CN117229357A - 一种植物乳杆菌细菌素及其制备方法和抗菌用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物乳杆菌细菌素及其制备方法和抗菌用途，所述植物乳杆菌细菌素的制备方法为：植物乳杆菌WZS02发酵上清液用乙酸乙酯萃取，收集有机相，然后旋蒸除乙酸乙酯用蒸馏水复溶得到蛋白质粗提液；蛋白质粗提液经过阳离子交换层析柱，用含1.0M NaCl的50mM的乙酸钠溶液作为洗脱液进行梯度洗脱，所得洗脱峰溶液经过透析除盐，获得蛋白质初步纯化液；再经半制备反向高效液相色谱纯化，获得植物乳杆菌WZS02细菌素，经过液质分析得到细菌素多肽序列为HNGEIGYWLGQK，分子量为1400.68。该植物乳杆菌WZS02细菌素对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均具有抑菌活性，对酵母菌和霉菌没有抑制作用。
Description
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌细菌素及其制备方法和抗菌用途。
背景技术
食品腐败在我们的日常生活中随处可见，通常引起食物变质的原因是微生物的作用，如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等食源性致病菌造成的食品污染；现今食品中应用最广泛的防腐剂为化学防腐剂，化学防腐剂的出现虽然可有效缓解由微生物引起的食品腐败问题，但是化学防腐剂长期食用危害人体健康，所以开发天然无毒无害的食品防腐剂成为了食品领域研究的重点。
植物乳杆菌细菌素是由植物乳杆菌产生的一种具有抑菌生物活性的多肽或蛋白质类物质，可作为生物防腐剂减少食源性病原体的污染，提高食品的安全性。且因其安全、无毒、易被人体消化，不产生耐药性，显示出了细菌素作为生物防腐剂在食品保鲜方面的巨大潜力。目前研究最为深入的细菌素是乳酸链球菌素Nisin，但因其抑菌谱窄、pH耐受性较差使其应用受到限制，所以发现新的具有广谱抑菌作用的细菌素成为研究的热点。
发明内容
针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌细菌素及其制备方法和抗菌用途。
本发明采用如下技术方案：
一种植物乳杆菌WZS02(Lactobacillus.plantarum WZS02)细菌素的制备方法，包括如下步骤：
1)、植物乳杆菌WZS02发酵上清液的制备：
将培养至生长对数期的植物乳杆菌WZS02(Lactobacillus.plantarum WZS02)的种子液，接种至MRS培养基发酵，所得的发酵液离心，获得发酵上清液；
其中，所述植物乳杆菌WZS02的保藏编号为CCTCC NO:M 20231103，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏时间2023年06月27日；
2)发酵上清液用乙酸乙酯萃取，收集有机相，旋蒸除去乙酸乙酯后用蒸馏水复溶得到蛋白质粗提液；
3)蛋白质粗提液经过阳离子交换层析柱，用含NaCl的40-60mM的乙酸钠容液作为洗脱液进行梯度洗脱，收集目标洗脱峰溶液经过透析除盐，得到蛋白质初步纯化液；
4)所述蛋白质初步纯化液经过半制备反相高效液相色谱纯化，获得植物乳杆菌WZS02细菌素。
进一步地，步骤1)发酵的步骤为：将所述种子液以1.5-2.5％的接种量接种到pH为5.0-7.0的MRS液体培养基中，30-37℃温度下静置厌氧培养20-30h。
更进一步地，步骤1)的具体步骤为：将培养至对数期生长期的植物乳杆菌WZS02(Lactobacillus.plantarum WZS02)种子液，以2％(v/v)的接种量接种到pH为6.0的MRS液体培养基中，37℃下静置培养24h；所得的发酵液离心(8000rpm、4℃离心10min)，去除菌体沉淀，获得发酵上清液，过0.22μm水膜备用。
