CN101301491B - 多醛基海藻酸钠交联聚磷酸钙/壳聚糖的复合支架及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于骨或软骨修复与治疗的多醛基海藻酸钠交联聚磷酸钙/壳聚糖的复合支架，以及支架材料的制备与应用。支架材料由聚磷酸钙、壳聚糖和多醛基海藻酸钠为原料制备而成。本发明的复合支架材料，由于其主要组分的有机相多醛基海藻酸钠交联的壳聚糖基体源于天然，因此安全无毒，有良好的生物相容性和生物降解性，且表面存在细胞识别信号，可为骨或软骨的再生和重建提供物理支架和最佳的化学环境，其网络结构使得材料力学性能得到了很大的提高。另外，其无机增强相聚磷酸钙的成分与人体骨组织的无机成分基本一致，并具有促进骨或软骨生长的活性和可控降解性。本发明的复合材料可在作为骨或软骨的缺损修复及组织工程支架、药物缓释载体中应用。

Description

多醛基海藻酸钠交联聚磷酸钙/壳聚糖的复合支架及其制备与应用

技术领域

本发明涉及骨或软骨缺损修复材料技术领域，具体来说是涉及一种包含无机/有机相的复合支架材料，同时本发明还涉及复合支架材料的制备方法及应用。

背景技术

骨骼是人体的支架，担负着支持、保护、承重、造血、贮钙、代谢等功能，是人体重要的组织器官。临床上常因创伤、肿瘤、感染、先天性缺陷等原因导致骨组织坏死、缺损及病变，是临床多发病症，属于关节部位的软骨的病变和缺损更是常见和多发病。随着人口老龄化和各种创伤的增加，对生物医学材料尤其是硬组织(骨、牙)替代材料的需求也持续增长，具有量大而广的特点。1998年全球生物材料产业的年交易额已达120亿美元，其中涉及硬组织修复和替代材料的约为23亿美元。而在中国每年由于车祸、疾病等原因造成的骨缺损患者达到300多万，骨质疏松患者高达6300万。随着人们生活水平的不断提高和保健意识的不断增强，骨或软骨组织修复的需求呈逐年递增趋势，有关骨或软骨修复材料和组织工程的临床应用前景极为广阔，因此，骨或软骨修复材料的开发研究具有重大的意义。

1993年，Science杂志提出了组织工程的概念，即“应用组织工程学和生命科学原理生长出活的替代物，用以修复、维持和改善人体组织和器官的功能”，达到提高生活与生存质量、延长生命活动的目的。信号因子(生长因子、诱导因子)、支架材料和靶细胞是构成组织工程的三要素。

依据组织工程的原理，科学家开始对人体最基本的组织-骨进行了组织工程化的研究。将分离的自体高浓度成骨细胞、骨髓基质干细胞或软骨细胞，经体外培养扩增后种植于一种天然或人工合成的、具有良好生物相容性、可被人体逐步降解吸收的细胞支架上，通常是一种可降解的生物材料。这种生物材料支架可为细胞提供生存的三维空间，有利于细胞获得足够的营养物质，进行气体交换，排除废料，使细胞在预制形态的三维支架上生长，然后将这种细胞杂化材料植入骨缺损部位，在生物材料逐步降解的同时，种植的骨细胞不断增殖，从而达到修复骨组织缺损的目的。在骨组织工程中，理想的支架材料应具有良好的生物相容性及生物学活性，可控降解性和足够的力学强度、易加工和易消毒性等。

目前，对于骨组织工程支架材料的研究主要集中在生物陶瓷，高分子材料和复合材料等。生物陶瓷又称生物医用无机非金属材料，与高分子材料和金属材料相比，生物陶瓷在人体内极其稳定，压缩强度高，对生物组织有良好的相容性与亲和性，且耐腐蚀，无毒副作用，几乎看不到与生物组织的排斥反应；高分子材料具有韧性好、容易加工等特点，因此，在骨修复领域也有广泛的研究和应用。近年来，天然高分子材料在骨组织工程和骨修复领域中的应用方面的报道层出不穷。该类材料的特点是生物相容性好，有利于细胞粘附，增殖和分化，缺点是缺乏必要的机械强度。

