CN102272149B - 新的抗衰老肽及含有所述肽的化妆品和/或药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通式(I)的肽化合物：R1-X1-X2-Ser-Pro-Leu-Gln-X3-X4-R2。一方面，本发明还涉及化妆品或者药物组合物，其包含在化妆品或者皮肤病学可接受的介质中的通式(I)的至少一种肽，以及另一方面，本发明涉及所述化妆品或者药物组合物在预防或者治疗衰老皮肤迹象和保护皮肤抵抗UV照射引起的有害作用中的应用。本发明最后还涉及一种化妆品治疗方法，用于预防和/或抗击衰老皮肤迹象和保护皮肤抵抗UV照射引起的有害作用。

Description

新的抗衰老肽及含有所述肽的化妆品和/或药物组合物
本发明涉及通式R1-X1-X2-Ser-Pro-Leu-Gln-X3-X4-R2的肽化合物，并涉及它们在用于预防和矫正衰老影响和UV照射对皮肤和皮肤附件的有害影响的化妆品和/或药物中的应用。
表皮的第一个功能是在外界环境与内部介质之间形成屏障。表皮的最外层，角质层，执行这项任务。其由在分化末期的角质形成细胞一角化细胞一构成，通过柔性和不可渗透性的厚细胞间粘合质彼此粘合。这个皮肤物理屏障使得人体可以保护自身免于各种类型攻击。这些攻击可具有不同内在来源，如随时间的衰老或者发生在疲劳、压力或者激素改变如妊娠期等期间的生物化学改变。其它攻击是外在来源的，如污染、日晒、疾病等。应答于这些攻击，皮肤外观发生改变，并观测到出现皱纹和细纹、色素沉着过多或者色素减少的区域、皮肤干燥或者甚至脱水、表皮变薄、弹性组织变性、瑕疵(imperfections)、衰老区(aged areas)等。这些改变是由于细胞更新功能、细胞结合力及胶原、弹性蛋白及其它蛋白质的合成的改变所致，最终导致皮肤的保护屏障特性降低以及降低外观的吸引力。所有这些改变不仅影响皮肤，也影响皮肤附件例如甲和头发。例如，头发变得无生命力或灰白，或者提前脱落。
为了克服这些缺点，近年来已经推出了众多化妆品组合物。这些组合物包括单独或组合使用水化剂、安抚剂、抗炎剂、抗自由基剂、抗泌脂剂、愈合剂、增白剂和角蛋白溶解剂，等等。不过，这些组合物目前无一能够预防或纠正内源性或外源性的皮肤老化迹象。
令人惊奇地，本申请人揭示了如下通式R1-X1-X2-Ser-Pro-Leu-Gln-X3-X4-R2的肽化合物，因其对皮肤老化的各种特征性症状的总体作用，其具有抗皮肤老化作用。现有技术领域中没有文献描述这种肽化合物以获得这种抗老化作用。此外，这些肽化合物特征在于其是参与昼夜节律周期调节的Clock(昼夜节律运动输出周期故障)基因的激活物。因此，本发明涉及是Clock激活物的肽化合物，以及涉及其在化妆品和药物组合物中的应用，用于预防或矫正由衰老和UV照射对皮肤和皮肤附件的有害影响而引起的迹象。
昼夜节律生物钟是由负调节环控制，其包括一组基因，特别是Per-1(period)、Clock和BMAL-1(脑和肌肉ARNt-样蛋白质)。
已经证实衰老伴随着生物节律的改变，具有降低的幅度(amplitude)及相位超前的倾向(Weinert D.，Chronobiol.Int.2000；17：261-83)。此外，已经发现昼夜节律生物钟由这种相同的衰老过程改变。
先前在现有技术中，针对由Clock、Per-1或BMAL-1基因产生的核苷酸和/或蛋白质的用途已建议了许多应用。例如，见专利US 6 291 429，其描述了用Clock基因产物使睡眠周期或生理学或内分泌过程再同步，或者使机体在飞行时差等之后再同步。但是，没有现有技术文献描述使用特异性Clock激活物肽以预防或矫正因衰老或UV照射的有害影响而引起的迹象。
本发明首先涉及下式(I)的肽化合物：
R1-X1-X2-Ser-Pro-Leu-Gln-X3-X4-R2