作为本发明的一种植物乳杆菌细菌素制备方法的改进，步骤2)的过程为：将发酵上清液浓缩为原来体积的40-60％，浓缩液中加入0.5-1.5倍体积的乙酸乙酯，充分混合后(让细菌素充分融入有机相)静置分液，收集有机相，将水相重复萃取的操作1-3次，有机相合并，然后50℃旋蒸除去乙酸乙酯后用蒸馏水复溶得到蛋白质粗提液。
作为本发明的一种植物乳杆菌细菌素制备方法的改进，步骤3)的过程为：将蛋白质粗提液经过CM SefinoseTMFF弱阳离子交换层析柱(BXK 16/20)，在180-250min内使通入至阳离子交换层析柱中的40-60mM乙酸钠洗脱液中的氯化钠浓度从0M匀速线性升至1M，收集0.42M～0.58M NaCl浓度对应的洗脱液；采用透析袋进行除盐，得蛋白质初步纯化液；
梯度洗脱时，利用平衡缓冲液和洗脱缓冲液的配比液进行梯度洗脱；
平衡缓冲液为40-60mM乙酸钠，pH调至4-5；
洗脱缓冲液为含1.0M NaCl的40-60mM乙酸钠，pH调至4-5；
例如当在225min内使通入至阳离子交换层析柱中的40-60mM乙酸钠洗脱液中的氯化钠浓度从0M匀速线性升至1M时，通入至阳离子交换层析柱中的洗脱液的程序是：
0-225min期间，洗脱液中平衡缓冲液的体积占比从100％匀速降低至0％，而洗脱缓冲液的体积占比从0％匀速上升至100％。
作为本发明的一种植物乳杆菌细菌素制备方法的改进，步骤4)的过程为：将蛋白质初步纯化液采用半制备C18反相高效液相色谱进行进一步的纯化；蛋白质初步纯化液用0.22μm水膜抽滤，单次进样体积为3mL，用pH为3.5的15mmol/L磷酸二氢钾作为流动相A，用纯乙腈作为流动相B；
梯度洗脱程序如下表：
梯度洗脱程序是：0-5min流动相A体积分数维持在80％；5-30min，流动相A由体积分数80％匀速降低至50％；收集220nm吸光度下具有抑菌活性的液相色谱洗脱组分，获得植物乳杆菌WZS02细菌素溶液。
本发明还同时提供了利用上述任一方法制备得到的植物乳杆菌WZS02细菌素溶液的抗菌用途：对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌均具有抑菌活性，但对酵母菌和霉菌没有抑制作用。
进一步地，革兰氏阳性细菌包括金黄色葡萄球菌ATCC 6538、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、发酵乳杆菌WZK01中的至少一种；
革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌K88、铜绿假单胞菌ATCC1544中的至少一种；
酵母菌包括酿酒酵母、毕赤酵母、假丝酵母中的至少一种；
霉菌包括根霉菌、黑曲霉、青霉菌、链霉菌中的至少一种。
与现有技术相比，本发明具有如下技术优势：
1)本发明应用“乙酸乙酯萃取—阳离子交换层析—半制备反相高效液相色谱”三步法从植物乳杆菌WZS02发酵上清液中获得细菌素，具有广谱抗菌性。
2)本发明获得的植物乳杆菌WZS02细菌素热稳定性好、耐酸。
3)本发明对植物乳杆菌WZS02细菌素高产的发酵条件优化，优化后发酵上清液的抑菌活性为原始的1.4倍。
综上所述，本发明通过三步法制备了一种植物乳杆菌WZS02细菌素，并确定该细菌素的广谱抗菌特性、热稳定性、酶敏感性，具有应用于食品防腐的潜力。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1a为培养温度对物乳杆菌菌体生长与合成细菌素的影响。
图1b为初始pH对植物乳杆菌菌体生长与合成细菌素的影响。
图1c为接种量对植物乳杆菌菌体生长与合成细菌素的影响。
图2a为发酵上清液、萃取有机相、阳离子交换色谱洗脱峰抑菌活性对比结果。
图2b为半制备反相高效液相纯化色谱图；
图2c为半制备反相高效液相出峰的抑菌活性对比结果。
图2d为分析型高效液相色谱图；
图2e为液质联用一级质谱图。
