JPS62287A - 酵素による油脂の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は酵素による油脂の精製法に関し、さらに詳しく
は油脂にモノグリセラードリパーゼおよび／またはジグ
リセライドリパーゼ（以下これらを総称して部分グリセ
ライドリパーゼという）を作用せしめ、油脂中のトリグ
リセライドに混在するモノグリセラードおよび／または
ジグリセライド（以下これらを総称して部分グリセライ
ドという）を加水分解することを特徴とする油脂の＋ｎ
製法に関する。

即ち、本発明は油脂に含まれる不純物たる部分グリセラ
イドを分解除去して、高トリグリセライド含量の油脂を
提供することを目的とする。

従来の技術 油脂は、脂肪酸とグリセロールとのエステル、即ちトリ
グリセライドを主成分として含有し、トリグリセライド
以外の成分としては部分グリセライド、遊離脂肪酸およ
び不ケン化物を少量含有している。

油脂に混在する部分グリセライドは、その起源である動
植物並びに微生物の生体内で合成されたもの、油脂の貯
蔵中にそこに含まれるリパーゼの作用若しく１ま非酵素
的な作用でトリグリセライドが部分加水分解されてでき
たもの、或いはエステル交換、脂肪酸とグリセロールか
らの油脂の合成などの油脂加工の工程で副産物として生
じたものなどに由来している。天然の油脂では、特にア
プラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ　ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ　）の
果肉より採取されるパーム油およびオリーブ（Ｏｌｅａ
　ｅｕｒｏｐａｅａ　）の果実より採取されるオリーブ
油は水分含量が高いため油脂の採取工程および貯蔵中に
酵素による加水分解を受けやすく、またコメ油の原料で
ある米糠には強いリパーゼ活性が含まれるため、それぞ
れの油脂は部分グリセライド含量が高い。

従来油脂中の不純物を除去する方法としては、まず、脂
肪酸の除去を目的としたアルカリ精製、有臭成分やその
他の揮発成分並びに脂肪酸の除去を目的とした真空水蒸
気蒸留、およびガム質、炭水化物、蛋白質などの除去を
目的とした脱ガムが行われており、これらの不純物の除
去は比較的容易である。ところが、トリ、）およびモノ
グリセラード相互の分離は、これらの分析のための手段
、即ちケイ酸を用いたカラムクロマトグラフィーや薄層
クロマトグラフィー並びに分子篩効果を利用したゲルパ
ーミェーションクロマトグラフィーなどの手法が用いら
れているすぎない。また、脂肪酸の除去と油脂の構成ト
リグリセライドの分別を目的として、トリグリセライド
の融点の差を利用した分別結晶、溶剤に対する溶解度の
差を利用した液−液抽出および沸点の差を利用した分別
蒸留並びに分子蒸留が行われているが、これらの方法で
はモノグリセラードは多少除去されるものの、ジグリセ
ライドの除去は困難であった。

発明が解決しようとする問題点 上記したクロマトグラフィー法による油脂からの部分グ
リセライドの除去は、実験室的には可能であっても工業
的規模では側底採用されるものではなかった。また、油
脂中の構成トリグリセライドの分別を目的とした前記の
手段では、ジグリセライドはトリグリセライドと共融混
合物を作るためこれらの分離ができなかった。即ち、従
来油脂から工業的に部分グリセライドを除去することが
切望されていたにもかかわらず、その目的に通した方法
が実質的に存在しなかったと言える。

部分グリセライドの混在は油脂に様々の好ましからざる
影響を及ぼす。第一に、部分グリセライドはトリグリセ
ライドの結晶核の生成を妨げる作用があり、例えばパー
ム油中の約２％以上のモノグリセラードの存在はトリグ
リセライドの結晶核の生長を阻害し、また同油中の約１
３％のジグリセライドの存在はα型結晶のライフタイム
を著しく長くし、更に、一般に油脂または油脂製品中の
ジグリセライドの存在はトリグリセライドのβ゛からβ
型への結晶転移を抑制するとされている（Ｏｌｅａｇｉ
ｎｉａｕｘ、２９，４２１．１９７４；　Ｏ４ｌ　Ｐａ
１ｍ　Ｎｅｗｓ。

