CN107075496B - 抗反馈乙酰羟酸合酶变体和使用其生产l-缬氨酸的方法 - Google Patents

抗反馈乙酰羟酸合酶变体和使用其生产l-缬氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及其中对L‑缬氨酸的反馈抑制被解除的乙酰羟酸合酶变体、编码该乙酰羟酸合酶变体的多核苷酸、包括该多核苷酸的表达载体、包括该乙酰羟酸合酶变体的生产L‑缬氨酸的微生物和使用该微生物生产L‑缬氨酸的方法。

Description

抗反馈乙酰羟酸合酶变体和使用其生产L-缬氨酸的方法
[技术领域]
本公开内容涉及其中对L-缬氨酸的反馈抑制被解除的乙酰羟酸合酶变体、编码该乙酰羟酸合酶变体的多核苷酸、包括该多核苷酸的表达载体、包括该乙酰羟酸合酶变体的生产L-缬氨酸的微生物、和使用该微生物生产L-缬氨酸的方法。
[背景技术]
L-缬氨酸是必需氨基酸并且被有效地用作饲料组分和食品的材料。
因为支链氨基酸(例如，L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸)使用相同的酶生物合成，所以已知难以经由发酵以大工业规模制备单一种类的支化氨基酸。另外，生物合成还具有由最终产物(即，L-缬氨酸)或其衍生物对主要酶发生反馈抑制的问题，并且因而存在关于发酵的限制。
[发明内容]
[技术问题]
在这种情况下，本发明人已经努力研发用于生产L-缬氨酸的有效方法。结果，他们已经验证了其中L-缬氨酸的反馈抑制被解除的新型乙酰羟酸合酶变体，并且确认了与不包含该变体的亲株相比，包括该变体的生产L-缬氨酸的微生物具有卓越的生产L-缬氨酸的能力，从而完成本公开内容。
[技术方案]
本公开内容的目标是提供其中对L-缬氨酸的反馈抑制被解除的乙酰羟酸合酶变体。
本公开内容的另一个目标是提供编码该乙酰羟酸合酶变体的多核苷酸和包含该多核苷酸的表达载体。
本公开内容的进一步的目标是提供生产L-缬氨酸的微生物，其包括乙酰羟酸合酶变体。
本公开内容的还进一步的目标是提供使用该生产L-缬氨酸的微生物生产L-缬氨酸的方法。
[发明的有益效果]
根据本公开内容的乙酰羟酸合酶变体处于其中对L-缬氨酸的反馈抑制被解除的状态。因此，与亲株相比，包括该变体的用于生产L-缬氨酸的微生物可以以高产率生产L-缬氨酸。
[具体实施方式]
在一个方面，本公开内容提供了乙酰羟酸合酶变体，其中从SEQ ID NO:3的氨基酸序列的N-端的第137个氨基酸——亮氨酸(L)——被置换为除亮氨酸以外的氨基酸，并且因而对L-缬氨酸的反馈抑制被解除。
如本文使用的，术语“L-缬氨酸”指的是具有(CH3)2CHCH(NH2)COOH的化学式的L-氨基酸，其是必需氨基酸之一，并且连同L-亮氨酸和L-异亮氨酸在结构上属于支链氨基酸。
如本文使用的，术语“乙酰羟酸合酶”指的是L-缬氨酸生物合成中的第一个酶并且也称为乙酰乳酸合酶。乙酰羟酸合酶催化丙酮酸的脱羧作用和与另一个丙酮酸分子的缩合反应以生产乙酰乳酸，其是缬氨酸的前体，或催化丙酮酸的脱羧作用和与2-丁酮酸的缩合反应以产生乙酰羟丁酸，其是异亮氨酸的前体。
乙酰羟酸合酶由两个基因即ilvB和ilvN编码。分别地，ilvB基因编码乙酰羟酸合酶的大亚基并且ilvN基因编码乙酰羟酸合酶的小亚基。在它们之间，由ilvN基因编码的小亚基被认为重要地参与反馈抑制。
由ilvN基因编码的乙酰羟酸合酶可以具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，但是不具体地限于此。
如本文使用的，术语“反馈抑制”指的是由酶系统中的最终产物抑制酶系统的早期(early state)反应。出于本公开内容的目的，反馈抑制指的是由L-缬氨酸抑制乙酰羟酸合酶——其介导L-缬氨酸生物合成的第一步——的活性，但是不限于此。因此，在当乙酰羟酸合酶的反馈抑制被解除的情况下，可以提高L-缬氨酸的生产能力。在本公开内容中，已经确认当从SEQ ID NO:3的氨基酸序列的N-端的第137个氨基酸——亮氨酸——被置换为不同的氨基酸——具体地苯丙氨酸(Phe，F)——时，对L-缬氨酸的反馈抑制被解除。
乙酰羟酸合酶——其中对L-缬氨酸的反馈抑制被解除——可以具体地具有SEQID NO:4的氨基酸序列。
另外，其中对L-缬氨酸的反馈抑制被解除的乙酰羟酸合酶变体不仅非限制性地包括具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的变体，而且包括如下变体：其具有与SEQ ID NO:4的氨基酸序列80％或更高，具体地90％或更高，更具体地95％或更高，并且甚至更具体地99％的同源性，其中与野生型乙酰羟酸合酶相比，对L-缬氨酸的反馈抑制实际上被解除。明显的是，具有如下生物学活性——其与具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的蛋白质的生物学活性基本上相同或相当——的任何氨基酸序列应当也属于本公开内容的范围，但是氨基酸序列在序列的一部分中可以具有缺失、修饰、置换或添加。
如本文使用的，术语“同源性”指的是两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性的百分比。一部分与另一部分的序列之间的同源性可以通过本领域已知的技术测定。例如，同源性可以使用容易获得的计算机程序通过直接布置两个多核苷酸分子或两个多肽分子的序列信息来测定。计算机程序的实例可以包括BLAST(NCBI)、CLC Main Workbench(CLC bio)、MegAlignTM(DNASTAR Inc.)等。另外，多核苷酸之间的同源性可以通过如下测定：在同源区之间形成稳定双链的条件下使多核苷酸杂交，使用单链特异性核酸酶解装配，接着大小测定解装配的片段。
如本文使用的，术语“同源的”指的是蛋白质之间的相关性，其中所有语法形式和拼写变化包括具有“共同的进化起源”的超家族源的(superfamily-derived)蛋白和其它物种源的(specie-derived)同源蛋白。这样的蛋白质(和其编码基因)具有由高程度的序列相似性反映的序列同源性。然而，在一般用途和在本公开内容中，当术语“同源性”被形容词比如“非常高”修饰时，它指的是序列相似性，而不是共同的进化起源。
根据本公开内容的具体实施方式，其中反馈抑制被解除的乙酰羟酸合酶变体可以是通过产L-缬氨酸微生物的突变生成的乙酰羟酸合酶变体。微生物的突变可以通过本领域中熟知的多种方法进行，并且可以使用来自物理或化学诱变的任一种。例如，适合于本公开内容的化学诱变因子可以包括N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、双环氧丁烷、甲磺酸乙酯、氮芥化合物(mustard compound)、肼和亚硝酸，但是不限于此。此外，化学诱变因子的实例可以包括N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、双环氧丁烷、甲磺酸乙酯、氮芥化合物、肼和亚硝酸，但是不限于这些化合物。另外，物理诱变因子的实例可以包括紫外辐射和γ辐射，但是不限于此。
此外，在本公开内容的具体实施方式中，谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P(韩国专利号10-1117022)被用作亲株，用于获得具有改进的生产L-缬氨酸能力的微生物的修饰菌株。菌株是具有对α-氨基丁酸(ABA)、α-羟缬氨酸(AHV)、噻唑丙氨酸(TA)和正缬氨酸(NV)的抗性的修饰菌株。在本公开内容中，使用NTG处理谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P，并且在菌株之中，获得显示对α-氨基丁酸(ABA)具有抗性的菌株并命名为“NA100-311”。与由等量的亲株的细胞生产的相比，“NA100-311”菌株显示了大约20.3％的L-缬氨酸生产量的增加。另外，在分析核苷酸序列之后，确认了在乙酰羟酸合酶的修饰菌株的氨基酸序列上发生突变，并且具体地，SEQ ID NO:3的氨基酸序列上的第137个氨基酸，即，亮氨酸，被置换为苯丙氨酸(实施例2)。
在另一个方面，本公开内容提供了编码乙酰羟酸合酶变体的多核苷酸和包括该多核苷酸的表达载体。
乙酰羟酸合酶和变体与上面说明的相同。
如本文使用的，术语“多核苷酸”指的是通过核苷酸单元的共价键纵向链延伸的核苷酸的聚合物，并且一般指的是具有某一长度的DNA或RNA链。在本公开内容中，它指的是编码乙酰羟酸合酶变体的多核苷酸。
例如，编码乙酰羟酸合酶变体的多核苷酸可以具有SEQ ID NO:5的核苷酸序列，其是编码SEQ ID NO:3的乙酰羟酸合酶的多核苷酸序列，其中第409个核苷酸，即，C，被置换为T，但是不限于此。
如本文使用的，术语“载体”指的是用于将核苷酸克隆和/或转移入宿主细胞的任何运载体。载体可以是复制子以允许复制与其它DNA片段(一个或多个)结合的片段(一个或多个)。“复制子”指的是充当DNA体内复制的自我复制单位——即通过自我调节可复制的——任何遗传单位(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体和病毒)。在本公开内容中，载体不被具体地限制而是可以使用本领域已知的任何载体，只要其可以在宿主中复制。在重组载体的制备中使用的载体可以是天然状态或重组状态的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、λEMBL3、λEMBL4、λFIXII、λDASHII、λZAPII、λgt10、λgt11、Charon4A、Charon21A等，并且作为质粒载体，可以使用基于pDZ载体、pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的那些。可以在本公开内容中使用的载体不被具体地限制，而是可以使用任何已知的表达载体。具体地，可以使用pDZ(韩国专利申请公布号2008-0025355作为引用以其全部并入本公开内容)，但是不限于此。
在还另一个方面，本公开内容提供了生产L-缬氨酸的微生物，其包括乙酰羟酸合酶变体。
L-缬氨酸、乙酰羟酸合酶和变体与上面说明的相同。
如本文使用的，术语“生产L-缬氨酸的微生物”指的是能够在生物体(bioorganism)内生产L-缬氨酸的原核或真核微生物菌株。出于本公开内容的目的，原核细胞和真核细胞二者可以是可能的，只要该微生物可以生产L-缬氨酸，例如，可以包括棒状杆菌属的微生物菌株(例如，谷氨酸棒状杆菌)。
包括乙酰羟酸合酶变体的生产L-缬氨酸的微生物可以包括包含由于染色体上编码乙酰羟酸合酶的基因突变造成的乙酰羟酸合酶变体的序列的微生物，和/或包含由于引入包括编码乙酰羟酸合酶变体的多核苷酸的载体造成的乙酰羟酸合酶变体的微生物，但是不限于此。
另外，包括乙酰羟酸合酶变体的生产L-缬氨酸的微生物可以是如下微生物：其中乙酰羟酸合酶变体活性与亲株相比增强。
用于增强乙酰羟酸合酶变体的活性的方法的实例可以包括增加编码变体的基因的细胞内拷贝数的方法、在染色体上的编码变体的基因的控制序列中引入修饰的方法、将染色体上的编码变体的基因的控制序列置换为具有强活性的序列的方法、将染色体上的编码变体的基因置换为突变基因以增加变体的活性的方法、和在染色体上的编码变体蛋白的基因中引入修饰以增强变体的活性的方法，但是不限于此。
如本文使用的，术语“引入”指的是用于将编码乙酰羟酸合酶变体的多核苷酸或包括该多核苷酸的载体递送入宿主细胞的方法。引入可以根据本领域的常规方法容易地进行。一般而言，CaCl2沉淀法，在CaCl2沉淀法中使用二甲基亚砜(DMSO)作为还原剂的具有提高效率的Hanahan法，电穿孔，CaPO4沉淀法，原生质体融合法，使用碳化硅纤维的搅拌法，使用PEG的转化，硫酸葡聚糖、lipofectamine、和干燥/抑制介导的(dry/suppression-mediated)转化等。用于转化载体的方法可以不限于这些方法，而是可以非限制性地使用本领域中常用的任何转化或转染方法。另外，递送的多核苷酸可以插入宿主细胞的染色体并且在其中或染色体外定位，只要该多核苷酸可以在宿主细胞中表达。另外，可以以任何形式引入多核苷酸，只要该多核苷酸可以被引入宿主细胞并且在其中表达。例如，多核苷酸可以以表达盒——其是包括自我表达需要的所有必需要素的多核苷酸构建体——的形式引入宿主细胞，但是不限于此。表达盒可以常规地包括可操作地连接至基因的开放阅读框(在下文中，“ORF”)的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域、和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。另外，多核苷酸可以按原样引入宿主细胞，并且可操作地连接至对于其在宿主细胞中表达必需的序列，但是不具体地限于此。
在本公开内容的具体实施方式中，谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P的亲株用包括编码乙酰羟酸合酶变体的核苷酸序列的载体转化，并且分析生产L-缬氨酸的能力，结果，与亲株相比，转化菌株显示具有增加的生产L-缬氨酸的能力。
在还另一个方面，本公开内容提供了使用生产L-缬氨酸的棒状杆菌属的微生物生产L-缬氨酸的方法。
L-缬氨酸、乙酰羟酸合酶、变体和微生物与上面说明的相同。
在本公开内容中，培养生产L-缬氨酸的菌株用于生产L-缬氨酸的方法可以使用本领域熟知的用于培养棒状杆菌属的微生物的方法进行。具体地，培养方法的实例可以包括分批培养、连续培养和补料分批培养，但是不限于此。这些不同方法在例如“BiochemicalEngineering”(James M.Lee,Prentice-Hall International Editions,pp 138–176,1991)等中公开。
用于培养物的培养基必须满足特定菌株培养物的需要。用于棒状杆菌属的微生物的培养基已经被公开(例如，Manual of Methods for General Bacteriology.AmericanSociety for Bacteriology.Washington D.C.,USA,1981)。用于培养基的碳源的实例可以包括糖类和碳水化合物，比如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，比如豆油、葵花油、蓖麻油和椰子脂；脂肪酸，比如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇类，比如甘油和乙醇；和有机酸，比如乙酸。这些碳源可以单独或组合使用，但是不限于此。用于培养基的氮源的实例可以包括蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆和大豆粉；和无机氮源，比如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源也可以单独或组合使用，但是不限于此。用于培养基的磷源的实例可以包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。另外，培养基必须包括生长必需的金属盐，比如硫酸镁和硫酸铁。除上面的物质之外，还可以包括生长必需物质，比如氨基酸和维生素。
