KR101271721B1 - 다공성생체활성유리를 포함하며 하이드록시아파타이트 및/또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체 및 이의 제조방법 - Google Patents

다공성생체활성유리를 포함하며 하이드록시아파타이트 및/또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다공성생체활성유리를 포함하며 골기질 성분인 하이드록시아파타이트 및/또는 콜라겐이 코팅된 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 상기 지지체의 대략적인 제조과정은 다공성생체활성유리를 제조한 후 생분해성고분자와 혼합하여 지지체를 제조한 후, 상기 전자의 지지체는 생체유사체액에 침지하여 하이드록시아파타이트를 코팅하거나 콜라겐 용액에 침지하여 콜라겐을 코팅하는 방법으로 수행되며, 상기 후자의 지지체는 생체유사체액에 침지하여 하이드록시아파타이트를 코팅한 후 콜라겐 용액에 침지하여 콜라겐을 코팅하는 방법으로 수행된다.
본 발명에서 제조된 다공성생체활성유리를 포함하며 하이드록시아파타이트 및/또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체는 인체에 이식한 초기에 과량의 칼슘이 유출되는 것을 막는 효과가 있으며, 높은 골재생 유도효과를 비롯하여 세포에 대하여 초기 접착, 증식 및 분화와 같은 세포의 거동에 있어서 뛰어난 효과를 갖는다.

Description

다공성생체활성유리를 포함하며 하이드록시아파타이트 및/또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체 및 이의 제조방법 {The coated scaffold for regeneration of hard tissue with hydroxyapatite and/or collagen containing mesoporous bioactive glass and the method thereof}
본 발명은 다공성생체활성유리를 포함하며 하이드록시아파타이트 또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체와 다공성생체활성유리를 포함하며 하이드록시아파타이트 및 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최근 산업재해 및 교통사고의 빈도가 늘고, 고령화 사회로 접어들면서, 경조직 대체용 생채 재료의 수요가 급증하고 있다. 생체고분자 소재의 경우 가공성이 우수하여 응력이 가해지는 경조직에 응용하기 위한 연구가 진행되어 왔으나 생체 금속과 유사한 골흡수 현상뿐만 아니라 미반응 단량체의 축적에 의한 제 2의 질병 야기로 인해 높은 하중을 받지 않는 인공 피부, 혈액 필터의 기능성 소재에만 한정되어 응용되어 왔다.
골 치료 및 재생에는 중간엽 줄기세포 및 조골세포와 같은 특정한 세포와 그들이 3차원으로 자라날 때까지는 지지체가 필요하며 성장인자와 세포외분자 및 기계적 강도가 요구된다. 뼈는 콜라겐 섬유다발과 콜라겐 피브릴을 따라 침전되어 있는 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 나노결정들로 이루어진 복합 구조를 가진다. 또한 뼈는 생명 현상을 유지하기 위해 혈관과 골세포, 점다당체(mucopolysaccharide)를 가지고 있다. 뼈의 구성 성분과 탄성계수의 관계를 살펴보면, 낮은 탄성계수를 가지는 콜라겐 섬유다발이 뼈의 주요 응력 방향을 따라 배열되어 있고 뼈 건조 중량의 70% 정도를 차지하는 하이드록시아파타이트 미네랄 부분이 뼈 강도의 상당 부분을 유지하게 된다.
한편, 생체활성과 생체흡수성이 우수한 인산칼슘계 화합물을 사용하여 골 이식 대체 재료로 사용하고 있으며, 이 화합물은 골 형성능력 및 인체의 뼈와 가장 근접한 화학적 구조를 가짐으로써, 인체에 우수한 생체적합성을 보인다. 하지만 인산칼슘계 화합물의 경우에는 성형하기가 어렵다는 단점이 있으며, 생체세라믹이라는 한정된 부분으로써 가장 큰 문제점인 취성을 가지고 있기에 인체 내 주입 시 탄성계수 및 압축강도에 대한 문제점을 갖고 있다.
이와 같이 골 이식재로 생체 재료 중 생체 친화성 및 기계적 특성이 요구되는 경조직 대체 생체소재에는 생체세라믹과 생체고분자의 적용이 요구되었다. 생체활성유리는 실리카를 주요성분으로 인, 칼슘을 함유한 재료로 조성에 따라 골융합과 생분해를 통한 골재생을 유도한다. 이들이 방출하는 이온들은 세포가 세포외 미네랄화 매트릭스(extracelluar mineralize matrix)를 형성하도록 한다. 다공성생체활성유리(MBG, Mesoporous bioactive glass)는 생체활성유리가 나노크기의 기공을 갖는 다공성 구조로 제조되어 비표면적 및 공극률을 증가시켜 생분해성을 높이고 생체적합성을 부여하였다(대한민국 등록특허 10-0831348). 또한 MBG를 생체유사체액(SBF, Simulated body fluid)에 침적시킬 경우 높은 비표면적으로 인해 이온들의 교환이 빨라지고, 이에 MBG 표면에 뼈의 모체인 하이드록시아파타이트(HAp, Hydroxyapatite)의 형성이 가속화된다. 따라서 골재생용 3차원 지지체에 MBG가 포함될 경우 높은 생체활성을 유도할 수 있다(대한민국 등록특허 10-751504, 10-0805303, 10-0814730, 10-0941374). 하지만 MBG가 생체활성은 높으나 그 때문에 오히려 많은 양의 칼슘이 용출됨으로 인하여 독성을 나타낼 수도 있다는 단점이 발견되었다.
이에 본 발명자는 MBG를 포함하는 지지체를 바로 생체에 이식하지 않고, 골기질 성분인 하이드록시아파타이트와 콜라겐을 각각 지지체에 코팅한 지지체와 하이드록시아파타이트 및 콜라겐을 모두 코팅한 지지체에 대하여 in vitro 실험을 하고 세포증식과 세포분화 모두 우수한 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 다공성생체활성유리를 포함하며 하이드록시아파타이트 및/또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 다공성생체활성유리를 포함하며 하이드록시아파타이트 및/또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다공성 생체활성유리를 포함하며 골기질 성분인 하이드록시아파타이트 및/또는 콜라겐이 코팅된 지지체를 제공한다.