２２、１０−１８．１９７７；　Ｊ、Ｓｃｉ、　Ｆｏｏ
ｄ　Ａｇｒｉｃ、、３２゜１１９７、１９８１およびＰ
ｅｔｔｅ　５ｅｉｆｅｎ　Ａｎｓｔｒｉｃｈｍ、　８５
＋６４、１９８３）。

次に、ジグリセライドは、前述のようにトリグリセライ
ドと共融混合物を作り、これらの分離を困難とするだけ
でなく、油脂の固体脂指数を減少させる作用があるため
、結晶に関与する高融点トリグリセライドの見掛けの含
有量が実際より低下するので固体部の収量が低下し、そ
して同時に液体部にも固体部の一部が残存することとな
るので、トリグリセライドの分別が不完全となる。また
、部分グリセライドはそれ自身乳化作用を有するため極
性有機溶媒を用いたトリグリセライドの分別結晶におい
てその効率を低下させる原因となる。

上記トリグリセライドの分別に及ぼす影響の他に、油脂
中での部分グリセライドの存在が問題となる例として、
カカオ代用脂のようにシャープな融点が要求される油脂
製品の場合、部分グリセライドは油脂の融点を不明瞭か
つ幅広いものとする原因物質となる。

問題点を解決するための手段、作用 本発明によれば、油脂に部分グリセライドリパーゼを作
用せしめることにより油脂中に混在する部分グリセライ
ドのみが加水分解され、その結果トリグリセライドから
の分離が容易となる。

本発明で使用される部分グリセライドリパーゼは、グリ
セロールの三つの水酸基のいずれか一つが脂肪酸でエス
テル化されたいわゆるモノグリセラードおよび／または
グリセロールの１，２（または２．３）乃至１，３の位
置の水酸基が脂肪酸でエスチル化されたいわゆるジグリ
セライドを加水分解する性質を有するが、三つの位置全
てが脂肪酸でエステル化されたトリグリセライドに対す
る特異性は全く若しくはほとんど有しない酵素である。

部分グリセライドばかりでなくトリグリセライドに高い
特異性を有するいわゆるトリグリセライドリパーゼは、
トリグリセライドをまず速やかに加水分解するため本発
明の目的には使用できない。

本発明で用いられる部分グリセライドリパーゼの例とし
ては、ラット小腸、ブタ脂肪組織などの動物臓器由来の
モノグリセラードリパーゼまたはジグリセライドリパー
ゼ、ペニシリウム（Ｐｅｎｉ−ｃｉｌｌｉｕ…）属の糸
状菌が産生ずるモノグリセラードおよびジグリセライド
に特異性を有するリパーゼが挙げられる。好ましくはペ
ニシリウム属菌株由来のリパーゼ、特に好ましくはＡＴ
ＣＣ３４６１３なる受託番号でアメリカン　タイプ　カ
ルチャーコレクションに寄託されているペニシリウム・
サイクロピウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　　ｃｙｃｌ
ｏｐｉｕｍ）の産生ずる部分グリセライドリパーゼが用
いられる。該菌株は当該寄託機関のカタログに掲載され
ており、何人も入手可能である。ペニシリウム・サイク
ロピウムがトリグリセライドリパーゼと同時に部分グリ
セライドリパーゼを産生すること、それ自体は公知であ
る（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、８７，２０５　２１１．
１９８０）。

