CN116355780A - 一种泰乐菌素发酵用复合有机氮源、发酵培养基及其应用 - Google Patents
一种泰乐菌素发酵用复合有机氮源、发酵培养基及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域，公开了一种泰乐菌素发酵用复合有机氮源、发酵培养基及其应用，所述泰乐菌素发酵用复合有机氮源以酵母粉、豆饼粉及谷氨酸钠为有机氮源，几种组分相互配合，协同作用，替代鱼粉，能够有效提高泰乐菌素的产量和泰乐菌素A组分的比例，且原料更易得和稳定，能够降低成本。本发明还公开了一种生产泰乐菌素的方法。本发明的复合有机氮源和发酵培养基用于生产复合有机氮源时，较现有方法产量和A组分比例显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种泰乐菌素发酵用复合有机氮源、发酵培养基及其应用，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
泰乐菌素，又名泰乐星，是一类大环内酯类兽用抗生素，其结构主要由十六元大环内酯环连接碳霉氨基糖、碳霉糖和6′-脱氧-D-阿洛糖等3个糖苷配基组成，可以与核糖体结合阻遏蛋白质的生成，能够有效抑制革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性球菌、支原体、分枝杆菌及螺旋体等微生物的生长和繁殖，具有抗菌谱广、吸收与排泄迅速、毒性低等特点。
泰乐菌素由泰乐菌素A、脱碳霉糖泰乐菌素B、大菌素C、雷洛菌素D四种组分构成，其中泰乐菌素A活性最强，是泰乐菌素的主要组分。目前泰乐菌素的发酵菌种多采用弗氏链霉菌，发酵获得的泰乐菌素A含量低于90％，且大量使用鱼粉作为原料，由于鱼粉的品质容易受到鱼种、地理位置及气候条件的影响，易对发酵过程中泰乐菌素的产量、各组分的比例及杂质水平造成影响，进而不易控制泰乐菌素及泰乐菌素A质量，造成批次间差异大。此外鱼粉价格高，大大限制了泰乐菌素的生产和规模化。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明在现有发酵培养基的基础上，针对发酵产泰乐菌素的微生物的发酵特点进行改进，以提高发酵效率，在此基础上，提出了一种优化的泰乐菌素发酵用复合有机氮源及发酵培养基。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明的目的之一是提供一种产泰乐菌素用复合有机氮源，所述氮源包括酵母粉、豆饼粉以及氨基酸或氨基酸盐。
本发明的另一目的是提供如上所述的复合有机氮源用于发酵产泰乐菌素中的应用。
本发明的另一目的是提供一种泰乐菌素发酵培养基，所述发酵培养基包括如上所述的复合有机氮源和碳源。
本发明的另一目的是提供如上所述的发酵培养基在发酵产泰乐菌素中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益成果包括：
通过将酵母粉、豆饼粉和氨基酸或其盐组合作为泰乐菌素发酵的氮源，配制的发酵培养基能够为弗氏链霉菌自身生长及代谢提供充足的营养，使发酵液的泰乐菌素的含量和泰乐菌素A的比例提高。本发明能够有效提高菌株如弗氏链霉菌产泰乐菌素的产量，且泰乐菌素A的比例可以达到总组分的90％以上。与传统发酵培养基相比，本发明通过组分合理配比，替代鱼粉，原料易得、质量稳定且成本低，具有广阔的工业应用前景。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
为了克服目前泰乐菌素发酵过程中所存在的问题，本发明提供了一种泰乐菌素发酵用复合有机氮源及发酵培养基，所述复合有机氮源以酵母粉、豆饼粉及谷氨酸钠为主要有机氮源，替代鱼粉，在为菌体生长和泰乐菌素发酵提供充足营养的基础上，能够有效提高泰乐菌素的产量和泰乐菌素A组分的比例，且原料更易得和稳定，能够降低成本。
本发明提供了一种产泰乐菌素用复合有机氮源，所述氮源包括酵母粉、豆饼粉以及氨基酸或氨基酸盐。
其中，所述氨基酸选自谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、苏氨酸中的一种或几种；
