CN111829810B - 一种超声分离获取鱼类微小耳石的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种超声分离获取鱼类微小耳石的方法，步骤是：(1)鱼类预处理：对于鱼类，使用手术剪去掉身体，仅留头部；(2)鱼体超声破碎：将预处理后的鱼类装入平皿，加入蒸馏水，放入超声波细胞破碎仪，调整超声强度与时间，进行鱼体破碎；(3)耳石分离：将经过超声破碎后的悬浊液在平面上摇动，使耳石从液体和杂质中分离并沉积到平皿的底部，在解剖镜下用一次性吸管吸除上部悬浊液，留下耳石与杂质；(4)耳石清洗：加入蒸馏水，在解剖镜下重复，直到视野中耳石清晰，耳石周边无明显杂质；(5)耳石收集与干燥。方法易行，操作简便，解决了传统耳石解剖方法中取样人员要掌握鱼类解剖的专业知识问题和操作过程中的标准化取样的问题。

Description

一种超声分离获取鱼类微小耳石的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种超声分离获取鱼类微小耳石的方法，适用于鱼类生态学上利用耳石对鱼类生长环境或产卵、洄游等生理行为的研究，以及生理学上对内耳发育的影响研究，也用于空间生物学上脊椎动物对重力的感受研究。
背景技术
鱼类耳石存在于内耳囊腔中，左右各有三颗，分别位于内耳半规管的球囊、椭圆囊与听壶中，其主要成份是碳酸钙。目前研究较多的是位于球囊中的矢耳石以及位于椭圆囊中的微耳石，分别在鱼类声波感受与运动平衡中起主要作用。
鱼类在其生长过程中能在耳石上形成生长轮纹，轮纹一般每天形成一轮，根据轮纹深浅、宽度以及耳石微量元素含量等特征可以追溯鱼类的生长环境、鱼类所经历的一些重要生活史事件，如孵化、初次摄食、变态、定居和生存环境的变化。目前耳石研究广泛应用于揭示地理或尺度-选择对鱼类种群的影响或种群生长、年龄与种群动态、种类鉴别、环境重建等鱼类所经历的生活史事件。
鱼类耳石研究是鱼类生态学研究的重要手段，在渔业生产与管理的各方面得到广泛应用。例如在增殖放流中，为了更好地了解种群的增长与资源量评估，通常把鱼类浸泡于荧光物质中，使耳石带上荧光标记再进行放流，在以后的捕捞中，通过检查耳石上的荧光物质来鉴别鱼类是否来源于放流种群，以及评估放流后的资源增长状态。在一些经济鱼类的生长评价中也往往使用耳石来作为评价标准，通过比较耳石的日轮或年轮，推断鱼类的生长、成熟周期和合理的资源捕捞量等。
近年来，随着鱼类生态学研究的发展，通过追踪鱼类产卵、生长、生活及洄游轨迹等鱼类生态学数据来揭示鱼类的主要产卵场、生长发育的关键场所及阶段，以及产卵阶段的洄游路线，从而更有针对性地进行鱼类资源的保护、鱼类资源存量的管理及渔业生产的指导具有重要的意义。尤其随着长江十年禁渔政策的实施，对于鱼类资源存量的摸底以及经济鱼类的人工放流管理变得格外迫切，亟需加大对于鱼类耳石的研究。
1g重力是地球的固有属性，生物在漫长的进化过程中发展出了感受地球1g重力环境的特定器官或组织，耳石是动物对重力感受的末端感受器。当重力环境发生变化时，耳石的形态大小也发生变化，这种形态的变化必然伴随着重力信号的改变，耳石与重力信号的变化对于人体健康的影响尚不清楚。随着人类对于外太空探索的需求，将来人类的足迹不仅仅局限于空间站，月球、火星或其它更遥远的星球都可能涉足，这些星球有着不同于地球的重力环境，耳石的生长与重力信号的变化如何影响机体的健康，机体如何调节自身去适应这种变化是值得关注的重要科学问题。鱼类是重要的模式动物，其体型较小、生长发育较快，适用于地面模拟重力的研究，而内耳结构在进化过程中的保守性与鱼类耳石的日沉积特性，更使得利用鱼类耳石进行的重力生物学研究具有可行性。
