KR101700927B1 - 고순도 마린콜라겐의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 세척한 어류 부산물을 동결건조한 후, 비늘을 제거하고 세절하여 어류 분말을 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 어류 분말에 알칼리 용액을 가한 후, 균질화하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 균질화한 용액을 원심분리하여 얻은 침전물에 알칼리 용액을 가한 후 1차 교반하고, 균질화한 후 2차 교반하고, 이를 원심분리하여 침전물을 얻는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 침전물에 물을 첨가하고 교반한 후 원심분리하여 침전물을 얻는 단계를 3회 반복하는 단계; (e) 상기 (d) 단계의 침전물에 산용액을 가하여 산추출하여 산가용성 콜라겐을 수득하는 단계; (f) 상기 (e) 단계의 산가용성 콜라겐에 펩신을 첨가하고 균질화한 후 펩신 가용화 콜라겐을 수득하는 단계; 및 (g) 상기 (f) 단계의 수득한 펩신 가용화 콜라겐을 이온교환크로마토그래피를 수행하여 마린콜라겐을 수득하는 단계를 포함하여 제조하는 어류 부산물로부터 고순도 마린콜라겐의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 고순도 마린콜라겐을 제공한다.

Description

고순도 마린콜라겐의 제조 방법{Method for producing high purity marine collagen}

본 발명은 고순도 마린콜라겐의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 고순도 마린콜라겐에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (a) 세척한 어류 부산물을 동결건조한 후, 비늘을 제거하고 세절하여 어류 분말을 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 어류 분말에 알칼리 용액을 가한 후, 균질화하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 균질화한 용액을 원심분리하여 얻은 침전물에 알칼리 용액을 가한 후 1차 교반하고, 균질화한 후 2차 교반하고, 이를 원심분리하여 침전물을 얻는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 침전물에 물을 첨가하고 교반한 후 원심분리하여 침전물을 얻는 단계를 3회 반복하는 단계; (e) 상기 (d) 단계의 침전물에 산용액을 가하여 산추출하여 산가용성 콜라겐을 수득하는 단계; (f) 상기 (e) 단계의 산가용성 콜라겐에 펩신을 첨가하고 균질화한 후 펩신 가용화 콜라겐을 수득하는 단계; 및 (g) 상기 (f) 단계의 수득한 펩신 가용화 콜라겐을 이온교환크로마토그래피를 수행하여 마린콜라겐을 수득하는 단계를 포함하여 제조하는 어류 부산물로부터 고순도 마린콜라겐의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 고순도 마린콜라겐에 관한 것이다.

콜라겐은 동물 체내에 가장 풍부하게 존재하는 단백질로서 체단백질의 약 30% 이상을 차지하며, 최소 19종류(Type Ⅰ-ⅩⅨ) 이상인 것으로 밝혀져 있다. 또한, 콜라겐은 동물의 결합조직의 주요 단백질이며, 조직이나 장기를 지탱하게 하고 체표를 둘러싸고 있어 체형을 유지시키는 역할을 한다. 특히 생체에서 피부, 연골, 뼈 등의 결합조직의 주요한 구성성분으로 40%는 피부, 20%는 뼈와 연골, 그 외 혈관과 내장 등 전신에 넓게 분포되어 있다. 콜라겐은 2중 나선구조를 하고 있는 근원섬유 단백질과는 달리 3중 나선구조로, 그 직경이 약 14~15 nm, 길이는 280~300 nm, 평균 분자량은 약 300 KDa이며, (Gly-XY)n과 같은 규칙적인 형태의 아미노산 배열을 가지며 섬유상 단백질의 기본단위 분자인 트로포콜라겐(tropocollagen) 분자 내 또는 트로포콜라겐(tropocollagen) 분자 간의 공유결합성 교차결합(crosslinking)에 의해 물리적, 생물학적으로 안정한 구조를 형성하고 있다.

콜라겐 펩타이드라는 명칭으로 불리는 콜라겐 가수분해물은 돈피, 어피의 비늘 등에서 고분자 콜라겐을 추출한 후, 효소 분해 등의 후처리 과정을 통해 가수분해시켜 펩타이드 형태로 저분자화시킨 것을 말하며 최근에는 분자량을 1,000~5,000 정도까지 낮춘 콜라겐 제품들이 판매되고 있다.