在一些优选实施方式中，所述氨基酸为谷氨酸，氨基酸盐为谷氨酸钠。
在一些优选实施方式中，所述酵母粉、豆饼粉以及氨基酸或氨基酸盐的质量比为(0.1-4):(0.1-5):(0.01-1.5)，可以是(0.5-1.5):(0.5-2):(0.05-0.3)，(0.5-1):(0.5-1):(0.05-0.1)，(1-1.5):(1-1.5):(0.1-0.15)，(1-1.5):(1.5-2):(0.15-0.2)，(1-1.5):(1.5-2):(0.2-0.3)；具体可以是0.5:1:0.2，1:0.5:0.1，1:2:0.3，1.5:0.5:0.05。
本发明还提供了如上所述的复合有机氮源用于发酵产泰乐菌素中的应用。
本发明还提供了一种泰乐菌素发酵培养基，所述发酵培养基包括如上所述的复合有机氮源和碳源。
其中，所述碳源选自葡萄糖、糊精、玉米淀粉、可溶性淀粉、豆油、甘油、乙酸钠、丙酸钠、柠檬酸钠中的一种或几种。在一些优选实施方式中，所述碳源为玉米淀粉和豆油的组合物。
本发明中，所述发酵培养基还可以包括其他氮源，所述其他氮源可以选自蛋白胨、棉籽粉、棉籽蛋白、麸质粉、花生饼粉、玉米浆、玉米蛋白中的一种或几种。
本发明中，所述发酵培养基还可以包含离子，所述离子选自Ca2+，Mg2+，PO4 3-等。本发明能够提供所述离子的试剂不做限制，只要是能够提供所述的离子，且对于发酵产泰乐菌素有益的试剂均可以，例如能够提供所述离子的试剂可以选自碳酸钙、磷酸氢二铵、甜菜碱盐酸盐、硫酸镁、硫酸亚铁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、硫酸镍、氯化钴、氯化铵、硫酸铵中的一种或几种的盐。
在一些优选实施方式中，所述发酵培养基由以下质量百分比的成分组成：玉米淀粉0.5-2％，豆油4-6％，酵母粉0.1-4％，豆饼粉0.1-5％，谷氨酸钠0.01-1.5％，碳酸钙0.05-0.5％，磷酸氢二铵0.01-0.5％，甜菜碱盐酸盐0.01-0.2％，硫酸镁0.01-0.5％，其余为水。
所述玉米淀粉的含量可以是0.5-1、1-1.5、1.5-2％。
所述豆油的含量可以是4-4.5、4.5-5、5-5.5、5.5-6％。
所述酵母粉的含量可以是0.1-0.5、0.5-1、1-1.5、1.5-2、2-2.5、2.5-3、3-3.5、3.5-4％。
所述豆饼粉的含量可以是0.1-0.5、0.5-1、1-1.5、1.5-2、2-2.5、2.5-3、3-3.5、3.5-4、4-4.5、4.5-5％。
所述谷氨酸钠的含量可以是0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9、0.9-1、1-1.1、1.1-1.2、1.2-1.3、1.3-1.4、1.4-1.5％。
所述碳酸钙的含量可以是0.05-0.1、0.1-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5％。
所述磷酸氢二铵的含量可以是0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5％。
所述甜菜碱盐酸盐的含量可以是0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.2％。
所述硫酸镁的含量可以是0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5％。
在一些更优选实施方式中，所述发酵培养基由以下质量百分比的成分组成：玉米淀粉0.5-2％，豆油4-6％，酵母粉0.1-1.5％，豆饼粉0.5-2％，谷氨酸钠0.05-0.5％，碳酸钙0.05-0.5％，磷酸氢二铵0.01-0.5％，甜菜碱盐酸盐0.01-0.2％，硫酸镁0.01-0.5％，其余为水。
具体可以是，所述发酵培养基由以下质量百分比的成分组成：玉米淀粉1％，豆油5％，酵母粉0.5％，豆饼粉1％，谷氨酸钠0.2％，碳酸钙0.2％，磷酸氢二铵0.1％，甜菜碱盐酸盐0.05％，硫酸镁0.1％，其余为水。
或，所述发酵培养基由以下质量百分比的成分组成：玉米淀粉0.5％，豆油6％，酵母粉1％，豆饼粉0.5％，谷氨酸钠0.1％，碳酸钙0.2％，磷酸氢二铵0.1％，甜菜碱盐酸盐0.05％，硫酸镁0.1％，其余为水。
