CN106929501A - 脂肪酶固定化载体、固定化脂肪酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及脂肪酶固定化载体、固定化脂肪酶及其制备方法和应用。具体而言，本发明提供一种固定化脂肪酶用载体或使用该固定化酶用载体作为载体的固定化脂肪酶，所述固定化脂肪酶用载体含有种子残渣和粉末吸附剂，或由种子残渣和粉末吸附剂组成。本发明还涉及种子残渣和粉末吸附剂的混合物在制备固定化脂肪酶中的应用。本发明能够降低固定化脂肪酶的成本，所制备的固定化脂肪酶具有很高的活力。

Description

脂肪酶固定化载体、固定化脂肪酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于酶工程领域，具体涉及脂肪酶固定化载体、固定化脂肪酶及其制备方法和应用。
背景技术
脂肪酶是一种工业中常用的生物催化剂，广泛存在于动植物和微生物体内。脂肪酶按其底物特异性可分为五类：(1)无特异性脂肪酶；(2)脂肪酸特异性脂肪酶；(3)位置特异性脂肪酶；(4)立体特异性脂肪酶；(5)底物特异性脂肪酶。具有位置特异性的脂肪酶优先催化甘油三酯的Sn-1和Sn-3位，因此也被称为Sn-1,3专一性脂肪酶。
CN 1806044 B描述了一种Sn-1,3专一性脂肪酶粉末的制备方法，该方法通过喷雾干燥得到固定化酶，酶液在喷雾干燥前需要经过超滤处理并调节pH值，制备过程复杂。经喷雾干燥后还需用油脂浸渍或浸润才能得到最终的固定化酶产品，对资源也造成极大的浪费，提高了生产成本。
CN 103468668 A描述了一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的固定化方法，该脂肪酶为Sn-1,3专一性脂肪酶。该固定化方法的特点是利用白炭黑作为脂肪酶固定化的载体，但固定过程中需要用到蛋白交联剂，过程较复杂且引入了化学试剂。并且通过该方法固定后，脂肪酶原有的Sn-1,3专一性丧失。
对脂肪酶的固定化不仅要考虑其固定化酶的活力大小，也要考虑其专一性的大小。目前市售的专一性(尤其是Sn-1,3专一性)固定化脂肪酶品种少、价格昂贵。
因此，需要一种价格低廉、酶活高并且专一性高的固定化专一性脂肪酶。
发明内容
本发明利用种子加工过程中的副产品种子残渣及价格非常低廉的粉末吸附剂混合作为脂肪酶的载体，不仅提高了副产物的利用价值，并且能够降低固定化脂肪酶的成本。所制备的固定化脂肪酶具有很高的活力和较高的专一性，尤其是Sn-1,3专一性。
具体而言，本发明提供一种显著增加脂肪酶活性及选择性的固定化脂肪酶的载体。同时，本发明也提供一种固定化脂肪酶，该固定化脂肪酶使用种子残渣和粉末吸附剂作为载体。
在某些实施方案中，所述固定化脂肪酶含有种子残渣、粉末吸附剂和脂肪酶。
在某些实施方案中，以固定化脂肪酶的重量计，所述粉末吸附剂以10％～70％的量存在，优选以20％～50％的量存在。
在某些实施方案中，以固定化脂肪酶的重量计，所述种子残渣(干基)以20％～80％的量存在，优选以40％～70％的量存在。
在某些实施方案中，固定化脂肪酶可含有水分，以固定化脂肪酶的重量计，所述水分以3％～25％的量存在，优选以7％～15％的量存在。
在某些实施方案中，以固定化脂肪酶的重量计，所述脂肪酶以0.2％～6％的量存在，优选以0.7％～2％的量存在。
在某些实施方案中，以干物质重量计，种子残渣与粉末吸附剂的比例为1:10～10:1，优选为1:5～6:1，更优选为1:3～6:1，更优选为1:2.2～5.5:1。
在某些实施方案中，所述脂肪酶为来自动物、植物或微生物的脂肪酶。
在某些实施方案中，所述脂肪酶固定化后表现出Sn-1,3专一性。
在某些实施方案中，所述脂肪酶选自但不限于：猪胰脂肪酶；来自疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、米根霉(Rhizopusoryzae)、南极假丝酵母(Candida antarctica)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)和根霉(Rhizopus sp.)以及它们的基因改造菌种的脂肪酶中的一种或多种的混合物；优选为Sn-1,3专一性脂肪酶，选自猪胰脂肪酶、疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、根霉(Rhizopussp.)以及它们的基因改造菌种的脂肪酶中的一种或多种的混合物。