传统骨修复材料具有降解速率不可控和力学强度低等缺陷使其在临床应用上受到很大的限制，而无机/有机复合支架材料是改善传统骨组织工程支架材料的降解速率和力学性能的重要趋势，而成为该领域的研究热点。

无机材料一般通过两种方法和有机材料复合。一种是物理混合法：将颗粒状的无机材料和液态有机材料混合制成膏状可注射复合物，通过无机材料的自固化形成固体组织工程支架或者直接将二者混合，利用有机相的熔融等特性将二者紧密地结合起来；化学自交联法是将有机预聚物、交联剂和无机物混合后，通过化学交联反应使预聚体形成包埋无机物，结合更紧密，机械性质更优良的三维网状复合物。

物理混合法和化学交联法两种复合方法，前者仅是进行物理的混合，陶瓷颗粒只是松散的分布在有机相中，不能有较好的结合效果。化学交联固化法能使复合物获得优良的机械性能，但仍存在缺陷，即交联时要使用各种引发剂和交联剂：如光引发剂、金属离子交联剂、共价交联剂(戊二醛、碳二亚胺等)。光敏物质和较长的辐照时间限制了光引发聚合方法的应用。金属离子交联则会引起金属离子在体内的释放，从而引起毒副作用。大多数可以与高分子进行交联反应的交联剂，如戊二醛，聚环氧化合物和异氰酸酯等本身都具有较高毒性，植入体内，会随着高分子基材的降解而逐步释放出来，引起毒副作用。原料和降解产物的毒性使这些体系难于用作组织工程支架，因为即使很低浓度的毒性试剂渗透到体液中都会造成灾难性的后果。因此，急需研究开发安全无毒的天然聚合物体系。

聚磷酸钙(CPP)是由磷酸二氢钙通过分子间缩聚反应而生成的，是一种无机聚合物。这种聚合物不同于一般的碳链有机高分子聚合物，CPP的聚合物主链以-P-O-P-为主，CPP具有无机材料的一般性能——高硬度和高强度，又有高分子材料的特点——大分子链对材料性能有重要影响。它既可以利用聚合物的特性，改变材料的聚合度等结构参数对其性能进行影响；也可以利用钙离子与-P-O-以离子键相互结合。近年来国内外的研究表明CPP在生理环境中具有较好的降解性能，更为重要的是其良好的生物相容性及成骨活性，这为解决骨修复和骨组织工程支架材料的可控降解问题提供了新思路。

从材料学与工程的观点，组织可视同细胞复合材料，它由具功能作用的细胞和其分泌的细胞外基质(ECMs)组成。ECMs提供细胞信息，细胞则指导ECMs的合成。ECMs是由蛋白质和糖胺聚糖(GAGs)构建的物理和化学交联网络。壳聚糖是β(1→4)键合D-葡糖胺残基和不同数目的无规N-乙酰基葡糖胺残基组成的线性多糖，其结构中的N-乙酰基葡糖胺存在于细胞外基质(ECMs)中的糖胺聚糖(GAGs)，如透明质酸中，因此壳聚糖的结构类似于糖胺聚糖。壳聚糖具有良好的生物相容性，可调节的生物降解性能，还能通过各种途径如相分离、纤维连接和溶液浇注等方法制备成具有不同微观形貌宏观形状，并且具有一定力学强度，适应不同部位的组织缺损修复要求的三维多孔支架。

海藻酸钠是从褐藻中分离出来的一种天然线性多糖，由1-4键合的β-D-甘露糖醛酸(M单元)和α-L-古洛糖醛酸(G单元)残基组成。因为其具有良好的生物相容性而被广泛的研究。海藻酸钠含有顺二醇结构，已有研究报道可以使用氧化顺二醇的方式加快高分子量的海藻酸盐的降解速率，并同时得到具有活性反应基团的醛基，有人更进一步的将氧化得到的醛基化海藻酸盐与明胶交联制备了一种水凝胶体系，用于药物控释，得到良好的效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的具有多孔结构，塑型方便，具有一定的力学强度和可控降解性，生物相容性优良的复合骨架材料——多醛基海藻酸钠交联聚磷酸钙/壳聚糖的复合支架。

