착도 및 조골세포로의 분화도를 더욱 개선하며, 독성도에 있어서도 영향을 주지 않는 등 생체적합성도 뛰어나다. 따라서 본 발명에 따른 골이식재는 강한 물리적 강도 및 다공성 구조를 가지는 특징으로 인해 골대체물로서 다양하게 활용할 수 있다.
도 1에서 A는 가공되지 않은 갑오징어 뼈(cuttlefish bone , CB)의 SEM 이미지이며, B는 열수작용에 의해 하이드록시아파타이트로 변환된 갑오징어 뼈(CB-HAp)의 SEM 이미지이다. C는 CB-HAp의 XRD 패턴을 나타낸다.
도 2에서 A는 각각 1, 5, 및 10 %(w/v) PCL로 코팅처리된 하이드록시아파타이트로 변환된 갑오징어 뼈(CB-HAp)의 XRD 패턴을 나타낸 것이며, B는 CB-HAp 및 PCL로 코팅된 CB-HAp 지지체의 SEM 이미지를 나타낸다. B에서 흰색 화살표는 CB-HAp에 코팅된 PCL을 가리킨다.
도 3에서 A, B 각각은 코팅처리되지 않은 CB-HAp 지지체 및 PCL로 코팅된 CB-HAp 지지체에서 배양한 MG-63 세포들의 MTT assay (A), DNA content 분석(B) 결과를 나타낸 것이며, C는 세포의 접종(seeding) 3일 후 생존성/ 독성 정도를 보여주는 형광 이미지이다.
도 4는 CB-HAP 및 1, 5, 및 10 %(w/v) PCL로 코팅처리된 CB-HAp 상에 MG-63 세포 배양 6일 후의 SEM 이미지를 보여준다.
도 5는 CB-HAP 및 1, 5, 및 10 %(w/v) PCL로 코팅처리된 CB-HAp 상에 배양된 MG-63 세포의 알카라인 포스파타제(ALP) 활성을 나타낸 그래프이다. 데이터는 세 개의 샘플의 평균(±SD)을 나타낸 것이며, *p < 0.05 및 **p < 0.01 코팅처리되지 않은 CB-HAp와의 중대한 차이가 있음을 가리킨다.
도 6은 실시간(real-time) PCR의 정량 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 각각의 조골세포(osteoblast) 마커 유전자의 발현은 18S를 기준으로 하였고, 상대적 발현 수준은 코팅처리되지 않은 지지체 상에 배양된 세포를 기준으로 하였다. 데이터는 세 개의 샘플의 평균(±SD)을 나타낸 것이며, *p < 0.05 및 **p < 0.01 는 코팅처리되지 않은 CB-HAp와의 중대한 차이가 있음을 가리킨다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 실시예들에 한정되지 않는다. 또한 본 명세서에서 사용되는 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다. 또한 특별한 설명없이 %를 사용한 경우는 당분야에서 통상적으로 사용되는 단위를 의미하며, 만약 그러한 경우에도 불확실한 경우가 있다면 단위 부피 당 중량(w/v)를 의미할 수 있다.
<제조예> 1. 갑오징어 뼈(CB)를 이용한 HAp(하이드록시아파타이트) 지지체(scaffold) 제조
갑오징어(Sepia esculenta, 한국 서해)로부터 추출한 갑오징어뼈(cuttlefish bone, CB)를 물로 세척한 후 건조하였다. 열수 반응을 위해, 내부의 CB 매트릭스(라멜라(lamellae) 부분)을 트레핀 바(trephine bar)를 이용하여 약 10mm 직경, 및 10mm 길이의 원통형 형태의 조각으로 잘랐다. 하이드록시아파타이트(HAp)로 변환하기(transform) 위해 공지된 열수 반응 방법(Rocha JH et al., J Biomed Mater Res A 2006;77:160-168)을 약간 변경하여 사용하였다. 0.6M NH4H2PO4의 수용액을 CB 조각들에 처리한 후, CB 조각들을 테플론으로 코팅된 스테인레스 압력 용기(Teflon-lined stainless pressure vesse)에 넣고 밀봉하였다. 압력 용기는 전기 화로에 넣고 24시간 동안 200℃로 열처리하였다. 생성된 HAp는 추가 실험을 위해 증류수로 세척한 후 100℃에서 건조시켰다.
<제조예> 2. 하이드록시아파타이트 지지체에 폴리카프로락톤(PCL)의 코팅처리
PCL 펠렛(분자량 10,000; Sigma-Aldrich St. Louis, MO)을 디클로로메탄에 각각 1, 5, 10% (w/v)가 되도록 용해시켰다. 제조된 CB-HAp 지지체를 진공상태에서 5분 동안 상기 PCL 용액에 침지시켜 다공성 지지체 구조 안으로 완전하게 침윤되도록 하였다. 그리고 나서, 초과된 용액을 300rpm, 30초 동안 원심분리에 의해 제거하였다. PCL이 코팅된 샘플은 40℃, 6시간 동안 오븐에서 건조시킨 다음, 유기 용매를 휘발시키기 위해 실온에서 7일동안 다시 건조시켰다.
<시험예 1> CB로부터 변환된 HAp 지지체의 표면 특성 및 다공성 정도 관찰
변환된 성분의 조성을 특징을 확인하기 위해 0.02/min (2h)의 스캔속도, 50 kV, 및 20-50° 의 30 mA 조건에서 CuKa radiation으로 XRD(X-ray diffraction) 분석을 수행하였다. 천연 CB, CB-HAp, 및 PCL-코팅처리된 CB-HAp의 마이크로구조 및 표면 형태(morphology)는 SEM (scanning electron microscopy; JOM-6360; JEOL, Tokyo, Japan)에 의해 분석되었다.
1. 천연(가공되지 않은) CB
도 1(A)는 천연 CB 라멜라의 마이크로 구조에 대한 SEM 이미지이다. 이러한 구조는 평행한 시트로 구성되어 있고, 수많은 기둥에 의해 지지되고 있었다. 라멜라 사이의 평균 간격은 약 500μm이며, 기둥사이의 간격은 약 150μm 이었다. 라멜라의 두께는 기둥의 것보다 약간 두꺼웠다. 고해상도의 SEM 이미지에서, 기둥의 표면에 물결모양이 관찰되었으며, 라멜라 구조에서는 일부 부드럽고 얇은 층이 관찰되었다.
2. CB로부터 변환된 다공성 HAp 지지체
도 1(B)는 열수 처리에 의해 HAp로 변환된 CB의 마이크로 구조를 보여준다. CB-HAp 의 다공성 구조는 HAp 변환동안 유지되었다. 더 높은 해상도의 이미지는 천연 CB의 기둥 표면의 특징적인 물결모양이 열수 처리에 따라 사라지며, 대신에 거친 표면 특징을 가지는 것을 보여주었다. HAp의 변환에 대한 XRD 분석결과를 도 1(C)에 나타냈다. CB-HAp의 XRD 피키는 표준 HAp의 것과 거의 일치하였다. 이러한 결과는 CB가 열수 반응에 의해 완벽하게 HAp로 변환되었음을 가리킨다.
PCL로 코팅된 CB-HAp 지지체의 XRD 패턴은 도 2(A)에 나타냈다. PCL로 코팅처리 후에, HAp-PCL 복합체의 패턴상에 HAp 피크이외에 전형적인 PCL 피크가 20-25° 지역에서 관찰되었다. 어떤 피크의 이동도 복합체에서 나타나지 않았다. 이러한 결과는 PCL 폴리머가 성공적으로 CB-HAp에 도입되었으며, 어떠한 화학적 반응도 발생하지 않았음을 나타낸다. PCL 농도의 증가는 PCL의 피크 강도를 증가시켰다. 그러나 HAp의 피크에서 중요한 변화는 없었다. PCL 복합체 구조는 SEM에 의해 추가로 확인하였다.
도 2(B)는 다공성 CB-HAp 및 PCL로 코팅처리된 후 다공성 CB-HAp의 SEM 형상을 나타낸다. CB-HAp는 1% PCL(w/v) 용액으로 코팅처리 되었을 때, PCL 층은 그 구조의 표면 및 기둥 및 평행 시트 구조 사이의 함몰한(sunken) 지역에서 거의 관찰되지 않았다. 또한 표면의 거칠기는 코팅 처리되지 않은 CB-HAp와 비교해보았을 때 큰 차이가 없었다. 5% PCL(w/v) 용액으로 코팅된 지지체에서는 얇은 층이 전체 표면을 뒤덮고 있었다. 농도가 높아질수록(10% PCL(w/v)), 두꺼운 층이 큰 두께로 표면을 덮었으며, 많은 기공들이 막혀 있었다. PCL 코팅으로 인한 층이 두꺼울수록 표면의 다결정(polycrystalline) 구조의 커버의 결과가 관찰되었다.
<시험예 2> 압축 강도(compressive strength)_및 다공도(porosity) 측정
Instron test machine (Model:4505, UK)을 사용하여 대기조건에서 분당 0.5mm 의 하중속도(cross-head speed)로 다공성 CB-HAp 지지체(8mm 직경 X 5mm 높이)의 압축강도 테스트를 수행하였다. 다공도(porosity)를 측정하기 위해, 액체 매체로 무수 에탄올을 사용하였다. 실험 전, 각 샘플, 피크노미터(pycnometer), 및 액체 매체를 25℃로 미리 예열하였다. 다공도는 하기식을 사용하여 계산하였다.
다공도(Porosity) (%) = (Wp- Ws)/ Wp - We X 100
상기 다공도 식에서, Ws는 지지체의 중량, Wp는 기공에 에탄올이 채워진 지지체의 중량을 가리키며, 4개의 샘플이 테스트되었다.
그 결과 천연 CB의 압축 강도는 1.63 ± 0.13 MPa이었으며, HAp로 열수반응에 의해 변환하는 동안, 그 강도는 1.11 ± 0.26 MPa로 약간 감소하였다. 1% PCL 코팅에서는 압축강도가 거의 변화가 없었다. 그러나 대조적으로, 5 및 10% PCL 코팅은 압축강도가 각각 2.32 ± 0.44, 및 3.67 ± 0.46 MPa로 크게 증가하였다(표 1 참조).
천연 CB의 총 다공도는 89.2 ± 2.3%이며, 열수 반응에 의해서도 거의 변화가 없었다. CB-HAp 지지체를 1 및 5% PCL로 코팅처리 하였을때, 총 다공도에 큰 변화는 없었다. 대조적으로 10% PCL로 코팅된 CB-HAp 지지체의 총 다공도는 약 20% 정도 현저하게 감소하였다(표 1 참조).
표 1 천연 갑오징어뼈(Raw CB), 및 PCL 폴리머로 코팅처리된 열수 작용에 의해 변형된 HAp의 압축 강도 및 다공도
Raw CB CB-HAp CB-HAp/1% PCL CB-HAp/5% PCL CB-HAp/10% PCL
압축강도(MPa) 1.63 ± 0.13 1.11 ± 0.26 1.25 ± 0.56 2.32 ± 0.44a 3.67 ± 0.46a
다공도(%) 89.2 ± 2.3 91.3 ± 1.9 89.6 ± 2.7 88.6 ± 1.3 76.8 ± 3.2a
데이터는 4개의 샘플에 대한 평균 ± 표준편차(SD)에 대한 것이다.
a 는 코팅처리되지 않은 CB-HAp (p < 0.05)와 중요한 차이가 있음을 가리킨다.
<시험예 3> PCL-코팅된 CB-HAp의 생체적합성(Biocompatibility)
1. 세포 배양(Cell culture)
MG-63 세포들을 PCL 코팅처리된 CB-HAp 지지체의 생체적합성을 평가하기 위해 사용하였다. MG-63 세포들은 한국세포주 은행(Seoul, Korea)으로부터 구입하였다. 세포들은 5% CO2, 37℃ 배양기에서 10% FBS( fetal bovine serum (Gibco-BRL)) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함한 DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium) 배지(Gibco-BRL, Gaithersbug, MD)에서 유지되었다. MG-63 세포들의 조골세포 분화는 조골세포 자극제(osteoblast stimulant (OS; 10 mM b-glycerophosphate, 50 mg/mL ascorbic acid, 및 100 nM dexamethasone; Sigma-Aldrich))의 존재 하 배양에 의해 유도되었다. 배지 및 OS는 2일마다 갈아주었다. CB-HAp상에서 3차원적인 배양을 위해, 5mm 직경 및 2mm 높이의 지지체를 사용하였다. 세포의 접종 전,지지체는 70% 알콜로 30분동안 살균되었으며, 1X phosphate-buffered saline (PBS)로 3번(각 10분) 워싱하였다. 그리고 난 다음, 세포들은 각 지지체에 대해 5 X 104의 밀도(cell/ml)로 지지체 상에 접종되었다. 접종 후, 세포들은 초기 세포 부착을 허용하기 위해 2시간동안 배양시킨후, 배지로 헹궈주었다. 다양한 시간 간격으로, 세포 구조물을 세포 증식, DNA 함량, 생존도/독성도, 세포 부착성, 및 조골세포 분화정도의 분석을 위해 이용하였다.
2. 세포의 증식 정도 및 DNA 함량 분석
코팅처리되지 않은 CB-HAp 및 PCL로 코팅된 CB-HAp 지지체 상에 자라는 세포의 증식 정도를 결정하기 위해 1, 6, 12, 및 18일 간격으로 MTS 및 DNA 함량 분석을 수행하였다.
세포 증식 정도를 측정하기 위해 CellTiter96VR Aqueous One solution(Invitrogen, Carlsbad, CA) 을 사용하였다. MG-63 세포들은 CB-HAp 및 PCL-코팅된 CB-HAP 지지체 상에 접종된 후 배양되었다. 표준작업시간 (1, 6, 12, 및 18 일)에 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) 시약 100ml과 500ml의 배지를 혼합하여, 각 웰에 첨가하였다. 이후 4시간 동안 배양한 다음, 상등액의 흡광도를 microplate reader(SpectraMAX M3; Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 490nm에서 측정하였다.
PicoGreen dsDNA Quantitation kit (Molecular Probes, Eugene, OR)를 사용한 DNA 함량의 분석에 의해 지지체상에 부착되고 자란 세포들의 수가 결정되었다. 세포들은 CB-HAp 및 PCL- 처리된 CB-HAp 지지체 상에 접종된 후 배양되었다. 표준작업시간 (1, 6, 12, 및 18일)에, 지지체는 PBS로 세척되었으며, 알맞게 잘라졌다. 총 DNA 함량을 배포하기(release) 위해, 조각들을 500ml의 라이시스 버퍼 (0.2% Triton X-100 및 5 mM MgCl2)에서 30분동안 담겨지도록 한 다음, 4℃ 10분동안 12,000rpm으로 원심분리하였다. 상등액의 10ml을 DNA-바인딩 형광 염료 용액과 혼합하여, 형광도를 plate reader (SpectraMAX M3)로 480nm의 여기 파장 및 528nm의 방출 파장에서 측정하였다.
MTS 분석의 결과는 도 3(A)에 나타냈다. 세포들은 전반적인 배양시간 동안 잘 자랐으며, 코팅되지 않은 CB-HAp 와 1% PCL로 코팅된 CB-HAp 사이에서는 그 증식 정도에 있어서 큰 차이가 없었다. 그러나 이와는 대조적으로, 5% 및 10% PCL은 다른 군보다 시각적 밀도 값이 더 높게 관찰되었다. 10% PCL로 코팅된 CB-HAp 상에 세포들이 배양되었을 때, 세포의 성장은 6일까지 빠르게 증가하였으며, 그 속도는 배양기간이 증가할 수록 느려졌다.
또한 MTS 분석이 미토콘드리아 활성에 근거를 두고 있기 때문에, 우리는 DNA 함량 분석을 사용하여 더욱 정확하게 세포의 증식 정도를 측정하엿다. DNA 함량 분석의 결과는 도 3(B)에 나타내었으며, 이는 도 3(A)의 MTS 분석 결과와 일치하였다.
3. 생존도 / 독성 분석
세포의 생존도 및 독성을 측정하기 위해, Live / Dead 생존도/ 독성 키트(INvitrogen)을 프로토콜대로 사용하였다. 세포들을 접종한 후, 3일간 배양하였으며, 페놀 레드 및 세럼을 30분동안 OBS로 세척하는 것에 의해 제거되었다. Live / Dead 생존도/ 독성 용액을 첨가한 다음 CO2 인큐베이터에서 30분동안 배양시킨 후, inverted fluorescence microscope(DM IL LED Fluo; Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)를 사용하여 샘플들을 관찰하였다.
PCL 코팅의 독성도를 측정하기 위해, live/dead staining assay 를 수행하였다. 비록 PCL-코팅처리된 CB-HAp 상에 약간의 죽은 세포들(빨간색)이 관찰되었으나, 대부분의 MG-63 세포들은 생존(녹색)하였다(도 3(C) 참조). 이러한 결과는 CB-HAp지지체의 코팅이 독성도와 관련없음을 나타낸다.
4. 세포 부착 정도의 관찰
CB-HAp로의 NG-63 세포들의 부착정도를 관찰하기 위해, SEM 분석을 수행하였다. 지지체상에 세포들의 부착 및 성장을 관찰하기 위해 각 지지체에 세포들을 접종시켰으며, 6일동안 성장 배지에서 배양하였다. 지지체를 PBS로 워싱하였고 2.5% 글루타르알데히드 용액으로 4시간동안 4℃에서 고정시켰다. 샘플들은 0.1% 사산화오스뮴 용액으로 후고정되었고, 점진적 고농도(25, 50, 75, 95, 및 100%)의 알콜로 탈수시켰다. 탈수된 샘플들은 플래티늄으로 스퍼터-코팅되었고 SEM(JOM-6360)에 의해 관찰되었다.
도 4는 MG-63 세포들의 부착 형태를 나타내는 SEM 현미경 사진이다. 이러한 세포들은 C지지체의 표면에 부착되었으며, CB-HAp 및 1 및 5%의 PCL로 코팅된 CB-HAp 의 내부 구조로 퍼져 있었다. 10%의 PCL로 코팅된 CB-HAp에서 배양되었을 때에는 거의 대부분의 세포들은 지지체의 표면에서만 자랐다.
<시험예 4> 조골세포(osteoblast)의 분화( differentiation) 정도 측정
코팅되지 않은 CB-HAp 와 PCL로 코팅된 CB-HAp 상에 배양된 MG-63 세포들이 조골세포(osteoblast)들로 분화될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 세포들은 OS로 처리되었다. 그리고 난 다음 ALP 활성을 측정하였으며, 조골세포 마커 발현을 탐지하기 위해 qRT-PCR을 수행하였다.
구체적으로 조골세포의 분화정도는 기질로 p-니트로페닐포스페이트 (p-nitrophenylphosphate) 를 사용하여 알카라인 포스파타제(ALP)활성도 분석에 의해 평가되었다. 활성도는 BCA 단백질 어세이 키트(Pierce, Rockford, IL)로 전체 단백질 양을 결정하여 평균화하였다. 세포들은 접종된 후, OS를 포함한 배지에서 5일동안 배양되었다. 배양된 지지체를 PBS로 씻은 후, 작은 조각으로 잘랐다. 지지체로부터 부착된 세포를 떼어내고, 단백질을 얻기 위해, 조각들을 아이스 박스 안에서 1% Triton X-100/PBS 에 10분동안 초음파 처리하였다. 이후, 지지체의 부스러기들을 제거하기 위해 샘플들을 12,000 rpm으로 원심분리한 다음, 상등액을 ALP 활성도 분석에 사용하였다.