其中
X1是半胱氨酸、甲硫氨酸或者等于零，
X2是丝氨酸、苏氨酸或者等于零，
X3是丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸或者等于零，
X4是天冬酰胺、谷氨酰胺或者等于零，
R1是N-末端氨基酸的伯胺官能团，其是游离的或者由保护基团取代，所述保护基团可以选自乙酰基团、苯甲酰基团、甲苯磺酰基团或者苄氧基羰基基团，
R2是C-末端氨基酸的羧基官能团的羟基基团，其是游离的或者由保护基团取代，所述保护基团可选自C1-C20烷基链或者NH2、NHY或者NYY基团，其中Y是C1-C4烷基链，
所述通式(I)的序列由4-8个氨基酸残基组成，
所述通式(I)的序列可能包含其它化学等价氨基酸对氨基酸X1至X4的取代。
本发明其次涉及包含通式(I)的肽化合物的化妆品组合物或皮肤药用组合物。
本发明还涉及包含通式(I)的肽化合物的化妆品组合物的应用。
最后，本发明涉及借助于包含通式(I)的肽化合物的组合物进行的化妆处理方法。
本发明的第一个目的涉及下述通式(I)的肽化合物：
R1-X1-X2-Ser-Pro-Leu-Gln-X3-X4-R2
其中
X1是半胱氨酸、甲硫氨酸或者等于零，
X2是丝氨酸、苏氨酸或者等于零，
X3是丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸或者等于零，
X4是天冬酰胺、谷氨酰胺或者等于零，
R1是N-末端氨基酸的伯胺官能团，其是游离的或者由保护基团取代，所述保护基团可以选自乙酰基团、苯甲酰基团、甲苯磺酰基团或者苄氧基羰基基团，
R2是C-末端氨基酸的羧基官能团的羟基基团，其是游离的或者由保护基团取代，所述保护基团可选自C1-C20烷基链或者NH2、NHY或者NYY基团，其中Y是C1-C4烷基链，
所述通式(I)的序列由4-8个氨基酸残基组成，
所述通式(I)的序列可能包含其它化学等价氨基酸对氨基酸X1至X4的取代。
为了改善对降解的抗性，可能需要使用本发明的肽的保护形式。保护形式当然必须是生物学相容形式并且必须与化妆品或药品领域内的应用相容。所述肽化合物优选地具有至少一个被保护基团保护的官能团，所述保护基团是氨基端的乙酰化或羧基端的酰胺化或酯化或两者均有。优选地使用基于羧基端的羟基官能团被NYY基团酰胺化或者用烷基基团酯化的保护，在所述NYY基团中，Y是C1到C4烷基链。
所述肽化合物优选具有下述序列之一：
(SEQ ID no 1)Ser-Pro-Leu-Gln-NH2
(SEQ ID no 2)Thr-Ser-Pro-Leu-Gln
(SEQ ID no 3)Ser-Ser-Pro-Leu-Gln-Leu-NH2
(SEQ ID no 4)Ser-Ser-Pro-Leu-Gln-Ala-Asn-NH2
在一个具体实施方案中，所述肽化合物的序列是序列SEQ ID no 1，即Ser-Pro-Leu-Gln-NH2。
本发明还涉及这些序列的同源形式。术语“同源”根据本发明是指与选自序列SEQ ID no 1至SEQ ID no 4的所述肽序列至少50％、或者优选至少80％、更优选至少90％相同的任何肽序列。“至少X％相同的肽序列”应理解是指在使两个序列最佳比对后获得的被比较的两个序列的氨基酸残基之间的相同性百分比。最佳比对借助于局部同源性算法获得，如由得自NCBI网站的IT软件BLAST P或T BLAST N使用的那些算法。
术语“同源”也可以指通过化学等价氨基酸的取代(即通过一个残基被具有相同特征的另一个残基取代)而与序列SEQ ID no 1至SEQ ID no 4的肽序列的序列不同的肽。因此，在Ala、Val、Leu和Ile之间，在Ser和Thr之间，在酸性残基Asp和Glu之间，在Asn和Gln之间，在碱性残基Lys和Arg之间，或者在芳香族残基Phe和Tyr之间进行常规取代。