研究耳石首先要获取耳石。目前获取鱼类耳石的方法是解剖法，即通过解剖头部，去除顶部头骨后，露出内耳，从内耳的膜迷路淋巴中找到耳石，采用解剖针或其它器具取出所需研究的耳石。取样过程存在诸多难点：一、寻找耳石部位存在困难：耳石位于内耳囊腔半规管的膜迷路中，被皮肤、头骨、半规管软骨等包围，周边还有脑组织、鼻、腮等器官，难以准确定位；二、找到全部耳石存在困难：矢耳石和微耳石位于囊腔的不同部位，矢耳石位于水平的球囊中，而微耳石位于垂直面的椭圆囊中，剥除膜迷路中一个耳石时，很容易因膜迷路的整体结构破坏而导致另一个耳石难以找到；三、从淋巴中剥除时耳石容易遗失：耳石生长于淋巴液中，呈无色至白色，与周边软骨难以区分，而耳石表面粘附的淋巴液也容易导致耳石粘附在其它组织上而遗失；四、耳石很小，最小的鱼耳石仅有几十到几百微米，所有过程都需要在显微镜下进行操作。基于以上难点，研究人员需要在反复实验过程中积累足够经验才能尽可能取得所需耳石，不仅对专业要求极高，而且费时费力，耳石获取率也低。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种超声分离获取鱼类微小耳石的方法，方法易行，操作简便，解决了耳石取样人员要掌握鱼类解剖的专业知识，还需要在工作中经过反复训练才能顺利取得所需样品的问题，省时省力，同时解决了样品操作过程中的标准化取样的问题，所获取的耳石数量与质量较高，在鱼类微小耳石的获取方面优势尤其明显。
为了实用上述技术措施，本发明采用以下技术措施：
一种超声分离获取鱼类微小耳石的方法，其步骤是：
(2)鱼类预处理：将对于体型或/和年龄较小的鱼类不需处理。直接进入下一步的鱼体超声破碎步骤。
A、对于体型或/和鱼龄较大的鱼类取头部部分；
B、体型较小的鱼指体长小于2cm以内的鱼；体型较大的鱼指体长大于2cm小于5cm的鱼；
C、鱼龄较小的鱼指仔、稚鱼或小于1月龄的鱼；鱼龄较大的鱼指进入性成熟前期的鱼或大于1月龄小于3月龄的鱼。
(2)鱼体超声破碎：将预处理后的鱼类装入平皿或圆盘，加入2-5ml蒸馏水，放入超声波细胞破碎仪(市场上购置)整超声强度与时间，进行鱼体破碎；为了不因超声强度太大损坏耳石或者耳石随水溅出，保持超声强度不小于15％，也不大于35％；平皿或圆盘中超纯水的体积不大于总容积的1/3。超声时间根据鱼类种类和生长周期确定，一般不小于10min，不大于30min；为了保证样品活性，使用冰块对样品器具外部进行降温，保持温度在4℃以内，超声破碎时程序选择运行3s，暂停2s；
(3)耳石分离：将经过超声破碎后的悬浊液在平面上轻轻摇动，使耳石从液体和杂质中分离并沉积到平皿或圆盘的底部。在解剖镜下用一次性吸管小心吸除上部悬浊液，留下耳石与少量杂质；
(4)耳石清洗：加入容器1/3体积的蒸馏水，在解剖镜下重复以上第3步骤3-5次，直到视野中耳石清晰，耳石周边无明显杂质；
(5)耳石收集与干燥：经过清洗的耳石再加入容器1/3体积的蒸馏水，洗入清洁小皿中，在平面上轻轻划圈摇动，使耳石大部分聚集到解剖镜视野的中间部分，便于下次使用时在解剖镜下易于寻找与取用。吸去平皿或圆盘周边多余水份，放入烘箱干燥，烘箱的干燥温度不大于60℃，控制在温度44－46℃干燥12小时或在室温(20－25℃)干燥24小时。