在某些实施方案中，所述种子残渣为植物种子粉碎、磨浆或榨油过程中的产物。
在某些实施方案中，所述种子残渣选自但不限于橄榄果渣、花生粕、油菜籽粕、棉籽粕、核桃渣、棕榈仁渣、豆渣、豆粕、玉米渣和芝麻残渣。
在某些实施方案中，所述粉末吸附剂选自但不限于二氧化硅基粉末吸附剂和活性炭，优选选自白炭黑、硅藻土、硅胶、活性炭、白土、沸石粉和硅酸镁。
本发明还涉及所述固定化脂肪酶的制备及其应用。
本发明制备所述固定化脂肪酶的方法包括将脂肪酶与种子残渣和粉末吸附剂混合、分离出固体以及干燥所述固体的步骤。
在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(1)将种子残渣与粉末吸附剂按一定的比例混合；
(2)将步骤(1)获得的混合物与脂肪酶混合；
(3)从步骤(2)获得的混合物中分离出固体；和
(4)将步骤(3)分离得到的固体干燥，得到所述固定化脂肪酶。
在某些实施方案中，种子残渣与粉末吸附剂的重量比为1:10～10:1，优选为1:5～6:1，更优选为1:3～6:1，更优选为1:2.2～5.5:1。
在某些实施方案中，步骤(1)中粉末吸附剂的用量足以使最终获得的固定化脂肪酶中，以固定化脂肪酶的重量计，所述粉末吸附剂以10％～70％的量存在，优选以20％～50％的量存在。
在某些实施方案中，步骤(1)中种子残渣的用量足以使最终获得的固定化脂肪酶中，以固定化脂肪酶的重量计，所述种子残渣(干基)以20％～80％的量存在，优选以40％～70％的量存在。
在某些实施方案中，所述种子残渣为植物种子粉碎、磨浆或榨油过程中的产物。
在某些实施方案中，所述种子残渣选自但不限于橄榄果渣、花生粕、油菜籽粕、棉籽粕、核桃渣、棕榈仁渣、豆渣、豆粕、玉米渣和芝麻残渣。
在某些实施方案中，所述粉末吸附剂选自但不限于二氧化硅基粉末吸附剂和活性炭，优选选自：白炭黑、硅藻土、硅胶、活性炭、白土、沸石粉和硅酸镁。
在某些实施方案中，所述脂肪酶为来自动物、植物或微生物的脂肪酶。
在某些实施方案中，所述脂肪酶固定化后表现出Sn-1,3专一性。
在某些实施方案中，所述脂肪酶选自但不限于：猪胰脂肪酶；来自疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、米根霉(Rhizopusoryzae)、南极假丝酵母(Candida antarctica)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)和根霉(Rhizopus sp.)以及它们的基因改造菌种的脂肪酶中的一种或多种的混合物；优选Sn-1,3专一性脂肪酶，选自猪胰脂肪酶、疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、根霉(Rhizopus sp.)以及它们的基因改造菌种的脂肪酶中的一种或多种的混合物。
在某些实施方案中，步骤(2)中，脂肪酶以溶液或粉末的形式提供。
在某些实施方案中，步骤(2)中，脂肪酶的量足以使最终获得的固定化脂肪酶中，以固定化脂肪酶的重量计，所述脂肪酶以0.2％～6％的量存在，优选以0.7％～2％的量存在。
在某些实施方案中，经步骤(4)所述的干燥后，所得固定化脂肪酶中水分的含量为3％～25％，优选7％～15％。
在某些实施方案中，步骤(3)所述的分离采用抽滤、过滤、离心和/或板框压滤进行。
在某些实施方案中，步骤(4)所述的干燥包括自然干燥、真空干燥、流化床干燥和/或冷冻干燥。
本发明还包括种子残渣与粉末吸附剂的混合物作为脂肪酶的固定化载体的用途，以及种子残渣与粉末吸附剂的混合物在制备固定化脂肪酶中的用途。
在某些实施方案中，所述种子残渣为植物种子粉碎、磨浆或榨油过程中的产物。
在某些实施方案中，所述种子残渣选自但不限于橄榄果渣、花生粕、油菜籽粕、棉籽粕、核桃渣、棕榈仁渣、豆渣、豆粕、玉米渣和芝麻残渣。
在某些实施方案中，所述粉末吸附剂选自但不限于二氧化硅基粉末吸附剂和活性炭，优选选自：白炭黑、硅藻土、硅胶、活性炭、白土、沸石粉和硅酸镁。
在某些实施方案中，所述脂肪酶为来自动物、植物或微生物的脂肪酶。
在某些实施方案中，所述脂肪酶固定化后表现出Sn-1,3专一性。
在某些实施方案中，所述脂肪酶选自但不限于：猪胰脂肪酶；来自疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、米根霉(Rhizopusoryzae)、南极假丝酵母(Candida antarctica)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)和根霉(Rhizopus sp.)以及它们的基因改造菌种的脂肪酶中的一种或多种的混合物，优选为Sn-1,3专一性脂肪酶，选自猪胰脂肪酶、疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、根霉(Rhizopussp.)以及它们的基因改造菌种的脂肪酶中的一种或多种的混合物。
在某些实施方案中，所述混合物中种子残渣(干基)与粉末吸附剂的重量比为1:10～10:1，优选为1:5～6:1，更优选为1:3～6:1，更优选为1:2.2～5.5:1。
本发明还包括采用上述方法制备得到的固定化脂肪酶。
本发明还包括一种载体，含有种子残渣与粉末吸附剂的混合物，或由该混合物组成。
在某些实施方案中，所述种子残渣选自但不限于橄榄果渣、花生粕、油菜籽粕、棉籽粕、核桃渣、棕榈仁渣、豆渣、豆粕、玉米渣和芝麻残渣。
在某些实施方案中，所述粉末吸附剂选自但不限于二氧化硅基粉末吸附剂和活性炭，优选选自：白炭黑、硅藻土、硅胶、活性炭、白土、沸石粉和硅酸镁。
在某些实施方案中，所述混合物中种子残渣(干基)与粉末吸附剂的重量比为1:10～10:1，优选为1:5～6:1，更优选为1:3～6:1，更优选为1:2.2～5.5:1。
本发明还包括本发明的固定化脂肪酶在甘油三酯水解和油脂酯交换中的应用。
在某些实施方案中，所述应用包括在选择性水解三酰甘油的1位和3位中的应用。
在某些实施方案中，所述应用包括：(1)酶法合成结构脂质，改变甘油骨架上脂肪酸组成和/或位置分布，得到具特定分子结构的三酰基甘油，即特定的脂肪酸残基位于特定的位置；(2)母乳脂肪替代品的制备；(3)合成类可可脂的制备；和(4)合成甘油二酯。
具体实施方式
本发明涉及使用包含种子残渣和粉末吸附剂的混合物作为脂肪酶的固定化载体，制备固定化脂肪酶。
适用于本发明所述各方面(产品、方法和用途)的种子残渣可以是各种植物的种子在粉碎、磨浆、榨油等加工过程中的产物。因此，本发明的种子残渣可以是，例如橄榄果渣、花生粕、油菜籽粕、棉籽粕、核桃渣、棕榈仁渣、豆渣、豆粕、玉米渣和芝麻残渣等。尤其优选的种子是大豆、玉米和芝麻。
适用于本发明所述各方面(产品、方法和用途)的粉末吸附剂可以是本领域周知的各种粉末吸附剂，尤其是各种已知用来制备固定化脂肪酶的粉末吸附剂。更优选的，使用本领域周知的各种二氧化硅基粉末吸附剂，包括但不限于白炭黑、硅藻土、硅胶、白土、沸石粉和硅酸镁中的一种或任意多种的任意比例的混合物。除此之外，还可使用活性炭。优选使用白炭黑和硅藻土。白炭黑和硅藻土是多孔性物质，其组成都可用SiO2·nH2O表示。硅胶的组成可用mSiO2·nH2O表示。可采用市售的白炭黑来实施本发明，例如可使用来自邱博工程材料有限公司的白炭黑产品。应理解，一些颗粒型吸附剂经粉碎成粉末也可用作粉末吸附剂。
用于制备固定化脂肪酶时，包含种子残渣与粉末吸附剂的混合物中，种子残渣(干基)与粉末吸附剂的重量比通常为1:10～10:1，优选为1:5～6:1，更优选为1:3～6:1，更优选为1:2.2～5.5:1。
因此，本发明某些实施方案中提供一种载体，优选是固定化脂肪酶用载体，含种子残渣和粉末吸附剂，或由所述种子残渣和粉末吸附剂组成。该固定化脂肪酶用载体中的种子残渣和粉末吸附剂及其用量配比优选如本文所述。
