CN110777084A - 一种a21978c高产菌株及其应用 - Google Patents
一种a21978c高产菌株及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110777084A CN110777084A CN201810856952.1A CN201810856952A CN110777084A CN 110777084 A CN110777084 A CN 110777084A CN 201810856952 A CN201810856952 A CN 201810856952A CN 110777084 A CN110777084 A CN 110777084A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- strain
- daptomycin
- yield
- cgmcc
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种A21978C的高产菌株,该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏号为CGMCC No.16016。本发明还公开了所述的A21978C高产菌株CGMCC No.16016用于生产达托霉素的应用。所述的A21978C高产菌株CGMCC No.16016,经发酵培养后,A21978C的产量可达到3.47g/L左右,是高产A21978C的优良菌株,具有广泛的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程的技术领域,具体的说,是关于一种A21978C高 产菌株及其应用。
背景技术
达托霉素是治疗革兰氏阳性菌感染、特别是耐药菌感染的重磅炸弹药 物,临床应用于革兰氏阳性菌引起的皮肤感染和MRSA引起的心内膜炎。达 托霉素是从链霉菌产生的脂肽类次级代谢产物A21978C混合物中分离出的 最小的组分。A21978C混合物均含有一个13个氨基酸组成的母核,包含了 环上10个氨基酸和环外的三个氨基酸残基。不同的是达托霉素在结构上含 有一个直链癸酸侧链,其他三个主组分在N末端分别含有11、12、13个碳原子的支链脂肪酸链。利用产A21978C的菌株在发酵罐上补加癸酸后可以 实现大规模工业化生产达托霉素。由于发酵单位低,达托霉素工业化生产 难度大、成本高,从而导致其价格昂贵、产量远远不能满足市场需求。目 前国内外应用的菌株,其达托霉素产量约在2.0g/L至3.0g/L之间。中国 专利文献CN102796680B公开了通过补加癸酸和癸醛组合物作为前体,发酵 玫瑰孢链霉菌生产达托霉素,其效价为2.55g/L。专利文献CN106133131A 公开了通过诱变获得丝状链霉菌(streptomyces filamentosus)突变株, 其罐发酵生产达托霉素的能力为2.75g/L。
发明内容
为了克服现有技术中的不足,本发明旨在提供一种A21978C高产菌株。 为此,本申请以小链霉菌(Streptomyces parvus)CGMCC No.4027为出发 菌株,经基因工程和诱变育种,筛选到一株A21978C高产菌株,并将其进 行了保藏,保藏号为CGMCC No.16016。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
作为本发明的第一个方面,一种A21978C高产菌株,其保藏号为CGMCC No.16016。
作为本发明的第二个方面,所述的A21978C高产菌株CGMCC No.16016 用于生产达托霉素的应用。
作为本发明的第三个方面,一种达托霉素的生产方法,通过发酵上述 所述的A21978C高产菌株CGMCC No.16016获得A21978C,再通过补加癸酸 获得达托霉素。
根据本发明,所述发酵的条件如下:
发酵培养基(wt):玉米淀粉0.5%,葡萄糖0.8%,糊精3.2%,黄豆饼 粉2.5%,(NH4)2SO4 0.5%,Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.06%,MnSO4 0.02%,pH 7.5;
发酵培养条件:28℃,通气量1vvm,搅拌转速150~400rpm,罐压 0.05mpa;DO保持20%以上,pH用氨水控制在6.5;自发酵培养20h开始补 加50%癸酸溶液,补加速率为0.15ml/L·h,每培养36h,前体补加速率 增加0.1ml/L·h,至约200h发酵结束。
本发明的有益效果:本发明提供的A21978C高产菌株,其遗传性状稳 定,具有良好的工业化应用价值。本发明的A21978C高产菌株,经过发酵 获得的发酵液中的A21978C的含量可达到3.47g/L左右,是高产A21978C 的优良菌株。
附图说明
图1为出发菌株和突变菌株的色谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例 仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体 条件的实验方法,通常按照常规条件,或厂商提供的条件进行。
本申请以Streptomyces parvus CGMCC No.4027为出发菌株,经基因 工程和紫外诱变,获得一株A21978C高产菌株,并将其进行了保藏,保藏 单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,分类命名为小链 霉菌Streptomyces parvus,保藏号为CGMCCNo.16016,保藏地址为北京 市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期为2018年06月28日。
1、以下实施例所用的试验材料,具体详见表1。
表1试验材料
试验材料 | 来源 |
pMD19-T simple载体 | Takara公司 |
pKC1139载体 | 生物风公司 |