经过以上步骤处理可获取的耳石直径最小可达20-30μm，最大可达1mm，耳石表面洁净，相同数目鱼类所获得的耳石数目比传统解剖方法高17.5-45％，所花费时间仅为传统方法的1/25-0.35倍。
本发明的重要关键步骤是步骤2与步骤3，即利用超声波对鱼体进行破碎，使鱼体肌肉细胞与骨骼破碎，从而释放出位于内耳膜迷路中的耳石，同时超声波又起到对耳石表面的清洗作用，使耳石表面附着的有机质去除。又利用耳石比水重的特性，使耳石沉降于容器底部，便于去除水中的其它杂质，对耳石进一步清洗。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
(1)相比于传统的解剖方法，本发明不需要研究人员有鱼类解剖专业知识，也不需要经过反复训练才能开展工作，对研究人员的专业水平要求低；
(2)省时省力，本发明所有样品采用一次取样处理，而解剖方法需要单次单个样品处理。本方法单位时间取样量大，取样过程所需时间更短，而且本方法把耳石剥离与清洗结合在一个过程中，免除了解剖方法剥离耳石的后续清洗过程，样品取样所需时间仅为传统取样方法的1/25-0.35倍；
(3)所获取的耳石质量与数量较高：传统解剖方法耳石剥除过程中外表面易于沾附淋巴、肌肉等组织，影响耳石洁净度，本方法使用超声破碎，把耳石剥离与清洗结合在一个过程中，得到的耳石外表面洁净无污染，质量较高。由于耳石质地坚硬，在超声波破碎时能保持完整结构，所有耳石都能从鱼体中分离出来，相同数目鱼类耳石获得率比传统方法提高17.5-45％；；
(4)易于形成标准化取样方法，对于同一类样品可采用相同处理方法，所获得结果便于比较；
(5)在鱼类微小耳石的获取方面优势明显：使用解剖方法获取耳石的操作中，微小耳石(微米级)的取样需要在显微镜下操作，耗时耗力，也易在取样过程中丢失，超声方法可有效解决这个问题，所获取耳石直径最小可达20-30μm。
附图说明
图1为一种受精3天斑马鱼示意图。
A为受精3天的斑马鱼，B为头部放大，红色箭头所示为矢耳石，黄色箭头所示为微耳石。A中标尺0.5mm。
图2为一种超声分离与传统解剖方法获取受精3天斑马鱼耳石的取样时间比较示意图。
图3为一种受精3天斑马鱼超声分离与传统解剖方法所获取耳石数目比较示意图。
图4为一种受精3天斑马鱼超声分离与传统解剖方法获取耳石的表面洁净度示意图。
图A为解剖方法获取的耳石，图B为超声方法获取的耳石。
图5为一种2月龄斑马鱼解剖预处理示意图。
图6为一种超声分离与传统解剖方法获取2月龄斑马鱼耳石的取样时间比较示意图。
图7为一种2月龄斑马鱼超声分离与传统解剖方法所获取耳石数目比较示意图。
图8为一种2月龄斑马鱼超声分离与传统解剖方法获取耳石的表面洁净度示意图。
图A为解剖方法获取的耳石，图B为超声方法获取的耳石，标尺0.1mm。
图9为一种5周龄鲫鱼解剖预处理示意图。
图10为一种超声分离与传统解剖方法获取5周龄鲫鱼耳石的取样时间比较示意图。
图11为一种5周龄鲫鱼超声分离与传统解剖方法所获取耳石数目比较示意图。
图12为一种5周龄鲫鱼超声分离与传统解剖方法获取耳石的表面洁净度示意图。
图A为解剖方法获取的耳石，图B为超声方法获取的耳石，标尺0.1mm。
具体实施方式
实施例1：
一种超声分离获取鱼类微小耳石的方法，其步骤是：