한편, 현재까지 어피 부산물은 음식물쓰레기로 분류되어 일반음식물과 같이 퇴비로 대부분 활용되었다. 건조한 어피는 단백질을 포함한 유용물질 함량이 90% 이상이어서 활용도가 매우 높아 콜라겐 추출, 화장품, 건강보조식품, 접착제 등 다양하게 이용할 수 있다. 근래 콜라겐을 이용한 건강보조제, 화장품 등 다양한 상품이 상용화되고 있으나 많은 부분 수입에 의존하고 있다.

국내 1인당 수산물소비가 세계 1위인 일본과 앞뒤를 다투는 상황에서 점차 증가하는 어피 부산물의 활용은 수입 대체 및 양질의 수산단백질, 콜라겐의 공급으로 경제적 상승효과 및 친환경적 산업개발에 매우 적합하다. 또한, 콜라겐, 알부민, 미오신, 엘라스틴 등 다양한 고분자 단백질을 다량으로 함유하고 있어, 고품질의 콜라겐으로 활용이 가능하며, 어피 부산물의 단백질원으로서 이용은 생선회의 소비가 높은 국내에서 수거가 용이하며, 국내 해산어 양식도 꾸준히 이루어지고 있는 만큼 안정된 수량 확보를 기대할 수 있어 해산어류 어피 부산물의 유효이용 가능성에 대한 평가가 절실한 상황이다.

한국공개특허 제2011-0119652호에서는 수생 동물로부터의 콜라겐 추출물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0532153호에서는 어류 비늘을 이용한 단백질 가수분해물의 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '고순도 마린콜라겐의 제조 방법'에 관해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 어류 부산물로부터 마린콜라겐을 제조하는 기존의 방법에서, 알칼리잔사를 수득하는 과정 중 알칼리 용액을 가한 후 균질화 과정을 추가하고, 펩신 가용화 콜라겐을 수득하는 과정에서 펩신을 첨가한 후 균질화 과정을 추가하는 등 전체 제조 공정 중 2회의 균질화 과정의 추가를 통하여, 기존 방법에 비해 99% 고순도 마린콜라겐의 수율이 약 10% 이상 향상되는 것을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 고순도 콜라겐의 제조 방법은 공정은 추가되나 수율 및 순도는 높아 경제적 장점이 있는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 세척한 어류 부산물을 동결건조한 후, 비늘을 제거하고 세절하여 어류 분말을 제조하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 어류 분말에 알칼리 용액을 가한 후, 균질화하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계의 균질화한 용액을 원심분리하여 얻은 침전물에 알칼리 용액을 가한 후 1차 교반하고, 균질화한 후 2차 교반하고, 이를 원심분리하여 침전물을 얻는 단계;

(d) 상기 (c) 단계의 침전물에 물을 첨가하고 교반한 후 원심분리하여 침전물을 얻는 단계를 3회 반복하는 단계;

(e) 상기 (d) 단계의 침전물에 산용액을 가하여 산추출하여 산가용성 콜라겐을 수득하는 단계;

(f) 상기 (e) 단계의 산가용성 콜라겐에 펩신을 첨가하고 균질화한 후 펩신 가용화 콜라겐을 수득하는 단계; 및

(g) 상기 (f) 단계의 수득한 펩신 가용화 콜라겐을 이온교환크로마토그래피를 수행하여 마린콜라겐을 수득하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 어류 부산물로부터 고순도 마린콜라겐의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 고순도 마린콜라겐을 제공한다.

본 발명은 기존 방법에 비해 어류 부산물로부터 99% 고순도 마린콜라겐을 높은 수율로 제조할 수 있으며, 이에 따라 폐기되는 부산물을 이용하여 고순도 마린콜라겐을 경제적으로 제조할 수 있어, 자원재활용 고부가가치 상품개발을 통한 연계 산업의 시너지 효과를 기대할 수 있다.