适用于本发明所述各方面(产品、方法和用途)的脂肪酶可以是来自动物、植物的脂肪酶，如猪胰脂肪酶，也可以使用来自微生物的脂肪酶，如来自疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、米根霉(Rhizopusoryzae)、南极假丝酵母(Candida antarctica)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)和根霉(Rhizopus sp.)等以及它们的基因改造菌种的脂肪酶中的一种或多种的混合物。
优选的是，脂肪酶是Sn-1,3专一性脂肪酶，可以选自猪胰脂肪酶、疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、根霉(Rhizopus sp.)以及它们的基因改造菌种的脂肪酶中的一种或多种的混合物。
固定化脂肪酶
本发明的固定化脂肪酶包含有种子残渣、粉末吸附剂和脂肪酶。
通常，以固定化脂肪酶的重量计，所述粉末吸附剂以10％～70％的量存在，优选以20％～50％的量存在；所述种子残渣(干基)以20％～80％的量存在，优选以40％～70％的量存在；所述脂肪酶以0.2％～6％的量存在，优选以0.7％～2％的量存在。
通常，固定化脂肪酶还存在一定量的水分。例如，以固定化脂肪酶的重量计，所述水分以3％～25％的量存在，优选以7％～15％的量存在。
或者，以干物质重量计，种子残渣与粉末吸附剂的重量比为1:10～10:1，优选1:5～6:1，更优选1:3～6:1，例如1:2.2～5.5:1。
优选的是，本发明的固定化脂肪酶含有种子残渣、粉末吸附剂、脂肪酶和水分，以固定化脂肪酶的重量计，所述粉末吸附剂以20％～50％的量存在；所述种子残渣(干基)以40％～70％的量存在；所述脂肪酶以0.7％～2％的量存在；所述水分以7％～15％的量存在；以干物质重量计，种子残渣与粉末吸附剂的重量比为1:2.2～5.5:1。进一步优选的是，种子残渣为豆渣。
固定化脂肪酶的制备
本发明制备固定化脂肪酶的方法通常包括将脂肪酶与种子残渣和粉末吸附剂混合、分离出固体以及干燥所述固体的步骤。
应理解，可先混合种子残渣与粉末吸附剂，然后再将所得混合物与脂肪酶混合。或者，也可先使脂肪酶与种子残渣或粉末吸附剂混合，然后再将所得混合物与另外一种载体(粉末吸附剂或种子残渣)混合。
混合过程即为固定化过程。可以本领域常规的固定化的方式进行，例如可在搅拌机中混合/固定。例如，在某些实施方案中，在气浴摇床上混合，转速为100～200rpm。混合应使得脂肪酶与种子残渣和/或粉末吸附剂充分接触，均匀混合。
对混合时的温度并无特殊限制，通常在室温(例如23～28℃左右)下进行混合。
对混合的时间也无特殊限制，通常在1～8小时之间，例如3～5小时。
在某些实施方案中，所述方法可包括以下步骤：
(1)将种子残渣与粉末吸附剂按一定的比例混合；
(2)将步骤(1)获得的混合物与脂肪酶混合；
(3)从步骤(2)获得的混合物中分离出固体；和
(4)将步骤(3)分离得到的固体干燥，得到所述固定化脂肪酶。
通常，种子残渣(干基)与粉末吸附剂的重量比为1:10～10:1，1:5～6:1，更优选1:3～6:1，更优选1:2.2～5.5:1。
本发明的方法中，粉末吸附剂的用量应足以使最终获得的固定化脂肪酶中，以固定化脂肪酶的重量计，所述粉末吸附剂以10％～70％的量存在，优选以20％～50％的量存在；种子残渣的用量足以使最终获得的固定化脂肪酶中，以固定化脂肪酶的重量计，所述种子残渣(干基)以20％～80％的量存在，优选以40％～70％的量存在。
本发明方法中，脂肪酶可以溶液或粉末的形式提供。脂肪酶溶液可以为市售的脂肪酶溶液，也可以是自行发酵的脂肪酶溶液。脂肪酶粉末可以是市售的脂肪酶粉末，也可以是自行发酵的脂肪酶溶液干燥(例如，自行喷雾干燥或冷冻干燥等)后获得的脂肪酶粉末。应理解，若以粉末的形式提供脂肪酶时，通常先将其配制为溶液，然后再与所述种子残渣和/或粉末吸附剂混合。若将脂肪酶粉末配制为脂肪酶溶液时，可将酶粉溶解于缓冲液中。混合或配制可以是技术人员容易想到的各种方式：例如当脂肪酶以粉末形式提供时，可在水存在的情况下直接将粉末形式的脂肪酶与种子残渣和/或粉末吸附剂混合；也可以直接先将粉末形式的脂肪酶与种子残渣和/或粉末吸附剂混合后，再加水使用。