E.coli ET12567/pUZ8002 | 生物风公司 |
armB基因 | NCBI登录号JQ911524.1 |
2、以下实施例所用到的引物,具体如表2所示。
表2本发明的引物
引物名称 | 引物序列 | SEQ ID |
arb-up-F | AAAAGCTTACGGTCTTGTGGCGGAAGA | NO:1 |
arb-up-R | GCTGTTCGAGGCACAGGCGTCTAGAGGTGACGTACGCAACCTGC | NO:2 |
arb-down-F | GCAGGTTGCGTACGTCACCTCTAGACGCCTGTGCCTCGAACAGC | NO:3 |
arb-down-R | GGGAATTCAGGAGGGCCGGGTCCTGTC | NO:4 |
arb-v-F | ACGGCAACCCGGTACCCCA | NO:5 |
arb-v-R | GCACCCCTTTCCCGACACG | NO:6 |
实施例1基因工程菌的构建
以CGMCC No.4027总DNA为模板,利用引物arb-up-F/R和arb-down-F/R 分别扩增armB基因的上下游同源臂片段,两片段重叠PCR拼接,克隆到 pMD19-T simple载体上,获得质粒pLYARB。pLYARB经Hind III和EcoR I 双酶切,回收同源臂片段,然后与经过同样双酶切的pKC1139载体连接, 获得用于敲除armB基因的重组质粒pKCARB。
将质粒pKCARB电转入E.coli ET12567/pUZ8002感受态,然后接合转 移入CGMCCNo.4027中,涂布于MS平板(组成为:黄豆饼粉2.0%,甘露醇 2.0%,琼脂粉2.0%,pH自然。),28℃培养18h后覆盖安普霉素和萘啶酮酸 溶液继续培养;挑取接合子在含有安普霉素抗性的MS培养基37℃培养,获 得单交换菌株;获得的单交换菌株经过连续传代后通过影印法挑取对安普 霉素敏感的菌株;利用引物arb-v-F/R进行筛选,其中,回复突变株PCR 片段长2.4kb,敲除突变株PCR片段长0.6kb,后者缺失了部分armB基因 序列;获得的ΔarmB敲除突变株记作LYARB。
实施例2紫外诱变及突变株筛选
用0.9%的生理盐水收集LYARB孢子,28℃、220rpm震荡20min,经灭 菌脱脂棉过滤,制得单孢子悬液,血球计数板计数,用生理盐水调整到孢 子浓度为108个/mL。取5mL上述制备的孢子悬液置于直径6cm的无菌培养 皿中,开盖置于15W紫外灯下30cm处照射,恒速搅拌。照射20s后,经过 适当稀释,涂布于含有10μg/ml卡那霉素和400μg/ml癸酸的高氏一号培 养平板上(组成为:可溶性淀粉2.0%,NaCl 0.05%,K2HPO4 0.05%,KNO3 0.1%,MgSO4·7H2O 0.05%,FeSO4 0.001%,琼脂2.0%。),28℃避光培养5-7d。
将平板上长出的单菌落划线于高氏一号平板上,28℃培养5天。待平 板上长出均匀的菌苔后,用一个无菌打孔器(孔径约5mm)在菌苔上打孔, 然后将孔中琼脂圆块放于涂布好金黄色葡萄球菌菌液的LB平板上。28℃培 养1天,通过比较抑菌圈直径大小进行初筛。共挑取5040个单菌落,抑菌 圈初筛得592株突变株。
实施例3突变株复筛
取实施例2的突变株的新鲜斜面孢子接种于种子培养基(组成为:糊 精3.5%,葡萄糖0.5%,棉籽粉2.0%,酵母粉0.4%,NaCl 0.2%,KH2PO4 0.04%, pH 7.5。),28℃振荡培养42h;转种于发酵培养基(组成为:玉米淀粉0.5%, 葡萄糖0.8%,糊精3.2%,黄豆饼粉2.5%,(NH4)2SO4 0.5%,Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.06%,MnSO4 0.02%,pH 7.5。),28℃振荡培养5d后,取发酵液加入两倍 体积的无水甲醇混匀,4℃放置45min,12000rpm离心15min,取上清进行 HPLC分析。HPLC条件为:色谱柱Hypersil C18柱(4.6mm×250mm,5μm); 流动相A:乙腈-0.5%(NH4)H2PO4缓冲液(10:90),B:乙腈-0.5%(NH4)H2PO4缓冲液(45:55),梯度洗脱(0-15min,A:B=25:75-0:100);流速1.5ml/min; 柱温35℃;进样量20μl。
592株初筛菌经复筛发酵验证,筛选获得21株阳性菌株。经对21株阳 性菌株的产孢能力以及5代以上传代稳定性的考察,优选出高产且稳定的 菌株HCCB20673进行保藏。本发明由出发菌株经基因工程和紫外诱变获得 的A21978C高产菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏号为CGMCC No.16016。
本实施例的微生物采用的发酵培养基为:玉米淀粉0.5%,葡萄糖0.8%, 糊精3.2%,黄豆饼粉2.5%,(NH4)2SO4 0.5%,Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.06%, MnSO4 0.02%,pH7.5。经过发酵获得的发酵液中A21978C的含量达到3.47g/l 左右。
实施例4突变菌株与出发菌株的比较
培养基、培养条件和检测方法,如实施例3。
(1)突变菌株与出发菌株的比较,以A21978C含量为例,其比较结果 如表3(取自3批发酵平均值):
表3突变菌株与出发菌株的比较
由表3可见,本发明的突变菌株的A21978C的含量与出发菌株的相比, 提高了194%;菌浓提高了77%。
(2)突变菌株与出发菌株的色谱图的比较,结果如图1所示。
由图1可见,A21978C系列化合物含量显著提高;两个大的杂质峰明显 消减。
实施例5突变菌株发酵产生达托霉素