图3为植物乳杆菌细菌素的不同浓度下抑菌照片结果。
图4为植物乳杆菌细菌素的热稳定性结果。
图5为植物乳杆菌细菌素的pH稳定性结果。
图6为植物乳杆菌细菌素的酶解稳定性结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明中的植物乳杆菌WZS02(Lactobacillus.plantarum WZS02)的保藏信息如下：保藏名称：植物乳杆菌Lactobacillus.plantarum WZS02，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号:CCTCC NO:M 20231103，保藏时间2023年06月27日。
实施例1：植物乳杆菌WZS02产细菌素发酵条件的优化
以下测定抑菌活性所用的指示菌均为金黄色葡萄球菌。
以下采用抑菌率法测定抑菌活性：将甘油管保藏的金黄色葡萄球菌划线于固体LB培养基，后放于37℃恒温培养箱中培养24h。待菌落形成后，挑取单菌落接种于液体LB培养基中后放于振荡培养箱37℃、200rpm培养12h-18h，测金黄色葡萄球菌OD600值，接着用0.9％生理盐水将菌液稀释成OD为1的菌悬液(菌浓默认为109CFU/mL)，然后用LB培养基将菌悬液稀释成105CFU/mL，吸取1mL于96深孔板内，然后加入处理好的发酵液50μL，混匀后放置在37℃、200rpm的震荡培养箱中培养12h-16h，待实验组OD为0.2-0.8时(金黄色葡萄球菌在此阶段处于对数生长期)，吸取200μL测其吸光度，同时以加入50μL无菌超纯水为阳性对照，以只加入1050μL的LB培养基为阴性对照，则
(1)培养温度的影响
将活化后的菌液以1％的接种量接种于MRS培养基中(MRS液体培养基的pH为6)，后于22℃、27℃、30℃、37℃、42℃培养箱中厌氧培养24h，测定其OD600与抑菌活性大小(以抑菌率大小表示)。结果如图1a所示，确定其最适发酵温度为37℃，此条件下抑菌率为45％。
(2)初始pH的影响
将MRS培养基用1M的NaOH和1M的HCl分别调pH为4、5、6、7、8。将活化后的菌液以1％的接种量接种于上述配制的培养基中，后于30℃培养箱中厌氧培养24h，测定其OD600与抑菌活性大小(以抑菌率大小表示)。结果结果如图1-b所示，确定其最适初始pH为6.0，此条件下抑菌率为35％。
(3)、接种量的影响
将活化后的菌液分别以1％、1.5％、2％、2.5％、3％的接种量接种于MRS培养基中(MRS液体培养基的pH为6)，后于30℃培养箱中厌氧培养24h，测定其OD600与抑菌活性大小(以抑菌率大小表示)。结果结果如图1c所示,确定其最适接种量为2.0，此条件下抑菌率为50％。
最终确定植物乳杆菌WZS02产细菌素的最佳培养条件为：按2％(v/v)的接种量接种于pH为6.0的MRS液体培养基中，于37℃下静置培养24h。在此条件下发酵上清液的抑菌活性为原始的1.4倍。
注：未优化前的参数为：接种量为1％(v/v)，MRS液体培养基的pH为7，于30℃下静置培养24h。
实施例2：植物乳杆菌WZS02细菌素的制备
以下测定抑菌活性所用的指示菌均为金黄色葡萄球菌。
以下采用琼脂扩散法测定抑菌活性：将用甘油管保藏的金黄色葡萄球菌划线于固体LB培养基中，后放于37℃恒温培养箱中培养12h-18h。待菌落形成后，挑取单菌落接种于液体LB培养基中后放于振荡培养箱37℃、200rpm培养12h-18h。然后测金黄色葡萄球菌OD600值，用0.9％的生理盐水稀释菌液至OD600值为1，取稀释后的菌液100μL到固体LB培养基中涂布均匀，将灭过菌的内径为6mm牛津杯置于固体LB中。然后吸取含细菌素的样品100μL加入到孔洞中，最后放入37℃恒温培养箱中培养12h-16h，直至有显著的抑菌圈形成，测量抑菌圈直径并记录。
(1)植物乳杆菌WZS02发酵上清液的制备