另外，可以使用适合于培养基的前体。这些来源可以在培养期间通过分批培养或连续培养以适当的方式添加至培养物，但是方法不限于此。
另外，通过以适当的方式添加碱性化合物比如氢氧化钠、氢氧化钾和氨，或酸性化合物比如磷酸和硫酸至培养物，可以在培养期间调节培养物的pH。在培养期间，可以添加消泡剂比如脂肪酸聚乙二醇酯以防止泡沫生成。另外，可以将氧气或含氧气体注入培养物，以便维持培养物的需氧条件。通常，培养温度可以在20℃至45℃的范围内，但是不限于此。培养可以继续直到L-缬氨酸生产的量达到最大水平，正常地持续10小时至160小时，但是不限于此。L-缬氨酸可以释放入培养基或可以包含在细胞中。
本公开内容的制备L-缬氨酸的方法可以进一步包括从培养的微生物或培养基回收L-缬氨酸。用于从培养的微生物或培养物回收L-氨基酸的方法可以包括本领域熟知的那些，比如离心、过滤、阴离子交换色谱法、结晶、HPLC等，但是不限于此。
根据本公开内容的实施方式，通过在低速下离心培养物然后去除得到的生物质获得的上清液通过离子交换色谱法分离。
[发明的详细描述]
在下文中，将参考下列实施例更详细地描述本公开内容。然而，这些实施例仅出于说明性目的，并且本发明不意欲被这些实施例限制。
实施例1：通过人工诱变选择突变株
为了获得具有增强的生产L-缬氨酸能力的突变微生物菌株，使用下列方法诱导微生物的突变。
具体地，亲株——产L-缬氨酸的谷氨酸棒状杆菌，谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P(韩国专利号10-1117022)——被接种入包含下面描述的组分的在121℃下灭菌15分钟的种子培养基，培养13小时，并且回收25mL的培养基。使用100mM柠檬酸盐缓冲液清洗回收的培养基并且N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)以400μg/mL的最终浓度被添加至其，处理30分钟，并且使用100mM磷酸盐缓冲液清洗培养基。将使用NTG处理的菌株涂抹在基本培养基上并且测量死亡率，结果，死亡率显示为99.6％。
为了获得具有对α-氨基丁酸(ABA)具有抗性的突变株，NTG-处理的菌株被涂抹在分别包含0mM、20mM、50mM、100mM和200mM的最终浓度的ABA的基本培养基上。然后，菌株在30℃下培养7天以获得ABA抗性突变株。如此获得的突变株被称为谷氨酸棒状杆菌NA100-311。
<种子培养基>
原糖(20g)、蛋白胨(10g)、酵母提取物(5g)、尿素(1.5g)、KH2PO4(4g)、K2HPO4(8g)、MgSO4·7H2O(0.5g)、生物素(100μg)、盐酸硫胺素(1000μg)、钙-泛酸(2000μg)和烟酰胺(2000μg)(基于1L的蒸馏水)，pH 7.0
<基本培养基>
葡萄糖(100g)、(NH4)2SO4(40g)、大豆蛋白(2.5g)、玉米饼(Corn Steep Solid)(5g)、尿素(3g)、KH2PO4(1g)、MgSO4·7H2O(0.5g)、生物素(100μg)、盐酸硫胺素(1000μg)、钙-泛酸(2000μg)和烟酰胺(3000μg)(基于1L的蒸馏水)，pH 7.0
实施例2：确认选择的菌株的产L-缬氨酸能力和确认ilvN的核苷酸序列
为了确认谷氨酸棒状杆菌NA100-311——在实施例1中选择的突变株——的产L-缬氨酸能力，该菌株通过下述方法培养。
亲株(即，谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P)和突变株(即，谷氨酸棒状杆菌NA100-311)以一定量的接种环被接种入250mL角挡板烧瓶(corner baffle flask)——其包含25mL的下面描述的生产培养基——并且以200rpm下的振荡在30℃下培养72小时以生产L-缬氨酸。
<生产培养基>
葡萄糖(100g)、(NH4)2SO4(40g)、大豆蛋白(2.5g)、玉米饼(5g)、尿素(3g)、KH2PO4(1g)、MgSO4·7H2O(0.5g)、生物素(100μg)、盐酸硫胺素(1000μg)、钙-泛酸(2000μg)和烟酰胺(3000μg)(基于1L的蒸馏水)，pH 7.0
在完成培养之后，通过高速液相色谱法测量L-缬氨酸生产的量。实验菌株的培养基中的L-缬氨酸的浓度显示在下面的表1中。
[表1]ABA抗性菌株的L-缬氨酸生产能力
菌株 L-缬氨酸浓度(g/L) 光密度(OD)
谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P 2.8 47.5
谷氨酸棒状杆菌NA100-311 1.9 26.8
根据上面的结果，在亲株(即，谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P)的情况下，培养物的光密度是47.5并且以2.8g/L的浓度生产L-缬氨酸，然而，在突变株(即，谷氨酸棒状杆菌NA100-311)的情况下，以1.9g/L的浓度生产L-缬氨酸，但是培养物的光密度仅为26.9。在计算每1光密度生产的L-缬氨酸的浓度(g/L/OD)之后，亲株(即，谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P)的L-缬氨酸的浓度显示为0.059，而突变株(即，谷氨酸棒状杆菌NA100-311)显示为0.071的增加的值，因而表明与亲株相比由相同量的突变株中的细胞生产的L-缬氨酸的量增加20.3％。
为了确认ilvN基因——其在突变株(即，谷氨酸棒状杆菌NA100-311)中编码乙酰羟酸合酶的小亚基——的核苷酸序列，通过聚合酶链反应(在下文中，PCR)扩增突变株的染色体DNA。
具体地，首先，使用Taq DNA聚合酶，在下列条件下使用突变株(即，谷氨酸棒状杆菌NA100-311)的染色体DNA作为模板连同SEQ ID NO:1和2的引物扩增大约1726bp片段：94℃变性1min，58℃退火30sec，和72℃聚合40sec的28个循环。在使用引物分析核苷酸序列之后，确定了第409个核苷酸C被置换为T，并且这表明突变是将第137个氨基酸亮氨酸置换为苯丙氨酸。
实施例3：制备包括ilvN的置换的核苷酸序列的载体
为了制备包括在实施例2中确认的突变的核苷酸序列的载体，使用Pfu DNA聚合酶，在下列条件下使用突变株的染色体DNA作为模板连同SEQ ID NO:1和2的引物扩增具有BamHI和XbaI限制位点的大约1726bp片段：94℃变性1min，58℃退火30sec，和72℃聚合1min的25个循环。使用限制酶BamHI和XbaI处理扩增的片段，并且连接入pDZ，其又使用相同的限制酶处理以制备pDZ-ilvN(L137F)。
实施例4：制备其中ilvN的核苷酸序列被置换的菌株
为了制备在上面的突变株中发现的包括ilvN-突变的核苷酸序列的菌株，生产L-缬氨酸的谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P被用作亲株。
谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P通过电穿孔转化有在实施例3中制备的pDZ-ilvN(L137F)载体。通过第二次交换获得产L-缬氨酸菌株，其中在由谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P的染色体上的ilvN基因编码的氨基酸序列中，第137个氨基酸亮氨酸被置换为苯丙氨酸。在使用Taq DNA聚合酶在下列条件——94℃变性1min，58℃退火30sec，和72℃聚合40sec的28个循环——下使用SEQ ID NO:1和2的引物通过PCR扩增1726bp片段后，通过使用SEQ IDNO:2的引物分析1726bp片段来确认ilvN的置换的存在。
转化有pDZ-ilvN(L137F)载体的菌株被命名为谷氨酸棒状杆菌KCJ-644，并且在2013年11月22日以登录号KCCM11485P保藏在由布达佩斯条约确认为国际保藏单位的韩国微生物保藏中心(KCCM)。
实施例5：在其中ilvN的核苷酸序列被置换的菌株中生产L-缬氨酸
为了从谷氨酸棒状杆菌KCJ-644——在实施例4中制备的产L-缬氨酸菌株——生产L-缬氨酸，通过下述方法培养该菌株。
亲株(即，谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P)和上面制备的谷氨酸棒状杆菌KCJ-644以一定量的接种环被接种入250mL角挡板烧瓶——其包含25mL的生产培养基——并且以200rpm下的振荡在30℃下培养72小时以生产L-缬氨酸。
在完成培养之后，通过高速液相色谱法测量L-缬氨酸生产的量。实验菌株的培养基中L-缬氨酸的浓度显示在下面的表2中。
[表2]谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P和谷氨酸棒状杆菌KCJ-644的L-缬氨酸生产能力
菌株 L-缬氨酸浓度(g/L)
谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P 2.8
谷氨酸棒状杆菌KCJ-644 3.0
如表2中显示的，与亲株——即谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P——相比，谷氨酸棒状杆菌KCJ-644——其是在ilvN基因上具有L137F突变的产L-缬氨酸菌株——显示了L-缬氨酸生产能力的7.1％的增加。
