CN114874306B - 鸡蛋壳膜多肽组合物、制备方法及在防皱纹、防脱发中的应用 - Google Patents
鸡蛋壳膜多肽组合物、制备方法及在防皱纹、防脱发中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了鸡蛋壳膜多肽组合物、制备方法及在防皱纹、防脱发中的应用。该组合物包括如SEQ ID NO.1～11所示多肽中的至少一种。该多肽组合物具有明显的增殖和迁移活性促进作用，对人骨骼肌细胞的收缩功能具有抑制作用，促进毛囊再生，防治脱发的功能，具有在抗皱、抗衰老类和防脱发类化妆品或化妆品的中应用前景。
Description
技术领域
本申请涉及鸡蛋壳膜蛋白成分技术领域，尤其涉及鸡蛋壳膜多肽组合物、制备方法及在防皱纹、防脱发中的应用。
背景技术
鸡蛋壳膜是一类生物活性物质，主要由蛋白质组成，其中蛋白质主要以糖蛋白的形式存在为主，与细胞组织中的细胞膜结构相类似。除糖蛋白外，鸡蛋壳膜中还含有一定量的其他成分，主要包括胶原蛋白、角质蛋白、卵清蛋白、骨桥蛋白和溶菌酶等生物活性成分。鸡蛋壳膜蛋白质中多肽和氨基酸的含量较高，其中富含肌氨酸、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸等。这些氨基酸具有较好的抗氧化活性，也是动物优质毛发必不可少的营养成分。并且由于鸡蛋壳膜的组成成分和结构功能特征，目前己经将鸡蛋壳膜作为功能性成分应用于日用化工、医药、食品保健等多个领域。
发明内容
然而，进一步充分挖掘的鸡蛋壳膜的活性成分，充分开发其应用领域仍然具有十分重要的意义。
第一方面，本申请实施例公开了一种鸡蛋壳膜多肽组合物，包括如SEQ ID NO.1~11所示多肽中的至少一种。
第二方面，本申请实施例公开了一种防皱和防脱发组合物，其中，包括如SEQ IDNO.1~11所示的多肽中的至少一项，及如SEQ ID NO.1~11所示的多肽的美容或药学上可接受的盐，缀合物分子，以及至少一种美容或药学上接上的赋形剂或佐剂。
第三方面，本申请实施例公开了一种防皱和防脱发组合物，包含美容或药物有效量的至少一种如SEQ ID NO.1~11所示的多肽，美容或药学有效量的选自去角质剂、润湿剂、脱色或美白剂、原色素剂、抗糖化剂、一氧化氮合成酶抑制剂、刺激皮肤或表皮分子合成和/或防止它们降解的药剂、刺激纤维母细胞和/或角质细胞增生及刺激角质细胞分化的药剂、欲改善真皮-表皮交界处的药剂、皮肤舒缓剂、固化剂、抗大气污染和/或抗自由基药剂、作用于毛细血管循环和/或微循环的药剂、安定剂、抗炎剂、抗微生物剂、作用于细胞代谢的药剂、作用于毛细血管循环和/或微循环的药剂、维生素、螯合剂、可抗紫外线A和/或B的有机或矿物性光保护剂及其混合物的活性剂。
第四方面，本申请实施例公开了一种防皱和防脱发组合物纳米乳，按重量份数计包含2~8份肉豆蔻酸异丙酯、10~20份聚氧乙蓖麻油、12~18份聚氧乙烯醚(EL-40)、1~10份1,2-丙二醇、1~8份异丙醇和10~15份如SEQ ID NO.2、4~8和10~11所示多肽中的至少一种。
第五方面，本申请实施例公开了一种防皱和防脱发组合物纳米乳，按重量份数计包含2~8份肉豆蔻酸异丙酯、10~20份聚氧乙蓖麻油、12~18份聚氧乙烯醚(EL-40)、1~10份1,2-丙二醇、1~8份异丙醇和10~15份的等量份的SEQ ID NO.4~8所示的多肽混合物。
第六方面，本申请实施例公开了一种防皱和防脱发组合物纳米乳，按重量份数计包含2~8份肉豆蔻酸异丙酯、10~20份聚氧乙蓖麻油、12~18份聚氧乙烯醚(EL-40)、1~10份1,2-丙二醇、1~8份异丙醇和10~15份的等量份的SEQ ID NO.4~8和10~11所示的多肽混合物。
第七方面，本申请实施例公开了一种防皱和防脱发组合物纳米乳，按重量份数计包含2~8份肉豆蔻酸异丙酯、10~20份聚氧乙蓖麻油、12~18份聚氧乙烯醚(EL-40)、1~10份1,2-丙二醇、1~8份异丙醇和10~15份的等量份的SEQ ID NO.2、4~8和10~11所示的多肽混合物。
第八方面，本申请实施例公开了鸡蛋壳膜多肽组合物的制备方法，其中，包括以下步骤：
获得鸡蛋壳膜粉；
酸解，包括将所述鸡蛋壳膜粉用10m/v%的乙酸溶液配制成悬浊液，向悬浊液中加入终浓度为0.5m/v%的3-巯基丙酸，充分反应后，离心得到酸解液；
酶解，包括取酸解液采用酶制剂进行酶解以得到鸡蛋壳膜多肽粗品的步骤，所述酶制剂包括α-糜蛋白酶和胶原酶；
纯化，包括将所述鸡蛋壳膜多肽粗品进行Sephadex G-25纯化和RP-HPLC分离纯化的步骤。