或，所述发酵培养基由以下质量百分比的成分组成：玉米淀粉1％，豆油5％，酵母粉1％，豆饼粉2％，谷氨酸钠0.3％，碳酸钙0.2％，磷酸氢二铵0.1％，甜菜碱盐酸盐0.05％，硫酸镁0.1％，其余为水。
或，所述发酵培养基由以下质量百分比的成分组成：玉米淀粉2％，豆油4％，酵母粉1.5％，豆饼粉0.5％，谷氨酸钠0.05％，碳酸钙0.2％，磷酸氢二铵0.1％，甜菜碱盐酸盐0.05％，硫酸镁0.1％，其余为水。
在一些更优选实施方式中，所述发酵培养基由以下质量百分比的成分组成：玉米淀粉1％，豆油5％，酵母粉0.5％，豆饼粉1％，谷氨酸钠0.2％，碳酸钙0.2％，磷酸氢二铵0.1％，甜菜碱盐酸盐0.05％，硫酸镁0.1％，其余为水。
本发明还提供了如上所述的发酵培养基在发酵产泰乐菌素中的应用。所述发酵培养基能够提高菌株产泰乐菌素的能力。
本发明中，所述菌株是指任何能够产泰乐菌素的菌株，包括但不限于是野生型菌株，基因工程菌株等。所述菌株可以选自弗氏链霉菌、龟裂链霉菌、吸水链霉菌中的一种或几种。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
以下对比例和实施例以及表1中，培养基的组分含量％，没有特别强调的，为重量体积百分比g/mL，例如玉米淀粉2％是指，在100mL培养基中，玉米淀粉的加入量为2g。
对比例1
将弗氏链霉菌划线于斜面培养基(可溶性淀粉2％，酵母浸粉0.1％，硝酸钾0.1％，磷酸氢二钾0.05％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.05％，硫酸亚铁0.001％，琼脂粉2％，其余为水)，28℃培养10-14天。
挖取2cm2大小菌块接种于种子培养基(玉米淀粉1％，酵母粉1％，碳酸钙0.3％，谷氨酸钠0.5％，豆油0.5％，其余为水)，装量：25ml/250ml，28℃、220rpm振荡培养40h。
然后以15％的接种量将种子培养液转种于传统含鱼粉发酵培养基(鱼粉1％，玉米粉1.5％，棉籽粉0.5％，麸质粉1％，豆油4％，碳酸钙0.2％，氯化钾0.1％，氯化钠0.1％，磷酸氢二铵0.04％，甜菜碱盐酸盐0.05％，硫酸镍0.0004％，氯化钴0.0004％，其余为水)，装量：25ml/250ml，28℃、220rpm振荡培养6天，利用HPLC测定泰乐菌素(色谱柱为C18(5μm,46×150mm)；流动相为乙腈：甲醇：5mM磷酸二氢铵(体积比)＝60:30:10；流速1ml/min，检测波长290nm)。泰乐菌素总组分产量为6.62g/L，泰乐菌素A组分占总组分质量百分比的85.4％。
对比例2
参照对比例1，发酵培养基改为：玉米淀粉1％，豆油5％，酵母粉0.5％，豆饼粉1％，碳酸钙0.2％，磷酸氢二铵0.1％，甜菜碱盐酸盐0.05％，硫酸镁0.1％，其余为水；其它与对比例1相同。
以对比例1泰乐菌素产量为标准，对比例2泰乐菌素总组分的相对产量为98.3％，泰乐菌素总组分中A组分的质量百分比为88.9％。
对比例3
参照对比例1，发酵培养基改为：玉米淀粉1％，豆油5％，酵母粉0.5％，豆饼粉1％，甘氨酸0.1％，碳酸钙0.2％，磷酸氢二铵0.1％，甜菜碱盐酸盐0.05％，硫酸镁0.1％，其余为水；其它与对比例1相同。
以对比例1泰乐菌素产量为标准，对比例3泰乐菌素总组分的相对产量为96.4％，泰乐菌素总组分中A组分的质量百分比为88.5％。
实施例1
参照对比例1，发酵培养基改为：玉米淀粉1％，豆油5％，酵母粉0.5％，豆饼粉1％，谷氨酸钠0.2％，碳酸钙0.2％，磷酸氢二铵0.1％，甜菜碱盐酸盐0.05％，硫酸镁0.1％，其余为水；其它与对比例1相同。
以对比例1泰乐菌素产量为标准，实施例1泰乐菌素总组分的相对产量为112.7％，泰乐菌素总组分中A组分的质量百分比为94.3％。
实施例2
参照对比例1，发酵培养基改为：玉米淀粉0.5％，豆油6％，酵母粉1％，豆饼粉0.5％，谷氨酸钠0.1％，碳酸钙0.2％，磷酸氢二铵0.1％，甜菜碱盐酸盐0.05％，硫酸镁0.1％，其余为水；其它与对比例1相同。
以对比例1泰乐菌素产量为标准，实施例2泰乐菌素总组分的相对产量为108.0％，泰乐菌素总组分中A组分的质量百分比为92.6％。