实施例6：测量其中ilvN的核苷酸序列被置换的菌株中的乙酰羟酸合酶活性
为了测量谷氨酸棒状杆菌KCJ-644——其是在实施例4中制备的产L-缬氨酸菌株——中的乙酰羟酸合酶活性，通过下述方法进行实验。
亲株(即，谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P)和上面制备的谷氨酸棒状杆菌KCJ-644以一定量的接种环被接种入250mL角挡板烧瓶——其包含25mL的种子培养基——并且以200rpm下的振荡在30℃下培养16小时。在完成培养之后，培养基被离心并且丢弃上清液，并且沉淀物被清洗并且与裂解缓冲液混合，并且使用珠匀浆机破碎细胞。根据Bradford试验定量在裂解物中存在的蛋白质，并且通过测量当使用包含100μg/mL的蛋白质的裂解物时产生的3-羟基丁酮来测量乙酰羟酸合酶的活性。每个菌株中乙酰羟酸合酶活性的测量结果显示在下面的表3中。
[表3]
菌株 ilvN活性(μM/mg/min)
谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P 73.6
谷氨酸棒状杆菌KCJ-644 84.1
如表3中显示的，与亲株——即谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P——相比，谷氨酸棒状杆菌KCJ-644——其是在ilvN基因上具有L137F突变的产L-缬氨酸菌株——显示了L-缬氨酸生产能力的14.3％的增加。
根据上文，本公开内容所属领域技术人员将能够理解本公开内容可以以其它具体形式体现，而不修改本公开内容的技术概念或基本特性。就这一点而言，本文公开的示例性实施方式仅出于说明性目的并且不应当解释为限制本公开内容的范围。相反，本公开内容意欲不仅覆盖示例性实施方式，而且覆盖可以包括在由所附权利要求限定的本公开内容的精神和范围内的多种替代方案、修改、等价物和其它实施方式。
Figure GDA0001279621580000121
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 抗反馈乙酰羟酸合酶变体和使用其生产L-缬氨酸的方法
<130> OPA15220
<150> KR10-2014-0100669
<151> 2014-08-05
<160> 5
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
cgttggccag caccagatgt 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
gatgtcgtca gctggcttga tc 22
<210> 3
<211> 172
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(172)
<223> 乙酰羟酸合酶
<400> 3
Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln
1 5 10 15
Asp Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg
20 25 30
Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Val Lys Thr Glu Thr Leu Gly
35 40 45
Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu
50 55 60
Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val
65 70 75 80
Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu Val Lys
85 90 95
Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn
100 105 110
Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val Val Ile
115 120 125
Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Leu Asp Val Met
130 135 140
Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu
145 150 155 160
Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile
165 170
<210> 4
<211> 172