在一些实施例中，所述酶解步骤包括：第一次酶解和第二次酶解，所述第一次酶解包括：
将所述酸解液调pH值至5.0~5.5析出后离心，取沉淀再次用10%的乙酸再次将其溶解，透析，取出，冷冻干燥得到冻干粉；
将冻干粉用0.7m/v%生理盐水调配成50mg/mL的溶液，向其中加入第一酶制剂，加酶量为10000~15000U/mL处理1~2.5h，经灭酶处理和离心后，取上清液，浓缩，冷冻干燥；其中，使用的第一酶制剂包含碱性蛋白酶200000U/g，胃蛋白酶30000U/g和木瓜蛋白酶100000U/g；
所述第二酶解包括：将所述第一次酶解得到的冻干粉用0.7m/v%生理盐水成50mg/mL的溶液，向其中加入第二酶制剂，加酶量为10000~15000U/mL处理1~2.5h，经灭酶处理和离心后，取上清液，浓缩，冷冻干燥，即可得到的鸡蛋壳膜多肽粗品；其中使用的第二酶制剂包含α-糜蛋白酶100000U/g和胶原酶150000U/g。
第九方面，本申请实施例公开了第一方面所述的鸡蛋壳膜多肽组合物、或第八方面所述的制备方法制得的鸡蛋壳膜多肽组合物在制备防皱纹、防脱发化妆品中的应用。
本申请实施例通过对鸡蛋壳膜粉进行酶解制得了11种多肽，通过抗菌实验证实了此11种多肽对15种常见致病菌的具有不同程度的抑菌效果，并且细胞实验证实了其中9种多肽对皮肤成纤维细胞具有明显的增殖和迁移活性促进作用，另外还对人骨骼肌细胞的收缩功能具有抑制作用，提示该鸡蛋壳膜多肽可通过抑制人骨骼肌细胞收缩，达到减少肌肉收缩，从而实现减少皱纹诞生的目的。
本申请实施例进行一步通过动物实验，将制备的11中鸡蛋壳膜多肽中部分多肽进行组合制得了一种防皱和防脱发纳米乳，通过皮肤修复实验和脱发修复实验证实，本申请实施例以鸡蛋壳膜多肽制得的纳米如具有明显的诱导伤口愈合，促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，促进成纤维细胞中的胶原沉积，具有明显皮肤组织修复功能；并且还有促进毛囊再生，防治脱发的功能，由此提示，本申请实施例制得的鸡蛋壳膜多肽不仅具有在抗皱、抗衰老类化妆品的中应用前景，还具有在防脱发类化妆品或保健品中的应用前景。
附图说明
图1为本申请实施例提供的鸡蛋壳膜多肽粗品的Sephadex G-25纯化洗脱图。
图2为图1中的0.8~1.4BV洗脱峰对应组分的RP-HPLC色谱图。
图3为图1中的1.8~2.1BV洗脱峰对应组分的RP-HPLC色谱图。
图4为图1中的2.4~2.8BV洗脱峰对应组分的RP-HPLC色谱图。
图5为图2中保留时间21~24min的洗脱峰对应组分进一步的RP-HPLC色谱图。
图6为本申请实施例提供的鸡蛋壳膜多肽对HSF细胞迁移结果图。
图7为本申请实施例提供的鸡蛋壳膜多肽对HSMCs的收缩抑制结果图。
图8为本申请实施例提供的鸡蛋壳膜多肽对大鼠皮肤组织的毛囊再生作用结果图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
鸡蛋壳膜多肽的制备
1、鸡蛋壳膜粉的制备
新鲜鸡蛋壳，剥离蛋壳膜，置于70℃烘箱烘烤6h后，用粉碎机粉碎，80目过筛，即可制得鸡蛋壳膜粉。
2、酸解
将上述的称取上述制得的鸡蛋壳膜粉，用乙酸进行酸解。一个具体的实施例中，准确称取上述制得的鸡蛋壳膜粉末15g，按固液比为1:100的比例加入至150mL 10%(m/v)的乙酸溶液中，配制成鸡蛋壳膜悬浊液，向悬浊液中加入3-巯基丙酸，使其浓度分别为0.5%(m/v)，置于90℃的恒温震荡器中连续反应8h，反应物经8000 r/min离心10min，取沉淀，用0.7m/v%生理盐水定容成200mL后，采用考马斯亮蓝G-250法测定溶液中的蛋白质含量。
3、酶解
（1）第一次酶解
将上述酸解得到的鸡蛋壳膜蛋白的溶液调pH值至5.0~5.5左右，室温静置10 min，以8000 r/min离心10 min，弃上清得乳白色蛋白质沉淀。用10%的乙酸再次将其溶解，透析，取出，冷冻干燥，得到冻干粉。
将冻干粉配置用0.7m/v%生理盐水成50mg/mL的溶液，取50mL，向其中加入第一酶制剂，加酶量为10000~15000U/mL处理1~2.5h，酶解完成后，于90℃灭酶处理10min，于5000r/min离心10min，取上清液，浓缩，冷冻干燥；其中，使用的第一酶制剂包含碱性蛋白酶(7.0-14.0U/mg，P8038，Sigma-Aldrich)200000U/g，胃蛋白酶(1.07185，Sigma-Aldrich)30000U/g和木瓜蛋白酶(P4762，≥10U/mg，Sigma-Aldrich)100000U/g。
（2）第二次酶解
