CN113151369A - 一种发酵富集咖啡豆中γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种发酵富集咖啡豆中γ‑氨基丁酸的方法，属于生物技术领域，本发明采用乳酸菌作为发酵菌株对咖啡豆进行发酵处理，乳酸菌菌株包括耐久肠球菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌中的一种或多种。采用耐久肠球菌与保加利亚乳杆菌混合菌种对咖啡豆进行发酵处理，可提高咖啡豆中GABA的含量且效果优于单一菌种；当咖啡豆复水比为1:1.5，发酵温度36℃、发酵时间72h，混合菌液添加量2%，MSG浓度为5mg/ml、PLP浓度为0.2mmol/l时，发酵咖啡豆中GABA产量可达到137.725mg/100g，比未发酵云南小粒咖啡豆的GABA含量提高了5.75倍。本发明的方法绿色环保，有利于规模化、工业化生产，可用于制作富含GABA的咖啡保健饮品，也用于生产GABA以作为功能性食品添加剂广泛应用于食品行业中。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的说，涉及一种混合乳酸菌发酵富集云南小粒咖啡豆中γ-氨基丁酸的方法。
背景技术
咖啡是采用经过烘焙的咖啡豆(咖啡属植物的种子)所制作出来的饮料，是目前世界上最受欢迎的饮料之一，在全球期货贸易额度排名中位列第二。近年来许多科研工作者对咖啡的药理活性进行了深入的研究，许多研究发现咖啡具有预防二型糖尿病、保护心血管、增强记忆力、缓解头痛、控制哮喘等功效。GABA是以游离态或结合态存在于植物、动物、细菌等生物体中的一种四碳、非蛋白质氨基酸，具有调节认知障碍、降低胆固醇、增强免疫力、抗焦虑、抗抑郁等生理功能，正日益受到人们的关注，并被越来越广泛地应用于保健食品、医药及农业等行业中，富含GABA的各类产品的开发也成为国内外研究的热点，但咖啡豆中GABA含量极少。因此，筛选具有产GABA能力的乳酸菌并提高咖啡豆中GABA的含量具有重要的意义。
微生物发酵法富集GABA是利用微生物细胞中谷氨酸脱羧酶(GAD)将谷氨酸或其衍生物(谷氨酸钠或富含谷氨酸的物质)转化为GABA，是目前生产GABA最健康环保的方式。目前生产富含GABA食品的菌株多用乳酸菌和酵母菌，国内外研究报道表明，乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)等一些乳酸菌能产生GAD，并且催化谷氨酸合成GABA，现有研究较多的集中在乳酸菌与酵母菌的混合分段式发酵，未见将两株同类型的乳酸菌用于发酵富集GABA的相关报道。经文献检索，暂未见富集咖啡生豆中GABA方法及富含GABA咖啡饮品的相关公开报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种发酵富集咖啡豆中γ-氨基丁酸(GABA)的方法。本发明的方法可有效提高咖啡豆中的GABA含量，绿色环保，有利于规模化、工业化生产，可用于制作富含GABA的咖啡保健饮品，也用于生产GABA以作为功能性食品添加剂广泛应用于食品行业中。
为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明提供了一种发酵富集咖啡豆中γ-氨基丁酸的方法，采用乳酸菌作为发酵菌株对咖啡豆进行发酵处理。进一步优选，乳酸菌菌株包括耐久肠球菌N1、保加利亚乳杆菌L2、植物乳杆菌W1-3中的一种或多种。
本发明具体提供了一种发酵富集咖啡豆中γ-氨基丁酸的方法，采用耐久肠球菌与保加利亚乳杆菌L2(体积比，1:1)作为发酵菌株对咖啡豆进行发酵处理，利用两株具有不同代谢能力的菌种组合以提高咖啡豆中GABA的含量。
进一步优选，采用两种或两种以上的混合菌种时，各菌株等体积混合。
进一步优选，采用耐久肠球菌N1、保加利亚乳杆菌L2或植物乳杆菌W1-3单一菌种作为发酵菌株对咖啡豆进行发酵处理时，发酵条件如下：复水比1:1.5，菌液添加量为3％(体积比)，MSG浓度为3.5mg/ml，磷酸吡哆醛PLP浓度为0.30mmol/L，发酵温度为35℃、发酵时间为60h。
进一步优选，采用两种或两种以上的混合菌种作为发酵菌株对咖啡豆进行发酵处理时，发酵条件如下：复水比1:1.5，混合菌种添加量为2％(体积比)，MSG浓度为5mg/ml，磷酸吡哆醛PLP浓度为0.2mmol/L，发酵温度为36℃、发酵时间为72h。
本发明的有益效果：
γ-氨基丁酸是一种非蛋白质氨基酸，具有多种生理活性，但其在咖啡豆中的含量极低。本发明提供了关于乳酸菌发酵富集咖啡豆中γ-氨基丁酸的方法，可提高咖啡豆中γ-氨基丁酸的含量。