将通过实施例3的方法获得的种子培养液按照发酵罐培养基体积1~5% 的接种量接种于发酵培养基中(50L发酵罐,装液量30L;组成为:玉米 淀粉0.5%,葡萄糖0.8%,糊精3.2%,黄豆饼粉2.5%,酵母粉0.5%, Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.06%,MnSO4 0.02%,KCl0.02%,消泡剂0.05%,pH 7.5。), 发酵培养条件:28℃,通气量1vvm,搅拌转速150~400rpm,罐压0.05mpa。 DO保持20%以上,pH用氨水控制在6.5。自发酵培养20h开始补加50%癸 酸溶液,补加速率为0.15ml/L·h,每培养36h,前体补加速率增加0.1ml /L·h,至约200h发酵结束。
连续发酵三批,达托霉素产量分别为3.8g/L、4.1g/L、3.9g/L。
对本发明提供的高产菌株进行发酵,可以高产量获得A21978C,进而高 水平发酵获得达托霉素,显著降低了达托霉素生产成本。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本 行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和 说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前 提下本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本 发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
序列表
<110> 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司
<120> 一种A21978C高产菌株及其应用
<130> 181061
<141> 2018-07-31
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaagcttac ggtcttgtgg cggaaga 27
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctgttcgag gcacaggcgt ctagaggtga cgtacgcaac ctgc 44
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcaggttgcg tacgtcacct ctagacgcct gtgcctcgaa cagc 44
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggaattcag gagggccggg tcctgtc 27
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acggcaaccc ggtacccca 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcaccccttt cccgacacg 19
Claims (4)
1.一种A21978C高产菌株,其特征在于,所述的A21978C高产菌株的保藏号为CGMCCNo.16016。
2.如权利要求1所述的A21978C高产菌株CGMCC No.16016用于生产达托霉素的应用。
3.一种达托霉素的生产方法,其特征在于,通过发酵权利要求1所述的A21978C高产菌株CGMCC No.16016获得A21978C,再通过补加癸酸获得达托霉素。
4.如权利要求3所述的达托霉素的生产方法,其特征在于,所述发酵的条件如下:
发酵培养基(wt):玉米淀粉0.5%,葡萄糖0.8%,糊精3.2%,黄豆饼粉2.5%,(NH4)2SO40.5%,Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.06%,MnSO4 0.02%,pH 7.5;
发酵培养条件:28℃,通气量1vvm,搅拌转速150~400rpm,罐压0.05mpa;DO保持20%以上,pH用氨水控制在6.5;自发酵培养20h开始补加50%癸酸溶液,补加速率为0.15ml/L·h,每培养36h,前体补加速率增加0.1ml/L·h,至约200h发酵结束。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810856952.1A CN110777084B (zh) | 2018-07-31 | 2018-07-31 | 一种a21978c高产菌株及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810856952.1A CN110777084B (zh) | 2018-07-31 | 2018-07-31 | 一种a21978c高产菌株及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110777084A true CN110777084A (zh) | 2020-02-11 |
CN110777084B CN110777084B (zh) | 2023-06-09 |
Family
ID=69382709
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810856952.1A Active CN110777084B (zh) | 2018-07-31 | 2018-07-31 | 一种a21978c高产菌株及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110777084B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2802575C1 (ru) * | 2023-04-06 | 2023-08-30 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Промомед Рус" | Новый штамм-продуцент даптомицина streptomyces baarnensis |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101928677A (zh) * | 2009-06-26 | 2010-12-29 | 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司 | 一种脂肽类化合物a21978c的产生菌株及其应用 |