通常，与种子残渣和/或粉末吸附剂混合的脂肪酶的加入量应满足：最终获得的固定化脂肪酶中所含有的所述脂肪酶的重量百分比含量为0.2％～6％，优选为0.7％～2％(以固定化脂肪酶的重量计)。
可采用抽滤、过滤、离心和/或板框压滤将固体形式的固定化脂肪酶分离出来，然后进行干燥。抽滤、过滤、离心和板框压滤的具体实施条件都是常规的条件，在本领域技术人员所掌握的知识范围之内。
干燥包括自然干燥、真空干燥、流化床干燥和/或冷冻干燥。干燥的条件，例如温度、压力和干燥时间等也都可由技术人员根据实际生产制备情况并结合本领域公知技术予以确定。
通常，干燥后，所得固定化脂肪酶中水分的含量为3％～25％，优选7％～15％。
本发明也包括采用上述方法制备获得的固定化脂肪酶。
固定化脂肪酶的性质和用途
本发明的固定化脂肪酶可用于甘油三酯的水解反应，也可用于油脂的酯交换反应。尤其是，当本发明的脂肪酶是Sn-1,3专一性脂肪酶时，该脂肪酶具有较高的Sn-1,3专一性。
本发明涉及的固定化脂肪酶，尤其是具有Sn-1,3专一性的脂肪酶可以使用在各种需要选择性地水解三酰甘油的1位和3位的应用中，包括但不限于以下这些具体应用：(1)酶法合成结构脂质，改变甘油骨架上脂肪酸组成和(或者)位置分布，得到具特定分子结构的三酰基甘油，即特定的脂肪酸残基位于特定的位置；(2)母乳脂肪替代品的制备；(3)合成类可可脂的制备；(4)合成甘油二酯。
本发明的固定化脂肪酶及其制备方法具有以下优点：
(1)本发明利用种子加工过程中的副产品种子残渣及价格非常低廉的粉末吸附剂混合作为脂肪酶的载体，提高了副产物的利用价值，降低了固定化脂肪酶的成本；
(2)固定化过程简单，省时省力；和
(3)所制备的固定化脂肪酶具有很高的活力，同时具有较高的Sn-1,3专一性，是种子残渣或粉末吸附剂单独作为载体所无法达到的。
在本发明的下述实施例中，水分含量及干基的测定方法，烘箱干燥法参照GB5009.3-2010；固定化酶中酶蛋白的量测定方法，参照文献L.Mojovic,et al.Immobilization of lipase from Candida rugosa on a polymer support.ApplMicrobiol Biotechnol,1998。对于实施例所采用的各种方法、试剂和条件，除非另有说明，否则均为本领域常规的方法、试剂和条件。
本发明中的种子残渣或具体的比如玉米渣、豆渣等，若无特别说明，为泛指，可以是干种子残渣、湿种子残渣、种子残渣的干燥物或是种子残渣的润湿物等。但具体实施例中的种子残渣除特别说明外均使用含有一定水分的湿种子残渣。但当计算其重量百分比时，本发明通常采用干基/干重进行计算，即种子残渣除去水分后剩余的物质的重量。
实施例1：固定化脂肪酶制备
1、将10g玉米渣(上海嘉里食品工业有限公司)与10g白炭黑(邱博工程材料有限公司)混合，将150mL自发酵的疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)脂肪酶溶液(41700U/mL，采用橄榄油乳化法测定)加入其中，气浴摇床120rpm，25℃固定4h，抽滤收集固体，将固体分成三份分别进行干燥，采用流化床进风温度40℃，进风量0.6m3/min，流化时间35min，干燥得到固定化酶A，自然风干5天得固定化酶B，-20℃冷冻干燥24h得固定化酶C。
2、将100g豆渣(上海嘉里食品工业有限公司，含水量85％)与10g白炭黑混合(邱博工程材料有限公司)，将市售米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶溶液(诺维信公司)用水配成水解活力为40000U/mL(采用橄榄油乳化法测定)的脂肪酶溶液，取200mL加入以上豆渣与白炭黑混合物中，气浴摇床120rpm，25℃固定4h，抽滤收集固体，将所得的固体进行35℃真空干燥24h得固定化酶D。
3、将33g豆渣(上海嘉里食品工业有限公司，含水量80％)与10g白炭黑(邱博工程材料有限公司)混合，将150mL自发酵的疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶液(41700U/mL，采用橄榄油乳化法测定)加入其中，200rpm机械搅拌，35℃固定2h，离心除去上清液，将固体放到通风良好的地方进行自然风干5天，干燥后得固定化酶E。
4、将12g橄榄果渣与10g硅藻土(邱博工程材料有限公司)混合，将100mL自发酵的疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶液(41700U/mL，采用橄榄油乳化法测定)和50mL米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶溶液(43600U/mL，采用橄榄油乳化法测定)加入其中，200rpm机械搅拌，35℃固定2h，离心除去上清液，将固体放到通风良好的地方进行自然风干5天，干燥后得固定化酶F。
5、将200g玉米磨浆残渣(含水量80％)与15g沸石粉(100～300目，辉煌保温材料厂)混合。将市售的猪胰脂肪酶(Sigma公司)粉末用水配制成水解活力为30000U/mL(采用橄榄油乳化法测定)的溶液，取200mL加入以上玉米磨浆残渣和白炭黑的混合物中，100rpm机械搅拌，30℃固定5h，离心分离出固体，将所得到的固体进行-20℃冷冻干燥36h得固定化酶G。
比较例
1、向150mL自行发酵的疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶(41700U/mL，采用橄榄油乳化法测定)中加入134g豆渣(上海嘉里食品工业有限公司，含水量85％)，气浴摇床120rpm，25℃吸附固定2h，抽滤收集固体，将固体进行自然风干4天得固定化酶H。
2、向150mL自行发酵的疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶(41700U/mL，采用橄榄油乳化法测定)中加入20g白炭黑(含水量85％)，气浴摇床120rpm，25℃吸附固定4h，抽滤收集固体，将固体进行自然风干5天得固定化酶I。
所制备的固定化脂肪酶各组分的含量如表1所示。
表1：固定化酶各组分含量
实施例2：固定化脂肪酶水解活力
固定化脂肪酶的水解活力用橄榄油乳化法测定，具体方法参照文献YTGargouri,et al.Process Biochemistry,2011。结果如表2所示。
表2：固定化脂肪酶水解活力
酶号 A B C D E F G H I
水解活力/kU/g 66 113 70 89 57 93 50 10 8
由表2可见，本发明所述的固定化脂肪酶具有很好的水解活力。
实施例3：固定化脂肪酶酯交换活力
以精炼大豆油和辛酸乙酯作为反应底物(质量比1:2)，固定化脂肪酶添加量10w％，60℃下反应4h。反应结束取0.1g产物用1mL正己烷溶解，进行薄层色谱法分析分离出甘三酯并将其刮下，添加1mL正庚烷和1mL NaOH-甲醇(2mol/L)混合2min甲酯化，离心取上清液进行气相色谱法(GC)检测。
表3为各个固定化脂肪酶产物辛酸插入率m，辛酸插入率越高说明固定化脂肪酶酯交换活力越高。
表3：固定化脂肪酶酯交换产物辛酸插入率(％)
由表3可见，本发明所述的固定化脂肪酶具有很好的酯交换活力。
实施例4：固定化脂肪酶专一性
测定实施例3固定化脂肪酶催化产物中2-位脂肪酸组成，方法参照GBT24894-2010，2-位脂肪酸组成中，辛酸的组成为n，并计算Sn-1,3辛酸插入率。
Sn-1,3辛酸插入率(％)＝100*(3m-n)/2
Sn-1,3辛酸插入率反映了固定化脂肪酶Sn-1,3专一性的大小，并且Sn-1,3辛酸插入率越大表明Sn-1,3专一性越强。表4为各固定化脂肪酶酯交换产物Sn-1,3辛酸插入率。
表4：固定化脂肪酶酯交换产物Sn-1,3辛酸插入率(％)
由表4可见，比较例中的固定化脂肪酶H和I几乎没有Sn-1,3专一性，而本发明的固定化脂肪酶A～G均具有Sn-1,3专一性。
实施例5：固定化脂肪酶用于母乳脂肪替代物制备
甘油三硬脂酸酯(嘉里特种油脂(上海)有限公司)与油酸(丰益油脂化学(上海)有限公司)按质量比1:2的比例混合溶解配成反应底物，固定化脂肪酶添加量10％，60℃水浴，150rpm反应4h，制备母乳脂肪替代物1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(OPO)。取样进行GC分析甘三酯组成。
表5：固定化脂肪酶催化产物甘三酯组成中OPO的含量
由表5可见，本发明所涉及的固定化脂肪酶应用于母乳脂肪替代物的合成制备中，所得母乳脂肪替代物OPO的含量相较于比较例有显著的提高。

Claims (10)

1.一种固定化脂肪酶用载体或使用该固定化酶用载体作为载体的固定化脂肪酶，其特征在于，所述固定化脂肪酶用载体含有种子残渣和粉末吸附剂，或由种子残渣和粉末吸附剂组成。
2.如权利要求1所述的固定化脂肪酶用载体或固定化脂肪酶，其特征在于，
所述种子残渣选自：橄榄果渣、花生粕、油菜籽粕、棉籽粕、核桃渣、棕榈仁渣、豆渣、豆粕、玉米渣和芝麻残渣中的一种或几种；和/或
所述粉末吸附剂选自二氧化硅基粉末吸附剂和活性炭，优选选自：白炭黑、硅藻土、硅胶、活性炭、白土、沸石和硅酸镁中的一种或几种；和/或
所述脂肪酶选自：猪胰脂肪酶、来自状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、萤光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、米根霉(Rhizopus oryzae)、南极假丝酵母(Candida antarctica)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)、皱褶假丝酵母(Candidarugosa)和根霉(Rhizopus sp.)以及它们的基因改造菌种的脂肪酶中的一种或多种的混合物；优选为Sn-1,3专一性脂肪酶，选自猪胰脂肪酶、疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、根霉(Rhizopus sp.)以及它们的基因改造菌种的脂肪酶中的一种或多种的混合物。
3.如权利要求1－2中任一项所述的固定化脂肪酶用载体或固定化脂肪酶，其特征在于，
以固定化脂肪酶的重量计，所述粉末吸附剂以10％～70％的量存在，优选以20％～50％的量存在；和/或
以固定化脂肪酶的重量以及种子残渣的干重计，所述种子残渣以20％～80％的量存在，优选以40％～70％的量存在；和/或
以固定化脂肪酶的重量计，所述脂肪酶以0.2％～6％的量存在，优选以0.7％～2％的量存在；和
优选的，以干物质重量计，种子残渣与粉末吸附剂的比例为1:10～10:1，优选为1:5～6:1，更优选为1:3～6:1，更优选为1:2.2～5.5:1。
4.如权利要求1－3中任一项所述的固定化脂肪酶用载体或固定化脂肪酶，其特征在于，所述固定化脂肪酶含有水分，以固定化脂肪酶的重量计，所述水分以3％～25％的量存在，优选以7％～15％的量存在。
5.一种制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述方法包括混合脂肪酶、种子残渣和粉末吸附剂，分离出固体以及干燥所述固体的步骤；
优选地，所述方法包括：
(1)将种子残渣与粉末吸附剂按一定的比例混合；
(2)将步骤(1)获得的混合物与脂肪酶混合；
(3)从步骤(2)获得的混合物中分离出固体；和
(4)将步骤(3)分离得到的固体干燥，得到所述固定化脂肪酶。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法具有以下一个或多个特征：
(1)种子残渣(干基)与粉末吸附剂的重量比为1:10～10:1，优选为1:5～6:1，更优选为1:3～6:1，更优选为1:2.2～5.5:1；
(2)粉末吸附剂的用量足以使最终获得的固定化脂肪酶中，以固定化脂肪酶的重量计，所述粉末吸附剂以10％～70％的量存在，优选以20％～50％的量存在；
(3)种子残渣的用量足以使最终获得的固定化脂肪酶中，以固定化脂肪酶的重量计，所述种子残渣(干基)以20％～80％的量存在，优选以40％～70％的量存在；
(4)所述种子残渣为植物种子粉碎、磨浆或榨油过程中的产物；
(5)脂肪酶的量足以使最终获得的固定化脂肪酶中，以固定化脂肪酶的重量计，所述脂肪酶以0.2％～6％的量存在，优选以0.7％～2％的量存在；和
(6)干燥后，所得固定化脂肪酶中水分的含量为3％～25％，优选7％～15％。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法具有以下一个或多个特征：
(a)所述脂肪酶选自：猪胰脂肪酶、来自疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、萤光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、米根霉(Rhizopus oryzae)、南极假丝酵母(Candida antarctica)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)、皱褶假丝酵母(Candidarugosa)和根霉(Rhizopus sp.)以及它们的基因改造菌种的脂肪酶中的一种或多种的混合物；优选为Sn-1,3专一性脂肪酶，选自猪胰脂肪酶、疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、根霉(Rhizopus sp.)以及它们的基因改造菌种的脂肪酶中的一种或多种的混合物；
(b)所述种子残渣选自橄榄果渣、花生粕、油菜籽粕、棉籽粕、核桃渣、棕榈仁渣、豆渣、豆粕、玉米渣和芝麻残渣；
(c)所述粉末吸附剂选自二氧化硅基粉末吸附剂和活性炭，优选选自：白炭黑、硅藻土、硅胶、活性炭、白土、沸石和硅酸镁；和
(d)干燥包括自然干燥、真空干燥、流化床干燥和/或冷冻干燥。
8.种子残渣与粉末吸附剂的混合物作为脂肪酶的固定化载体的用途，或种子残渣与粉末吸附剂的混合物在制备固定化脂肪酶中的用途；
优选的，所述种子残渣为植物种子粉碎、磨浆或榨油过程中的产物，优选选自橄榄果渣、花生粕、油菜籽粕、棉籽粕、核桃渣、棕榈仁渣、豆渣、豆粕、玉米渣和芝麻残渣；和/或
所述粉末吸附剂选自二氧化硅基粉末吸附剂和活性炭，优选选自：白炭黑、硅藻土、硅胶、活性炭、白土、沸石、硅酸镁；和/或
所述脂肪酶为来自动物、植物或微生物的脂肪酶；优选地，所述脂肪酶选自：猪胰脂肪酶、来自疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、米根霉(Rhizopus oryzae)、南极假丝酵母(Candida antarctica)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)和根霉(Rhizopus sp.)中的任何一种或其基因改造菌种的脂肪酶中的一种或多种的混合物；优选地，所述脂肪酶为Sn-1,3专一性脂肪酶，选自猪胰脂肪酶、疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、萤光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、根霉(Rhizopus sp.)以及它们的基因改造菌种的脂肪酶中的一种或多种的混合物；和/或
所述混合物中种子残渣(干基)与粉末吸附剂的重量比为1:10～10:1，优选为1:5～6:1，更优选为1:3～6:1，更优选为1:2.2～5.5:1。
9.采用权利要求5－7中任一项所述的方法制备得到的固定化脂肪酶。
10.权利要求1－4和9中任一项所述的固定化脂肪酶在甘油三酯水解和油脂酯交换中的应用，包括在选择性水解三酰甘油的1位和3位中的应用，例如：(1)酶法合成结构脂质，改变甘油骨架上脂肪酸组成和/或位置分布，得到具特定分子结构的三酰基甘油，即特定的脂肪酸残基位于特定的位置；(2)母乳脂肪替代品的制备；(3)合成类可可脂的制备；和(4)合成甘油二酯。
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