CN104013968B - 一种叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠自组装纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠自组装纳米粒，其特征在于由疏水性胆固醇与亲水性海藻酸钠偶联自组装成具有疏水内核及亲水外壳的球形核‑壳结构纳米粒，亲水外壳的表面共价连接有叶酸。公开了所述叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠自组装纳米粒的制备方法。以叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒为载体，通过包载抗肿瘤药物，应用于抗肿瘤药物制备。本发明与现有技术相比，具有形态结构稳定，纳米粒粒径大小适于穿透肿瘤组织，药物载体对肿瘤组织具有主动靶向输送作用，载药纳米粒可以较长时间滞留肿瘤组织释放药物，增强疗效，降低毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种叶酸介导的自组装纳米靶向抗肿瘤药物载体，具体是一种结构式为
的叶酸介导的胆固醇疏水改性海藻酸钠主动靶向抗肿瘤药物载体和以此载体制备的载抗肿瘤药物，以及在抗肿瘤治疗中的应用。
背景技术
抗肿瘤药物通常为小分子疏水性有机物，水中的溶解度很小，使用时一般加入有机溶剂，对机体产生副作用。另外小分子抗肿瘤药物没有肿瘤组织靶向作用，在抑制肿瘤细胞的同时也杀灭了正常细胞。因此临床上亟待能包载疏水性小分子药物且具有肿瘤组织主动靶向作用的抗肿瘤药物载体的开发应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是制造出能包载疏水性小分子药物且具有肿瘤组织主动靶向作用的抗肿瘤药物输送载体。
本发明解决技术问题的技术方案为：一种叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠自组装纳米，其结构式如下：
。
所述一种叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠自组装纳米粒，其特征在于由疏水性胆固醇与亲水性海藻酸钠偶联自组装成具有疏水内核及亲水外壳的球形核-壳结构纳米粒，亲水外壳的表面共价连接有叶酸。该纳米粒粒径分布区间为55-300nm，平均粒径约为150nm。
所述叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠自组装纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备胆固醇疏水改性海藻酸钠，将海藻酸钠加入到二甲亚砜溶液中，搅拌溶解，再加入N,N′-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶，活化海藻酸钠的羧基，搅拌后，再加入胆固醇，室温下搅拌偶联反应，将偶联反应产物通过透析、过滤、洗涤，然后冻干干燥，得到胆固醇疏水改性海藻酸钠；所述海藻酸钠、N,N′-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶和胆固醇的质量比为10:2:1:10；
（2）活化叶酸的羧基，将叶酸加入加入到二甲亚砜溶液中，搅拌溶解，再加入N,N′-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶，搅拌反应活化叶酸的羧基；所述叶酸、N,N′-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的质量比为3:2:1；
（3）合成叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠自组装纳米粒，将第一步中得到的胆固醇疏水改性海藻酸钠溶于二甲亚砜溶液后，再加入第二步中活化的叶酸溶液，室温下搅拌偶联反应，将产物过滤，渗析和洗涤，最后冷冻干燥，得到干燥的叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒。
以叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒为载体，通过包载抗肿瘤药物，应用于抗肿瘤药物制备。以叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒为载体包载的抗肿瘤药物为疏水性小分子药物，比如阿霉素。
叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒用于包装制备抗肿瘤药物方法为：以叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒为载体，加入到以阿霉素与其3倍摩尔量的三乙胺混合并溶解于二甲基乙酰胺溶液中，将上述溶液保存在4℃中静置反应24h，然后将混合溶液置于透析袋中，在1/15M, pH 7.4的磷酸盐缓冲液中室温下进行透析，将制备的载药叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒通过孔径为1.0 µm微孔过滤器去除不溶物，收集清澈溶液，冻干，即得到阿霉素叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒。
本发明与现有技术相比，所制备的叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒药物载体，具有形态结构稳定，纳米粒粒径分布区间为55-300nm，平均粒径约为150nm,有利于穿透肿瘤组织，能有效包载疏水性抗肿瘤药物，药物载体对肿瘤组织具有主动靶向输送作用，解决了小分子抗肿瘤药物没有肿瘤组织靶向作用的难题，载药纳米粒可以较长时间滞留肿瘤组织，长时间释放药物，可增强抗肿瘤药物对肿瘤组织的疗效，降低对正常组织的毒副作用。