将保藏在-80℃植物乳杆菌WZS02划线于MRS固体培养基平板上，置于37℃培养箱进行培养，待其长出单菌落后挑取单菌落于5mL的MRS液体培养基中，培养至其生长对数期得到植物乳杆菌种子液，以2％(v/v)接种量接种到100mL的pH为6.0的MRS液体培养基中，于37℃下静置培养24h。所得的发酵液在8000r/min，4℃下离心10min，去除菌体沉淀，获得植物乳杆菌发酵上清液，过0.22μm水膜，将发酵上清液进行琼脂扩散抑菌实验结果发现如图2a发酵上清液有明显的抑菌圈。将有抑菌活性的发酵上清液置于4℃冰箱，备用。
(2)、乙酸乙酯萃取
将2L发酵上清液60℃旋蒸浓缩成1L与乙酸乙酯按照1：1的比例混合置于摇床(150r/min,2h)混合，让细菌素充分融入有机相中，随后将混合液置于分液漏斗中静置2h，收集有机相(上层液体)，将水相(下层液体)收集重复上述萃取操作，共萃取3次，将3次萃取所得有机相合并后用50℃旋蒸除去乙酸乙酯，旋蒸后的细菌素用蒸馏水复溶得到蛋白质粗提液(浓度为9.9mg/mL)，将萃取得到的蛋白质粗提液进行琼脂扩散抑菌实验结果发现如图2a萃取液有明显的抑菌圈。将具有抑菌活性的萃取液置于4℃冰箱用于后续实验。
(3)阳离子交换层析
取步骤(2)所得的蛋白质粗提液50mL，经过阳离子交换层析系统(蛋白层析系统AKTABasic/cl，GE，美国)，采用CM SefinoseTMFF弱阳离子交换色谱柱(BXK 16/20)。平衡缓冲液为pH＝4.5的50mM乙酸钠，0.22μm抽滤，超声20min。洗脱缓冲液为pH＝4.5的含1.0MNaCl的50mM乙酸钠，0.22μm抽滤，超声20min。在225min内使通入至阳离子交换层析柱中的50mM乙酸钠洗脱液中的氯化钠浓度从0M线性升至1M，收集220nm和280nm吸光度下0.42M～0.58M NaCl浓度对应的蛋白洗脱峰溶液，接着采用500Da分子量的透析袋进行除盐，将得到的蛋白洗脱峰溶液进行琼脂扩散抑菌实验，如图2a，发现洗脱峰溶液具有抑菌活性，但是抑菌圈小于发酵上清液和萃取液，这可能由于在纯化过程中，发酵上清液中除了细菌素之外还有有机酸和过氧化氢等物质也有抑菌活性，在离子交换的过程中损失了。得到蛋白质初步纯化液进行后续实验。
对阳离子交换层析柱洗脱的具体操作为：
1)1M NaOH溶液经过3个CV清洗填料；
2)2M NaCl溶液经过5个CV洗去杂蛋白；
3)平衡缓冲液经过5个CV平衡系统，流速恒定为2mL/min；
4)所述蛋白质粗提液进样50mL，流速恒定为1mL/min；
5)平衡缓冲液经过5个CV平衡系统，流速恒定为2mL/min；
6)用平衡缓冲液和洗脱液的配比液进行梯度洗脱经过15个CV(经过15个CV的运行时间大概是225min)，使NaCl的浓度从0线性升至1M，流速恒定为1mL/min；
在225min内使通入至阳离子交换层析柱中的50mM乙酸钠洗脱液中的氯化钠浓度从0M匀速线性升至1M时，通入至阳离子交换层析柱中的洗脱液的程序是：
0-225min期间，洗脱液中平衡缓冲液的体积占比从100％匀速降低至0％，而洗脱缓冲液的体积占比从0％匀速上升至100％。
7)2M NaCl溶液经过5个CV洗去杂蛋白；
8)脱气水经过5个CV；
9)20％乙醇溶液经过5个CV。
注：一个CV为一个柱体积。
(4)半制备型反相高效液相色谱
采用半制备C18反相高效液相色谱(岛津LC-20AR，日本)进行进一步的纯化步骤(3)的蛋白洗脱峰，色谱柱选用SunfireTM Prep C18(5μm，10×100mm)。步骤(3)所得的蛋白质初步纯化液60℃真空离心浓缩，过0.22μm滤膜后置于4℃下备用，用蒸馏水复溶后进行高效液相色谱分析。设置洗脱程序如表1所示，用pH＝3.5的15mmol/L磷酸二氢钾作为流动相A，用纯乙腈作为流动相B，收集220nm吸光度下的单峰溶液。纯化结果见图2b，可以看到经半制备高效液相色谱纯化后得到是三个单峰，对各个单峰对应的流出液收集起来做琼脂扩散抑菌实验，见图2c，发现峰1和峰3的流出液没有抑菌活性，峰2的流出液有抑菌活性。