实施例3
参照对比例1，发酵培养基改为：玉米淀粉1％，豆油5％，酵母粉1％，豆饼粉2％，谷氨酸钠0.3％，碳酸钙0.2％，磷酸氢二铵0.1％，甜菜碱盐酸盐0.05％，硫酸镁0.1％，其余为水；其它与对比例1相同。
以对比例1泰乐菌素产量为标准，实施例3泰乐菌素总组分的相对产量为109.6％，泰乐菌素总组分中A组分的质量百分比为90.3％。
实施例4
参照对比例1，发酵培养基改为：玉米淀粉2％，豆油4％，酵母粉1.5％，豆饼粉0.5％，谷氨酸钠0.05％，碳酸钙0.2％，磷酸氢二铵0.1％，甜菜碱盐酸盐0.05％，硫酸镁0.1％，其余为水；其它与对比例1相同。
以对比例1泰乐菌素产量为标准，实施例4泰乐菌素总组分的相对产量为106.9％，泰乐菌素总组分中A组分的质量百分比为91.8％。
以下表1中的数值，代表每种成分的百分含量％，即100mL培养基中，每种组分的质量g。
表1
由在上述列举的实施例和对比例中，与利用鱼粉为原料的传统发酵培养基(对比例1)相比，实施例1～4中，泰乐菌素产量及A组分比例都有一定提高；与对比例2及对比例3相比，可以发现实施例1～4中添加的谷氨酸钠可以促进泰乐菌素及A组分的合成，其中实施例1的效果最佳。
综上所述，本发明提供的泰乐菌素发酵用复合有机氮源、发酵培养基及其应用能够显著提升菌株产泰乐菌素的产量和泰乐菌素A的比例。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种产泰乐菌素用复合有机氮源，其特征在于，所述氮源包括酵母粉、豆饼粉以及氨基酸或氨基酸盐。
2.如权利要求1所述的复合有机氮源，其特征在于，所述氨基酸选自谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、苏氨酸中的一种或几种。
3.如权利要求1所述的复合有机氮源，其特征在于，所述氨基酸为谷氨酸，氨基酸盐为谷氨酸钠；和/或，
所述酵母粉、豆饼粉以及氨基酸或氨基酸盐的质量比为(0.1-4):(0.1-5):(0.01-1.5)。
4.如权利要求1～3任一项所述的复合有机氮源用于发酵生产泰乐菌素中的应用。
5.一种泰乐菌素发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基包括如权利要求1～3任一项所述的复合有机氮源和碳源。
6.如权利要求5所述的发酵培养基，其特征在于，所述碳源选自葡萄糖、糊精、玉米淀粉、可溶性淀粉、豆油、甘油、乙酸钠、丙酸钠、柠檬酸钠中的一种或几种；优选所述碳源为玉米淀粉和豆油的组合物。
7.如权利要求5所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基还包括选自蛋白胨、棉籽粉、棉籽蛋白、麸质粉、花生饼粉、玉米浆、玉米蛋白中的一种或几种的氮源；
和/或，所述发酵培养基还包含选自碳酸钙、磷酸氢二铵、甜菜碱盐酸盐、硫酸镁、硫酸亚铁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、硫酸镍、氯化钴、氯化铵、硫酸铵中的一种或几种的盐。
8.如权利要求5所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基由以下质量百分比的成分组成：玉米淀粉0.5-2％，豆油4-6％，酵母粉0.1-4％，豆饼粉0.1-5％，谷氨酸钠0.01-1.5％，碳酸钙0.05-0.5％，磷酸氢二铵0.01-0.5％，甜菜碱盐酸盐0.01-0.2％，硫酸镁0.01-0.5％，其余为水。
9.如权利要求5所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基由以下质量百分比的成分组成：玉米淀粉0.5-2％，豆油4-6％，酵母粉0.1-1.5％，豆饼粉0.5-2％，谷氨酸钠0.05-0.5％，碳酸钙0.05-0.5％，磷酸氢二铵0.01-0.5％，甜菜碱盐酸盐0.01-0.2％，硫酸镁0.01-0.5％，其余为水。
10.如权利要求5～9所述的发酵培养基在发酵产泰乐菌素中的应用。
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