具体包括：将上述的冻干粉用0.7m/v%生理盐水成50mg/mL的溶液，取50mL，向其中加入第二酶制剂，加酶量为10000~15000U/mL处理1~2.5h，酶解完成后，于90℃灭酶处理10min，于5000r/min离心10min，取上清液，浓缩，冷冻干燥；即可得到的鸡蛋壳膜多肽粗品。其中使用的第二酶制剂包含α-糜蛋白酶（≥40 units/mg protein，C3142，Sigma-Aldrich）100000U/g和胶原酶（≥125 CDU/mg solid，C0130，Sigma-Aldrich）150000U/g。
4、纯化
本申请进一步采用硫酸铵分级沉淀和Sephadex G-25对上述制得的鸡蛋壳膜多肽粗品进行进一步纯化，得到分离的多肽产品，并对多肽产品进行HPLC检测。
（1）Sephadex G-25纯化
采用Sephadex G-25填料（Sigma-Aldrich，G2580）湿法填充2.0cm×35cm的层析柱，柱体积为60mL，取上述的鸡蛋壳膜多肽粗品，溶解于去离子水中制成100mg/mL的供试品溶液，取2.0mL上样静置30min后，以0.5 mL/min流速洗脱，于280nm检测，收集洗脱峰。结果如图1所示。由图1可知，在洗脱图谱中在0.8~1.4BV、1.8~2.1BV、2.4~2.8BV处共有3个洗脱峰。可进行多次Sephadex G-25纯化，收集上述三个洗脱峰合并，分别浓缩，冷冻干燥。
（2）RP-HPLC分离纯化
将经过上述Sephadex G-25纯化得到的3个洗脱峰组分的冻干粉进一步进行RP-HPLC分离纯化，纯化条件为：分离柱为SepaxHP-C18柱（美国赛分），洗脱液A为0.1%三氟乙酸(TFA)/H2O，洗脱液B为0.1%三氟乙酸(TFA)/乙腈；流动相为25% B，流速为1.0 mL/min，检测波长为215nm，柱温箱温度为40℃。每次上样100μL，收集洗脱峰，用质谱仪鉴定洗脱峰中物质的分子量。若首次分离无法得到单独的分离峰，需要将流动相洗脱程序调整为10~35min，B相从10%梯度洗脱至40%。
（3）质谱分析
供试品：RP-HPLC的洗脱峰冻干样品。
在MALDI-TOF/TOF Mass质谱仪上进行一级质谱(MS)和串联质谱(MS/MS)分析。CCA基质：0.1%TFA、50%ACN、50%H2O。取1μL样品与3μLCCA基质混合均匀，取0.5μL混合液在按规律分别在板上点样，风干后送入机内检测。MS:正离子检测模式，离子源加速电压为20kV，N2激光波长337nm，脉冲宽度3ns，离子延迟提取150ns，真空度4×10-7 Torr。转化MS/MS模式后，将满足MS的离子进行串联质谱分析，MS/MS模式的m/z范围为0~3000。
小分子肽的鉴定用Mascot软件的串级质谱数据和序列标签进行搜索，并依据NCBI中公开的鸡蛋壳膜蛋白氨基酸序列进行比对分析得到。
由图2可知为图1中0.8~1.4BV洗脱峰对应组分的 RP-HPLC图谱，由于其在保留时间21~24min中有多个融合的洗脱峰，依次进行一步采用洗脱手段进行分离，结果如图5所示。如图3、4分别为图1中1.8~2.1BV、2.4~2.8BV洗脱峰对应组分的RP-HPLC图谱。由此总共得到11个色谱峰，对应组分进行多次收集、浓缩和冻干，并进行质谱检测后与已知鸡蛋壳膜蛋白氨基酸序列进行比对分析得出该11个片段的氨基酸序列如表1所示。
表1
细胞实验及抗菌实验
一、材料与方法
1、抗菌活性检测
参照“曹凤仪，马港庆，秦琦，梅林，朱根兴；碱性氨基酸-PAF26衍生多肽的抗菌性能研究[J].化学与生物工程，2021.05.17.”公开的方法检测上述实施例制得的F1~F19鸡蛋壳膜多肽的抗菌性能。
实验菌株：肠外致病性大肠杆菌（E.coli EXPEC，货号BMZ134803，明舟生物），肠沙门氏菌肠炎亚种（S.e.subsp.货号ZKCC-1053，北京中科质检生物技术有限公司），金黄色葡萄球菌（S.aureus,货号ZKCC-55，北京中科质检生物技术有限公司），溶血性葡萄球菌（S.h,B94695，明舟生物），表皮葡萄球菌（S.e,货号BMZ123772，明舟生物），枯草芽孢杆菌（B.sub，货号B98052，明舟生物），粪肠球菌（E.fae，货号BMZ121811，明舟生物），滕黄微球菌（M.lut，货号BMZ116117，明舟生物），溶血性链球菌（Strep.h,货号B9077，明舟生物）、绿色链球菌（Strep.v,货号B80796，明舟生物）、粪链球菌（Strep.f,货号B81864，明舟生物）、酿脓链球菌（Strep.p,货号B84159，明舟生物）、绿脓杆菌（Chry.v,货号CIP 108934，明舟生物）、变形杆菌（Pro.v,货号BMZ124689，明舟生物）和副溶血性弧菌（Vib.p,货号B87538，明舟生物）。