术语“肽”是指两个或多个氨基酸通过肽键或者通过修饰的肽键连接在一起的序列。
“肽”必须被理解为指上述本发明的天然或者合成肽，或者至少其片段之一，其得自蛋白酶解或者合成获得，或者任何天然或合成肽，其序列全部或部分由上述肽序列形成。
本发明的通式(I)的肽可以从构成氨基酸或其衍生物通过常规化学合成(固相或者均质液相)或者通过酶合成(Kullman et al.，J.Biol.Chem.1980，225，8234)获得。
本发明的肽可以是天然或者合成来源的。根据本发明，肽优选经化学合成获得。
最后，活性成分可以是单一肽、肽的混合物或者肽衍生物和/或由氨基酸衍生物构成的衍生物的混合物。
本发明的肽化合物可以用作药物。
本发明的第二个目的涉及包含通式(I)的所述肽化合物的化妆品组合物。本发明的组合物优选以包含化学品或皮肤可接受的介质的适于局部应用的形式存在。“化学品或皮肤可接受的”是指这样的介质，其适于这样的应用，其中它们与皮肤或人类皮肤附件接触而不产生毒性、不耐受性、不稳定性、变态反应等的风险。所述肽化合物优选以大约0.0005至500ppm的浓度、优选以0.01至5ppm的浓度存在于组合物中。在本发明组合物中，肽化合物预先溶解于一或多种化妆品或皮肤可接受溶剂中，如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、一缩二丙二醇、乙氧基化二甘醇或丙氧基化二甘醇、环状多元醇(cyclic polyol)、凡士林油、植物油或者这些溶剂的任何混合物。
根据进一步有利的实施方案，本发明的活性成分预先溶解于化妆品或药物载体如脂质体中，或者吸附在粉状有机聚合物、矿物质支持物如滑石粉和皂土上，更普遍地溶解在任何生理学可接受载体中或者固定在所述载体上。
施用于皮肤的组合物可以以如下形式存在：水溶液或者水醇溶液、水包油或油包水乳液、微乳液、水凝胶或无水凝胶、乳浆(serum)、或小泡分散液、贴(patch)、乳霜(cream)、喷雾、软膏(salve)、软膏剂(ointment)、洗剂(lotion)、凝胶、溶液、悬浮液等。组合物也可以以香波、染料或睫毛膏形式经刷子或梳子施加于皮肤附件，特别是施加于眼睫毛、眉毛或头发，或者以指甲护理形式如指甲油。
在一个具体实施方案中，本发明的组合物还含有至少一种另外的活性成分，其促进所述肽活性成分的作用。非限制性例子包括下述类别的成分：其它肽活性成分、植物提取物、愈合剂、抗衰老剂、抗皱剂、安抚剂(soothing agents)、抗辐射剂、抗UV剂、真皮大分子合成的刺激剂或者能量代谢的刺激剂、水合剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗炎剂、麻醉剂、调节皮肤分化、色素沉着或者色素脱失的制剂、指甲或毛发生长的刺激剂等。优选使用抗辐射或者抗氧化剂或者真皮大分子合成的刺激剂或者能量代谢的刺激剂。
另外，添加剂如增稠剂、乳化剂、湿润剂和润滑剂、香料、抗氧化剂、成膜剂、螯合剂、掩蔽剂(sequestering agents)、调节剂(conditioningagents)等可以加入到组合物中。
在任何情况中，本领域技术人员会保证对这些添加剂以及其量进行选择以使之不破坏本发明的组合物的希望的有利性质。例如，这些添加剂可以相应于组合物总重量的0.01-20％。当本发明组合物是乳液时，脂肪相基于组合物的总重量可以是5-80％(重量)、优选5-50％(重量)。组合物中使用的乳化剂和共乳化剂从相关领域常规使用的那些中选择。例如，它们可以以基于组合物总重量为0.3-30％(重量)的比例使用。