本发明的另一目的在于提供一种制备多醛基海藻酸钠交联聚磷酸钙/壳聚糖的复合支架的方法，该制备方法工艺简单，易于控制。

本发明的目的还在于提供一种多醛基海藻酸钠交联聚磷酸钙/壳聚糖的复合材料在作为骨或软骨缺损修复及组织工程支架、药物缓释载体中的应用。

本发明提供的多醛基海藻酸钠交联聚磷酸钙/壳聚糖的复合支架，是由聚磷酸钙、壳聚糖和多醛基海藻酸钠为原料制备而成。所述原料的重量配比为，聚磷酸钙2-90％，壳聚糖2-90％，多醛基海藻酸钠4-10％。

在上述技术方案中，所述多醛基海藻酸钠可以是采用下述方法制备的多醛基海藻酸钠：

a、将海藻酸钠溶于蒸馏水配制成质量浓度为1-5％的溶液；

b、将高碘酸钠加入蒸馏水中，室温下避光搅拌，使其成为均一的溶液或过饱和溶液，；

c、将步骤b中的溶液，按照高碘酸钠的摩尔数与海藻酸钠单体单元的摩尔比在1∶3-3∶1之间的比例，倒入步骤a的溶液中，避光进行氧化反应；

d、待反应进行了12-24h后停止反应，加入与初始高碘酸钠等摩尔的乙二醇于反应液中，避光继续搅拌以终止反应；

e、用1-10倍于反应液体积的乙醇将海藻酸钠沉淀出来，所得沉淀加蒸馏水溶解，加入为海藻酸钠质量0.5-4倍的氯化钠，用等体积乙醇将海藻酸钠沉淀出来，重复2-5次；

f、沉淀经干燥即得到固体多醛基海藻酸钠。

步骤c所述的氧化程度可通过碘量滴定法测定反应液中残余高碘酸钠的浓度来计算得到，其中氧化程度(％)＝(被氧化的海藻酸钠的单体单元摩尔数/海藻酸钠的总的单体单元摩尔数)×100％。

上述所述的多醛基海藻酸钠交联聚磷酸钙/壳聚糖的复合支架，其制备方法主要包括如下步骤：

a、将多醛基海藻酸钠溶于蒸馏水或摩尔浓度为0.1-10mol/L PBS缓冲液配备质量浓度为2-20％的A液；

b、将壳聚糖溶于蒸馏水或体积分数为0.1-5％的醋酸溶液中，配制成质量浓度为0.5-8％的溶液，再加入与壳聚糖质量比为1∶9-9∶1的聚磷酸钙颗粒充分混合得到B液；

c、将A液和B液混合，使海藻酸钠分子链上的醛基和壳聚糖上的端氨基进行交联反应，使壳聚糖交联形成三维网状结构，交联反应1-30min，得到含聚磷酸钙的海藻酸钠交联壳聚糖的水凝胶；

d、将步骤c中制得的水凝胶于-20--85℃的温度预冻12-24h后，经冷冻干燥即可得到含聚磷酸钙颗粒的海藻酸钠交联壳聚糖的复合支架。

在上述制备含聚磷酸钙颗粒的海藻酸钠交联壳聚糖的复合支架的方法中，其步骤b所制备的B液中混合有生物活性组分或治疗药物。

在上述制备含聚磷酸钙颗粒的海藻酸钠交联壳聚糖的复合支架的方法中，其步骤c中的交联程度可通过茚三酮显色法测定支架材料中残余氨基的量来计算得到，其中交联程度(％)＝(1-交联后壳聚糖氨基浓度/未交联时壳聚糖氨基浓度)×100％。