또한, 알코올을 포함하는 용매에 블록공중합체를 용해시켜 템플레이트 용액을 합성하는 단계 (단계 1); 상기 템플레이트 용액에 규소 화합물, 칼슘 화합물 및 인 화합물을 혼합하여 생체활성유리 용액을 합성하는 단계 (단계 2); 상기 생체활성유리 용액을 건조 및 소성하여 다공성 생체활성유리를 얻는 단계 (단계 3); 상기 다공성 생체활성유리를 서브미크론 크기로 분쇄하는 단계 (단계 4); 상기 분쇄된 다공성 생체활성유리를 생분해성 고분자와 혼합하여 페이스트를 얻는 단계 (단계 5); 상기 페이스트를 적층조형법을 이용하여 지지체를 제조하는 단계 (단계 6); 상기 제조된 지지체를 세정 및 건조하는 단계 (단계 7); 상기 용매가 제거된 지지체의 표면에 하이드록시아파타이트 및/또는 콜라겐을 코팅하는 단계 (단계 8); 상기 코팅된 지지체를 세정 및 건조하는 단계 (단계 9); 및 상기 건조된 지지체를 멸균 및 건조하는 단계 (단계 10)를 포함하는 다공성 생체유리를 포함하며 하이드록시아파타이트 및/또는 콜라겐이 코팅된 지지체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 다공성생체활성유리/생분해성고분자 지지체를 생체유사체액에 침지하여 하이드록시아파타이트를 상기 지지체 표면에 형성시킨 지지체, 상기 지지체를 콜라겐 용액에 침지하여 콜라겐 코팅이 된 지지체 및 상기 지지체에 하이드록시아파타이트 및 콜라겐을 순서대로 코팅한 지지체는 인체에 이식된 초기에 다량의 칼슘이 지지체의 다공성 생체활성유리로부터 한꺼번에 유출되어 발생하는 독성을 일으키는 것을 방지한다. 또한 뼈의 대부분을 차치하는 골기질 중 하이드록시아파타이트 및 콜라겐을 포함하고 있어 높은 골재생 유도효과를 비롯하여 세포에 대하여 초기 접착, 증식 및 분화와 같은 세포의 거동에 있어서 뛰어난 효과를 갖는다.
도 1은 본 발명을 개괄적으로 나타낸 개괄도이고,
도 2는 코팅으로 표면 처리하기 전/후의 SEM 사진이고,
도 3은 지지체의 세포 증식거동을 평가한 그래프이고,
도 4는 조골세포의 활성도를 나타낸 그래프이고
도 5는 세포파종 14일 후 지지체의 표면을 측정한 주사전자현미경 사진이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 다공성생체활성유리를 포함하며 골기질 성분인 하이드록시아파타이트 또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체를 제공한다. 상기 다공성생체활성유리를 포함하는 지지체는 생체유사체액에 침지함으로써 다공성생체활성유리 내에서 유출되는 Ca2 +, PO4 2 -, Si4 + 등의 이온으로 부터 상기 지지체 표면에 실리카겔 층이 형성되고, 이 실리카겔 층에 하이드록시아파타이트가 형성되며, 콜라겐 용액에 상기 다공성생체활성유리를 포함하는 지지체를 침지하여 콜라겐의 자기 자기조직화 및 자기조립화에 의하여 상기 지지체의 표면에 콜라겐을 코팅하게 된다. 상기 지지체들을 인체에 이식한 초기에 다량의 칼슘이 한꺼번에 유출되는 것을 방지하게 된다. 또한 상기 지지체들은 골기질 성분을 함유하고 있어 생체 친화도는 물론이거니와 높은 골재생 유도효과를 비롯하여 세포에 대하여 초기 접착, 증식 및 분화와 같은 세포의 거동에 있어서 뛰어난 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명은
알코올을 포함하는 용매에 블록공중합체를 용해시켜 템플레이트 용액을 합성하는 단계 (단계 1);
상기 템플레이트 용액에 규소 화합물, 칼슘 화합물 및 인 화합물을 혼합하여 생체활성유리 용액을 합성하는 단계 (단계 2);
상기 생체활성유리 용액을 건조 및 소성하여 다공성 생체활성유리를 얻는 단계 (단계 3);
상기 다공성 생체활성유리를 서브미크론 크기로 분쇄하는 단계 (단계 4);
상기 분쇄된 다공성 생체활성유리를 생분해성 고분자와 혼합하여 페이스트를 얻는 단계 (단계 5);
상기 페이스트를 적층조형법을 이용하여 지지체를 제조하는 단계 (단계 6);
상기 제조된 지지체를 세정 및 건조하는 단계 (단계 7);
상기 용매가 제거된 지지체의 표면에 하이드록시아파타이트 또는 콜라겐을 코팅하는 단계 (단계 8);
상기 코팅된 지지체를 세정 및 건조하는 단계 (단계 9); 및
상기 건조된 지지체를 멸균 및 건조하는 단계 (단계 10)를 포함하는 다공성생체활성유리를 포함하며 하이드록시아파타이트 또는 콜라겐이 코팅된 지지체의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 각 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 단계 1은 알코올을 포함하는 용매에 블록공중합체를 용해시켜 템플레이트 용액을 합성하는 단계로, 상기 블록공중합체 템플레이트로는 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드의 구조를 갖는 폴록사머(poloxamer)를 사용할 수 있는데, 이때 사용하는 폴록사머는 친수성기 및 소수성기를 갖는 플루로닉(Pluronic)계 또는 테트로닉(Tetronic)계 고분자이다. 이 중, F127((폴리에틸렌옥사이드)100(폴리프로필렌옥사이드)65(폴리에틸렌옥사이드)100, BASF), F108((폴리에틸렌옥사이드)133(폴리프로필렌옥사이드)50(폴리에틸렌옥사이드)133, BASF), F98((폴리에틸렌옥사이드)118(폴리프로필렌옥사이드)44(폴리에틸렌옥사이드)118, BASF), F88((폴리에틸렌옥사이드)104(폴리프로필렌옥사이드)39(폴리에틸렌옥사이드)104, BASF), P123((폴리에틸렌옥사이드)20(폴리프로필렌옥사이드)70(폴리에틸렌옥사이드)20, BASF), P105((폴리에틸렌옥사이드)37(폴리프로필렌옥사이드)56(폴리에틸렌옥사이드)37 ,BASF) 및 P104((폴리에틸렌옥사이드)27(폴리프로필렌옥사이드)61(폴리에틸렌옥사이드)27, BASF)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종인 것으로 친수성 고분자블록 및 소수성 고분자블록으로 이루어지는 블록공중합체라면 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 단계 2는 상기 템플레이트 용액에 규소화합물, 칼슘화합물 및 인화합물을 혼합하여 다공성생체활성유리를 합성하는 단계로, 생체활성유리를 합성하는 방법은 졸-겔(sol-gel)법을 사용하는 것이 바람직하다. 한편, 졸-겔법의 화학적인 과정은 실리콘이나 금속 알콕사이드 단위 전구체(monomer precursor)로부터 다양한 종류의 무기질 망상 조직(network)을 만드는 것이다. 이 과정을 이용하면 고온에서 용융과정을 거쳐 무기질 유리를 만드는 전통적인 방법과는 달리 상온에서 경도와 투명도, 화학적 안정도, 조절된 기공, 열전도도 등 좋은 성질의 균질한 무기질 산화물질을 만들 수 있는 장점이 있다.
상기 단계 2에서 규소화합물, 칼슘화합물 및 인 화합물의 첨가량은 규소, 칼슘 및 인이 50~80 : 18~45 : 2~10의 원소비율로 템플레이트 용액으로 도입하는 것이 바람직하다. 상기의 원소비율 범위에서 가장 안정한 3차원의 입방정 나노기공구조가 형성되기 때문이다. 범위를 초과하거나 미만의 비율이 되면 3차원이 아닌 2차원의 구조를 형성하게 된다. 그 중에서도 상기 칼슘 화합물은 상기 규소 화합물, 상기 칼슘 화합물 및 상기 인 화합물의 전체 양에 대하여 10~40 질량%로 함유되는 것이 바람직하다. 상기 농도 범위에서는 입방정의 나노 기공구조의 형성이 확인되나, 40 무게% 이상에서는 다공성은 띄나 기공의 규칙구조는 열악해짐을 알 수 있다. 템플레이트를 사용한 졸-겔법으로 생체활성유리용액을 제조하되 템플레이트 용액에 규소화합물을 도입하여 반응시키고, 이후 인 화합물을 도입하여 완벽히 용해한 후 칼슘 화합물을 도입하여 수행된다.
상기 단계 2에서 템플레이트 용액은 상기 생체활성유리 용액에 대하여 30~50 질량%로 첨가되는 것이 바람직하다. 템플레이트 용액이 30% 미만으로 첨가되면 표면에 요철이 많아 나노입자가 규칙적으로 형성되지 않을 수 있으며, 템플레이트 용액이 50 %를 초과하여 첨가되면 규소 화합물, 인 화합물, 칼슘 화합물이 잘 용해되지 않는 문제점이 있다.
본 발명에 따른 단계 3은 생체활성유리 용액을 건조 및 소성하여 다공성 생체활성유리를 얻는 단계이다. 상기 건조과정을 통하여 졸-겔 반응 및 고분자의 자기조립화 반응으로 만들어진 메조구조가 균일하게 형성되고 안정화된다. 제조된 생체활성유리용액은 -15~80 ℃ 범위의 온도 및 5~100 %의 상대습도에서 건조되는 것이 바람직하고, 상기 온도 및 습도를 만족하는 항온항습기에서 24~72시간 건조하는 것이 바람직하다. 상기 온도 및 습도 범위는 균일한 메조구조체 형성과 밀접한 관계가 있다. 구체적으로 상기 온도범위를 벗어난 경우 전혀 다른 구조체를 형성하게 되고, 습도가 5% 미만인 경우 습도가 너무 낮아 빠른 속도로 건조되어 메조기공구조가 형성되지 않는 문제가 있다.
상기 단계 3에서 소성은 0.2 ~ 2 ℃/min의 승온 속도로 600~1000 ℃의 온도 범위에서 2~6시간 동안 수행되는 것이 바람직하다. 승온 속도가 0.2 ℃/min 미만인 경우 생체활성유리의 골격이 너무 치밀화 될 수 있으며, 2 ℃/min를 초과하는 경우 빠른 온도 증가로 인하여 템플레이트의 급격한 분해가 일어나 구조체의 붕괴로 이어질 수 있다. 소성 온도가 600 ℃ 미만인 경우 템플레이트가 제거되지 않을 수 있으며, 800 ℃를 초과하면 결정화 및 치밀화로 인하여 메조구조체가 붕괴되는 문제점이 있다. 또한 소성시간이 2시간 미만인 경우 소성이 제대로 되지 않을 수 있으며, 6시간을 초과하여도 이로 인한 유리한 효과가 없으므로 바람직하지 않다.
본 발명에 따른 단계 4는 다공성 생체활성유리를 서브미크론 크기로 분쇄하는 단계이다. 예를 들면 볼밀링(ball-milling) 또는 유발을 사용하여 균일하게 분쇄할 수 있다. 25 ㎛의 크기를 가진 다공성생체활성유리 파우더를 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 단계 5는 분쇄된 다공성 생체활성유리를 생분해성 고분자와 혼합하여 페이스트를 얻는 단계로, 고분자 지지체는 조직공학에서 사용될 수 있는 세포의 부착, 증식 및 분화의 활성에 도움을 주는 고분자를 사용하여야 한다. 상기 생분해성 고분자로는 인공피부 이식재로나 수술용 봉합제 등으로 응용이 가능한 PCL(poly(ε-caprolactone)), PLA(poly(lactic acid)), PGA(Polyglycolide), PLGA (poly(glycolide-lactide)) 및 키토산 등을 사용할 수 있으나, 인체에 무해하고 지지체를 구성할 수 있다면 이에 한정되지 않는다. PCL을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. PCL은 특히 장기간의 치료를 요하는 골절치료에 적합한 소재로 생체내에 이식되었을 때 신진대사를 통해 젖산으로 분해되어 인체에 무해하다. 상기 지지체에 사용하는 생분해성 고분자는 클로로포름에 녹여 액상으로 준비된다.
상기 단계 5에서 생분해성 고분자가 다공성 생체활성유리와 혼합되는 비율은 50~80 : 50 ~20 질량%가 바람직하다. 다공성 생체활성유리의 비율이 50 질량%를 초과하면 지지체의 기계적 강도가 약해질 수 있으며, 20 질량% 미만으로 도입되면 생체활성유리에서 발휘되는 생체친화도 및 하이드록시아파타이트의 형성에 문제가 생길 수 있다.
본 발명에 따른 단계 6에서는 상기 페이스트를 적층조형법을 이용하여 지지체를 제조하는 단계로, 3축 조형기에 상기 페이스트를 넣고 압출하여 지그재그 방식으로 가는 생분해성 고분자 선을 층간에 수직이 되도록 면상에 주사한다. 이 때 형상유지를 위하여 필요에 따라 기판에 적당한 온도의 열을 가해주어 경화를 촉진시킬 수 있다.
상기 단계 6에서 상기 적층조형법으로 제조된 지지체의 기둥간격은 0.5 ~ 2.0 mm인 것이 바람직하고, 1 mm 인 것이 더욱 바람직하다. 지지체의 간격이 0.5 mm 미만이면 기둥간의 간격이 좁아져 지지체 기공형성이 어려우며, 2.0 mm를 초과하면 지지체 기둥간의 간격이 넓어져 기계적 강도가 떨어짐과 동시에 세포재생 효율이 저하되는 문제점이 발생한다. 또한 지지체에 생성되는 기공의 크기는 100 ~ 600 ㎛인 것이 바람직하다. 기공의 크기가 100 ㎛ 미만이면 세포가 부착하여 자라는 경로가 확보되지 않아 세포의 부착, 증식, 분화 및 조직 재생이 잘 되지 않을 수 있으며, 600 ㎛를 초과하면 세포성장 저하와 동시에 지지체의 기계적 강도가 약해질 수 있다.
본 발명에 따른 단계 7은 제조된 지지체를 세정 및 건조하는 단계로, 지지체 제조시 사용된 유해용매를 제거하기 위한 것이다. PCL의 경우 인체 유해한 클로로포름에 용해시켜 지지체를 제조하므로 충분한 세정이 필요하며 세정에는 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다. 하지만 인체에 무해하고 상기 지지체를 구성하는데 사용된 용매를 세정할 수 있다면 이에 한정되지 않는다. 세정 후 진공건조를 실시하여 지지체 내부에 있는 유해 용매성분까지 제거를 유도하며 이 과정은 세정-건조로 여러 번 반복 실시한다. 최소 4회 이상 실시하며 클로로포름이 검출되지 않음을 확인할 필요가 있다. 건조 방법은 진공건조가 바람직하나 상기 지지체의 생체활성 및 기계적 강도에 문제를 야기하지 않으며 건조할 수 있다면 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 단계 8은 상기 세정 및 건조된 지지체의 표면에 하이드로아파타이트 또는 콜라겐을 코팅하는 단계이다. 먼저 상기 지지체에 대한 하이드로아파타이트의 코팅은 생체유사체액에 상기 지지체를 침지하는 방법으로 수행된다. 이는 상기 지지체에 포함되어 있는 생체활성유리가 생체유사체액에 침지되면서 생체활성유리의 재료 내 Ca2 +, PO4 2 -, Si4 + 등의 이온이 용출됨과 동시에 재료표면에 실리카겔 층이 형성되며, 이 불안정한 실리카겔 층에 하이드록시아파타이트가 형성되어 지지체에 코팅되는 원리이다.
상기 단계 8에서 다른 골기질 성분인 콜라겐을 코팅하는 것은 산을 용매로 하여 콜라겐을 용해한 용액에 상기 지지체를 침지하는 방법으로 수행된다. 콜라겐은 3중 나선구조의 구조단백질로서 단백질 중에서도 특이한 존재이고 생체의 주요부분을 이루는 가장 중요한 단백질로, 다른 단백질과 구별되는 점은 자기조직화 및 자기조립화 기능을 갖는다는 점이다. 자기조직화나 자기조립화 모두 고차구조를 이루는 개념으로서 자기조직화란 계의 임의의 파라미터가 임계치에 달할 때 자발적으로 배열을 하게 되는 현상이다. 한편, 자기조립화란 최소에너지 상태의 안정한 구조가 달성될 때까지 각 요소들이 자발적으로 모여 합치는 과정으로서, 구동력인 초기상태와 최종상태와의 에너지 차이에 의해 각 구성요소가 구조 중에서 적절한 위치를 찾게 되는 것이다. 결국 상기 단계는 콜라겐의 자기조직화 및 자기조립화에 의하여 상기 지지체의 표면에 콜라겐을 코팅하는 것이다.
상기 콜라겐의 농도는 0.1 ~ 100 ㎍/ml가 되도록 도입되는 것이 바람직하다. 콜라겐의 농도가 0.1㎍/ml 미만인 경우는 콜라겐의 농도가 너무 낮아 콜라겐의 특성을 발휘하는데 문제가 있으며, 100㎍/ml를 초과하는 경우는 독성을 초래할 수 있는 문제가 있다.
상기 단계 8에서 하이드록시아파타이트 또는 콜라겐을 코팅하기 위하여 생체유사체액 또는 콜라겐 용액에 침지하는 시간은 12시간 ~ 48 시간인 것이 바람직하고, 24시간인 것이 더욱 바람직하다. 12시간미만으로 침지한 경우 지지체 표면에 하이드록시아파타이트 및 콜라겐의 양이 충분히 코팅되지 못하는 문제점이 있으며, 48시간을 초과하여 침지하여도 이로 인한 유리한 효과가 없어 바람직하지 않다.
본 발명에 따른 단계 9는 상기 코팅된 지지체를 세정 및 건조하는 단계이다. 증류수를 이용하여 잔여 생체유사체액 또는 콜라겐 용액을 제거하고, 동결건조를 사용하되 지지체의 생체활성 및 기계적 강도에 영향을 주지 않는 건조법이면 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 단계 10은 건조된 지지체를 멸균 및 건조하는 단계이다. 무균상태에서 70 % 에탄올을 사용하여 멸균하되, 인체에 무해하고 지지체의 특성을 저해하지 않고 멸균할 수 있다면 이에 한정되지 않는다. 멸균된 지지체를 진공건조기를 이용하여 건조하는 것이 바람직하나, 상기 지지체의 생체활성 및 기계적 강도에 문제를 야기하지 않으며 멸균상태를 유지하도록 건조할 수 있다면 이에 한정되지 않는다.