数据表明，耐久肠球菌N1与保加利亚乳杆菌L2(体积比，1:1)两种乳酸菌混合发酵可以提高咖啡豆中γ-氨基丁酸的含量，且比单一乳酸菌发酵效果好，当咖啡豆复水比为1:1.5，发酵温度36℃、发酵时间72h，混合菌液添加量2％，谷氨酸钠浓度为5mg/ml、磷酸吡哆醛浓度为0.2mmol/l时，发酵咖啡豆中GABA产量可达到137.725mg/100g，比未发酵云南小粒咖啡豆的GABA含量提高了5.75倍，因此，乳酸菌混合发酵富集咖啡豆中γ-氨基丁酸的方法可以被用于制备富含γ-氨基丁酸的咖啡保健饮品。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
实施例所用咖啡生豆购于云南省普洱百世咖啡有限公司，发酵菌株由云南农业大学实验室提供。发酵培养基TYG(胰蛋白胨酵母膏葡萄糖肉汤)液体培养基(g/L)的制备为：蛋白胨5、酵母膏5、葡萄糖10、丁二酸钠5、1000mL蒸馏水。乳酸菌培养基Ι：酵母膏7.5g，葡萄糖10.0g，番茄汁100mL，蛋白胨7.5g，磷酸二氢钾2.0g，吐温800.5mL，蒸馏水900mL，pH值7.0。
本发明用于GABA定性分析的方法为：取9mL发酵液于4℃离心15min(12000rpm/min)，取2μL上清液于距层析板底边1㎝处点样，在密闭容器中进行，当展开剂距层析板上端1㎝处时取出，放置于90℃烤箱中烘烤10min。展开剂组成为：正丁醇：冰醋酸：水＝4：1：3(V/V/V)，展开剂中加入0.4％的茚三酮作为显色剂，分别配制GABA标准品和L-谷氨酸钠1g/L用于定性参比。
本发明用于GABA定量分析的方法为氨基酸分析仪测定法：云南小粒咖啡豆经研磨机粉碎后准确称取20mg于水解管中，加入10mL6mol/L的盐酸溶液混匀后，继续加入苯酚3滴～4滴。将水解管放入冷冻剂中，冷冻5min，接到真空泵的抽气管上，抽真空(接近0Pa)，然后充入氮气，重复抽真空-充入氮气3次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖。将已封口的水解管放在110℃±1℃的电热鼓风恒温箱或水解炉内，水解22h后，取出，冷却至室温。打开水解管，将水解液过滤至50mL容量瓶内，用少量水多次冲洗水解管，水洗液移入同一50mL容量瓶内，最后用水定容至刻度，振荡混匀。准确吸取1.0mL滤液移入到15mL或25mL试管内，用试管浓缩仪或平行蒸发仪在40℃～50℃加热环境下减压干燥，干燥后残留物用1mL～2mL水溶解，再减压干燥，最后蒸干。用1.0mL～2.0mLpH2.2柠檬酸钠缓冲溶液加入到干燥后试管内溶解，振荡混匀后，吸取溶液通过0.22μm滤膜后，转移至仪器进样瓶，使用混合氨基酸标准工作液注入氨基酸自动分析仪。
参照JJG1064—2011氨基酸分析仪检定规程及仪器说明书，适当调整仪器操作程序及参数和洗脱用缓冲溶液试剂配比(色谱柱:磺酸型阳离子树脂；检测波长：570nm和440nm)。混合氨基酸标准工作液和样品测定液分别以相同体积注入氨基酸分析仪，以外标法通过峰面积计算样品测定液中氨基酸的浓度。
实施例1：发酵咖啡豆产GABA乳酸菌的筛选
准确称取5g的咖啡豆加入10mL溶有4mg/mLMSG、0.4mmol/L PLP的蒸馏水中，在105℃高压灭菌40min，然后把通过定性、定量检测筛选出的菌株分别按3％的接种量，以单一菌株和混合菌株(按体积各菌株平均分配)的方式接入咖啡豆三角瓶内，以等量无菌生理盐水作为空白对照，在37℃的恒温培养箱中培养3天，用氨基酸分析仪法测定咖啡豆中GABA含量，结果表明单一菌株耐久肠球菌发酵效果最好，混合菌株耐久肠球菌与保加利亚乳杆菌L2混合发酵效果最好，结果如表2所示。
表2菌株发酵咖啡豆产GABA的含量
实施例2：产GABA单一乳酸菌发酵咖啡豆的发酵条件优化
准确称取咖啡豆，选取咖啡豆复水比(1：0、1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5)，单一耐久肠球菌N1添加量(1％、2％、3％、4％、5％(体积比))，发酵温度(25、29、33、37、41、45℃)，谷氨酸钠添加量(1、2、3、4、5和6mg/mL)，磷酸吡哆醛浓度(0.05、0.10、0.20、0.40、0.60和0.80mmol/L)和发酵时间(24h、48h、72h、96h和120h)进行单因素实验，每组设置3个平行，用氨基酸分析仪法测定咖啡豆中GABA含量，分析结果选出因素水平表，如表3。在单因素发酵情况结果和实际情况，采取4因素3水平进行正交试验设计，优化发酵条件，通过方差分析，得出最佳发酵条件。
表3单一菌株发酵正交优化试验的因素水平表
单一耐久肠球菌N1发酵检测结果为，复水比1:1.5，菌液添加量为3％，发酵温度为35℃，MSG浓度为3.5mg/ml，磷酸吡哆醛浓度为0.30mmol/L，发酵时间为60h，方差分析见表4。在该条件下发酵，咖啡生豆中GABA产量可达到134.975mg/100g，比未发酵咖啡豆的GABA含量(23.945mg/100g)提高了5.64倍。
表4单一菌株发酵方差分析结果
实施例3：产GABA混合乳酸菌发酵咖啡豆的发酵条件优化
准确称取咖啡豆，选取咖啡豆复水比(1：0、1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5)，耐久肠球菌N1与保加利亚乳杆菌L2混合菌种添加量(1％、2％、3％、4％、5％)(按体积各菌株平均分配)，发酵温度(25、29、33、37、41、45℃)，谷氨酸钠添加量(1、2、3、4、5和6mg/mL)，磷酸吡哆醛浓度(0.05、0.10、0.20、0.40、0.60和0.80mmol/L)和发酵时间(24h、48h、72h、96h和120h)进行单因素实验，每组设置3个平行，用氨基酸分析仪法测定咖啡豆中GABA含量，分析结果选出因素水平表，如表5。在单因素发酵情况结果和实际情况，采取4元素3水平进行正交试验设计，优化发酵条件，通过方差分析，得出最佳发酵条件。
表5混合菌株发酵正交优化试验的因素水平表
耐久肠球菌N1与保加利亚乳杆菌L2混合菌株发酵检测结果为，复水比1:1.5，菌液添加量为2％，发酵温度为36℃，MSG浓度为5mg/ml，磷酸吡哆醛浓度为0.2mmol/L，发酵时间为72h，方差分析见表6。在该条件下发酵，咖啡生豆中GABA产量可达到137.725mg/100g，比未发酵咖啡豆的GABA含量(23.945mg/100g)提高了5.75倍。
表6混合菌株发酵方差分析结果
结果表明：耐久肠球菌N1与保加利亚乳杆菌L2混合乳酸菌发酵比单一乳酸菌发酵富集咖啡豆中GABA的效果好，发酵咖啡豆中GABA的含量可达到137.725mg/100g，比未发酵咖啡豆的GABA含量提高了5.75倍。两种乳酸菌混合发酵时，菌种的基因功能得到扩增；同时，不同代谢能力的菌种组合，可以进行单个菌种难以完成的复杂代谢活动，同时也能取代一些基因工程菌以完成复杂代谢反应，这样会促进菌种的生长代谢和提升生产效率。说明利用两种乳酸菌来进行混合发酵富集咖啡豆中GABA是可行的，且发酵条件因素对发酵咖啡豆中GABA的富集作用都呈高度显著(P<0.01)。
多菌株混合发酵是指将不同微生物进行共同培养来扩增菌种的基因功能，可以进行单个菌种难以完成的复杂代谢活动，同时也能取代一些基因工程菌以完成复杂代谢反应，这样会促进菌种的生长代谢和提升生产效率。
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (6)
1.一种发酵富集咖啡豆中γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：采用乳酸菌作为发酵菌株对咖啡豆进行发酵处理。
2.根据权利要求1所述的一种发酵富集咖啡豆中γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：乳酸菌菌株包括耐久肠球菌N1、保加利亚乳杆菌L2、植物乳杆菌W1-3中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种发酵富集咖啡豆中γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：采用耐久肠球菌N1与保加利亚乳杆菌L2（体积比，1:1）作为发酵菌株对咖啡豆进行发酵处理，利用两株具有不同代谢能力的菌种组合以提高咖啡豆中GABA的含量。
4.根据权利要求2或3所述的一种发酵富集咖啡豆中γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：采用两种或两种以上的混合菌种时，各菌株等体积混合。
5.根据权利要求2所述的一种发酵富集咖啡豆中γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：采用耐久肠球菌N1、保加利亚乳杆菌L2或植物乳杆菌W1-3单一菌种作为发酵菌株对咖啡豆进行发酵处理时，发酵条件如下：复水比1:1.5，菌液添加量为3%（体积比），MSG浓度为3.5mg/ml，磷酸吡哆醛PLP浓度为0.30mmol/L，发酵温度为35℃、发酵时间为60h。
6.根据权利要求2-4任一项所述的一种发酵富集咖啡豆中γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：采用两种或两种以上的混合菌种作为发酵菌株对咖啡豆进行发酵处理时，发酵条件如下：复水比1:1.5，混合菌种添加量为2%（体积比），MSG浓度为5mg/ml，磷酸吡哆醛PLP浓度为0.2mmol/L，发酵温度为36℃、发酵时间为72h。
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