CN115505541A - 一种适用于小麦真菌病害的生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌及其应用 - Google Patents
一种适用于小麦真菌病害的生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种适用于小麦真菌病害的生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌及其应用，所述的分类命名为吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）F‑12，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号是：CCTCCM 2022619，保藏日期：2022年5月13日。本发明还公开了上述吡咯伯克霍尔德氏菌首次在防治小麦赤霉病中的应用和在促进小麦生长中的应用。本发明还提供了一种防治小麦赤霉病的杀菌剂，即将F‑12接种于培养基中发酵培养所得。本发明的F‑12对禾谷镰孢菌抑制作用强，对多种病原真菌具有拮抗作用，且培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，具体地说，涉及一种适用于小麦真菌病害的生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌及其应用。
背景技术
小麦赤霉病属于世界性病害，能危害小麦的各个发育阶段，导致穗腐、茎腐、苗腐、杆腐，其中穗腐最为严重，它的爆发，严重影响了小麦的生产和发展。小麦是世界上总产量仅次于玉米的粮食作物，2019年种植面积为2.16亿hm2，全球43个国家，约40％的人口以小麦为主。该病菌最早是1822年希雅尼兹(Schweinitz)在美国玉米上发现此病，且与小麦上的赤霉病相同；我国对于赤霉病的研究最早报道在1930年，至今，我国的麦田依然在遭受赤霉病的威胁。小麦赤霉病由禾谷镰孢菌复合种(Fusarium graminearum complex)引起，其致病病原菌主要有5种，分别是禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)、黄色镰孢菌(Fusariumcu lmorum)、燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)和亚洲镰孢菌(Fusarium asiaticum)，江浙沪一代最为严重。小麦赤霉病是小麦减产的主要原因，发病的麦穗出粉率低，麦粒皱瘪，使用该类发病小麦制作出的面粉颜色呈黑色且粘性差，最重要的是，发病的麦穗含有毒素，人畜食用会发生急性中毒，产生呕吐、腹痛、头昏等症状，严重危害健康。
由于小麦赤霉病的发生对经济发展和人畜健康等各方面均有严重影响，所以该病害的防治就显得尤为重要。如今，人们对农作物产量和品质的要求越来越高，过度依赖农药的化学防治措施和大量使用化肥等农业防治加剧了土壤和水环境的污染，给农业生产和发展带来了巨大威胁，所以，生物防治成为了研究热点。筛选生防菌是开展生物防治措施的一项重要工作，研究发现，目前具有防治小麦赤霉病功能的生防菌涵盖了细菌、真菌的多个种属，最常见的有芽孢杆菌、酵母菌、霉菌、放线菌。
洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia complex，简称Bcc)是一类广泛存在于植物根际的革兰氏阴性菌，该类细菌具有显著的生防、促生和环境修复等作用，不少优势菌株已作为典型的生防菌广泛应用于生产实践中，被研究作为杀虫剂、杀菌剂、生物农药等来使用。目前，Bcc的9个基因型，除基因型I保留原名以外，基因型II-IX都重新命名，它们分别为：Burkholderia multivorans、Burkholderia cenocepacia、Burkholderiastabilis、Burkholde ria vietnamiensis、Burkholderia dolosa、Burkholderiaambifaria、Burkholderia anthina、B.p yrrocinia。Bcc已经成为国外研究的热点，但是国内对该类菌株的研究报道相对较少。目前，该菌株已被发现对多种病害具有防效，如：棉花枯萎病，花生黄曲霉，杨树溃疡病，但是对小麦赤霉病的防效还未见相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高效防治小麦赤霉病且能够有效促进植物生长的吡咯伯克霍尔德氏菌。
技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案：
本发明的吡咯伯克霍尔德氏菌(B.pyrrocinia)FH-12是一种从麦玉轮作田中分离到的对禾谷镰孢菌具有拮抗作用且对小麦生长具有促进作用的生防菌株，所述的Burkholderia pyrro cinia F12菌，其编号为F12，2022年5月13日保存于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC M 2022619。
上述吡咯伯克霍尔德氏菌(B.pyrrocinia)中，所述的吡咯伯克霍尔德氏菌(B.pyrroci nia)的最佳发酵条件为：采用LB培养基进行振荡培养，振荡培养速度为180r/min～220r/min，培养温度为28℃，初始pH为6～7，发酵时间为24～60h。
本发明还提供了包含所述吡咯伯克霍尔德氏菌株的微生物菌剂。
可选的，所述微生物菌剂为吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12的菌液，对照菌株为实验室分离保存的吡咯伯克霍尔德氏菌(B.pyrrocinia)H-BX7的菌液。
本发明还提供了所述吡咯伯克霍尔德氏菌株在促进植物生长中的应用。