나아가, 본 발명은
알코올을 포함하는 용매에 블록공중합체를 용해시켜 템플레이트 용액을 합성하는 단계 (단계 a);
상기 템플레이트 용액에 규소 화합물, 칼슘 화합물 및 인 화합물을 혼합하여 생체활성유리 용액을 합성하는 단계 (단계 b);
상기 다공성 생체활성유리 용액을 건조 및 소성하여 생체활성유리를 얻는 단계 (단계 c);
상기 다공성 생체활성유리를 서브미크론 크기로 분쇄하는 단계 (단계 d);
상기 분쇄된 다공성 생체활성유리를 생분해성 고분자와 혼합하여 페이스트를 얻는 단계 (단계 e);
상기 페이스트를 적층조형법을 이용하여 지지체를 제조하는 단계 (단계 f);
상기 제조된 지지체를 세정 및 건조하는 단계 (단계 g);
상기 용매가 제거된 지지체의 표면에 하이드록시아파타이트 및 콜라겐을 코팅하는 단계 (단계 h);
상기 코팅된 지지체를 세정 및 건조하는 단계 (단계 i); 및
상기 건조된 지지체를 멸균 및 건조하는 단계 (단계 j)를 포함하는 다공성생체활성유리를 포함하며 하이드록시아파타이트 및 콜라겐이 코팅된 지지체의 제조방법을 제공한다.
상기 단계 a~g는 상기 다공성생체활성유리를 포함하며 하이드록시아파타이트 또는 콜라겐이 코팅된 경조직 지지체의 제조방법 중 단계 1~7과 동일하게 수행되었다.
본 발명에 따른 단계 h는 용매가 제거된 지지체의 표면에 하이드록시아파타이트 및 콜라겐을 코팅하는 단계이다. 먼저, 상기 지지체를 생체유사체액에 12~48시간을 침지하여 표면에 하이드록시아파타이트를 코팅하고 증류수를 이용하여 세정한 다음 콜라겐 용액에 12~48시간 침지하여 콜라겐을 부착시키는 방법으로 수행된다. 상기 생체유사체액 및 콜라겐 용액에 침지하는 시간이 12시간 미만이면 하이드록시아파타이트 및 콜라겐이 충분히 코팅되지 않으며, 48시간을 초과하여 침지하여도 이로 인한 유리한 효과가 없어 바람직하지 않다.
상기 단계 h에서 콜라겐 용액은 산에 용해한 후 0.1~100㎍/ml 이 되도록 물로 희석하는 것이 바람직하다. 콜라겐의 농도가 0.1㎍/ml 미만인 경우 콜라겐 농도가 너무 낮아 콜라겐의 특성을 발휘하는데 문제가 있으며, 100㎍/ml를 초과하는 경우는 독성을 초래하거나 하이드록시아파타이트가 생성된 면적 모두를 코팅함으로 하이드록시아파타이트의 기증을 저해할 수 있는 문제가 있다.
상기 단계 ｉ 및 j는 상기 다공성생체활성유리를 포함하며 하이드록시아파타이트 또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체 제조방법 중 단계 9 및 10과 동일하게 수행된다.
또한, 본 발명은 다공성생체활성유리를 포함하며 콜라겐 및 하이드록시아파타이트가 코팅된 경조직 재생용 지지체를 제공한다. 상기 다공성생체활성유리를 포함하는 지지체의 표면은 생체유사체액에 침지함으로써 다공성생체활성유리 내에서 유출되는 Ca2 +, PO4 2 -, Si4 + 등의 이온으로부터 지지체 표면에 실리카겔 층이 형성되고, 이 층에 하이드록시아파타이트가 형성된다. 하이드록시아파타이트가 형성된 상기 지지체를 다시 콜라겐 용액에 침지하여 콜라겐을 코팅한다. 상기 지지체를 인체에 이식하였을 경우, 이식 초기에 다량의 칼슘이 한꺼번에 유출되는 것을 방지하게 된다. 또한 상기 지지체들은 골기질 성분을 함유하고 있어 생체 친화도는 물론이거니와 높은 골재생 유도효과를 비롯하여 세포에 대하여 초기 접착, 증식 및 분화와 같은 세포의 거동에 있어서 뛰어난 효과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 발명을 예시하는 것일 뿐, 내용이 하기 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 하이드록시아파타이트가 코팅된 MBG / PCL 지지체의 제조
단계 1. 템플레이트 용액을 합성하는 단계
졸-겔법을 이용하여 2.95 g의 폴록사머 F-127을 에탄올 30 mL와 1M 염산 0.95 mL에 넣고, 40 ℃에서 1시간 동안 900 rpm으로 교반하면서 용해하는 방법으로 템플레이트 용액을 합성하였다.
단계 2. 생체활성유리용액을 합성하는 단계
상기 단계 1에서 합성된 템플레이트 용액의 F-127이 완벽히 녹은 것을 확인한 후, 템플레이트 용액에 TEOS(tetraethyl orthosilicate) 6.15 mL을 첨가하였다. 30분간 교반하여 반응시킨 후 0.33 mL의 트리에틸포스페이트((C2H5O)3PO)를 천천히 넣었다. 반응시킨 후 1.26 g의 칼슘나이트레이트 4수화물(Ca(NO3)24H2O)를 서서히 녹여가면서 넣었다. 이후 40 ℃에서 900 rpm으로 교반하면서 4시간동안 반응시켜 생체활성유리용액을 제조하였다.
단계 3. 생체유리용액을 건조 및 소성하여 다공성 생체활성유리를 얻는 단계
상기 단계 2에서 제조된 생체활성유리용액을 증발접시에 10 mL씩 나누어 담고, 40 ℃의 온도 및 40 %의 상대습도로 설정된 항온항습기에 넣어 건조하되, 투명한 필름상이 될 때까지 건조하였다.
상기 건조된 다공성 생체활성유리필름을 600 ℃에서 4시간 소결시켜 다공성 생체활성유리를 제조하였다.
단계 4. 다공성 생체활성유리를 분쇄하는 단계
제조된 다공성생체활성유리를 유발을 사용하여 25 ㎛로 분쇄하여 다공성생체활성유리(MBG) 파우더를 제조하였다.
단계 5. MBG 파우더와 생분해성 고분자를 혼합하여 페이스트를 제조하는 단계
PCL(poly ε-caprolacton) 10 g을 5 mL의 클로로포름에 녹여 MBG 파우더를 PCL용액에 대하여 60 질량%로 넣어 고르게 분산시켜 페이스트를 제조하였다.
단계 6. 적층조형법을 이용하여 지지체를 제조하는 단계
상기 제조된 페이스트를 3축 조형기에 넣고 X축과 Y축의 간격은 1 mm로 설정하고, 지그재그로 방식으로 가는 고분자 선을 층간에 수직이 되도록 주사하여 지지체를 제조하였다.