在96孔板中预先加入己经预热的LB ( Luria-Bertani)液态培养基，然后在各孔中接入上述细菌，将多肽（F1~F11）等比稀释后分别加入各孔之中，置于恒温摇床中37℃培养12h后，使用酶标仪检测600nm的OD值，以未接种菌株的培养孔作为对照，当OD600nm值超过空白孔0.2以以上时，说明无抑菌性能。
2、细胞培养
将冻存在液氮罐中的皮肤成纤维细胞（HSF，货号HTX2132，ATCC）取出，放入预热的37℃恒温水浴锅中迅速搅动融化，用酒精棉擦拭冻存管表面，然后在超净工作台中将细胞从冻存管中转移至离心管中1000 rpm离心5 min，弃去上清液，使用培养液将细胞重新悬浮，并转移至培养瓶中，加入5mL含10%FBS的DMEM培养液，放入细胞培养箱中，37℃、5% CO2饱和湿度培养至细胞融合度至80%，弃除原有培养基，使用常温的PBS洗涤细胞两次，用0.25%胰蛋白酶+0.25% EDTA（Gibco）溶液按照1mL/25cm2加入细胞培养瓶中将细胞消化，需使得胰酶溶液能够将细胞培养瓶底部的细胞全部覆盖住，将细胞放入培养箱中37℃保持2~3 min，然后在显微镜下观察，当细胞皱缩变圆，且逐个分离开时，轻轻拍打培养瓶，使细胞全部脱落，此时加入适量含血清的培养液终止胰蛋白酶消化作用，然后用移液器反复吹打，使得聚团的细胞全部分散成单个悬浮细胞，按照1:3的比例转移至新的培养瓶中，并将每个培养瓶中的培养液补足至5 mL做好标记，继续放入细胞培养箱中培养，培养条件同上。
3、细胞迁移活性检测
将对数生长期的HSF细胞，分别以0.25%胰蛋白酶消化，并用含10%胎牛血清和200μg/mL鸡蛋壳膜多肽F1~F11其中一种的培养液制成细胞悬液，按1/106个/孔的密度接种到6孔板，置于37℃、5% CO2培养条件下培养至细胞长满，吸弃培养液，PBS洗涤1次。用20μL无菌枪头在每个试验孔中央划一隔离线，小心洗去培养液，并用PBS吹洗几次，洗去划痕产生的细胞团，使划痕边缘整齐。小心吸除PBS后，加入无血清的新鲜培养基和适当浓度的样品，显微镜下拍照后。继续置于细胞培养箱中培养。培养过程中，每隔12h观察一次，并拍照记录。
4、细胞增殖活性检测
采用MTT法检测人皮肤成纤维细胞(HSF)的增殖情况。实验组：将上述实施例制得的鸡蛋壳膜多肽F1~F11分别溶于无血清普通高糖培养DMEM（含100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素）中，使得F1~F11的浓度均为200μg/mL，以作为HSF细胞培养的培养液。对照组：将培养液添加至96孔板(每孔2 × 104个/孔)的细胞中，以无血清DMEM培养基(不含F1~F11)作为对照。将实验组和对照组分别于37℃、5% CO2环境中培养24 h后，每孔加入2μL 5 mg/mL MTT溶液，继续培养4h，最后将细胞溶解于200μL的DMSO溶液中，于酶标仪上测定570 nm处的吸光值。计算细胞增殖率=(实验孔OD570－对照孔OD570)/对照孔OD570×100%。
5、肌细胞收缩检测
使用Cell Biolabs公司的细胞收缩检测试剂盒(Collagen-based ContractionAssay Kit, CBA-201)评估肌肉细胞的收缩性。实验方法步骤包括：
（1）将人骨骼肌细胞(HSMCs，美国ATCC)在骨骼肌细胞培养基(普诺赛公司)中，37℃，5% CO2条件下培养，将采集的细胞进行重悬，使细胞终浓度为106个细胞/mL培养基。
（2）取100μL细胞悬液与400μL预冷的胶原凝胶溶液（型号5074，AdvancedBioMatrix）混合后转入至24孔板中，于37℃孵育1h；当胶原聚合后，向凝胶晶格中添加1.0mL培养基，继续培养48 h后。
（3）将上述步骤（2）培养48h后的细胞分为11组（实验组），在释放收缩基质之前，各组分别用浓度为100μmol/L的F1~F11多肽溶液处理细胞1 h，24 h后用直尺测量胶原凝胶大小的变化；设置对照组，将步骤（2）处理后的细胞作为阴性对照。计算各组实验人骨骼肌细胞的收缩率(mm=释放前胶原凝胶的直径（对照组）－释放24 h后胶原凝胶的直径（实验组）。
6、统计学分析
所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用SPSS13.0软件处理数据，并对数据进行多重比较和显著性差异标记。