可选的，在植物生长期间，对所述植物灌根吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12的菌液，同时以 H-BX7菌液为对照组。
植物生长主要涉及地下部分，可用根长指标来衡量。
上述所述的吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12及其代谢产物对禾谷镰孢菌(F.graminearum) 具有一定的拮抗作用，因此能高效防治小麦赤霉病，然而，并不是所有的吡咯伯克霍尔德氏菌对禾谷镰孢菌有很好的拮抗效果，本专利以同一种的H-BX7菌液为对照组。
所述的吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12的剂型为菌液，吡咯伯克霍尔德氏菌H-BX7的剂型为菌液。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)吡咯伯克霍尔德氏菌(B.pyrrocinia)FH-12为促生土壤细菌的一种，对禾谷镰孢菌抑制作用强，对多种病原真菌具有拮抗作用，在植物病害生物防治中所起到的非常重要的作用，对病原菌的拮抗作用具有广谱性；促进植物的生长等优点，尤其是对小麦赤霉病的防治具有重要意义。
(2)吡咯伯克霍尔德氏菌(B.pyrrocinia)FH-12能够人工培养、培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1为实施例1中菌株筛选及对峙培养图；图中：A：小麦根际土壤细菌分离，B：吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12划线培养，C：吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12与禾谷镰孢菌对峙培养正面，D：吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12与禾谷镰孢菌对峙培养反面，E：吡咯伯克霍尔德氏菌H -BX7与禾谷镰孢菌对峙培养正面，F：吡咯伯克霍尔德氏菌H-BX7与禾谷镰孢菌对峙培养反面。
图2为本发明中基于recA基因构建伯克霍尔德氏菌属种分类单元的最大似然(ML)树，本研究分离菌株吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12的分类单元用红点显示。
图3为实施例2中病原菌菌丝形态；图中：A：正常的禾谷镰孢菌菌丝萌发形态，B：20％的吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12发酵液拮抗后的禾谷镰孢菌菌丝形态，C：吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12菌悬液拮抗后的禾谷镰孢菌菌丝形态。
图4为实施例3中为吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12具有广谱抑菌效果。
图5为实施例4中为吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12对小麦幼苗生长影响的结果图；图中： A：清水CK；B：吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12的菌液；C：吡咯伯克霍尔德氏菌H-BX7的菌液。
图6为实施例4中吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12对小麦赤霉病大田防效结果图：图中：A：接无菌水；B：喷施吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12菌悬液；C：接种吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12菌悬液；D：接种禾谷镰孢菌孢子液；E：喷施吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12菌悬液+接种禾谷镰孢菌孢子液；F：接种吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12菌悬液+接种禾谷镰孢菌孢子液。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
供试材料如下：
(1)菌种
供试小麦赤霉病的病原菌(禾谷镰孢菌F.graminearum)由安徽农业大学植物保护学院菌种库提供。
对比菌株吡咯伯克霍尔德氏菌H-BX7为安徽农业大学植物保护学院真菌学及植物真菌病害研究课题组实验室分离保存的菌种库提供。
(2)主要试剂
琼脂、酵母提取物YEAST EXTRACT、胰蛋白胨TRYPTONE、氯化钠、葡萄糖、蔗糖、95％乙醇、硝酸铵、羧甲基纤维素钠、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、蛋白胨、酵母浸膏、牛肉浸膏。
(3)培养基
CMC培养基、LB培养基、PDA培养基。
实施例1
禾谷镰孢菌拮抗菌的筛选与鉴定
从安徽蒙城玉米-小麦轮作区，玉米季土壤中采集表层土壤(10cm-15cm处土壤)。过2m m不锈钢筛后，称取10g土壤样品，放入盛有90mL灭菌水的锥形瓶，28℃，200r/min震荡1 h，制成土壤悬液。吸取1mL土壤悬液，采用灭菌水梯度稀释101-107倍。随后，分别吸取各稀释度土悬液0.1mL，均匀涂布于LB固体培养基平板上，28℃恒温培养12h～72h。待菌落长出后，连续划线培养获得纯培养物，20％甘油于-80℃保存。挑取细菌接LB液体培养基中，置于28℃、180r/min的摇床中培养36h。