しかしながら、当該部分グリセライドリパーゼが本発明
の目的に使用できることを示唆する如何なる先行文献も
本発明者らは知らない。

本発明に使用される部分グリセライドリパーゼをペニシ
リウム属の菌株より取得するには、部分グリセライドリ
パーゼを産生ずる能力を有するペニシリウム属菌株を通
常の微生物の培養に用いられる培地に増殖せしめ、培養
物中に部分グリセライドリパーゼを蓄積せしめ、これよ
り採取することができる。培養物から採取した部分グリ
セライドリパーゼの純化は、公知の精製手段により行う
ことができるが、本発明の目的にはあえて純粋の伏態に
まで精製する必要はない。ただし、粗製酵素中にトリグ
リセライドリパーゼが含まれる場合にはそれを除去しな
ければならない。本発明において特に好適に用いられる
ペニシリウム・サイクロピウムＡＴＣＣ３４６１３株の
培養物中にはトリグリセライドリパーゼが含まれるが、
その粗製酵素液をクロマトグラフィー、特に好ましくは
ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ、−６Ｂを使用するクロマ
トグラフィーに付すことによってトリグリセライドリパ
ーゼを分離除去することができる。

本発明において精製の対象となる油脂は、天然または合
成の油脂、これらの加工された油脂、並びにそれらを含
む油脂製品である。天然の油脂には、動物の組織、植物
の果実および種子、微生物の培養物などから抽出された
粗原油、並びにこれら粗原油にアルカリ精製、脱ガム、
脱臭などの処理を施した精製油が含まれ、合成の油脂に
は、触媒の存在下脂肪酸とグリセロールから合成された
油脂が含まれ、加工油脂には、油脂に当分野で用いられ
る一般的な加工技術である分別、水素添加、エステル交
換などの処理を施したものが含まれる。

より具体的には、大豆油、綿実油、パーム油、ヤシ油、
オリーブ油、コメ油、ゴマ油、コーン油、サフラワー油
、牛脂、豚脂、魚油などの粗原油およびこれらの精製油
、並びにそれらを加工した硬化油、エステル交換油、天
ぷら浦、フライ浦、サラダ油、ハードバター、マーガリ
ン、ショートニング、精製ラード、乾性油などが挙げら
れる。

本発明における油脂と部分グリセライドとの反応の条件
は、用いる部分グリセライドリパーゼの加水分解活性が
発現され得れば如何なる条件でもよい。例えば、反応の
温度は用いる部分グリセライドリパーゼの至適温度およ
び油脂の融点に応じて適切な値を選ぶことができるが、
通常２０〜５５℃が好ましい。反応の時間は、油脂中の
部分グリセライドが要求される値に低下する時間を選べ
ばよい。リパーゼ反応は一般に可逆的であり、反応系の
水分含量が高いときは加水分解反応を、低いときはエス
テル合成反応を触媒する。従って本発明では水分の存在
は必須であり、水分含量の高い程好ましいと言えるが、
多すぎる水分の添加は酵素反応後の油脂の精製に際し水
分の除去が煩わしいだけである。好適な水分含量は油脂
に対して０．５〜１０倍（Ｖ／Ｗ）である。水分の調整
には水または用いる部分グリセライドリパーゼに適した
ｐＨの緩衝液が用いられる。部分グリセライドリパーゼ
の使用量は、油脂中に存在する部分グリセライドの量、
反応の温度、時間などに応じて変えることができるが、
通常油脂１ｇ当り　０．１−１，０００単位、特に好ま
しくは１〜１００単位である。本発明では、部分グリセ
ライドリパーゼを不溶性”担体に結合させ、固定化酵素
として使用することもできる。

固定化酵素は酵素を反覆または連続して使用できるため
好ましい。

更に本発明では、反応系に有ｍｆ４媒を添加することが
好ましい。有機溶媒の添加は、反応系の水分含量を少な
くすることができ、また高融点の油脂を熔解し、反応速
度を促進するという効果がある。用いられる有機溶媒は
油脂を溶解するが、部分グリセライドリパーゼの加水分
解活性を阻害しなければ如何なるものでもよい。例えば
、好ましい有機溶媒としてはｎ−へキサン１．シクロヘ
キサン、デカン、ウンデカン、ヘキサデカン、テトラデ
カン、ペンタデカン、石油エーテル、ジエチルエーテル
、アセトン、メチルエチルケトンが挙げられる。有機溶
媒の添加量は油脂に対し０．１〜１０倍（Ｖ／Ｗ）が好
ましい。

反応の操作は、油脂と水溶性の酵素は本来親和性を欠く
ため、互いに接触を良くするように物理的条件を整える
ことが望まれる。例えば、攪拌装置のついた反応槽にビ
ーズを入れて反応することにより油脂と部分グリセライ
ドリパーゼの接触面を増大し、反応を速やかに進行させ
ることができる。

本発明に従い、部分グリセライドリパーゼにより加水分
解された油脂中の部分グリセライドはグリセロールと遊
離脂肪酸を生成するが、グリセロールは直ちに水層に移
行するため自動的にトリグリセライドより分離され、一
方遊離脂肪酸はそのまま油層中に残存するが、前述の従
来の油脂の精製手段、即ちアルカリ精製、分別結晶、真
空蒸留、低級アルコールとのエステルの真空蒸留などの
処理により容易にトリグリセライドから分離することが
できる。

以下に試験例および実施例を示して本発明の詳細な説明
する。ただし、油脂の成分の分析および部分グリセライ
ドリパーゼの単位の定義は次のとおりである。

油脂の成分の分析 原料油脂または油脂と部分グリセライドリパーゼとの反
応混合物を石油エーテルに抽出し、その油層成分を調製
用シリカゲル薄層プレー）（ＰＬＫ５、ワットマン社製
）に供し、石油エーテル：ジエチルエーテル：酢酸（８
０：　、３０：　１　、容量比）で展開後、沃素蒸気で
スポットを検出した。各グリセライドおよび脂肪酸に相
当するスポットを回収し、グリセライドは１〜リグリセ
ライドリバーゼを使用した酵素的なグリセライド分析用
試薬組成物（商品名：　Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ　Ｇ
−ｔｅｓｔ　Ｗａｋｏ、和光紬薬社製）により測定し、
脂肪酸はアシルＣｏＡ合成酵素を用いた酵素的な遊離脂
肪酸分析用試薬組成物く商品名：　ＮＥＦＡ　Ｃ−ｔｅ
ｓｔ　Ｗａｋｏ、同社製）により測定した。各分子種の
割合はモル比（％）で表示した。

部分グリセライドリパーゼの単位の定義２．５ｍＭ　　
ｐ−ニトロフェニルラウリン酸および２．０％トリトン
Ｘ　−１００を含む５０ｎ＋Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，６
）　０．９５−と酵素液０．０５−を混合し、３７℃に
おいて１５分間インキュベートした後、アセトン２．０
−を添加して反応を停止する。次いで、反応で遊離した
ｐ−二トロフェノールの量を４１０ｎｍにおける吸光度
の強度から求める。部分グリセライドリパーゼの活性は
、上記反応において１分間に１マイクロモルのｐ−二ト
ロフェノールを遊離せしめる酵素の量を１単位とした。

試験側部分グリセライドリパーゼの調製米糠４％および
コーン・ステイープ・リカー３％より成る液体培地（ｐ
ｌ＋　６．０）にペニシリウム・サイクロピウムＡＴＣ
Ｃ３４６１３を接種し、２６℃において通気、攪拌下、
２日間培養した。得られた培養液より菌体をろ別した後
、ろ液を限外ろ過により濃縮した。この濃縮液をＤＥＡ
Ｅ−セファロースＣＬ−６Ｂ　（ファルマシア社製）を
用いたりロフトグラフイーに付し、共存するトリグリセ
ライドリパーゼを分離除去し、精製部分グリセライドリ
パーゼ標品を得た。この標品はモノグリセラードおよび
ジグリセライドを加水分解するが、トリグリセライドに
対する作用はほとんど有しないことが確認された。

以下の説明では全てこの部分グリセライドリパーゼを使
用した。

実施例１ 製造ロフトの異なる２種類の未精製のパーム油各々　１
．０ｇと部分グリセライドリパーゼの水溶液１．０ｍｔ
’　（２０単位）およびｎ−へキサン３．Ｏｍｅ並びに
径５龍のガラスピーズ３０個を容ｉ　１００−の三角フ
ラスコに入れ、４０°Ｃにおいて１時間振盪（振幅３　
ｃｍ、サイクル１４０回／分）した。元の２種類のパー
ム油にはジグリセライドとモノグリセラードが各々、計
６．４８％および１３．３１％含まれていたが、反応後
は全く検出されなかった（第１表に示す）。

同表において、ＴＧ、ＦＡ、ＤＣおよびＭＧはそれぞれ
トリグリセライド、脂肪酸、ジグリセライドおよびモノ
グリセラードを表す（以下同様）。

第１表 実施例２ 脂肪酸が除去された精製パーム浦製品１．０ｇ、部分グ
リセライドリパーゼの水溶’ａ　０．５ｍｃ　（２０単
位）並びに下記第２表に示す量の水およびｎ−へキサン
を混合した４種類の反応混合物を調整し、実施例１に準
じて反応した。元のパーム油にはジグリセライドとモノ
グリセラードが合計２．０６％含まれていたが、反応終
了後は全く検出されなかった（第２表に示す）。

第２表 実施例３ 実施例２において、パーム油に代えて脂肪酸が除去され
た精製コメ油製品を用い同じ操作を行った。第３表に示
すように、反応混合物に水とｎ−ヘキサンを適当量添加
することにより、部分グリセライドの含量を顕著に低下
させることができた。

第３表 実施例４ 加工パーム油１．０ｇ、部分グリセライドリパーゼの水
溶液１．０ｍｊ　（１０単位）と下記第４表に示す各種
の有機溶媒３．Ｏｍｅまたは５０ｍＭ＃酸緩衝液（ｐＨ
５，６）　２．０−を混合し、実施例１に準じて反応し
た。これら有機溶媒の添加により、低水分含量でも顕著
に部分グリセライドを分解することができた（第４表に
示す）。

第４表 実施例５ 加工した以下の油脂、即ち、パーム油、オリーブ油、コ
メ油、菜種油、ゴマ浦および綿実油の各々　１．０ｇ、
５０ｒｎＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）　５．０−と下記
第５表に示す活性を含む部分グリセライドリパーゼの水
溶液１．０−を混合し、同表に示す温度および反応時間
、実施例１に準じて操作した。反応前後の油脂の組成を
第５表に示す。

第５表 実施例６ トリグリセライド７６．４％、脂肪酸１０．３％、１，
３−シグリセライド８．９％、１．２−ジグリセライド
２．８％およびモノグリセラード１．６％からなる組成
の未精製パーム油ｉ　、　ｏｏｏ　ｇと部分グリセライ
ドリパーゼの水溶液１，０００ｍｅ　（２０，０００単
位）およびｎ−ヘキサン３，０００　ｍｆ’を混合し、
攪拌下、４０℃において１時間反応した。反応混合物を
静置して油層と水層を分別した後、得られた油層に２０
°ｎ６の水酸化ナトリウム　１５１ｍ１を加え、６０℃
において攪拌し、生成したセッケンの沈澱をろ別した。

得られた油状物を減圧蒸留に付して溶媒を除去し、精製
パーム油８３３ｇを得た。この油脂の組成は（トリグリ
セライド９９．９８％、脂肪酸０．０２％で、部分グリ
セライドは検出されなかった。

発明の効果 本発明によれば、トリグリセライドの分解を伴うことな
く、油脂に不純物として混在する部分グリセライドが酵
素によって脂肪酸とグリセロールに加水分解され、その
結果トリグリセライドからの分離が容易となった。本発
明に従って精製された油脂はトリグリセライド含量が高
く、その結晶性、融点等の物理的性質が改善され、高品
質、高付加価値の油脂製品となり得る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　油脂にモノグリセラードリパーゼおよび／またはジ
   グリセライドリパーゼを作用せしめ油脂中に存在するモ
   ノグリセラードおよび／またはジグリセライドを加水分
   解することを特徴とする酵素による油脂の精製法。 ２　モノグリセラードリパーゼおよび／またはジグリセ
   ライドリパーゼがペニシリウム・サイクロピウムＡＴＣ
   Ｃ３４６１３株の産生するリパーゼである特許請求の範
   囲第１項記載の酵素による油脂の精製法