단계 7. 제조된 지지체를 세정 및 건조하는 단계
상기 제조된 지지체에 포함된 클로로포름을 제거하기 위해 99.9 %의 에탄올로 20 분간 세척한 후 진공동결건조기에서 30분간 건조하였다. 이를 5회 반복하여 MBG의 메조구조에 있는 클로로포름까지 완전히 제거하였다. 마지막 5회째 진공동결건조는 하루 동안 실시하여 지지체를 건조하였다.
단계 8. 지지체에 하이드록시아파타이트를 코팅하는 단계
상기 세정 및 건조된 지지체를 생체유사체액에 1일간 침지하여 하이드록시아파타이트를 코팅하였다.
단계 9. 코팅된 지지체를 세정 및 건조하는 단계
하이드록시아파타이트가 코팅된 지지체를 생체활성유사체액이 완벽히 제거되도록 증류수로 세정하고, 12시간동안 진공동결건조하였다.
단계 10. 건조된 지지체를 멸균 및 건조하는 단계
상기 세정된 지지체를 70% 에탄올로 30분간 멸균하고 클린벤치 안에서 진공건조하는 단계를 거쳐 골기질 성분이 코팅된 지지체를 제조하였다.
< 실시예 2> 콜라겐이 코팅된 MBG / PCL 지지체의 제조
상기 실시예 1에서 단계 8의 생체유사체액을 대신하여 0.1M 아세트산에 2 mg/mL의 농도로 용해한 콜라겐 용액에 침지하여 콜라겐 코팅을 수행한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 MBG/PCL 지지체를 제조하였다.
< 실시예 3> 하이드록시아파타이트 및 콜라겐이 코팅된 MBG / PCL 지지체의 제조
상기 실시예 1에서 단계 8이 하기와 같이 실시된 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 하이드록시아파타이트 및 콜라겐이 코팅된 MBG/PCL 지지체를 제조하였다. 생체유사체액에 1일 침지하여 하이드록시아파타이트를 형성시킨 후 증류수로 세정하였다. 0.1M 아세트산에 2mg/mL의 농도로 용해시킨 콜라겐 용액을 2 mL 취하여 총 200mL이 되도록 증류수로 희석한 용액에 상기 하이드록시아파타이트가 형성된 지지체를 1일간 침지하여 콜라겐 코팅을 수행하였다. 이후 절차는 실시예 1과 동일하게 수행하여 하이드록시아파타이트 및 콜라겐이 코팅된 MBG/PCL 지지체 제조를 제조하였다.
< 비교예 1> MBG / PCL 지지체 제조
상기 실시예 1에서 단계 8 및 9를 수행하지 않은 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 MBG/PCL 지지체를 제조하였다.
< 실험예 1> 코팅 전/후 지지체의 표면 측정
지지체의 표면 특성을 살펴보기 위하여 전자주사현미경(SEM)을 이용하여 골기질 성분의 코팅 전/후의 지지체 표면을 관찰하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2와 같이 코팅 전의 지지체(비교예 1)는 PCL에 MBG가 분포되어 있으며 비교적 거친 표면을 가지고 있었다. 콜라겐 코팅(실시예 2)한 경우 코팅전보다 지지체의 거친 표면이 매끄러워짐을 통하여 콜라겐이 지지체 전체 표면을 덮고 있음을 알 수 있었다. 생체유사체액에 침지하여 하이드록시아파타이트 코팅된 지지체(실시예 1)의 경우 코팅 전(비교예 1)과 비슷하게 거친 표면을 유지하고 있으며 표면에 수백 나노크기의 하이드록시아파타이트가 비교적 균일하게 생성되어 있음이 확인되었다. 또한 생체유사체액에 침지하여 하이드록시아파타이트를 형성시킨 후 콜라겐을 코팅한 지지체(실시예 3)의 경우 실시예 1과는 다르게 하이드록시아파타이트위로 매끄러운 표면이 같이 존재하는 것이 보인다. 이것은 하이드록시아파타이트 형성 후 콜라겐을 코팅이 수행되었기 때문에, 형성된 하이드록시아파타이트 일부분이 콜라겐에 의하여 덮여있기 때문이다.
< 실험예 2> 지지체의 셀 증식거동 평가
세포 증식거동을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
상기 실시예 1, 2, 3 및 비교예 1에 의하여 제조된 지지체를 α-MEM (1% penicilin-streptomycin, 10% FBS)에 30분 동안 침지한 후, 지지체를 꺼내어 새로운 α-MEM에 추가로 30분간 더 침지시켰다. 다시 α-MEM을 바꾸어 지지체를 침지하고, 데시케이터에 넣어 진공을 유지하면서 기포를 10분 이상 2번씩 제거하였다. 이후 α-MEM을 모두 제거하고 48웰(well) 플레이트에 지지체를 옮겼다.
MC3T3-E1(Mouse Osteoblastic Cells) 조골모세포(pre-osteoblast)를 1× 105 (cell/50㎕/지지체)의 농도로 파종하였다. 30분 동안 배양한 후 지지체를 다시 뒤집어 세포가 외부로 나오는 것을 방지하였다. 2시간을 더 배양한 후 1 mL의 배지(α-MEM)를 추가하였다.
상기에서 배양 중인 웰의 배지를 모두 제거하고 500 ㎕의 배지에 1% MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) 용액을 첨가하여 3시간 동안 배양하였다. 발색된 배지를 100 ㎕씩 96웰 플레이트에 옮겨 담고 490 nm에서 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 따르면 세포파종 3시간 경과 후 본 초기부착거동에 있어서는 표면처리 전후에 큰 차이가 없음을 알 수 있다. 하지만 5일, 7일 경과 후 세포 증식거동에 있어서는 표면처리전의 샘플인 비교예 1에 비해 표면 처리한 모든 샘플이 우수한 증식을 유도하고 있음을 확인할 수 있었다. 특히 하이드록시아파타이트를 형성시킨 샘플(실시예 1 및 실시예 3)에 있어서 표면처리 전에 비하여 약 50%이상 높은 증식이 이루어진 것을 확인할 수 있었다.