表1、梯度洗脱程序
梯度洗脱程序是：0-5min流动相A体积分数维持在80％；5-30min，流动相A由体积分数80％匀速降低至50％。
(5)分析型反相高效液相色谱对细菌素纯度鉴定
将上述步骤(4)所得的由半制备HPLC纯化所得的具有较好抑菌活性的峰2溶液用分析型反相高效液相色谱仪(waters 2489，中国)进行纯度检测，色谱柱选用C18(5μm，4.6×250mm)。洗脱程序同表1，流动相同实施例1步骤(4)，进样体积为10μL，流速为1mL/min。色谱图如图2d可见，220nm的吸光度下，出现单一色谱峰，表明细菌素得到了较好的纯化，半制备液相峰2对应的流出液即为细菌素溶液。
(6)、液质联用测定细菌素的分子量和氨基酸序列
将上述步骤(4)纯化得到的细菌素样品(即峰2溶液)采用液质联用测定细菌素的分子量和氨基酸序列。
1mg/mL的样品中加入DTT溶液使其终浓度为10mmol/L，于56℃水浴中还原1h；加入IAM溶液使其终浓度为50mmol/L，避光反应40min；使用自填脱盐柱脱盐，于45℃真空离心浓缩仪中挥干溶剂。分析柱：ACQUITYUPLC HSS C18 Column(1.8μm,2.1mm×100mm)，流动相A：0.1％甲酸的水溶液，流动相B：含0.1％甲酸和80％乙腈的水溶液，流速：0.200ml/min,每个组分分析时间：90min，洗脱程序是见下表：
采用电喷雾电离(ESI)正离子模式进行检测。结果显示见图2e质谱采集的wiff文件，经过软件PEAKS Studio数据库检索，得到氨基酸的序列HNGEIGYWLGQK，分子量为1400.68。
实施例3：植物乳杆菌WZS02细菌素抑菌谱及最小抑菌浓度(MIC)的测定
植物乳杆菌WZS02细菌素抑菌谱的测定
挑选革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌及霉菌共13种作为指示菌，采用牛津杯法抑菌圈实验对植物乳杆菌WZS02所产的峰2细菌素进行抑菌活性测试，以金黄色葡萄球菌作为指示菌，将甘油管保藏的金黄色葡萄球菌划线于固体LB培养基，后放于37℃恒温培养箱中培养24h。待菌落形成后，挑取单菌落接种于液体LB培养基中后放于振荡培养箱37℃、200rpm培养12h-18h，测金黄色葡萄球菌OD600值，接着用0.9％生理盐水将菌液稀释成OD为1的菌悬液，取稀释后的菌液100μL涂布到LB平板上，放入牛津杯，往牛津杯孔洞中加入100μL浓度为1mg/mL的细菌素溶液，最后放入37℃恒温培养箱中过夜培养，直至有显著的抑菌圈形成，测量抑菌圈直径并记录。结果如表2所示，表明该植物乳杆菌WZS02所产的细菌素是一种具有广谱抑菌活性的细菌素，对大多数革兰氏阳性菌都具有较好的抑菌活性，同时对大肠杆菌K88、铜绿假单胞菌ATCC 15442这两株革兰氏阴性菌具有一定的抑菌活性，但对酵母菌和霉菌无抑菌作用。该细菌素对常见的一些食源性致病菌如大肠杆菌，金黄色葡萄球菌等都具有较好的抑菌作用。因此，本发明的植物乳杆菌WZS02细菌素弥补了大多数细菌素抗菌谱窄的缺陷。
表2、植物乳杆菌WZS02的抑菌谱
注:“+++”直径≥15mm高度敏感；“++”直径10-15mm中度敏感；“+”直径0-10mm低度敏感；“-”无抑菌作用。
采用微量肉汤稀释法测定细菌素对指示菌金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)。
将甘油管保藏的金黄色葡萄球菌划线于固体LB培养基，后放于37℃恒温培养箱中培养12h-18h。待菌落形成后，挑取单菌落接种于液体LB培养基中后放于振荡培养箱37℃、200rpm培养12h-18h，测金黄色葡萄球菌的OD600值，然后用无菌LB将菌液稀释成OD600为0.2的菌悬液，备用。