CB-HAp 및 PCL 코팅된 CB-HAp 지지체상에 배양된 세포에 있어서 조골세포의 분화정도를 측정하기 위해, 몇몇 조골세포 마커 유전자의 mRNA 발현 정도를 분석하기 위해 정량 실시간 (qRT)-PCR을 수행하였다. 세포들은 접종된 다음, OS가 포함된 배지에서 5일 동안 배양된 후, RNA isolation kit(Ribospin, GeneAll, Seoul, Korea)를 이용하여 전체 mRNA가 추출되었으며, cDNA로 역전사되었다. TaqMan Universal PCR Master Mix, ALP (Hs01029144_m1), Runx2 (Hs00231692_m1), Col1αI (Hs00164004_m1), 및 18S (Hs99999901_s1; Applied Biosystems, Carlsbad, CA)를 타rpt팅하는 TaqMan 프라이머, 및 프로브 세트를 사용하여 PCR을 수행하였다. 모든 Taqman PCR 분석은 StepOne Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems)을 사용하여 수행하였다. 18S ribosomal RNA 유전자는 함께 증폭되었으며, 상대적인 발현양은 CB-HAp 지지체를 기준으로 하였다.
그 결과 1% PCL로 코팅된 CB-HAp 상에 배양하였을 때, 활성도의 패턴 및 레벨은 코팅되지 않은 CB-HAp와 큰 차이가 없었다. 대조적으로 ALP 활성도는 5% 및 10% PCL 처리된 CB-HAp상에 배양된 세포에서는 ALP 활성도가 크게 증가하였다(도 5 참조). 조골세포의 마커 유전자의 발현은 ALP 활성도 분석의 결과와 일치하였다(도 6 참조). 반면 5% 및 10% PCL로 처리된 CB-HAp 상에 세포들을 배양하였을 때, ALP, Runx2 및 Col1αI의 발현이 코팅되지 않은 CB-HAp에서 배양된 세포와 비교해보았을 때 크게 증가하였다.

Claims (12)

  1. 인산칼슘(calcium phosphate)계 다공체, 및 다공체의 표면에 폴리머를 함유하는 코팅층을 포함하는 골이식재.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 코팅층에 함유되는 폴리머는 폴리카프로락톤, 폴리락틱산(PLA), 폴리글리콜릭산(PGA), 폴리포스파젠, 폴리언하이드라이드, 폴리(폴리프로필렌 푸마레이트), 폴리-디옥사논, 폴리(락틱-코-글리콜릭 산), 콜라겐, 키토산, 젤라틴, 피브린, 피브리노겐, 키틴, 히알루론산, 알지네이트, 덱스트란, 이들 고분자들의 공중합체, 및 이들의 혼합물로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리머인 것을 특징으로 하는 골이식재.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 코팅층은 상기 폴리머를 2 내지 9 중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는 골이식재.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 인산칼슘계 다공체는 하이드록시아파타이트(HAp), β-삼인산칼슘(β-TCP), 또는 이들의 혼합 복합체인 이상인산칼슘(Biphasic calcium phosphate, BCP)인 것을 특징으로 하는 골이식재.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 인산칼슘계 다공체는 갑오징어뼈로부터 유래된 것을 특징으로 하는 골이식재.
  6. 인산칼슘계 다공체에 폴리머를 함유하는 코팅층을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 코팅층을 형성하는 단계는 상기 인산칼슘계 다공체를 진공상태에서 폴리머가 용해된 용액에 침지 처리하는 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 폴리머는 폴리카프로락톤, 폴리락틱산(PLA), 폴리글리콜릭산(PGA), 폴리포스파젠, 폴리언하이드라이드, 폴리(폴리프로필렌 푸마레이트), 폴리-디옥사논, 폴리(락틱-코-글리콜릭 산), 콜라겐, 키토산, 젤라틴, 피브린, 피브리노겐, 키틴, 히알루론산, 알지네이트, 덱스트란, 이들 고분자들의 공중합체, 및 이들의 혼합물로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 코팅층은 상기 폴리머를 2 내지 9 중량% 로 함유하는 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
  10. 제 6항에 있어서, 상기 인산칼슘계 다공체는 하이드록시아파타이트(HAp), β-삼인산칼슘(β-TCP), 또는 이들의 혼합 복합체인 이상인산칼슘(Biphasic calcium phosphate, BCP)인 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 인산칼슘계 다공체는 갑오징어뼈로부터 유래된 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 인산칼슘계 다공체는 절단된 갑오징어뼈를 인산이온을 포함하는 용액으로 처리하여, 100 - 300℃에서 6-48 시간 반응시키는 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
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