本发明提供的多醛基海藻酸钠交联聚磷酸钙/壳聚糖的复合支架，可在作为骨或软骨缺损修复及组织工程支架、药物缓释载体材料中应用。

本发明提供的多醛基海藻酸钠交联聚磷酸钙/壳聚糖的复合支架是一种包含无机/有机相的复合支架，其主要组分的有机相多醛基海藻酸钠交联的壳聚糖基体，它们源于天然、安全无毒、有良好的生物相容性、生物降解性，表面存在细胞识别的信号，可为骨或软骨的再生和重建提供物理支架和最佳的化学环境。应用大分子作交联剂，形成网络结构能极大提高力学性能。无机增强相为聚磷酸钙，它的成分与人体骨组织的无机成分基本一致，并具有生物活性和可控降解性。

与现有技术的复合支架材料相比，本发明具有以下特点：

(1)本发明的复合支架材料为安全无毒的纯天然聚合物体系。多醛基海藻酸钠为源于海藻的天然多糖、壳聚糖为源于动物外壳的甲壳素，均为安全无毒的天然成分。以海藻酸钠为交联剂，克服了以往材料中小分子交联剂的毒性和安全性问题。聚磷酸钙的钙磷比与人体骨组织的无机成分类似，具有良好的生物相容性和可控降解性。

(2)本发明的复合支架材料为骨或软骨的再生和重建提供了最佳的物理化学环境。将无机聚磷酸钙颗粒均匀包埋在海藻酸钠共价交联壳聚糖的多孔三维网络中，模拟了天然骨组织的细胞外基质成分，使材料具有优异的生物相容性及可调的物理机械性能和降解性能。

(3)本发明的复合支架材料易于成型，可根据骨或软骨缺损部位扫描所得图像，制得相应形状的型材，与周围组织密切接触。并且，由于冷冻干燥前是凝胶态，可跟生物活性分子、治疗药物等均匀混合后再成型。

具体实施方式

参考下列实施例将更易于理解本发明，给出实施例是为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。在下面各实施例中，所涉及到的组分浓度、百分比和份数均为相应的质量浓度、质量百分比和质量份数。

实例1：

取海藻酸钠配成质量浓度为1％的水溶液，加入与海藻酸钠摩尔比为1∶1质量浓度为2％的高碘酸钠溶液避光氧化约24h后，加入为溶液体积1/10的乙二醇终止氧化反应。加入与海藻酸钠等质量的NaCl充分混合后加入乙醇使其沉淀析出。抽滤，用去离子水溶解产物，再用乙醇析出、抽滤，如此反复3次后真空干燥。最终得到白色产物。

CPP研磨，过筛，取粒径小于200目的粉末备用。将ADA(氧化度43.7％)溶解于0.1M PBS溶液中，配成质量浓度为10％的溶液备用。将壳聚糖溶解于醋酸溶液中，配成质量含量为10％的壳聚糖溶液。将溶液转入三颈瓶中，水浴加热约40℃左右搅拌，使壳聚糖完全溶解形成均一的高分子溶液。称取等量的CPP粉末，使用无水乙醇分散后，迅速加入到壳聚糖溶液中，然后升温至60℃左右搅拌，使CPP均匀分散。将ADA溶液均匀的加入到壳聚糖溶液中，高速搅拌。迅速将制备的CPP/CS/ADA凝胶转入到PE模具中。将填有凝胶混合物的模具转入冰箱中于-20℃冷冻，使固液相分离。之后，使用冷冻干燥机于压力约为0.5mmHg，-5℃左右的条件下干燥约24h，以完全除去溶剂。干燥完毕后，即得CPP/CS/ADA多孔支架。调整ADA的浓度，按照前述方法重复制备不同交联度的复合支架材料。

实例2：

取海藻酸钠配成质量浓度为2.5％的水溶液，加入与海藻酸钠摩尔比为1∶2质量浓度为1％的高碘酸钠溶液避光氧化约24h后，加入为溶液体积1/10的乙二醇终止氧化反应。加入为海藻酸钠质量2倍的NaCl充分混合后加入乙醇使其沉淀析出。抽滤，用去离子水溶解产物，再用乙醇析出、抽滤，如此反复3次后真空干燥。最终得到白色产物。