도 1은 본 발명의 어류 부산물로부터 99% 고순도 마린콜라겐을 제조하는 공정을 나타낸 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 세척한 어류 부산물을 동결건조한 후, 비늘을 제거하고 세절하여 어류 분말을 제조하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 어류 분말에 알칼리 용액을 가한 후, 균질화하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계의 균질화한 용액을 원심분리하여 얻은 침전물에 알칼리 용액을 가한 후 1차 교반하고, 균질화한 후 2차 교반하고, 이를 원심분리하여 침전물을 얻는 단계;

(d) 상기 (c) 단계의 침전물에 물을 첨가하고 교반한 후 원심분리하여 침전물을 얻는 단계를 3회 반복하는 단계;

(e) 상기 (d) 단계의 침전물에 산용액을 가하여 산추출하여 산가용성 콜라겐을 수득하는 단계;

(f) 상기 (e) 단계의 산가용성 콜라겐에 펩신을 첨가하고 균질화한 후 펩신 가용화 콜라겐을 수득하는 단계; 및

(g) 상기 (f) 단계의 수득한 펩신 가용화 콜라겐을 이온교환크로마토그래피를 수행하여 마린콜라겐을 수득하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 어류 부산물로부터 고순도 마린콜라겐의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 본 발명의 마린콜라겐의 재료로 사용된 어류 부산물은 비늘을 포함한 어류로, 바람직하게는 어피 부산물을 의미한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (c) 또는 (f) 단계의 균질화는 2~6℃에서 10~20분 동안 균질기로 수행하는 것일 수 있고, 바람직하게는 4℃에서 15분 동안 균질기로 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서는 기존 방법과 비교하여 상기 (c) 및 (f) 단계의 균질화의 공정을 추가시킴으로써, 최종적으로 마린 콜라겐의 추출 수율을 약 10% 이상 향상시키는 효과를 확인하였다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (b) 및 (c) 단계의 알칼리 용액은 0.05~0.2M 농도의 수산화 나트륨, 수산화 칼슘 또는 수산화 칼륨일 수 있고, 바람직하게는 0.05~0.2M 농도의 수산화 나트륨일 수 있고, 가장 바람직하게는 0.1M 농도의 수산화 나트륨일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 (b) 및 (c) 단계의 알칼리 용액을 어류 분말에 첨가한 후 최종적으로 얻어지는 침전물은 알칼리 추출에 의해 비콜라겐성 단백질과 내인성 콜라겐 분해효소를 효율적으로 제거된 알칼리잔사에 해당한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (e) 단계에서 산용액은 염산, 황산 등의 무기산 또는 초산 등의 유기산일 수 있고, 바람직하게는 초산일 수 있고, 가장 바람직하게는 0.5M 초산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (e) 단계에서 침전물과 산용액을 1:5~10의 중량비로 혼합한 다음 실온(20~25℃)에서 12~24시간 동안 교반한 후 원심분리기를 이용하여 상등액을 분리하여 산 가용성 콜라겐을 수득할 수 있고, 바람직하게는 침전물과 산용액을 1:10의 중량비로 혼합한 다음 실온에서 18시간 동안 교반한 후 원심분리기를 이용하여 상등액을 분리하여 산 가용성 콜라겐을 수득할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은,

(a) 세척한 어류 부산물을 동결건조한 후, 비늘을 제거하고 세절하여 어류 분말을 제조하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 어류 분말에 0.05~0.2M 농도의 수산화 나트륨 용액, 수산화 칼슘 용액 또는 수산화 칼륨 용액을 가한 후, 균질화하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계의 균질화한 용액을 원심분리하여 얻은 침전물에 0.05~0.2M 농도의 수산화 나트륨 용액, 수산화 칼슘 용액 또는 수산화 칼륨 용액을 가한 후 1차 교반하고, 2~6℃에서 10~20분 동안 균질기로 균질화한 후 2차 교반하고, 이를 원심분리하여 침전물을 얻는 단계

(d) 상기 (c) 단계의 침전물에 물을 첨가하고 교반한 후 원심분리하여 침전물을 얻는 단계를 3회 반복하는 단계;

(e) 상기 (d) 단계의 침전물에 초산을 1:5~10의 중량비로 혼합한 다음 실온에서 12~24시간 동안 교반한 후 원심분리기를 이용하여 상등액을 분리하여 산 가용성 콜라겐을 수득하는 단계;

(f) 상기 (e) 단계의 산가용성 콜라겐에 펩신을 첨가하고 2~6℃에서 10~20분 동안 균질기로 균질화한 후 펩신 가용화 콜라겐을 수득하는 단계; 및