本发明的第三个目的涉及如上定义的肽化合物用作Clock激活物活性成分。“Clock激活物”肽化合物意味着在生物学上能够增加Clock活性的任何肽或衍生物，其通过增加Clock蛋白合成(通过直接或间接调节Clock基因表达)或者通过其它生物学过程如Clock蛋白的稳定化或者RNA信使转录物的稳定化。
本发明的第四个目的涉及使用包含所述肽化合物组合物来预防或者治疗衰老的皮肤迹象。“衰老的皮肤迹象”包括但不限于由衰老导致的皮肤上的任何可见表现。具体地，这意味着皱纹、细纹(fine lines)、皮肤皲裂(chapped skin)、毛孔增大、瑕疵、紧度丧失(losses in firmness)、褪色、衰老区域、角化病、胶原丧失、真皮和表皮的其他改变等。“衰老的皮肤迹象”也意味着由衰老导致的皮肤和皮肤附件外观的任何改变，如角质层的表面粗糙，以及未系统地表现为改变的外观的任何皮肤内部改变，如真皮变薄或任何其他内部退化。
此外，本发明涉及本发明的组合物在保护皮肤抵抗UV照射引起的有害作用中的应用。
本发明进一步的目的涉及使用有效量的本发明的肽活性成分以制备用于预防或者对抗与氧化过程相关的病变的组合物。
本发明最后一个目的涉及化妆处理方法，其特征在于将含有有效量的肽活性成分的组合物局部施用于皮肤或皮肤附件，以预防或治疗衰老皮肤迹象或保护皮肤抵抗UV照射的有害作用。另外，这种化妆处理方法特征在于为了具有皮肤再年轻作用，所述组合物在睡觉前施用以遵守皮肤的昼夜节律。事实上，在夜间，皮肤促进更新功能以及代谢合成过程。因此，通过遵守皮肤的生物学节律，所述组合物的施用使得可以获得再年轻作用(其刺激细胞更新)以及再生作用。
下述实施例描述和证实本发明所述肽化合物的功效。所述化妆品配制物是本发明的代表但是仅仅是举例，不应理解为限制本发明。
实施例1：证实肽SEQ ID no 1对培养的成纤维细胞中Clock蛋白的表达的激活作用
通过在培养的成纤维细胞中进行蛋白质印迹以及通过以免疫标记方式标记Clock蛋白的免疫组织化学方法来评估Clock蛋白的表达而进行肽SEQ ID no 1的激活作用研究。蛋白质印迹技术是半定量方法，其使得可以评估皮肤细胞中的Clock蛋白水平。
方案
a)蛋白质印迹研究
在存在或不存在(从10-4M溶液)稀释至1％的肽SEQ ID no 1的条件下，将培养的成纤维细胞在直径100mm的容器中在含有5％CO2的湿润空气中在37℃培养16小时。漂洗细胞，然后用提取缓冲液(20mM TRIS，150mM NaCl，10mM EDTA，0.2％triton X10)在蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)存在下从支持物上取下。由此提取的蛋白质在4℃10000rpm离心，之后用BCA蛋白定量(dosing)试剂盒(Pierce)定量。细胞裂解物与变性缓冲液混合并进行SDS-PAGE电泳。所用凝胶是4-12％Nupage(Invitrogen)。蛋白质然后转移到硝酸纤维素膜(Pal corporation)。膜在环境温度下于5％PBS-乳和0.1％Tween 20中饱和2小时，然后在4℃与1/1000稀释的抗Clock一抗(Abcam)保温过夜，之后与稀释1/5000的抗兔二抗Iggy-过氧化物酶保温。经化学发光底物进行观测。细胞中存在的蛋白质的定量评估用chemiimager软件(Alpha innotech Corporation USA)进行。蛋白质的量表示为与未接受处理的对照条件相比的发光强度百分比。
b)免疫组织化学研究
在存在或不存在(从10-4M溶液)稀释至1％的肽SEQ ID no 1的条件下，将培养的成纤维细胞在8孔盒(Labteck)中在含有5％CO2的湿润空气中在37℃培养18小时。同时培养未处理的细胞用作对照。在标记当日，洗涤细胞，在混合物(2％戊二醛-2％甲醛)中固定3分钟，然后再洗涤。加入1/250稀释的一抗(ABcam)温育1小时，再加入1/50稀释的连接有发色团的二抗温育1小时。用合适的封片介质将细胞封闭于载片和盖片之间，在表面荧光显微镜下观察。