< 실험예 3> 조골세포의 분화거동 평가
특정 기질을 탈인산화 하는 효소의 활성을 측정하여 조골세포의 활성도를 알아보기 위하여, 실시예 1~3 및 비교예 1에 대하여 하기와 같은 실험을 수행하고 그 결과를 도 4에 나타내었다. 조골모세포인 MC3T3 E-1 세포의 분화를 위하여 아스코브산이 함유한 것을 제외하고는 상기 실험예 2의 세포파종과 동일한 방법으로 수행하였다. 배양중인 웰 플레이트의 배지를 잘 섞은 뒤 100 ㎕씩 옮겨 담고 nPP((p-Nitrophenyl) phosphate) 용액을 50 ㎕ 주입한 후 60분동안 배양하였다. 발색된 용액 100 ㎕를 96웰 플레이트에 넣고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 배지를 모두 제거하고 PBS로 세정한 후 ALP-키트(kit)의 에세이 버퍼를 500 ㎕ 넣어서 10분 동안 반응시킨 후 피펫으로 강하게 수십 회 섞어준 후 용액을 수거하여 13,000 rpm으로 3분간 원심분리 하였다. 이 용액의 상층액을 100 ㎕씩 옮겨담고 nPP 용액을 50 ㎕ 넣어 60분간 배양한다. 발색된 용액 100 ㎕를 96 웰 플레이트에 넣고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 하기의 공식을 사용하여 측정된 배지내의 흡광도 및 세포외 흡광도를 합하여 계산하였다.
ALP 활성도 = 흡광도 / 측정량 /시간
표준화된 ALP 활성도 = ALP 활성도 / 세포 수
알칼리 포스페타아제 활성(Alkaline phosphatase activity)은 특정 기질을 탈인산화 하는 효소의 활성을 측정하는 것으로 알칼리 포스페타아제는 뼈 생성에 중요한 요소로써 조골세포의 활성이 증가할수록 활성도가 증가한다. 이 실험을 통해 MC3T3 E-1 셀이 조골세포로 분화한 정도를 알 수 있다. 도 4에 따르면, 실험결과 활성정도는 3일차에 있어 실시예 3이 가장 높으며 7일차에 있어 비교예 1에 비해 모든 실시예가 높음을 확인할 수 있다. 특히, 하이드록시아파타이트가 존재하는 실시예 1과 실시예 3이 높다. 같은 경향이 14일차와 21일차에도 볼 수 있다. 특히 14일차와 21일차에 있어 하이드록시아파타이트가 존재하는 실시예 1과 실시예 3의 경우 세포 당 활성도 표준화 그래프를 보면 활성도가 줄어들었다가 다시 향상되는데 이는 하이드록시아파타이트가 존재하는 경우 세포증식과 더불어 조기 세포분화가 촉진되기 때문이라 판단된다. 특히, 콜라겐과 하이드록시아파타이트가 공존하는 실시예 3에 있어서 이러한 거동이 명확히 나타나며 이것은 증식 등의 초기세포거동에 영향을 미치는 콜라겐과 세포분화에 영향을 미치는 하이드록시아파타이트가 함께 존재함으로써 상생효과를 발휘하여 생체골기질과 유사한 기능을 유도하였기 때문으로 판단되며 가장 월등한 효과를 기대할 수 있다.
< 실험예 4> 지지체 표면의 세포거동 관찰
실시예 1, 2, 3과 비교예 1에 대하여 세포파종이 이루어진 후, 지지체 표면에 배양된 세포의 거동을 살펴보기 위하여 하기와 같은 처리를 하고, 전자주사현비경의 관찰을 하고, 그 결과를 도5에 나타내었다. 배지를 모두 제거하고 PBS (phosphate bufferd saline)로 지지체를 세정한 후 2.5% 글루타알데히드 용액을 넣고 30분간 빛의 차단을 유지하였다. 다시 PBS로 세정하고 50, 70, 90, 100% 에탄올로 탈수과정을 거친 다음 클린벤치 내에서 완전히 건조시켰다.
도5의 그림과 같이, 세포파종 14일 경과 후 지지체 표면을 관찰한 결과 표면을 처리하지 않은 실시예 1에서는 부분적인 세포성장이 관찰되었으나 실시예 1, 2, 3과 같이 표면처리된 경우 세포성장이 원활히 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다. 특히 실시예 3에 있어서 우수한 세포성장을 확인할 수 있었으며 본 발명의 유효성이 입증되었다.

Claims (20)

  1. 메조 다공성 생체활성유리를 포함하며 표면에 골기질 성분인 하이드록시아파타이트(HAp) 또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체.
  2. 알코올을 포함하는 용매에 블록공중합체를 용해시켜 템플레이트 용액을 합성하는 단계 (단계 1);
    상기 템플레이트 용액에 규소 화합물, 칼슘 화합물 및 인 화합물을 혼합하여 생체활성유리 용액을 합성하는 단계 (단계 2);
    상기 생체활성유리 용액을 건조 및 소성하여 메조 다공성 생체활성유리를 얻는 단계 (단계 3);
    상기 메조 다공성 생체활성유리를 서브미크론 크기로 분쇄하는 단계 (단계 4);
    상기 분쇄된 메조 다공성 생체활성유리를 생분해성 고분자와 혼합하여 페이스트를 얻는 단계 (단계 5);
    상기 페이스트를 적층조형법을 이용하여 지지체를 제조하는 단계 (단계 6);
    상기 제조된 지지체를 세정 및 건조하는 단계 (단계 7);
    상기 용매가 제거된 지지체의 표면에 하이드록시아파타이트 또는 콜라겐을 코팅하는 단계 (단계 8);
    상기 코팅된 지지체를 세정 및 건조하는 단계 (단계 9); 및
    상기 건조된 지지체를 멸균 및 건조하는 단계 (단계 10)를 포함하는 메조 다공성 생체활성유리를 포함하며 표면에 골기질 성분인 하이드록시아파타이트(HAp) 또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체의 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 단계 1에서 블록공중합체는 F127, F108, F98, F88, P123, P105 및 P104로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 메조 다공성 생체활성유리를 포함하며 표면에 골기질 성분인 하이드록시아파타이트(HAp) 또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체의 제조방법.
  4. 상기 제 2항에 있어서, 상기 단계2 생체활성유리를 합성하는 방법은 졸-겔(sol-gel)법을 이용하는 것을 특징으로 하는 메조 다공성 생체활성유리를 포함하며 표면에 골기질 성분인 하이드록시아파타이트(HAp) 또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체의 제조방법.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 단계 2에서 규소화합물, 칼슘화합물 및 인 화합물의 첨가량은 규소, 칼슘 및 인이 50~80 : 18~45 : 2~10의 원소비율인 것을 특징으로 하는 메조 다공성 생체활성유리를 포함하며 표면에 골기질 성분인 하이드록시아파타이트(HAp) 또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체의 제조방법.