(g) 상기 (f) 단계의 수득한 펩신 가용화 콜라겐을 이온교환크로마토그래피를 수행하여 마린콜라겐을 수득하는 단계를 포함하여 제조하는 것일 수 있고, 바람직하게는,

(a) 세척한 어류 부산물을 동결건조한 후, 비늘을 제거하고 세절하여 어류 분말을 제조하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 어류 분말에 0.1M 농도의 수산화 나트륨 용액을 가한 후, 균질화하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계의 균질화한 용액을 원심분리하여 얻은 침전물에 0.1M 농도의 수산화 나트륨 용액을 가한 후 1차 교반하고, 4℃에서 15분 동안 균질기로 균질화한 후 2차 교반하고, 이를 원심분리하여 침전물을 얻는 단계

(d) 상기 (c) 단계의 침전물에 물을 첨가하고 교반한 후 원심분리하여 침전물을 얻는 단계를 3회 반복하는 단계;

(e) 상기 (d) 단계의 침전물에 0.5M 초산을 1:10의 중량비로 혼합한 다음 실온에서 18시간 동안 교반한 후 원심분리기를 이용하여 상등액을 분리하여 산 가용성 콜라겐을 수득하는 단계;

(f) 상기 (e) 단계의 산가용성 콜라겐에 펩신을 첨가하고 4℃에서 15분 동안 균질기로 균질화한 후 펩신 가용화 콜라겐을 수득하는 단계; 및

(g) 상기 (f) 단계의 수득한 펩신 가용화 콜라겐을 이온교환크로마토그래피를 수행하여 마린콜라겐을 수득하는 단계를 포함하여 제조하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 고순도 마린콜라겐을 제조한다.

본 발명에 적용된 어류는 모든 어류의 껍질(어류)이 적용될 수 있으나, 바람직하게는 농어, 조피볼락, 넙치, 참돔을 포함하는 어류에서 선택된 적어도 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 본 발명의 2회 균질화 단계를 포함하는 어류 부산물로부터 고순도 마린콜라겐의 제조 방법

농어, 조피볼락, 넙치, 참돔 등의 어류의 피부조직은 건조 및 분말화하여 10배량의 0.1M 수산화나트륨으로 균질화하여 알칼리추출을 통해 비콜라겐성 단백질과 내인성 콜라겐 분해효소를 효율적으로 제거하였다. 상기 알칼리 추출 과정을 설명하자면 다음과 같다. 먼저, 세척한 어류 부산물을 동결건조한 후, 비늘을 제거하고 세절하여 제조된 어류 분말에 0.1M 농도의 수산화 나트륨 용액을 가한 후, 균질기로 균질화하고, 상기 균질화한 용액을 원심분리하여 얻은 침전물에 0.1M 농도의 수산화 나트륨 용액을 가한 후 1차 교반하고, 4℃에서 15분 동안 균질기로 균질화한 후 2차 교반하고, 이를 원심분리하여 침전물을 얻었다. 상기 침전물에 물을 첨가하고 교반한 후 원심분리하여 침전물을 얻는 단계를 3회 반복하여 알칼리잔사를 수득하였다.

증류수로 세척한 알칼리잔사는 다시 0.5M 초산에서 돼지 펩신(EC 3.4.23.1; crystallized and lyophilized, Sigma, MO)으로 교반한 다음 4℃에서 15분 동안 균질기로 균질화하고, 원심분리(10,000g, 20분) 후 얻어진 상등액에 2.0M 염화나트륨을 넣어 침전된 콜라겐 획분을 증류수로 투석하여 펩신 가용화 콜라겐을 얻을 수 있었다.

이어서, 이온크로마토그래피 시스템을 이용하여 아래와 같이 진행하였다. 펩신 가용화 콜라겐은 20mM Na₂HPO₄에서 투석하여 펩신을 불활성화한 다음 2M 요소를 포함한 50mM 초산용액(pH 4.8)에서 투석하여 인산셀룰로오스(P11, Whatman, Maidstone, UK)를 충진한 컬럼에서 600mM NaCl의 linear gradient(60 ml/h)로 진행하였다. 230 nm에서 용출된 획분은 2.0M NaCl을 포함한 0.5M 초산용액으로 침전시켜 원심분리로 회수한 다음 증류수로 투석, 동결건조한 다음 고순도 마린콜라겐을 수득할 수 있었다.