将1mg/mL的细菌素溶液用无菌LB培养基进行二倍梯度稀释，稀释成最终浓度为1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.3μg/mL、15.6μg/mL、7.8μg/mL、3.9μg/mL的细菌素溶液，分别向96孔板中加入500μL不同稀释浓度的细菌素溶液，以只加入500μL的液体LB培养基作为空白对照。接着向每孔中加入500ul OD600为0.2的菌悬液，混匀后，37℃、400rpm震荡培养24h。观察菌悬液的浑浊度。以无指示菌生长的最低浓度作为细菌素的最小抑菌浓度(MIC)，结果见图3，当细菌素浓度为1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL时菌悬液未变浑浊，指示菌没有生长，当细菌素浓度为31.3μg/mL、15.6μg/mL、7.8μg/mL、3.9μg/mL时指示菌生长、菌悬液变浑浊，因此对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为62.5μg/mL。
实施例4：温度、pH和酶解对植物乳杆菌WZS02细菌素稳定性的影响
(1)、植物乳杆菌WZS02细菌素温度稳定性
将上述实施例2得到的细菌素溶液分别在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、121℃恒温处理40min，并以未经热处理的细菌素溶液为对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用抑菌率法测定抑菌活性(方法同实施例1)。由图4可得，当用不同温度处理时，植物乳杆菌WZS02细菌素对指示菌的抑菌活性基本没有变化；虽然随着温度增加，抑菌圈率稍有减小。说明细菌素ZFM225具有良好的热稳定性。
(2)、植物乳杆菌WZS02细菌素pH稳定性
将上述实施例2得到的细菌素溶液分别用1M的NaOH溶液和1M的HCl溶液调pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10，并在30℃下静置90min，然后将细菌素溶液调回初始pH(初始pH＝6)，以pH＝4的细菌素溶液为对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用抑菌率法测定抑菌活性(方法同实施例1)。由图5可得，细菌素在经pH 2-5范围处理后抑菌活性几乎没有丧失；但是经过较高pH处理之后，抑菌活性大幅下降甚至丧失活性。
(3)、植物乳杆菌WZS02细菌素酶解稳定性
将上述实施例2得到的细菌素溶液分别用1M的NaOH和1M的HCl调至胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、α-糜蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶和过氧化氢酶的最适pH，然后在各酶的最适温度下处理90min(各种蛋白酶的终浓度为1mg/mL)。然后将处理好酶解液调至细菌素溶液的初始pH＝6，最后80℃、20min灭活蛋白酶，并以未用蛋白酶处理的细菌素溶液为对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用抑菌率法测定抑菌活性(方法同实施例1)。由图6可得，细菌素对α-淀粉酶和脂肪酶不敏感，对蛋白酶较为敏感，其中胃蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后，抑菌率下降至23％左右，胰蛋白酶和蛋白酶k处理后，抑菌率下降了30％，α-蛋白酶处理后，抑菌活性基本丧失。
本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。
Claims (10)