将活化好的禾谷镰孢菌，接种于PDA平板中心位置，置于25℃的培养箱中，培养2d后，在菌落边缘打取新鲜菌丝块转接于干净的PDA平板中心位置，在菌块四周2.5cm放置四片无菌滤纸片(Φ＝6mm)，吸取4μL菌液至滤纸片上，以滴加4μL无菌水空白对照，同时以滴加 4μL H-BX7菌液为对照，置于25℃培养箱中培养。待对照组菌丝接近满板时，测量菌落直径，每组试验重复3次，计算抑菌率。
小麦根系土壤伯克霍尔德氏菌对禾谷镰孢菌的抑制率计算公式：
式中：A是指对照组病原菌菌落的直径；
B是指处理组病原菌菌落的直径；
实验分离筛选获得一株吡咯伯克霍尔德氏菌菌株，编号FH-12。经过平板对峙实验吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12对禾谷镰孢菌有明显拮抗作用，对禾谷镰孢菌的抑制率达到71.8％，而H-BX7对禾谷镰孢菌的拮抗效果明显没有FH-12菌株拮抗效果明显，H-BX7的拮抗效果为44.47％，菌株筛选及对峙培养结果如图1。测序结果在NCBI的数据库中进行核酸序列比对显示，FH-12菌株和伯乐霍尔德属菌的相似性达到99.97％，再用特异引物测的相似度为9 9.53％。利用MAGE X软件采用邻接法构建FH-12菌株的系统发育树。
结合图2来看，将吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12的16S rDNA序列在NCBI数据库中进行Blast比对，与FH-12菌株同源性较高的菌株均属于伯克霍尔德氏属；在用该属的特异引物recA扩增的序列在NCBI数据库中进行序列比对，用MAGE X软件采用邻接法构建FH-12 菌株的系统发育树，FH-12与吡咯伯克霍尔德氏菌(B.pyrrocinia)在同一系统进化分支上，相似度为99.53％。
实施例2
吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12(发酵液、菌液)、吡咯伯克霍尔德氏菌H-BX7菌株(发酵液、菌液)对禾谷镰孢菌生长影响。
挑取活化好的吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12(或对照菌株)新鲜单菌落接入LB培养基中， 28℃、180r/min的摇床中培养36h，随后将菌悬液分装到离心管中放入低温高速离心机(4℃、 10000r/min)，取上清液弃菌体沉淀。用无菌的细菌过滤器(Φ＝0.22μm)过滤，得到菌株的无菌发酵液。
将无菌发酵液加入PDA培养基中，制成含20％发酵代谢产物平板。使用6mm内径的打孔器打取新鲜的禾谷镰孢菌边缘菌丝块，转接于处理过的PDA平板中心位置，以未加入无菌发酵液的平板为空白对照，置于28℃下恒温培养。待对照组菌丝铺满整个培养皿时，记录数据并计算抑菌率。
由实施例1可知，吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12对禾谷镰孢菌有较强的抑制作用。因此，使用接种针挑取平板抑菌圈边缘菌丝，置于载玻片上，盖上盖玻片，于显微镜下观察。如图3、图4所示，对照组菌丝生长正常，表面平滑，形状均匀；加入20％FH-12发酵液作用后菌丝尖端变细，变厚的现象，用菌悬液对峙培养的菌丝尖端变细且有内容物流出。
结果表明，加入20％吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12的发酵液对禾谷镰孢菌有明显拮抗作用，其中发酵液抑制率达到37.64％，用吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12菌悬液对峙培养的抑制率达71.80％；此外，在相同条件下以H-BX7为对照，作为近似菌的对比菌株，其中发酵液抑制率仅为22.58％，用其菌悬液对峙培养的抑制率仅为44.47％。
表1吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12/H-BX7、对比菌株对禾谷镰孢菌平板的抑菌率
| 样本 | 菌落直径(cm) | 抑制率(％) |
| FH-12发酵液 | 5.30 | 37.64 |
| FH-12菌液 | 2.43 | 71.80 |
| H-BX7发酵液 | 6.58 | 22.58 |
| H-BX7菌液 | 4.72 | 44.47 |
实施例3
吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12具有广谱抑菌效果
挑取活化好的吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12新鲜单菌落接入LB培养基中，28℃、180r/m in的摇床中培养36h，在真菌菌落边缘打取新鲜菌丝块转接于干净的PDA平板中心位置，在菌块四周2.5cm放置四片无菌滤纸片(Φ＝6mm)，吸取4μL菌液至滤纸片上，以滴加4μL无菌水空白对照，置于25℃培养箱中培养。待对照组菌丝接近满板时，测量菌落直径，每组试验重复3次，计算抑菌率。吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12对立枯丝核菌的抑菌率为71.6％、对苹果黑腐皮壳菌的拮抗效果为68.5％、核盘菌的拮抗效果为76.63％、对尖孢镰孢菌的拮抗效果为64.1％、对炭角菌的拮抗效果为72.1％、对韦司梅拟盘多毛孢的拮抗效果为64.2％、对禾谷镰孢菌的拮抗效果为71.8％、轮枝镰孢菌的拮抗效果为67.6％。
实施例4
吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12对小麦幼苗生长作用研究