(1)鱼类来源与背景：鱼类来源于国家斑马鱼资源中心，为实验室人工受精后在培养箱内培养至第3天的AB系斑马鱼。斑马鱼(Daniorerio)，英文名称zebrafish，属硬骨鱼类，辐鳍鱼纲(Actinopterygii)，鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，鲐属(Danio)。原产于东印度及孟加拉国的淡水水域，为杂食性的热带淡水鱼类，适宜生长温度为20-30℃，性成熟期为3个月左右。因斑马鱼体型小、易于养殖、发育迅速、产卵量大、体外受精、体外发育、胚胎透明、多种组织器官具有再生能力、基因组与人类同源性高等特点，作为模式动物被广泛应用于遗传学、发育生物学、神经生物学、肿瘤学、再生和干细胞研究、疾病模型和药物筛选、基础水产学等科研领域。
(2)鱼类预处理：对于体型或/和鱼龄较大的鱼类取头部部分。该批次斑马鱼刚从受精卵孵化成鱼苗，属于生长阶段的仔鱼期，体长约3-4mm，耳石直径约20-30μm(图1)，为体型与鱼龄较小的鱼，不需要进行鱼体预处理。
(3)鱼体破碎：用一次性吸管小心吸取20条待获取耳石的样品放入直径30mm的一次性培养皿中，向培养皿中加入2ml蒸馏水，放入JY92-ⅡN超声波细胞破碎仪(宁波新芝，中国)。调整破碎仪变幅杆的位置与高度，使变幅杆浸入水中但不与培养皿四周与底面接触，变幅杆末端距培养皿0.5cm以上，培养皿下底面放在冰上对培养皿降温，使温度保持在4℃以下。打开超声波细胞破碎仪电源，调节变幅杆型号按钮至φ3处，依次选择工程组参数为超声时间为10min，运行3s，暂停2s，温度4℃，超声强度为15％，设置结束后运行程序进行超声破碎。
(4)耳石分离：破碎程序结束后取出培养皿，放置于实验台面上，以顺时针方向轻轻摇动悬浊液，使液体以培养皿中心为圆心形成涡旋，再放在解剖镜下，用一次性吸管沿培养皿周边小心吸除上部悬浊液，显微镜下可观察到培养皿中有大量耳石与少量杂质；
(5)耳石清洗：再加入2ml蒸馏水，重复以上第4步骤3或4或5次，直到显微镜视野中耳石清晰，耳石周边无明显杂质；
(6)耳石收集与干燥：经过清洗的耳石再加入1.5ml蒸馏水，在实验台面上以顺时针方向轻轻摇动悬浊液，使液体以培养皿中心为圆心形成涡旋，使耳石大部分聚集到培养皿的中间部分。吸去培养皿周边多余水份，放入烘箱45℃干燥12小时后取出。
该批次斑马鱼使用超声方法与传统解剖方法进行取样时间、耳石获取率与耳石表面洁净度比较，每种方法均采用20条培养至第3天的斑马鱼，实验重复3次以上，数据使用平均值±标准差表示。
采用超声方法所需的取样时间为0.6±0.1小时；使用传统解剖方法所需的取样时间为15±3小时(图2)。超声方法所需时间仅为传统方法的1/25。
采用超声方法获取的耳石数目为61±7个，耳石获取率为76.25％；使用传统解剖方法获取的耳石数目为47±6个，耳石获取率为58.75％。超声方法比传统方法获取率提高17.5％(图3)。
比较超声方法与传统方法所获取耳石的外观洁净度，超声方法获取的耳石呈透明状，表面无杂质粘附；而使用传统方法获取的耳石表面有明显细丝状杂质粘附(图4)。
实施例2：
一种超声分离获取鱼类微小耳石的方法，其步骤是：
(1)鱼类来源与背景：鱼类来源于国家斑马鱼资源中心，为实验室人工受精后在斑马鱼循环水养殖系统培养2个月的AB系斑马鱼。斑马鱼(Daniorerio)，英文名称zebrafish，属硬骨鱼类，辐鳍鱼纲(Actinopterygii)，鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，鲐属(Danio)。原产于东印度及孟加拉国的淡水水域，为杂食性的热带淡水鱼类，适宜生长温度为20-30℃，性成熟期为3个月左右。因斑马鱼体型小、易于养殖、发育迅速、产卵量大、体外受精、体外发育、胚胎透明、多种组织器官具有再生能力、基因组与人类同源性高等特点，作为模式动物被广泛应用于遗传学、发育生物学、神经生物学、肿瘤学、再生和干细胞研究、疾病模型和药物筛选、基础水产学等科研领域。