CPP研磨，过筛，取粒径介于200-300目之间的粉末备用。将ADA(氧化度43.7％)溶解于0.1M PBS溶液中，配成质量浓度为12％的溶液备用。将壳聚糖溶解于醋酸溶液中，配成质量浓度5％的壳聚糖溶液。将溶液转入三颈瓶中，水浴加热约40℃左右搅拌，使壳聚糖完全溶解形成均一的高分子溶液。称取等量的CPP粉末，使用无水乙醇分散后，迅速加入到壳聚糖溶液中，然后升温至约60℃搅拌，使CPP均匀分散。将ADA溶液均匀的加入到壳聚糖溶液中，高速搅拌。迅速将制备的CPP/CS/ADA凝胶转入到PE模具中。将填充有凝胶混合物的模具转入冰箱中于-85℃冷冻，使固液相分离。之后，使用冷冻干燥机于压力约为0.5mmHg，-5℃左右的条件下干燥约24h，以完全除去溶剂。干燥完毕后，即得CPP/CS/ADA多孔支架。调整ADA的浓度，按照前述方法重复制备不同交联度的复合支架材料。

实例3：

取海藻酸钠配成质量浓度为4％的水溶液，加入与海藻酸钠摩尔比为2∶1质量浓度为1％的高碘酸钠溶液避光氧化约24h后，加入为溶液体积1/10的乙二醇终止氧化反应。加入为海藻酸钠质量1/2倍的NaCl充分混合后加入乙醇使其沉淀析出。抽滤，用去离子水溶解产物，再用乙醇析出、抽滤，如此反复3次后真空干燥。最终得到白色产物。

CPP研磨，过筛，取粒径介于200-300目之间的粉末备用。将ADA(氧化度43.7％)溶解于0.2M PBS溶液中，配成质量浓度为8％的溶液备用。将壳聚糖溶解于醋酸溶液中，配成质量浓度为5％的壳聚糖溶液。将溶液转入三颈瓶中，水浴加热50℃左右搅拌，使壳聚糖完全溶解形成均一的高分子溶液。称取等量的CPP粉末，使用无水乙醇分散后，迅速加入到壳聚糖溶液中，然后升温至70℃左右搅拌，使CPP均匀分散。将ADA溶液均匀的加入到壳聚糖溶液中，高速搅拌。迅速将制备的CPP/CS/ADA凝胶转入到PE模具中。将填充有凝胶混合物的模具转入冰箱中于-20℃左右冷冻，使固液相分离。之后，使用冷冻干燥机于压力约为0.5mmHg，-5℃左右的条件下干燥约24h，以完全除去溶剂。干燥完毕后，即得CPP/CS/ADA多孔支架。调整ADA的浓度，按照前述方法重复制备不同交联度的复合支架材料。

实例4：

取海藻酸钠配成质量浓度为5％的水溶液，加入与海藻酸钠摩尔比为1∶3质量浓度为4％的高碘酸钠溶液避光氧化约12h后加入为溶液体积1/10的乙二醇终止氧化反应。加入为海藻酸钠质量3倍的NaCl充分混合后加入乙醇使其沉淀析出。抽滤，用去离子水溶解产物，再用乙醇析出、抽滤，如此反复3次后真空干燥。最终得到白色产物。

CPP研磨，过筛，取粒径大于300目的粉末备用。将ADA溶解于0.5M PBS溶液中，配成质量浓度为8％的溶液备用。将壳聚糖溶解于醋酸溶液中，配成质量浓度2％的壳聚糖溶液。将溶液转入三颈瓶中，水浴加热30℃左右搅拌，使壳聚糖完全溶解形成均一的高分子溶液。称取等量的CPP粉末，使用无水乙醇分散后，迅速加入到壳聚糖溶液中，然后升温至50℃左右搅拌，使CPP均匀分散。将ADA溶液均匀的加入到壳聚糖溶液中，高速搅拌。迅速将制备的CPP/CS/ADA凝胶转入到PE模具中。将填充有凝胶混合物的模具转入冰箱中于-20℃左右冷冻，使固液相分离。之后，使用冷冻干燥机于压力约为0.5mmHg，-5℃左右的条件下干燥约24h，以完全除去溶剂。干燥完毕后，即得CPP/CS/ADA多孔支架。调整ADA的浓度，按照前述方法重复制备不同交联度的复合支架材料。