挑取吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12(或吡咯伯克霍尔德氏菌H-BX7菌株)单菌落接种到LB培养基中，放于28℃、180r/min的摇床中培养36h。小麦消毒催芽后种植，待麦苗出芽3d、7d，将吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12菌(或吡咯伯克霍尔德氏菌H-BX7菌株)悬液浇灌于小麦的根部，对照组浇灌无菌水。
结果表明，吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12的菌液在小麦生长过程中对于小麦的幼苗生长有促生作用，浇灌菌液的小麦，小麦平均根长增加12.52cm，同等样品条件下，用吡咯伯克霍尔德氏菌H-BX7浇灌菌液的植株的平均根长比空白对照组增加6.17cm(如表2所示)。小麦在生长过程中，浇灌一定量的菌液，有一定的促生效果，植株比未浇灌菌液的小麦根部要粗壮且侧根数量有明显增加。此外，采用吡咯伯克霍尔德氏菌H-BX7菌株处理后，对于小麦苗的根长提升作用有限。A：施用清水CK的小麦；B：施用吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12菌液的小麦；C：施用吡咯伯克霍尔德氏菌H-BX7菌液的小麦(如图5所示)。
表2吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12对小麦苗生长影响
| 处理 | 根长(株/cm) |
| CK | 19.35±0.59a |
| H-BX7 | 25.53±0.62b |
| FH-12 | 31.86±0.94c |
注：抑制率表示为平均值±标准误差，小写英文字母为组间差异在P＜0.05显著水平的显著性
实施例5
吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12对大田小麦赤霉病的防效研究
供试小麦种系为安农203，实验地点为安徽农业大学农翠园，挑取供试菌株的单菌落接种到LB培养基中，于28℃、180r/min的摇床中培养36h。在四月中旬小麦扬花期，将供试菌株菌液均匀的喷洒或注射在大小一致、生长状态相似的小麦穗表面，套袋处理，3d后，每株小麦穗注射1×106个/mL孢子悬浮液10μL，以喷洒无菌水作为空白对照，以只喷洒菌液和只注射菌液的小麦穗为条件对照，以未做菌液处理只接禾谷镰孢菌孢子液的小麦为阳性对照，以喷洒菌液3d后接种禾谷镰孢菌为处理1，以注射10μL菌液3d后接种禾谷镰孢菌为处理2，分别对应图6施用吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12后中A、B、C、D、E、F，15d后统计麦穗发病情况并拍照。
如表3和图6所示，吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12在田间防效分别达67.18％和65.52％。
表3吡咯伯克霍尔德氏菌FH-12对田间小麦赤霉病的防治效果
| 处理 | 病穗率(％) | 病情指数 | 防效(％) |
| 小麦赤霉病CK组 | 91.69 | 63.89 | / |
| FH-12处理1 | 75.00 | 20.97 | 67.18 |
| FH-12处理2 | 75.42 | 22.03 | 65.52 |
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。
Claims (6)
1.一种适用于小麦真菌病害的生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌，其特征在于：所述的吡咯伯克霍尔德氏菌的拉丁学名为Burkholderia pyrrocinia，其编号为F-12，2022年5月13日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2022619。
2.根据权利要求1所述的适用于小麦真菌病害的生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌，其特征在于：
所述的吡咯伯克霍尔德氏菌的剂型为微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的适用于小麦真菌病害的生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌，其特征在于：
所述的微生物菌剂为菌悬液。
4.一种适用于小麦真菌病害的生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌在常见病原防治中的应用，其特征在于：
所述的常见病包括禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）、苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporium）、炭角菌（Xylariales sp.）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、轮枝镰孢菌（Fusarium verticillioides）、韦司梅拟盘多毛孢（Pestalotiopsis vismiae）。
5.根据权利要求4所述的适用于小麦真菌病害的生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌在常见病菌防治中的应用，其特征在于：
所述的小麦赤霉病菌为禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）。
6.一种适用于小麦真菌病害的生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌在促进小麦生长中的应用。
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