(2)鱼类预处理：对于体型或/和鱼龄较大的鱼类取头部部分。生长2个月的斑马鱼在生长阶段上属于幼鱼向成鱼生长的过渡阶段，体长约1-1.5cm，属于体型较小而鱼龄较大的种类，需要对鱼体进行处理。将需要获取耳石的样品取出放在解剖盘上，使用解剖剪从腹部沿鳃盖剪至侧线部分，然后以垂直侧线角度剪掉鱼体后半部分，保留鱼头。解剖方法示意图见图5。
(3)鱼体破碎：将处理后的鱼头放入直径为60mm的一次性培养皿中，加入5ml蒸馏水，放入JY92-ⅡN超声波细胞破碎仪。调整破碎仪变幅杆的位置与高度，使变幅杆浸入水中但不与培养皿四周与底面接触，变幅杆末端距培养皿0.5cm以上，培养皿下底面放在冰上对培养皿降温，使温度保持在4℃以下。打开超声波细胞破碎仪电源，调节变幅杆型号按钮至φ3处，依次选择工程组参数为超声时间为30min，运行3s，暂停2s，温度4℃，超声强度为35％，设置结束后运行程序进行超声破碎。
(4)耳石分离：鱼体破碎程序结束后取出培养皿，放置于实验台面上，以顺时针方向轻轻摇动悬浊液，使液体以培养皿中心为圆心形成涡旋，再放在解剖镜下，用一次性吸管沿培养皿周边小心吸除上部悬浊液，显微镜下可观察到培养皿中有大量耳石与少量杂质；
(5)耳石清洗：再加入5ml蒸馏水，重复以上第4步骤3或4或5次，直到显微镜视野中耳石表面清洁，周边无明显杂质；
(6)耳石收集与干燥：经过清洗的耳石再加入3ml蒸馏水，在实验台面上以顺时针方向轻轻摇动悬浊液，使液体以培养皿中心为圆心形成涡旋，使耳石大部分聚集到培养皿的中间部分。吸去培养皿周边多余水份，放入烘箱干燥45℃干燥12小时后取出。
该批次斑马鱼使用超声方法与传统解剖方法进行取样时间、耳石获取率与耳石表面洁净度比较，每种方法均采用10条2月龄的斑马鱼，实验重复3次以上，数据使用平均值±标准差表示。
采用超声方法所需的取样时间为0.7±0.1小时；使用传统解剖方法所需的取样时间为2±0.5小时(附图2)。超声方法所需时间仅为传统方法的0.35倍(图6)。
采用超声方法获取的耳石数目为36±2个，耳石获取率为90％；使用传统解剖方法获取的耳石数目为10±3个，耳石获取率为25％。超声方法比传统方法获取率提高45％(图7)。
比较超声方法与传统方法所获取耳石的外观洁净度，超声方法获取的耳石表面洁净，无杂质粘附；而使用传统方法获取的耳石表面有明显杂质粘附(图8)。
实施例3：
一种超声分离获取鱼类微小耳石的方法，其步骤是：
(1)鱼类来源与背景：鱼类来源于中国科学院水生生物研究所官桥养殖基地，为养殖基地人工养殖至5周的鲫鱼。鲫鱼(Carassiusauratusauratus)，别称刀子鱼，属硬骨鱼纲，辐鳍鱼亚纲，鲤形目，鲤亚目，鲤科，鲤属，是我国最常见的淡水鱼类之一，生活在青藏高原地域以外的各大水系。鲫鱼是杂食性鱼类，食性广、适应性强、繁殖力强、抗病力强、生长快、对水温要求不高，便于养殖，是我国重要的养殖性鱼类。
(2)鱼类预处理：对于体型或/和鱼龄较大的鱼类取头部部分。生长至5周的鲫鱼处于稚鱼期，体长约3cm，属于年龄较小而体型较大的种类，需要对鱼体进行预处理。将需要获取耳石的样品取出放在解剖盘上，使用解剖剪从腹部沿鳃盖剪至侧线部分，然后以垂直侧线角度剪掉鱼体后半部分，保留鱼头(解剖方法示意图见图9)。