二、结果
本实验以F1~F11浓度达到200μg/mL的观察的结果如表2所示。
表2 200μg/mL
表2示出了本申请实施例制得的鸡蛋壳膜多肽F1~F11对15种常见致病菌的抑菌效果，其中“+”表示有200μg/mL是有抑菌作用，“—”表示有200μg/mL是无抑菌作用。由表2可知，F2~F8、F10和F11具有更加广谱的抑菌范围。
200μg/mL F1~F11的培养液对于HSF细胞迁移活性检测如图6所示，在划痕区域中除了200μg/mL F1和200μg/mL F9，其他9种鸡蛋壳膜多肽与HSF细胞共培养后，在划痕区域中可见明显的HSF细胞生长，由此可说明此9种鸡蛋壳膜多肽具有明显的促进HSF细胞迁移的活性。
表3 200μg/mL
由表3可知，F2和F11单独对HSF细胞的增殖率最高，而F1和F9单独对HSF细胞的增殖率最低。结果如图7和表3所示，F2、F8和F10的收缩率较高，其他的鸡蛋壳膜多肽的收缩率相对降低。但均说明本申请实施例制得的鸡蛋壳膜多肽对人骨骼肌细胞的收缩功能均具有一定的抑制作用，提示该鸡蛋壳膜多肽可通过抑制人骨骼肌细胞收缩，达到减少肌肉收缩，从而实现减少皱纹诞生的目的。
防皱和防脱发组合物及动物实验
为进一步验证本申请实施例制得的鸡蛋壳膜多肽在抗皱纹等美容和化妆品领域的应用，本申请实施例还提供了一种防皱和防脱发组合物，所述组合物包括上述实施例制得的鸡蛋壳膜多肽组合物，包括如SEQ ID NO.1~11所示的多肽中的至少一项，及如SEQ IDNO.1~11所示的多肽的美容或药学上可接受的盐，缀合物分子，以及至少一种美容或药学上接上的赋形剂或佐剂。
在一些实施例中，所述多肽是包含在美容或药学上可接受的持续释放系统或选自脂质体、毫胶囊、微胶囊、纳米胶囊、海绵、囊胞、微团、脂球、微乳液、纳米乳液、毫颗 粒、微颗粒和纳米颗粒的载体中。
在一些实施例中，所述多肽是吸附在美容或药学上可接受的选自滑石、皂粘土、硅石、淀粉或麦芽糊精中的有机聚合物或固相矿物质载体上。
为此，本申请实施例还公开了一种防皱和防脱发组合物，包含美容或药物有效量的至少一种如SEQ ID NO.1~11所示的多肽，美容或药学有效量的选自去角质剂、润湿剂、脱色或美白剂、原色素剂、抗糖化剂、一氧化氮合成酶抑制剂、刺激皮肤或表皮分子合成和/或防止它们降解的药剂、刺激纤维母细胞和/或角质细胞增生及刺激角质细胞分化的药剂、欲改善真皮-表皮交界处的药剂、皮肤舒缓剂、固化剂、抗大气污染和/或抗自由基药剂、作用于毛细血管循环和/或微循环的药剂、安定剂、抗炎剂、抗微生物剂、作用于细胞代谢的药剂、作用于毛细血管循环和/或微循环的药剂、维生素、螯合剂、可抗紫外线A和/或B的有机或矿物性光保护剂及其混合物的活性剂。
本申请实施例公开的防皱和防脱发组合物对象可被应用于需要治疗或照顾的身体区域，通过涂抹、蒸气包裹或包覆的方式或通过离子透入法的方式以实现更多的有效成分穿透的目的。施用区域是具有表情纹的前额区域以及眉毛之间区域、嘴部周围和/或眼睛周围的皱纹及细纹，以及头皮部位。
本申请实施例公开的防皱和防脱发组合物可包含或可与止痛化合物和/或抗炎化合物组合给予，其目的是减少敏感性皮肤的肿胀及刺激。类固醇型化合物诸如氢化可的松、非类固醇型化合物诸如对乙酰氨基酚或乙酰水杨酸或具有内在止痛及抗炎活性的天然提取物或精油。
因此，本申请实施例公开的其它方面涉及至少一种通式(I)的肽在制备治疗那 些哺乳类中(特别是人)需要神经元胞吐调节的病症的美容或药物组合 物中的用途。本发明的其它方面涉及至少一种SEQ ID NO.1~11所示的多肽在制备用于治疗、清洁或照顾皮肤的防皱纹和/或防脱发化妆品组合物中的用途。
为进一步对验证本申请实施例制得的鸡蛋壳膜多肽在防皱和防脱发中的应用，本申请实施例还公开了一种防皱和防脱发组合物纳米乳，按重量份数计包含2~8份肉豆蔻酸异丙酯、10~20份聚氧乙蓖麻油、12~18份聚氧乙烯醚(EL-40)、1~10份1,2-丙二醇、1~8份异丙醇和10~15份至少一种SEQ ID NO.1~11所示的多肽。其中，术语“份”仅指重量份，用于表示各组分之间的配比，不对各组分的绝对重量进行限定，可以是0.0001~1000kg之间或者其他重量范围内的任意重量。
为此，本申请实施例还公开了该防皱和防脱发组合物纳米乳的制得方法，具体包括分别制得油相和水相，油相包括上述重量配比的肉豆蔻酸异丙酯、聚氧乙蓖麻油、聚氧乙烯醚、1,2-丙二醇和异丙醇充分混合后作为油相，按照上述配方量称取至少一种SEQ IDNO.1~11所示的多肽用纯水溶解后（浓度为10~25wt%）即作为水相，将油相溶液混入水相中，充分搅拌后，即可制得乳液。