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乙酰羟酸合酶变体
<400> 4
Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln
1 5 10 15
Asp Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg
20 25 30
Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Val Lys Thr Glu Thr Leu Gly
35 40 45
Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu
50 55 60
Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val
65 70 75 80
Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu Val Lys
85 90 95
Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn
100 105 110
Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val Val Ile
115 120 125
Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Phe Arg Ala Leu Leu Asp Val Met
130 135 140
Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu
145 150 155 160
Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile
165 170
<210> 5
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 乙酰羟酸合酶变体
<400> 5
atggctaatt ctgacgtcac ccgccacatc ctgtccgtac tcgttcagga cgtagacgga 60
atcatttccc gcgtatcagg tatgttcacc cgacgcgcat tcaacctcgt gtccctcgtg 120
tctgtaaaga ccgaaacact cggcatcaac cgcatcacgg ttgttgtcga cgccgacgag 180
ctcaacattg agcagatcac caagcagctc aacaagctga tccccgtgct caaagtcgtg 240
cgacttgatg aagagaccac catcgcccgc gcaatcatgc tggttaaggt ctctgcggat 300
agcaccaacc gtccgcagat cgtcgacgcc gcgaacatct tccgcgcccg agtcgtcgac 360
gtggctccag actctgtggt tattgaatcc acaggcaccc caggcaagtt ccgcgcactg 420
cttgatgtga tggaaccatt cggaatccgc gaactgatcc aatccggaca gattgcactc 480
aaccgcggtc cgaagaccat ggctccggcc aagatctaa 519

Claims (8)

1.乙酰羟酸合酶变体，其中从SEQ ID NO:3的氨基酸序列的N-端的第137个氨基酸亮氨酸(L)被置换为苯丙氨酸，并且因而对L-缬氨酸的反馈抑制被解除。
2.根据权利要求1所述的乙酰羟酸合酶变体，其中所述变体由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。
3.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述的乙酰羟酸合酶变体。
4.一种表达载体，其包括权利要求3所述的多核苷酸。
5.生产L-缬氨酸的棒状杆菌属的微生物，其包括权利要求1所述的乙酰羟酸合酶变体。
6.根据权利要求5所述的微生物，其中所述乙酰羟酸合酶变体由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。
7.根据权利要求5所述的微生物，其中所述棒状杆菌属的微生物是谷氨酸棒状杆菌。
8.用于生产L-缬氨酸的方法，其包括：
(a)在培养基中培养权利要求5至7中任一项所述的生产L-缬氨酸的棒状杆菌属的微生物并且生产L-缬氨酸；和
(b)从培养的微生物或所述培养基回收L-缬氨酸。
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