(3)鱼体破碎：将处理后的鱼头放入直径为60mm的一次性培养皿中，加入5ml蒸馏水，放入JY92-ⅡN超声波细胞破碎仪。调整破碎仪变幅杆的位置与高度，使变幅杆浸入水中但不与培养皿四周与底面接触，变幅杆末端距培养皿0.5cm以上，培养皿下底面放在冰上对培养皿降温，使温度保持在4℃以下。打开超声波细胞破碎仪电源，调节变幅杆型号按钮至φ3处，依次选择工程组参数为超声时间为30min，运行3s，暂停2s，温度4℃，超声强度为35％，设置结束后运行程序进行超声破碎。
(4)耳石分离：鱼体破碎程序结束后取出培养皿，放置于实验台面上，以顺时针方向轻轻摇动悬浊液，使液体以培养皿中心为圆心形成涡旋，再放在解剖镜下，用一次性吸管沿培养皿周边小心吸除上部悬浊液，显微镜下可观察到培养皿中有大量耳石与少量杂质；
(5)耳石清洗：再加入5ml蒸馏水，重复以上第4步骤3或4或5次，直到显微镜视野中耳石表面清洁，周边无明显杂质；
(6)耳石收集与干燥：经过清洗的耳石再加入3ml蒸馏水，在实验台面上以顺时针方向轻轻摇动悬浊液，使液体以培养皿中心为圆心形成涡旋，使耳石大部分聚集到培养皿的中间部分。吸去培养皿周边多余水份，放入烘箱干燥45℃干燥12小时后取出。
该批次鲫鱼使用超声方法与传统解剖方法进行取样时间、耳石获取率与耳石表面洁净度比较，每种方法均采用10条5周龄的鲫鱼，实验重复3次以上，数据使用平均值±标准差表示。
采用超声方法所需的取样时间为0.75±0.1小时；使用传统解剖方法所需的取样时间为2.5±0.5小时。超声方法所需时间仅为传统方法的0.3倍(图10)。
采用超声方法获取的耳石数目为29±3个，耳石获取率为72.5％；使用传统解剖方法获取的耳石数目为15±4个，耳石获取率为37.5％。超声方法比传统方法获取率提高35％(图11)。
比较超声方法与传统方法所获取耳石的外观洁净度，超声方法获取的耳石表面洁净，无杂质粘附；而使用传统方法获取的耳石表面有明显杂质粘附(图12)。

Claims (1)

1.一种超声分离获取鱼类微小耳石的方法，其步骤是：
(1)鱼类预处理：将对于体型或/和年龄较小的鱼类不需处理，直接进入下一步的鱼体超声破碎步骤；
A、对于体型或/和鱼龄较大的鱼类取头部部分；
B、体型较小的鱼指体长小于2cm以内的鱼；体型较大的鱼指体长大于2cm小于5cm的鱼；
C、鱼龄较小的鱼指仔、稚鱼或小于1月龄的鱼；鱼龄较大的鱼指进入性成熟前期的鱼或大于1月龄小于3月龄的鱼；
(2)鱼体超声破碎：将预处理后的鱼类装入平皿或圆盘，加入2-5ml蒸馏水，放入超声波细胞破碎仪，调整超声强度与时间，进行鱼体破碎，超声强度与时间根据鱼类种类和生长周期确定，不小于10min，不大于30min，使用冰块对样品器具外部进行降温，保持温度在4℃以内，超声破碎时程序选择运行3s，暂停2s；
(3)耳石分离：将经过超声破碎后的悬浊液在平面上摇动，使耳石从液体和杂质中分离并沉积到平皿或圆盘的底部，在解剖镜下用一次性吸管吸除上部悬浊液，留下耳石与杂质；
(4)耳石清洗：加入容器1/3体积的蒸馏水，在解剖镜下重复第3步骤3-5次，直到视野中耳石清晰，耳石周边无明显杂质；
(5)耳石收集与干燥：经过清洗的耳石再加入容器1/3体积的蒸馏水，洗入平皿或圆盘中，在平面上划圈摇动，使耳石大部分聚集到解剖镜视野的中间部分，吸去平皿或圆盘周边多余水分，放入烘箱干燥，烘箱的干燥温度不大于60℃，控制在温度44－46℃干燥12小时或在室温干燥24小时。
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