结果：
蛋白质印迹获得的结果显示用稀释至1％的肽SEQ ID no 2处理显著增加培养的成纤维细胞中的Clock蛋白的量。结果总结于下表。
  强度(％)   实验1
  未处理对照   100％
  1％处理   179％
通过标记成纤维细胞内的Clock蛋白确认了这些结果。这实际上证实，Clock蛋白在经处理的成纤维细胞中的表达是升高的。
结论：
施加肽SEQ ID no 1使得可以增加培养的皮肤细胞中的Clock蛋白的量。
实施例2：证实肽SEQ ID no 1对皮肤活组织检查样品中的Clock和Per蛋白的表达的激活作用
通过评估离体皮肤活检样品中Clock和Per-1蛋白的表达进行肽SEQID no 1的激活作用的研究。
方案
通过免疫标记的离体研究使得可以显示皮肤样品中的Clock和Per-1蛋白的表达。人类皮肤样品在气/液界面培养。稀释至1％(从10-4M溶液)的肽SEQ ID no 1局部施加于这些样品48小时，每24小时施加两次。
未用肽SEQ ID no 1处理的皮肤样品用作对照。皮肤样品用10％甲醛固定并包埋在石蜡中。用切片机制备3μm切片。在除去石蜡并暴露抗原位点之后进行免疫标记。
通过稀释1/250的抗体(Abcam)和稀释1/50并偶联于发色团的二抗进行Clock蛋白的免疫标记。
通过稀释1/100的多克隆抗体(Cosmobio)和稀释1/50并偶联于发色团的二抗进行Per-1蛋白的免疫标记。
玻片然后在合适介质中封固并在表面荧光显微镜(Nikon Eclipse E600)下观测。
结果：
获得的结果显示用肽SEQ ID no 1处理的皮肤Clock蛋白的表达量略大于未处理皮肤的表达量。类似地，发现用肽SEQ ID no 1处理的皮肤Per-1蛋白的表达量大于未处理皮肤的表达量。
标记的半定量评估通过显微镜观测进行并总结于下表。
  未处理   用稀释至1％的肽SEQ ID no 1处理
 Clock蛋白标记   +/-   ++
 PER-1蛋白标记   +   +
结论：
肽SEQ ID no 1可以增加皮肤活检样品中Clock和PER-1蛋白的量。
实施例3：证实肽SEQ ID no 1对衰老过程中皮肤活检样品中的Clock和Per-1蛋白的表达的激活作用
通过评估在培养期间人工老化的皮肤模型中的Clock和Per-1蛋白的表达进行肽SEQ ID no 1的激活作用研究。在培养62小时和134小时之后进行分析。
方案
通过免疫标记的离体研究使得可以显示在培养期间老化的皮肤样品中的Clock和Per-1蛋白的表达。人类皮肤样品在气/液界面培养62小时和134小时。稀释至1％(从10-4M溶液)的肽SEQ ID no 3在实验期间以每天2次局部施加于这些样品。
未用肽SEQ ID no 1处理的皮肤样品用作对照。皮肤样品用10％甲醛固定并包埋在石蜡中。用切片机制备3μm切片。在除去石蜡并暴露抗原位点之后进行标记标记。通过稀释1/250的抗体(Abcam)和稀释1/50并偶联于发色团的二抗进行Clock蛋白的免疫标记。
使用1/100稀释的多克隆抗体(Cosmobio)和稀释1/50并偶联于发色团的二抗进行Per-1蛋白的免疫标记。
玻片然后在合适介质中封固并在表面荧光显微镜(Nikon Eclipse E600)下观测。
结果：
获得的结果显示Clock蛋白的标记(主要在表皮)在培养62小时后与未处理对照玻片相比增加。类似地，处理62小时后PER-1蛋白的表达增加。这个标记随时间持续，因为134小时之后Clock蛋白的标记与未处理对照皮肤相比大大增加。下表给出标记的目视评估。