Claims (7)

1.一种多醛基海藻酸钠交联聚磷酸钙/壳聚糖的复合支架，其特征在于由聚磷酸钙、壳聚糖和多醛基海藻酸钠为原料制备而成，原料的质量配比为聚磷酸钙2-90％，壳聚糖2-90％，多醛基海藻酸钠2-10％。

2.根据权利要求1所述的多醛基海藻酸钠交联聚磷酸钙/壳聚糖的复合支架，其特征在于所述的多醛基海藻酸钠为按照下述方法制备的多醛基海藻酸钠：

a、将海藻酸钠溶于蒸馏水配制成质量浓度为1-5％的溶液；

b、将高碘酸钠加入蒸馏水中，室温下避光搅拌，使其成为均-的溶液或过饱和溶液，；

c、将步骤b中的溶液，按照高碘酸钠的摩尔数与海藻酸钠单体单元的摩尔数比在1∶3-3∶1之间的比例，倒入步骤a的溶液中，避光进行氧化反应；

d、待反应进行了12-24h后停止反应，加入与初始高碘酸钠等摩尔的乙二醇于反应液中，避光继续搅拌以终止反应；

e、用1-10倍于反应液体积的乙醇将海藻酸钠沉淀出来，所得沉淀加蒸馏水溶解，加入海藻酸钠质量0.5-4倍的氯化钠，用等体积乙醇将海藻酸钠沉淀出来，重复2-5次；

f、沉淀经干燥即得到固体多醛基海藻酸钠。

3.根据权利要求2所述的多醛基海藻酸钠交联聚磷酸钙/壳聚糖的复合支架，其特征在于步骤c中氧化反应的程度可通过碘量滴定法测定反应液中残余高碘酸钠的浓度来计算得到，其中氧化程度(％)＝(被氧化的海藻酸钠单体单元的摩尔数/海藻酸钠的总的单体单元摩尔数)×100％。

4.一种关于权利要求1或2或3所述多醛基海藻酸钠交联聚磷酸钙/壳聚糖的复合支架的制备方法，主要包括如下步骤：

a、将多醛基海藻酸钠溶于蒸馏水或摩尔浓度为0.1-10mol/L PBS缓冲液配备质量浓度为2-20％的A液；

b、将壳聚糖溶于蒸馏水或体积分数为0.1-5％的醋酸溶液中，配制成质量浓度为0.5-8％的溶液，再加入与壳聚糖质量比为1∶9-9∶1的聚磷酸钙颗粒，充分混合得到B液；

c、将A液和B液混合，使海藻酸钠分子链上的醛基和壳聚糖上的端氨基进行交联反应，使壳聚糖交联形成三维网状结构，交联反应1-30min，得到含聚磷酸钙的海藻酸钠交联壳聚糖的水凝胶；

d、将步骤c中制得的水凝胶于-20--85℃的温度预冻12-24h后，经冷冻干燥即可得到多醛基海藻酸钠交联聚磷酸钙/壳聚糖的复合支架。

5.根据权利要求4所述的多醛基海藻酸钠交联聚磷酸钙/壳聚糖复合支架的制备方法，其特征在于步骤b所制备的B液中混合有生物活性组分或治疗药物。

6.根据权利要求4所述多醛基海藻酸钠交联聚磷酸钙/壳聚糖的复合支架的制备方法，其特征在于步骤c中交联反应的程度可通过茚三酮显色法测定支架材料中残余氨基的量来计算得到，其中交联程度(％)＝(1-交联后壳聚糖氨基浓度/未交联时壳聚糖氨基浓度)×100％。

7.权利要求1或2或3所述的多醛基海藻酸钠交联聚磷酸钙/壳聚糖的复合支架在制备作为骨或软骨缺损修复及骨组织工程支架、药物缓释载体材料中应用。