  6. 제 2항에 있어서, 상기 단계 2에서 템플레이트 용액은 상기 생체활성유리 용액에 대하여 30~50 질량%로 첨가되는 것을 특징으로 하는 메조 다공성 생체활성유리를 포함하며 표면에 골기질 성분인 하이드록시아파타이트(HAp) 또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체의 제조방법.
  7. 제 2항에 있어서, 상기 단계 3은 -15~80 ℃ 범위의 온도 및 5~100 %의 상대습도에서 건조되는 것을 특징으로 하는 메조 다공성 생체활성유리를 포함하며 표면에 골기질 성분인 하이드록시아파타이트(HAp) 또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체의 제조방법.
  8. 제 2항에 있어서, 상기 단계 3에서 소성은 0.2~2 ℃/min의 승온 속도로 400~800 ℃의 온도 범위에서 2~6시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 메조 다공성 생체유리를 포함하며 메조 다공성 생체활성유리를 포함하며 표면에 골기질 성분인 하이드록시아파타이트(HAp) 또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체의 제조방법.
  9. 제 2항에 있어서, 상기 단계 5에서 생분해성 고분자는 폴리ε-카프로락톤(Poly-ε-caprolactone. PCL), 폴리락타이드(Poly-L-lactide, PLA), 폴리글라이콜라이드(Polyglycolide, PGA), 폴리락타이드-글라이콜라이드(poly(glycolide-lactide), PLGA) 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 메조 다공성 생체활성유리를 포함하며 표면에 골기질 성분인 하이드록시아파타이트(HAp) 또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체의 제조방법.
  10. 제 2항에 있어서, 상기 단계 5는 생분해성 고분자가 상기 다공성 생체활성유리와 50~80 : 50~20의 질량% 비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는 메조 다공성 생체활성유리를 포함하며 표면에 골기질 성분인 하이드록시아파타이트(HAp) 또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체의 제조방법.
  11. 제 2항에 있어서, 상기 단계 6에서 적층조형법으로 제조된 지지체의 X축 및 Y축 사이의 간격은 0.5 ~ 2 mm이고, 기공크기는 500 ~ 800 ㎛인 것을 특징으로 하는 메조 다공성 생체활성유리를 포함하며 표면에 골기질 성분인 하이드록시아파타이트(HAp) 또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체의 제조방법.
  12. 제 2항에 있어서, 상기 단계 7은 진공동결건조를 통하여 수행되는 것을 특징으로 하는 메조 다공성 생체활성유리를 포함하며 표면에 골기질 성분인 하이드록시아파타이트(HAp) 또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체의 제조방법.
  13. 제 2항에 있어서, 상기 단계 8의 하이드록시아파타이트 코팅은 지지체를 생체유사체액에 12 ~ 48 시간동안 침지하여 하이드록시아파타이트를 부착 및 형성시키는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 메조 다공성 생체활성유리를 포함하며 표면에 골기질 성분인 하이드록시아파타이트(HAp) 또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체의 제조방법.
  14. 제 13항에 있어서, 콜라겐 용액의 농도는 0.1~ 100 ㎍/ml 인 것을 특징으로 하는 메조 다공성 생체활성유리를 포함하며 표면에 골기질 성분인 하이드록시아파타이트(HAp) 또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체의 제조방법.
  15. 제 2항에 있어서, 상기 단계 8에서 콜라겐 코팅은 지지체를 산에 용해시킨 콜라겐 용액에 12 ~ 48 시간 동안 침지하여 콜라겐을 부착시키는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 메조 다공성 생체활성유리를 포함하며 표면에 골기질 성분인 하이드록시아파타이트(HAp) 또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체의 제조방법.
  16. 제 2항에 있어서, 상기 단계 9에서 건조는 동결건조의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 메조 다공성 생체활성유리를 포함하며 표면에 골기질 성분인 하이드록시아파타이트(HAp) 또는 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체의 제조방법.
  17. 알코올을 포함하는 용매에 블록공중합체를 용해시켜 템플레이트 용액을 합성하는 단계 (단계 a);
    상기 템플레이트 용액에 규소 화합물, 칼슘 화합물 및 인 화합물을 혼합하여 생체활성유리 용액을 합성하는 단계 (단계 b);
    상기 생체활성유리 용액을 건조 및 소성하여 메조 다공성 생체활성유리를 얻는 단계 (단계 c);
    상기 메조 다공성 생체활성유리를 서브미크론 크기로 분쇄하는 단계 (단계 d);
    상기 분쇄된 메조 다공성 생체활성유리를 생분해성 고분자와 혼합하여 페이스트를 얻는 단계 (단계 e);
    상기 페이스트를 적층조형법을 이용하여 지지체를 제조하는 단계 (단계 f);
    상기 제조된 지지체를 세정 및 건조하는 단계 (단계 g);
    상기 용매가 제거된 지지체의 표면에 하이드록시아파타이트 및 콜라겐을 코팅하는 단계 (단계 h);
    상기 코팅된 지지체를 세정 및 건조하는 단계 (단계 i); 및
    상기 건조된 지지체를 멸균 및 건조하는 단계 (단계 j)를 포함하는 메조 다공성 생체활성유리를 포함하며 표면에 골기질 성분인 하이드록시아파타이트(HAp) 및 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체의 제조방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 단계 8의 하이드록시아파타이트 및 콜라겐 코팅은 지지체를 생체유사체액에 12~48시간 침지하여 하이드록시아파타이트를 형성한 후, 산에 용해시킨 콜라겐 수용액에 12~48시간 침지하여 콜라겐을 부착시키는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 메조 다공성 생체활성유리를 포함하며 표면에 골기질 성분인 하이드록시아파타이트(HAp) 및 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체의 제조방법.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 콜라겐 용액의 농도는 0.1~ 100 ㎍/ml인 것을 특징으로 하는 메조 다공성 생체활성유리를 포함하며 표면에 골기질 성분인 하이드록시아파타이트(HAp) 및 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체의 제조방법.
  20. 제 17항에 따라 제조된, 메조 다공성 생체활성유리를 포함하며 표면에 골기질 성분인 하이드록시아파타이트(HAp) 및 콜라겐이 코팅된 경조직 재생용 지지체.
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