  未处理   用稀释至1％的肽SEQ ID no 1处理
  Clock蛋白标记62小时   +   ++
  Clock蛋白标记134小时   +   ++
  未处理   用稀释至1％的肽SEQ ID no 1处理
  PER-1蛋白标记62小时   +/-   ++
  PER-1蛋白标记134小时   +/-   +
结论：
肽化合物SEQ ID no 1使得可以增加在培养过程中人工老化的处理的皮肤活组织检查样品中的Clock和PER-1蛋白的量。
实施例4：在皮肤活检样品中证实肽SEQ ID no 1在衰老过程中的保护作用
在62小时和134小时平行研究肽SEQ ID no 1的保护性作用，通过采用对皮肤切片染色的免疫组织学方法评价衰老引起的损害而进行。
方案
将人皮肤样品放置在空气/液体界面培养。将稀释至1％(从10-4M溶液)的肽SEQ ID no 1局部施加到这些培养上处理62小时和134小时。实验过程中每天更新施加两次。将未处理的样品作为实验过程中的对照。以4％的甲醛固定样品并石蜡包埋。使用切片机制备3μm的切片。使用苏木精(其将细胞核染成深蓝色)和曙红(其特异性染色细胞质)进行组织染色。然后在透射显微镜下评估活检样品的形态学结构。
结果：
所得结果显示，未以肽SEQ ID no 1处理的皮肤受损，细胞出现空泡，细胞看起来受损，细胞核固缩(凋亡迹象)。相反，以肽SEQ ID no 1处理的皮肤具有保存良好的形态学结构，很少看到衰老引起的损害。在62小时和134小时这两组实验中，肽SEQ ID no 1均保护活检皮肤抵抗衰老。
结论：
在皮肤活检样品的形态学上，肽SEQ ID no 1对培养过程中进行的人工老化能够显示出保护作用。
实施例7：制备组合物
防晒霜
将A相和B相组分分别在70℃和75℃之间加热。将B相在A相中搅拌乳化。在45℃加入C相，加快搅拌。然后在温度降至40℃以下时加入D相。然后快速搅拌，冷却至25℃。

Claims (13)

1.以下式的肽化合物：
(SEQ ID no 1)Ser-Pro-Leu-Gln-NH2。
2.权利要求1的肽化合物，特征在于其被用作药物。
3.化妆品组合物，其包含作为活性成分的权利要求1的肽化合物。
4.权利要求3的化妆品组合物，特征在于其以包含化妆品可接受的介质的适于局部施用的形式存在。
5.权利要求3的组合物，特征在于所述肽化合物在所述组合物中以0.0005-500ppm之间的浓度存在。
6.权利要求5的组合物，特征在于所述肽化合物在所述组合物中以0.01-5ppm之间的浓度存在。
7.权利要求3-6任一项的组合物，特征在于所述肽化合物溶解于一或多种溶剂中，所述溶剂选自水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、一缩二丙二醇、乙氧基化二甘醇或者丙氧基化二甘醇、环状多元醇、凡士林油、植物油或者这些溶剂的任何混合物。
8.权利要求3-6任一项的组合物，特征在于其进一步含有促进所述肽化合物作用的至少一种活性成分。
9.权利要求8的组合物，特征在于所述活性成分是抗自由基剂或者抗氧化剂，或者皮肤大分子合成的刺激剂，或者能量代谢的刺激剂。
10.权利要求1的肽化合物在制备Clock激活物活性成分中的应用。
11.权利要求1的肽化合物在制备权利要求3-9任一项的组合物中的应用，特征在于所述组合物用于治疗衰老的皮肤迹象。
12.权利要求11的应用，特征在于所述组合物用于保护皮肤抵抗UV照射引起的有害作用。
13.权利要求1的肽化合物在制备组合物中的应用，所述组合物局部施用于待治疗的皮肤或者皮肤附件，以治疗衰老的皮肤迹象或保护皮肤抵抗UV照射引起的有害作用。
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