一、材料与方法
1、实验动物
SD大鼠，凯学生物科技（上海）有限公司，250g左右，正常饮食和饲养条件。
2、供试品
一个具体的防皱和防脱发组合物纳米乳的实施例中，按重量份计其包含肉豆蔻酸异丙酯4.5%，聚氧乙蓖麻油17.5%、聚氧乙烯醚15.8%，1,2-丙二醇质量比为5.5% ，异丙醇6.5%，至少一种SEQ ID NO.1~11所示的多肽14 wt%，余量为水。更加具体的防皱和防脱发组合物纳米乳作为动物实验的供试品，其具体组成可见表4，其中，各实施例和对比例仅仅区别在于鸡蛋壳膜多肽的不同，并且其他组分和重量配比均相同。
表4
3、皮肤修复实验
SD大鼠，麻醉后，将大鼠背部皮肤的毛剔除干净，再用75%的酒精擦拭皮肤消毒，最后以大鼠脊柱为中心线，用打孔器在大鼠背部左右两边的皮肤穿出两个直径为6 mm大小相同且位置对称的创面作为模型区，去除全层皮肤。术后将大鼠置于鼠笼中，并将室内温度适当调高直至麻醉效果消失，大鼠苏醒过来。
将带有模型区的SD大鼠分为模型组、实验组和阳性对照组，实验组分别按照表4在模型区涂抹实施例1~3和对比例1~4分别提供的防皱和防脱发组合物纳米乳（每天100mg），模型组大鼠不做处理。
4、皮肤组织切片和染色
直至创伤完全愈合为止，将皮肤修复实验中，各组大鼠的模型区皮肤取样，制作石蜡切片，经HE染色后置入光镜拍照后，利用Image Pro Plus测量出皮肤组织中的肉芽组织厚度和上皮化百分率。
对石蜡切片进行免疫组化检测：将石蜡切片3 mm范围内，在封闭内源性过氧化酶和非特异性结合后滴加抗体anti-a SMA ( Abcam )常温下，过夜孵育后，在室温下用山羊血清IgG ( Abcam)孵育1h。阴性对照使用不含抗体的缓冲液进行处理。 a-平滑肌动蛋白(a-SMA)是平滑肌细胞分化的标记物，用来标记肌成纤维细胞，肌成纤维细胞可被染成了棕色，利用Image Pro Plus检测视图中棕色面积可以间接检测肉芽组织中a-SMA的表达量和肌成纤维细胞含量；同时用Masson Trichrome法染色，胶原束成蓝色，根据蓝色面积评估模型区皮肤组织中的胶原蛋白量。
5、防脱发实验
将SD大鼠，将石蜡和松香按照体积比1:1进行混合加热融化后，冷却至适宜的温度，均匀的涂在大鼠背部，然后继续待胶体凝固后快速揭去，以去除大鼠的背毛，形成模型区，模型区面积为2cm×2cm。
将带有模型区的SD大鼠分为模型组和试验组。模型组造模后不给药，正常饮食。试验组SD大鼠在模型区每日涂抹200mg，连续给药30日。取各组大鼠，处死，取各组大鼠背部相同表面积大小脱毛区的皮肤，将皮肤表皮的毛发用手术刀刮去，精密称重，分析大鼠毛发质量情况；取模型区皮肤，制作石蜡切片，观察大鼠皮肤组织，200倍视野下计数三个不重叠区域毛囊数量，取平均值，代表动物毛囊数量，并进行分析。
6、皮肤刺激性/腐蚀性检测
根据《化妆品安全技术规范》2015年版中毒理学试验方法中的皮肤刺激性/腐蚀性试验方法检测上述供试品对SD大鼠的刺激性/腐蚀性标准进行评分。
7、统计学分析
所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用SPSS13.0软件处理数据，并对数据进行多重比较和显著性差异标记。
二、结果
表5
皮肤修复实验中，再给予带有模型区皮肤防皱和防脱发组合物纳米乳后，各组大鼠的伤口愈合时间平均达到10天左右，表5中列出了10天后各组大鼠模型区愈合后的上皮化率和肉芽组织厚度。由表5可知，相对正常组，模型组大鼠模型区皮肤的上皮化率和肉芽组织厚度均显著降低，而实施例1~3提供的防皱和防脱发组合物纳米乳对模型区的愈合情况优于对比例1~4。
另外，表5还示出10天后后各组大鼠模型区愈合的a-SMA表达和胶原沉积情况。由表5可知，相对于正常组，模型组大鼠模型区皮肤的a-SMA表达和胶原含量均显著降低，而实施例1~3提供的防皱和防脱发组合物纳米乳对模型区的作用后，能够明显诱导伤口愈合后的a-SMA，促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，促进成纤维细胞中的胶原沉积，具有明显皮肤组织修复功能，且效果优于对比例1~4。
表6
图8示出了各组大鼠模型区的HE染色图，图中箭头类型区域为毛囊。表6示出防脱发实验中各组大鼠模型区愈合的毛发重量、毛囊数量和皮肤刺激性评分。结果可知，相对于模型组，实施例1~3提供的防皱和防脱发组合物纳米乳能够促进大鼠模型区毛囊再生，并保护毛囊，从而使得毛发重量显著高于模型组和对比例1~4。
综上所述，本申请实施例通过对鸡蛋壳膜粉进行酶解制得了11种多肽，通过抗菌实验证实了此11种多肽对15种常见致病菌的具有不同程度的抑菌效果，并且细胞实验证实了其中9种多肽对皮肤成纤维细胞具有明显的增殖和迁移活性促进作用，另外还对人骨骼肌细胞的收缩功能具有抑制作用，提升该鸡蛋壳膜多肽可通过抑制人骨骼肌细胞收缩，达到减少肌肉收缩，从而实现减少皱纹诞生的目的。
本申请实施例进行一步通过动物实验，将制备的11中鸡蛋壳膜多肽中部分多肽进行组合制得了一种防皱和防脱发纳米乳，通过皮肤修复实验和脱发修复实验证实，本申请实施例以鸡蛋壳膜多肽制得的纳米如具有明显的诱导伤口愈合，促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，促进成纤维细胞中的胶原沉积，具有明显皮肤组织修复功能；并且还有促进毛囊再生，防治脱发的功能，由此提示，本申请实施例制得的鸡蛋壳膜多肽不仅具有在抗皱、抗衰老类化妆品的中应用前景，还具有在防脱发类化妆品或保健品中的应用前景。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种鸡蛋壳膜多肽组合物，包括如SEQ ID NO.1~11所示多肽中的至少一种。
2.一种防皱和防脱发组合物，其中，所述组合物选自以下三组中的至少一项：
（1）SEQ ID NO.4~8所示的多肽混合物；
（2）SEQ ID NO.4~8和10~11所示的多肽混合物；
（3）SEQ ID NO.2、4~8和10~11所示的多肽混合物；
及上述多肽的美容或药学上可接受的盐，以及至少一种美容或药学上接受的赋形剂或佐剂。
3.一种防皱和防脱发组合物，包含美容或药物有效量的多肽混合物，其中所述组合物选自以下三组中的至少一项：
（1）SEQ ID NO.4~8所示的多肽混合物；
（2）SEQ ID NO.4~8和10~11所示的多肽混合物；
（3）SEQ ID NO.2、4~8和10~11所示的多肽混合物；
以及美容或药学有效量的选自去角质剂、润湿剂、脱色或美白剂、原色素剂、抗糖化剂、一氧化氮合成酶抑制剂、刺激皮肤或表皮分子合成和/或防止它们降解的药剂、刺激纤维母细胞和/或角质细胞增生及刺激角质细胞分化的药剂、欲改善真皮-表皮交界处的药剂、皮肤舒缓剂、固化剂、抗大气污染和/或抗自由基药剂、作用于毛细血管循环和/或微循环的药剂、安定剂、抗炎剂、抗微生物剂、作用于细胞代谢的药剂、维生素、螯合剂、可抗紫外线A和/或B的有机或矿物性光保护剂及其混合物的活性剂。
4.一种防皱和防脱发组合物纳米乳，按重量份数计包含2~8份肉豆蔻酸异丙酯、10~20份聚氧乙蓖麻油、12~18份聚氧乙烯醚EL-40、1~10份1,2-丙二醇、1~8份异丙醇和10~15份如SEQ ID NO.2、4~8和10~11所示多肽中的至少一种，余量为水。
5.一种防皱和防脱发组合物纳米乳，按重量份数计包含2~8份肉豆蔻酸异丙酯、10~20份聚氧乙蓖麻油、12~18份聚氧乙烯醚EL-40、1~10份1,2-丙二醇、1~8份异丙醇和10~15份的等量份的SEQ ID NO.4~8所示的多肽混合物，余量为水。
6.一种防皱和防脱发组合物纳米乳，按重量份数计包含2~8份肉豆蔻酸异丙酯、10~20份聚氧乙蓖麻油、12~18份聚氧乙烯醚EL-40、1~10份1,2-丙二醇、1~8份异丙醇和10~15份的等量份的SEQ ID NO.4~8和10~11所示的多肽混合物，余量为水。
7.一种防皱和防脱发组合物纳米乳，按重量份数计包含2~8份肉豆蔻酸异丙酯、10~20份聚氧乙蓖麻油、12~18份聚氧乙烯醚EL-40、1~10份1,2-丙二醇、1~8份异丙醇和10~15份的等量份的SEQ ID NO.2、4~8和10~11所示的多肽混合物，余量为水。
8.权利要求1所述的鸡蛋壳膜多肽组合物的制备方法，其中，包括以下步骤：
获得鸡蛋壳膜粉；
酸解，包括将所述鸡蛋壳膜粉用10m/v%的乙酸溶液配制成悬浊液，向悬浊液中加入终浓度为0.5m/v%的3-巯基丙酸，充分反应后，离心得到酸解液；
酶解，包括取酸解液采用酶制剂进行酶解以得到鸡蛋壳膜多肽粗品的步骤，所述酶制剂包括α-糜蛋白酶和胶原酶；
纯化，包括将所述鸡蛋壳膜多肽粗品进行Sephadex G-25纯化和RP-HPLC分离纯化的步骤；
其中，所述酶解步骤包括：第一次酶解和第二次酶解，所述第一次酶解包括：
将所述酸解液调pH值至5.0~5.5析出后离心，取沉淀再次用10%的乙酸再次将其溶解，透析，取出，冷冻干燥得到冻干粉；
将冻干粉用0.7m/v%生理盐水调配成50mg/mL的溶液，向其中加入第一酶制剂，加酶量为10000~15000U/mL处理1~2.5h，经灭酶处理和离心后，取上清液，浓缩，冷冻干燥；其中，使用的第一酶制剂包含碱性蛋白酶200000U/g，胃蛋白酶30000U/g和木瓜蛋白酶100000U/g；
所述第二次酶解包括：将所述第一次酶解得到的冻干粉用0.7m/v%生理盐水调配成50mg/mL的溶液，向其中加入第二酶制剂，加酶量为10000~15000U/mL处理1~2.5h，经灭酶处理和离心后，取上清液，浓缩，冷冻干燥，即可得到的鸡蛋壳膜多肽粗品；其中使用的第二酶制剂包含α-糜蛋白酶100000U/g和胶原酶150000U/g。
9.权利要求2或3所述的防皱和防脱发组合物在制备防皱纹、防脱发化妆品中的应用。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101649341A (zh) * | 2009-09-04 | 2010-02-17 | 黄继红 | 一种从禽蛋壳膜中提取蛋白肽的方法 |
| CN105296583A (zh) * | 2014-07-11 | 2016-02-03 | 淮安鸿玛生物科技有限公司 | 一种鸡蛋膜蛋白多肽的生产方法及其应用 |
| CN108707638A (zh) * | 2018-04-23 | 2018-10-26 | 华中农业大学 | 蛋壳膜酶解制备抗氧化多肽的方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040180025A1 (en) * | 2003-03-12 | 2004-09-16 | New Life Resources, Llc | Therapeutic, nutraceutical and cosmetic applications for eggshell membrane and processed eggshell membrane preparations |
| CN101805773B (zh) * | 2010-03-25 | 2012-07-18 | 淮安鸿玛生物科技有限公司 | 鸡蛋膜蛋白的生产方法 |
| US20140363418A1 (en) * | 2013-06-10 | 2014-12-11 | Molecular Biology International, Inc. | Method of producing collagen from hydrolyzed egg membrane |
| WO2020150332A1 (en) * | 2019-01-15 | 2020-07-23 | University Of Massachusetts | Eggshell particle containing hydrogels and prepolymer compositions for biomedical applications |
-
2022
- 2022-05-11 CN CN202210510137.6A patent/CN114874306B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101649341A (zh) * | 2009-09-04 | 2010-02-17 | 黄继红 | 一种从禽蛋壳膜中提取蛋白肽的方法 |
| CN105296583A (zh) * | 2014-07-11 | 2016-02-03 | 淮安鸿玛生物科技有限公司 | 一种鸡蛋膜蛋白多肽的生产方法及其应用 |
| CN108707638A (zh) * | 2018-04-23 | 2018-10-26 | 华中农业大学 | 蛋壳膜酶解制备抗氧化多肽的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Chemiluminescence evaluation of antioxidant activity and prevention of DNA damage effect of peptides isolated from soluble eggshell membrane protein hydrolysate;Xi Huang等;《J. Agric. Food Chem.》;20101103;第58卷(第23期);摘要、第12138页材料和方法、表1 * |
| 对蛋壳膜中角蛋白与胶原蛋白的提取分离技术及功能多肽的概述;周艳华等;《四川食品与发酵》;20080825;第44卷(第04期);51-57 * |
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