1.一种植物乳杆菌细菌素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将培养至生长对数期的植物乳杆菌WZS02的种子液，接种至MRS培养基进行发酵，所得的发酵液离心，获得发酵上清液；其中，所述植物乳杆菌WZS02的保藏编号为CCTCC NO:M20231103，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏时间2023年06月27日；
2)发酵上清液用乙酸乙酯萃取，收集有机相，旋蒸除去乙酸乙酯后用蒸馏水复溶得到蛋白质粗提液；
3)蛋白质粗提液经过阳离子交换层析柱，用含NaCl的40-60mM的乙酸钠容液作为洗脱液进行梯度洗脱，收集目标洗脱峰溶液经过透析除盐，得到蛋白质初步纯化液；
4)所述蛋白质初步纯化液经过半制备反相高效液相色谱纯化，获得植物乳杆菌WZS02细菌素。
2.如权利要求1所述的一种植物乳杆菌细菌素的制备方法，其特征在于步骤1)发酵的步骤为：将所述种子液以1.5-2.5％的接种量接种到pH为5.0-7.0的MRS液体培养基中，30-37℃温度下静置厌氧培养20-30h。
3.如权利要求2所述的一种植物乳杆菌细菌素的制备方法，其特征在于所述发酵的具体步骤为：将所述种子液以2％的接种量接种到pH为6.0的MRS液体培养基中，37℃温度下静置厌氧培养24h。
4.如权利要求1所述的一种植物乳杆菌细菌素的制备方法，其特征在于步骤2)的过程为：将发酵上清液浓缩为原来体积的40-60％，浓缩液中加入0.5-1.5倍体积的乙酸乙酯，充分混合后静置分液，收集有机相，将水相重复萃取的操作1-3次，有机相合并后旋蒸除去乙酸乙酯后用蒸馏水复溶得到蛋白质粗提液。
5.如权利要求1所述的一种植物乳杆菌细菌素的制备方法，其特征在于步骤3)的具体过程为：将蛋白质粗提液经过阳离子交换层析柱，在180-250min内使通入至阳离子交换层析柱中的40-60mM乙酸钠洗脱液中的氯化钠浓度从0M匀速线性升至1M，收集0.42M～0.58MNaCl浓度对应的洗脱液；采用透析袋进行除盐，得蛋白质初步纯化液；
梯度洗脱时，利用平衡缓冲液和洗脱缓冲液的配比液进行梯度洗脱；
平衡缓冲液为40-60mM乙酸钠，pH调至4-5；
洗脱缓冲液为含1.0M NaCl的40-60mM乙酸钠，pH调至4-5。
6.如权利要求5所述的一种植物乳杆菌细菌素的制备方法，其特征在于步骤3)所述阳离子交换层析柱为CM SefinoseTMFF。
7.如权利要求1所述的一种植物乳杆菌细菌素的制备方法，其特征在于步骤4)中蛋白质初步纯化液采用半制备型C18反相高效液相色谱进行进一步的纯化，用pH＝3.5的15mmol/L磷酸二氢钾作为流动相A，用纯乙腈作为流动相B，梯度洗脱程序是：0-5min流动相A体积分数维持在80％；5-30min，流动相A由体积分数80％匀速降低至50％；
收集220nm吸光度下具有抑菌活性的液相色谱洗脱组分，获得植物乳杆菌WZS02细菌素溶液。
8.如权利要求1-7任一所述方法制备的一种植物乳杆菌细菌素。
9.如权利要求8所述的一种植物乳杆菌细菌的抗菌用途，其特征在于：对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌均具有抑菌活性；但对酵母菌和霉菌没有抑制作用。
10.如权利要求9所述的一种植物乳杆菌细菌的抗菌用途，其特征在于：革兰氏阳性细菌包括金黄色葡萄球菌ATCC 6538、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、发酵乳杆菌WZK01中的至少一种；
革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌K88、铜绿假单胞菌ATCC 1544中的至少一种；
酵母菌包括酿酒酵母、毕赤酵母、假丝酵母中的至少一种；
霉菌包括根霉菌、黑曲霉、青霉菌、链霉菌中的至少一种。
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