CN102965304A (zh) * | 2011-10-27 | 2013-03-13 | 四川大学 | 达托霉素高产菌株及制备方法 |
-
2018
- 2018-07-31 CN CN201810856952.1A patent/CN110777084B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101928677A (zh) * | 2009-06-26 | 2010-12-29 | 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司 | 一种脂肽类化合物a21978c的产生菌株及其应用 |
CN102965304A (zh) * | 2011-10-27 | 2013-03-13 | 四川大学 | 达托霉素高产菌株及制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
L.WANG等: "Improvement of A21978C production in Streptomyces roseosorus by reporter-guided rpsL mutation slection", JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY * |
杨一恭: "达托霉素的菌种选育及发酵条件", 中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技I辑 * |
杨夏露: "A21978C发酵条件优化及高产菌株选育", 中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2802575C1 (ru) * | 2023-04-06 | 2023-08-30 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Промомед Рус" | Новый штамм-продуцент даптомицина streptomyces baarnensis |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110777084B (zh) | 2023-06-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110643544B (zh) | 副干酪乳杆菌761及其应用、青贮饲料添加剂、青贮饲料 | |
CN101671703B (zh) | 一种提高ε-聚-L-赖氨酸产量的新方法 | |
CN110591987B (zh) | 唾液乳杆菌358及其应用、青贮饲料添加剂、青贮饲料 | |
CN105420154A (zh) | 双基因敲除重组红球菌、构建方法及其应用 | |
CN105154382B (zh) | 基因工程菌株筑波链霉菌l20及其应用 | |
CN101016533A (zh) | 一种蒽环类抗生素产生工程菌及其应用 | |
CN112899210B (zh) | 增强正调控蛋白基因表达以提高井冈霉素发酵水平的方法 | |
CN110564718B (zh) | 高通量诱变筛选高产两性霉素b结节链霉菌的方法及菌株 | |
CN116426439A (zh) | 一种发酵产金霉素的金色链霉菌株及其应用 | |
CN106635945A (zh) | 重组菌株及其制备方法和生产l‑苏氨酸的方法 | |
CN116622580A (zh) | 一株戊糖片球菌pkc10及其应用 | |
CN116286560A (zh) | 一株拉乌尔菌hc6及其低温生产2,3-丁二醇的应用 | |
CN110777084B (zh) | 一种a21978c高产菌株及其应用 | |
CN112625925B (zh) | 一种达巴万星前体a40926b0高产菌株及应用 | |
CN105907778B (zh) | 褐黄孢链霉菌重组表达质粒及工程菌与应用 | |
CN115074347A (zh) | 一种含角蛋白酶突变体和胆汁酸的饲料添加剂及其应用 | |
CN106190854B (zh) | 一种荒漠拟孢囊菌和奥利万星中间体的制备方法 | |
CN109554321B (zh) | 一种高产脂肽的基因工程菌及其应用 | |
CN115820613B (zh) | 一种含杜仲叶提取物的角蛋白酶制剂及其应用 | |
CN116286575B (zh) | 一种利用枯草芽孢杆菌高效表达生淀粉α-淀粉酶的方法 | |
CN117256728B (zh) | 一种凹凸棒石表面活性素及其制备和应用 | |
CN103740628B (zh) | 直接发酵产妥布霉素工程菌及其构建和应用 | |
CN117363552B (zh) | 生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株及其构建方法 | |
CN114717135B (zh) | 一种普拉特链霉菌及其发酵产假尿苷和1-甲基-假尿苷的方法 | |
CN113897301B (zh) | 基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及ε-聚赖氨酸的生产方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |