CN107326041A - 一种利用终止子调控酿酒酵母基因表达强度的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种利用终止子调控酿酒酵母基因表达强度的方法,属于生物工程领域。首先构建含有启动子和报告基因的终止子验证载体,通过生物信息学分析酿酒酵母结构基因下游的3'‑UTR终止子序列信息,扩增后与终止子验证载体连接形成终止子库;通过替换或改变基因表达盒中的终止子,可以实现从转录和翻译水平调控目标基因或途径的表达强度,为酵母代谢途径优化提供了高效的精细调控手段,有利于外源基因或途径在酵母细胞中的高效和平衡表达。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用终止子调控酵母基因表达强度方法,属于生物工程领域。
背景技术
酿酒酵母作为传统工业微生物,能够以安全可靠的方式生产高值天然产物、生物燃料、化工产品和材料等,通过引入新的功能基因模块或新的合成途径已经能够在其中合成青蒿素前体青蒿酸、人参皂甙、丁醇衍生物等复杂化合物。然而,由于外源基因在酵母细胞内受转录调控、翻译后修饰、代谢网络协调等多层次的影响,限制了外源基因或途径在酵母细胞内的表达效果,造成代谢流不平衡等问题,最终限制了目标产品的生产浓度,外源基因和代谢途径的精细表达调控显得尤为重要。
代谢途径调控作为代谢工程以及合成生物学的核心,可以在转录水平、翻译水平、蛋白质水平进行不同程度的调节,但能够应用于酿酒酵母的调控元件非常有限,目前最常用元件为启动子和转录因子两种,都是从基因表达的“输入”进行控制,很少从“输出”角度探索。终止子是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列,当RNA转录到终止子区域时,其自身形成发卡结构,发卡式的结构阻碍了RNA聚合酶的移动,导致RNA聚合酶从模板上脱落下来,转录终止,属于“输出”控制。现已证明,在真核细胞(如酿酒酵母)的基因表达调控中,每个基因的表达均受终止子的调控,当终止子缺失时,可能由于延长了转录过程而导致翻译过程出现不稳定,终止子的终止调控作用是酵母基因表达不可或缺的,且不同的终止子具有不同的终止活性,能够影响mRNA3′末端的进程、mRNA的稳定性、对完成转录和影响mRNA的半衰期起到重要角色,并通过影响mRNA的半衰期影响净蛋白的产生等。因此,将终止子作为一种新型的调控元件控制基因表达,将有利于丰富酵母调控元件,对酵母途径工程的精细调控起到重要促进作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是:通过建立酿酒酵母终止子验证载体或工程菌株的构建方法,在验证终止子调控基因表达效果的基础上,提供一种利用终止子调控目标基因或途径表达强度的方法,从而解决在酿酒酵母途径工程中目的基因表达难以精细控制的问题。
为解决上述技术问题,采用的技术方案是:一种利用终止子调控酵母基因表达强度方法:利用终止子中不同活性的终止子替换或改变酵母“启动子+结构基因+终止子”基因表达盒中的终止子,可以实现从转录和翻译水平精细调控酵母中外源基因或途径的表达。
所述的替换或改变酵母基因表达盒中的“终止子”的终止子,其获得过程为:基于Genbank数据库中酿酒酵母基因组信息,通过生物信息学分析获得酿酒酵母结构基因下游的3'-UTR(3'-非翻译区)终止子序列,设计引物扩增获得终止子基因片段,与Hind III和BamH I双酶切线性化pRS41H-TYS1p-eGFP的验证载体共转化酿酒酵母,并经验证载体验证终止子活性后,得到活性合适的终止子。
所述的替换或改变酵母基因表达盒中的“终止子”的终止子为CDC20t、HRR25t、FOB1t、HDA1t、DEP1t、PDA1t、SLD2t、HAP4t、NUT1t、LAT1t、GND1t、APP1t、BUD31t、OAC1t、APE2t、MIC60t、RBG2t、AAT1t、SIR2t、RAD53t、CDC42t、RAD54t、CDC25t、SAC6t、NAB2t、RTG2t、NDI1t、HMT1t、MDH1t、CIT2t、SSO2t、PGM2t、CIT1t、PFK1t、PUF3t、RPC40t、PDB1t、ATP5t、AAT2t、GUT2t、HST2t、MDH2t、GIP2t、ACP1t、BUD20t、BUD20t、GEP3t、YGK3t、SSB2t、IDH2t、MET5t、PYC2t、RVS167t、TAF1t、RAD26t、NDI1t、ISC1t、PIM1t、MMS22t、DOP1t、NTA1t、GRS2t、TPS1t、TDH3t、PGK1t、DIT1t、TRZ1t、PTC6t、SDH1t、SOR1t、HOG1t、CDC48t、YFH1t、MIG1t、SSD1t、ERG6t、LSM1t、RAD14t、SLX5t、RIM15t、VPS41t、PHO23t、ELO2t、RTG3t、LRP1t、TIF2t、REI1t、SSF1t、MNN10t、JNM1t、VPS8t、FUM1t、GRS1t、STB5t、SDH4t、LEU1t、ILV1t、ZRT1t、SDH2t、MDM35t、ATP15t。
所述的验证载体验证终止子活性,其验证方法:以经Sal I和Hind III限制性内切酶线性化的单拷贝质粒pRS41H为骨架,以绿色荧光蛋白eGFP为报告基因,以启动子TYS1p控制绿色荧光蛋白eGFP表达,通过酶切连接而形成验证载体pRS41H-TYS1p-eGFP,该验证载体不含有终止子,将终止子连接至验证载体pRS41H-TYS1p-eGFP后形成表达载体“pRS41H-TYS1p-eGFP-终止子”,通过测定绿色荧光蛋白eGFP的荧光强度来表征终止子的活性。
所述的酿酒酵母为酿酒酵母CEN.PK2-1C、INVSc1、CEN.PK2-1D或W303-1a。
有益效果:本申请公开的终止子调节目的基因或途径表达强度的方法,操作方便,使用灵活,可以有效地调节目的基因或途径的表达强度,为酵母代谢途径优化提供了高效的精细调控手段,有利于外源基因或途径在酵母细胞中的高效和平衡表达。
附图说明
附图1验证载体pRS41H-TYS1p-eGFP的图谱;
附图2终止子对绿色荧光蛋白荧光强度的影响;
附图3终止子对绿色荧光蛋白转录水平的影响;
附图4终止子对β-半乳糖苷酶表达的影响。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,如实施例中组成型启动子TYS1p、绿色荧光蛋白eGFP、β-半乳糖苷酶LacZ所用的技术手段为本领域人员所熟知的常规手段。
实施例1:终止子验证载体的构建
步骤一、从Genbank基因库中查询获得酿酒酵母组成型启动子TYS1p基因序列,提取酿酒酵母基因组,扩增获得TYS1p基因片段。
引物序列为:
引物1:5’>ACGCGTCGACTCCTTGCGCTTACTCGAATA<3’,下划线序列为与Sal I酶切位点的重叠序列。
引物2:5’>GGGACAACTCCAGTGAAAAGTTCTTCTCCCTTGCTCACCATTGTTATCGTCAATTAGAG<3’,下划线序列为与报告基因eGFP重叠序列。
步骤二、从Genbank基因库中查询获得报告基因eGFP片段,化学合成后扩增获得eGFP基因片段。
引物序列为:
引物4:5’>TCCATAACCGCATACTCTAATTGACGATAACAATGGTGAGCAAGGGAGAAGAACTTTTC<3’,下划线序列为与启动子TYS1p重叠序列。
引物5:5’>CCCAAGCTTTTATTTGTATAGTTCATCCA<3’,下划线序列为与Hind III酶切位点的重叠序列。
步骤三、通过OE-PCR将启动子TYS1p与报告基因eGFP连接构建成TY S1p-eGFP,然后用Sal I和Hind III限制性内切酶对TYS1p-eGFP和单拷贝质粒pRS41H分别进行双酶切,柱回收后,用T4连接酶将TYS1p-eGFP和线性化的pRS41H连接,形成终止子验证载体pRS41H-TYS1p-eGFP(见附图1)。
步骤四、将上述连接形成的终止子验证载体pRS41H-TYS1p-eGFP转化大肠杆菌感受态细胞,涂在含有X-Gal、IPTG和Amp抗性的筛选平板上,经蓝白斑筛选、菌落PCR和测序验证获得含有终止子验证载体pRS41H-TYS1p-eG FP的大肠杆菌工程菌。
实施例2:终止子库的构建
步骤一、在NCBI数据库中查询酿酒酵母基因组序列,通过生物信息学分析获得酿酒酵母结构基因下游的3’-UTR终止子序列信息,设计引物,扩增获得终止子。以终止子TPS1t为例,从NCBI数据库库中查询获得TPS1t结构基因的3’-UTR终止子基因序列,设计引物扩增获得终止子TPS1t的基因片段。
引物序列为:
引物14:5’>CCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAATAAATGAACCCGATGCAAATGAG<3’,下划线序列为与eGFP报告基因的重叠序列。
引物15:5’>GCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCTTTTTGTCTTCTTCAAATTG<3’,下划线序列为与pRS41H质粒的重叠序列。
步骤二、挑取含有验证载体pRS41H-TYS1p-eGFP的大肠杆菌单菌落,接种于含有2%氯化钠、2%蛋白胨和1%酵母粉的液体培养基中,37℃、150rpm振荡过夜培养,提取质粒,验证载体pRS41H-TYS1p-eGFP采用Hind III和B amH I双酶切,使其线性化,用于终止子连接。
步骤三、将线性化好的验证载体pRS41H-TYS1p-eGFP和扩增获得的酵母终止子(如终止子TPS1t)用醋酸锂转化法转化到酿酒酵母CEN.PK2-1C细胞中,由于基因表达盒和终止子之间彼此具有重叠序列,通过酿酒酵母自身的同源重组功能完成验证载体pRS41H-TYS1p-eGFP和终止子的组装,形成完整的表达载体pRS41H-TYS1p-eGFP-TPS1t,获得酿酒酵母转化子。
步骤四、选择不同结构基因下游的3’-UTR终止子进行扩增,按照实施例2中的步骤一至步骤三,可获得含有不同终止子的表达载体和酿酒酵母转化子,形成终止子库。本案例按照实施例2,提供了含有100个不同终止子的库(表1)。
表1终止子库
实施例3:终止子对荧光蛋白表达强度的调控作用
从终止子库中随机挑取含有不同终止子表达载体的酿酒酵母转化子,接种于含有2%葡萄糖、2%蛋白胨和1%酵母粉的10mL培养基中,30℃、200rpm振荡培养36小时,利用流式细胞仪检测细胞内eGFP的荧光强度,以酿酒酵母CEN.PK2-1C的荧光强度为空白,终止子PGK1t的荧光强度为参照,发现终止子在翻译水平可以有效调控酵母基因表达(见附图2),如终止子RAD14t、TDH3t、SDH1t、NTA1t、MMS22t、SOR1t、TPS1t、ATP15t和ELO2t的荧光蛋白表达强度的顺序是:
RAD14t<TDH3t<PGK1t<SDH1t<NTA1t<MMS22t<SOR1t<TPS1t<ATP15t<ELO2t
提取培养36小时后酿酒酵母转化子的总RNA,反转录为cDNA后,以c DNA为模板,TUB1基因为内参,通过实时定量PCR检测eGFP的转录水平,说明酵母终止子能有效的影响mRNA的表达水平(见附图3),终止子的荧光蛋白表达强度的顺序是:HMT1<SSO2<CDC25<IDH2<CIT1<G EP3<AAT2<GIP2<MDH2<PGK1<MIC60<SOR1<APE2<ILV1<TPS1<PDA1<PYC2<SSD1<LRP1<HOG1
实施例4:终止子对β-半乳糖苷酶表达强度的调控作用
为了进一步验证终止子对结构基因表达强度的调控作用,选用β-半乳糖苷酶LacZ为报告基因,按照实施例1和2的方法,构建形成了不同终止子控制β-半乳糖苷酶LacZ表达的表达载体pRS41H-TYS1p-LacZ-RAD14t、pRS41H-TYS1p-LacZ-TDH3t、pRS41H-TYS1p-LacZ-SDH1t、pRS41H-TYS1p-LacZ-NTA1t、pRS41H-TYS1p-LacZ-MMS22t、pRS41H-TYS1p-LacZ-SOR1t、pRS41H-TYS1p-LacZ-TPS1t、pRS41H-TYS1p-LacZ-ATP15t和pRS41H-TYS1p-LacZ-HOG1t和相应的酿酒酵母转化子。
将上述酿酒酵母转化子接种于含有2%葡萄糖、2%蛋白胨和1%酵母粉的10mL培养基中,30℃、200rpm振荡培养36小时,测定报告基因LacZ的酶活,发现终止子对LacZ表达强度的调控作用与对eGFP的表达调控作用是一致的(见附图4),进一步增加了所得结论的可信性。
Claims (5)
1.一种利用终止子调控酿酒酵母基因表达强度的方法,其特征在于:利用终止子替换或改变酵母“启动子+结构基因+终止子”基因表达盒中的“终止子”,实现从转录和翻译水平调控酿酒酵母中外源基因或途径的表达。
2.如权利要求1所述的一种利用终止子调控酿酒酵母基因表达强度的方法,其特征在于:所述的替换或改变酵母基因表达盒中的“终止子”的终止子,其获得过程为:基于酿酒酵母基因组数据库,通过生物信息学分析扩增获得的酿酒酵母结构基因下游的3'-UTR终止子序列,并经验证载体验证终止子活性后,得到活性合适的终止子。
3.如权利要求1或2所述的一种利用终止子调控酿酒酵母基因表达强度的方法,其特征在于:所述的替换或改变基因表达盒中的“终止子”的终止子为CDC20t、HRR25t、FOB1t、HDA1t、DEP1t、PDA1t、SLD2t、HAP4t、NUT1t、LAT1t、GND1t、APP1t、BUD31t、OAC1t、APE2t、MIC60t、RBG2t、AAT1t、SIR2t、RAD53t、CDC42t、RAD54t、CDC25t、SAC6t、NAB2t、RTG2t、NDI1t、HMT1t、MDH1t、CIT2t、SSO2t、PGM2t、CIT1t、PFK1t、PUF3t、RPC40t、PDB1t、ATP5t、AAT2t、GUT2t、HST2t、MDH2t、GIP2t、ACP1t、BUD20t、BUD20t、GEP3t、YGK3t、SSB2t、IDH2t、MET5t、PYC2t、RVS167t、TAF1t、RAD26t、NDI1t、ISC1t、PIM1t、MMS22t、DOP1t、NTA1t、GRS2t、TPS1t、TDH3t、PGK1t、DIT1t、TRZ1t、PTC6t、SDH1t、SOR1t、HOG1t、CDC48t、YFH1t、MIG1t、SSD1t、ERG6t、LSM1t、RAD14t、SLX5t、RIM15t、VPS41t、PHO23t、ELO2t、RTG3t、LRP1t、TIF2t、REI1t、SSF1t、MNN10t、JNM1t、VPS8t、FUM1t、GRS1t、STB5t、SDH4t、LEU1t、ILV1t、ZRT1t、SDH2t、MDM35t、ATP15t。
4.如权利要求2所述的一种利用终止子调控酿酒酵母基因表达强度的方法,其特征在于:所述的验证载体验证终止子活性,其验证方法为:以经Sal I和HindIII限制性内切酶线性化的单拷贝质粒pRS41H为骨架,以绿色荧光蛋白eGFP为报告基因,以启动子TYS1p控制绿色荧光蛋白eGFP表达,通过酶切连接而形成的载体pRS41H-TYS1p-eGFP,将终止子连接至载体pRS41H-TYS1p-eGFP后形成表达载体“pRS41H-TYS1p-eGFP-终止子”,通过测定绿色荧光蛋白eGFP的荧光强度来表征终止子活性。
5.如权利要求1或2所述的一种利用终止子酿酒调控酵母基因表达强度的方法,其特征在于:所述的酿酒酵母为酿酒酵母CEN.PK2-1C、INVSc1、CEN.PK2-1D或W303-1a。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20171107 |