본 발명에서는 하기 표 1에서와 같이, 마린콜라겐 제조 공정 중 단계별 균질화(호모게나이져) 방법의 추가 유무에 따라 최종적인 마린콜라겐 수율을 조사하였다.

본 발명에서, 실험구 1은 상기 본 발명의 2회 균질화 단계를 포함하는 어류 부산물로부터 마린콜라겐의 제조 방법에 따라 제조한 것이며, 대조구로 사용된 실험구 2, 3 및 4의 실험방법은 다음과 같다. 실험구 2는 본 발명의 특허청구범위 제6항에 기재된 (c) 단계의 균질화는 수행하였으나, (f) 단계의 균질화는 생략한 것으로, 이 단계 이외의 방법은 실험구 1과 동일하며, 실험구 3은 본 발명의 특허청구범위 제6항에 기재된 (c) 단계의 균질화는 생략하였으나, (f) 단계의 균질화는 수행한 것으로, 이 단계 이외의 방법은 실험구 1과 동일하며, 실험구 4는 본 발명의 특허청구범위 제6항에 기재된 (c) 단계의 균질화 및 (f) 단계의 균질화 모두를 생략한 것으로, 이 단계 이외의 방법은 실험구 1과 동일하게 수행한 것이다. 기존 공정(한국등록특허 제1341704호)인 4번 실험구를 100%로 하였을 때 각 실험구의 수율은 다음과 같았다.

마린콜라겐 제조 공정 중 단계별 균질화(호모게나이져) 방법의 추가 유무에 따른 최종적인 고순도 마린콜라겐 수율

실험구	실험 방법	수율
1	(ASC 제조 + 호모게나이져) + (PSC 제조 + 호모게나이져)	110%
2	(ASC 제조 + 호모게나이져) + PSC 제조	100%
3	ASC 제조 + (PSC 제조 + 호모게나이져)	102%
4	ASC 제조 + PSC 제조	100%

ASC : Acid Soluble Collagen

PSC : Pepsin Solubilized Collagen

상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, (c) 단계의 균질화 및 (f) 단계의 균질화 공정을 기존 공정에 모두 추가했을 때, 기존 공정에 비해 약 10%의 마린콜라겐 수율이 증가하였다. 상기 내용과 같이 약 15분간의 물리적 균질화과정을 추가하여 기존 대비 10% 이상의 수율을 높임으로서 기존 공정과정과 비교하여 생산량대비 생산시간은 10시간 이상 감소하였으며, 추출치 못하고 폐기되는 콜라겐 역시 감소함으로서 생산율이 22% 상승하였다.

Claims (6)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. (a) 세척한 어류 부산물을 동결건조한 후, 비늘을 제거하고 세절하여 어류 분말을 제조하는 단계;
   (b) 상기 (a) 단계의 어류 분말에 0.05~0.2M 농도의 수산화 나트륨 용액, 수산화 칼슘 용액 또는 수산화 칼륨 용액을 가한 후, 균질화하는 단계;
   (c) 상기 (b) 단계의 균질화한 용액을 원심분리하여 얻은 침전물에 0.05~0.2M 농도의 수산화 나트륨 용액, 수산화 칼슘 용액 또는 수산화 칼륨 용액을 가한 후 1차 교반하고, 2~6℃에서 10~20분 동안 균질기로 균질화한 후 2차 교반하고, 이를 원심분리하여 침전물을 얻는 단계
   (d) 상기 (c) 단계의 침전물에 물을 첨가하고 교반한 후 원심분리하여 침전물을 얻는 단계를 3회 반복하는 단계;
   (e) 상기 (d) 단계의 침전물에 초산을 1:5~10의 중량비로 혼합한 다음 실온에서 12~24시간 동안 교반한 후 원심분리기를 이용하여 상등액을 분리하여 산 가용성 콜라겐을 수득하는 단계;
   (f) 상기 (e) 단계의 산가용성 콜라겐에 펩신을 첨가하고 2~6℃에서 10~20분 동안 균질기로 균질화한 후 펩신 가용화 콜라겐을 수득하는 단계; 및
   (g) 상기 (f) 단계의 수득한 펩신 가용화 콜라겐을 이온교환크로마토그래피를 수행하여 마린콜라겐을 수득하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 어류 부산물로부터 고순도 마린콜라겐의 제조 방법.

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