附图说明
图1叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒制备原理图。
图2 海藻酸钠(A)及叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠(B)的1H-NMR谱图。
图3 叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠电镜照片及动态光散射图。
图4. 叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒的芘荧光光谱及I386/I374的比值直线图。
图5不同pH值条件下载药叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒的阿霉素的累积释放量。
图6阿霉素、载药胆固醇疏水改性海藻酸钠和载药叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒对KB细胞的半致死浓度(IC50)图。
具体实施例
叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒的制备。
在N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)与 4-二甲氨基吡啶(DMAP)的偶联作用下，胆固醇连接到海藻酸钠的羧基上，得到胆固醇疏水改性海藻酸钠自组装纳米聚合物，在水溶液中可自组装成具有疏水内核及亲水外壳的纳米颗粒，再将主动靶向信号分子叶酸用类似方法连接到胆固醇疏水改性海藻酸钠的羟基上，得到叶酸介导的肿瘤组织主动靶向胆固醇疏水改性海藻酸钠自组装纳米颗粒，制备的自组装纳米颗粒在水溶液中能长时间保持结构及形态稳定。其疏水内核可包载疏水性抗肿瘤药物，叶酸作为靶向配基实现抗肿瘤药物的肿瘤组织主动靶向输送。实验原理如下图1，具体制备方法如下。
150 ml二甲亚砜中加入海藻酸钠3g，搅拌溶解0.5小时，再加入N,N′-二环己基碳二亚胺600 mg、4-二甲氨基吡啶300 mg活化海藻酸钠的羧基，搅拌反应5小时后加入胆固醇3 g，室温下搅拌偶联反应24h。将偶联反应产物装入透析袋，置于蒸馏水中透析，每隔4h换一次蒸馏水，连续透析2天。透析过程重复3次。过滤产物并用乙醚和蒸馏水分别洗涤3-4次，然后冻干获得干燥的胆固醇疏水改性海藻酸钠。
20ml二甲亚砜中加入叶酸600 mg，搅拌溶解0.5小时，再加入N,N′-二环己基碳二亚胺400 mg、4-二甲氨基吡啶200 mg搅拌反应5小时活化叶酸的羧基。再将胆固醇疏水改性海藻酸钠溶于130ml二甲亚砜后加入上述活化的叶酸中，室温下搅拌偶联反应24h。将产物过滤，透析和洗涤，最后冷冻干燥，得到干燥的叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒。
叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒性质验证。
比较图2海藻酸钠及叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠的1H -NMR谱图。叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠的1H -NMR谱中，化学位移0.9 ppm处的弱峰为胆固醇脂肪侧链甲基的质子峰，化学位移6.65和7.34 ppm处为叶酸的芳环质子峰，表明胆固醇及叶酸与海藻酸钠成功偶联。另外，胆固醇和叶酸分子中不同化学环境的亚甲基质子使化学位移1.6-1.8ppm处的峰显著增强。
胆固醇疏水改性海藻酸钠及叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠分别分散于蒸馏水中，在在37 ℃下摇床轻缓摇动2天，再用探针型超声波仪在100W功率下超声处理2分钟，制备胆固醇疏水改性海藻酸钠及叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠两种自组装纳米颗粒溶液，经1.0微米微孔过滤器过滤以除去灰尘和杂质。自组装纳米颗粒的形态用透射电子显微镜观察，粒径用动态光散射法测定，临界自组装浓度用芘探针测定。
透射电子显微镜照片显示自组装叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠为粒径均匀的球形纳米颗粒（图3左），动态光散射法测定的纳米颗粒粒径分布区间为55-300nm，平均粒径约为150nm（图3右）。
图4左为不同浓度的叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒的芘荧光光谱图，从图中可以看出，随着叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠浓度增加，荧光强度也提高。当叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠溶液浓度高于其临界自组装浓度时，386nm处的吸光度值有很大增加，而此时374nm处的吸光度值无明显变化。因此本实验中用I386/I374的比值来确定叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠的临界自组装浓度。图4右显示叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠的临界自组装浓度为10-1.4，即0.04 mg/mL。
以叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒为载体包载抗肿瘤药物及药物释放。
阿霉素（DOX）为抗瘤谱较广的肿瘤临床治疗使用的疏水性药物，以其为例研究叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒对小分子疏水性抗肿瘤药物的包载与释放。称取10mg的阿霉素与其3倍摩尔量的三乙胺一同溶于2mL的二甲基乙酰胺溶液中。再分别加入叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠200mg，300mg，400mg，500mg于4份上述溶液中，以制备载药（阿霉素）叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠DOX0，DOX1，DOX2，DOX3。将上述溶液保存在4℃中静置反应24h，然后将包载有阿霉素的叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠混合物置于透析袋中，在1/15M, pH 7.4的磷酸盐缓冲液中室温下进行透析，第一天，透析介质每4h更换一次，第二，第三天，缓冲液一天更换一次。3天后，将制备的载药叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠通过孔径为1.0 µm微孔过滤器去除不溶物，收集清澈溶液，冻干，即得到阿霉素叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠载药纳米粒。
称量冻干的载药纳米粒分散于蒸馏水中，以空白叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠载体为对照，用紫外分光光度法在490nm处测定吸收度。计算包载的药物含量，然后分别计算载药纳米粒的载药量与药物包载率：
实验测得增加阿霉素对纳米载体的比值，阿霉素的包载量增加，但包载率下降。叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒对阿霉素的包载量为5.2-10.1%，药物包载率为70.6-80.3%。
图5显示了不同pH(5.5、6.5、7.4)条件下载药叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠的阿霉素的累积释放量。在正常生理环境下(pH 7.4)阿霉素的累积释放量较少，而在肿瘤的酸性环境下(pH 5.5)阿霉素的累积释放量很大。
叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米对肿瘤细胞的毒性实验。
以叶酸受体过表达的肿瘤细胞(KB细胞)为受试对象，检测游离阿霉素、载药胆固醇疏水改性海藻酸钠和载药叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒对KB细胞的半致死浓度(IC50)。实验结果如图6，图6中游离阿霉素对KB细胞的半致死浓度最高，为0.61 mg/L；载药胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒对KB细胞的半致死浓度为0.52 mg/L，略低于游离阿霉素的半致死浓度；而载药叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒对KB细胞的半致死浓度最低，为0.28 mg/L，明显低于游离阿霉素的半致死浓度。该实验结果证明叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒对叶酸受体过表达的肿瘤细胞有明显的靶向作用，其机理是叶酸介导靶向纳米粒与KB细胞膜上的叶酸受体特异性结合，靶向纳米粒再借胞吞作用进入肿瘤细胞，所以载药叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒较低浓度就可致KB细胞死亡。
当载药叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒作用于KB细胞时，加入不同浓度的游离叶酸，由于叶酸的竞争作用，KB细胞的存活率随着叶酸浓度逐渐提高而相因提高。说明叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒对肿瘤细胞的靶向作用十分明显。
以上实验结果表明本发明制备的叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒形态结构稳定，临界自组装浓度低，制作简单；能有效包载疏水性抗肿瘤药物，解决了临床使用的疏水性抗肿瘤药物难溶于水的问题，且本发明实现了通过包载抗肿瘤药物对肿瘤组织的主动靶向输药，解决了小分子抗肿瘤药物没有肿瘤组织靶向作用的难题，即能增强抗肿瘤药物对肿瘤组织的疗效，也可以减少抗肿瘤药物的用量，降低对正常组织的毒副作用。
Claims (2)
1.一种叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠自组装纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备胆固醇疏水改性海藻酸钠，将海藻酸钠加入到二甲亚砜溶液中，搅拌溶解，再加入N,N′-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶，活化海藻酸钠的羧基，搅拌后，再加入胆固醇，室温下搅拌偶联反应，将偶联反应产物通过透析、过滤、洗涤，然后冻干干燥，得到胆固醇疏水改性海藻酸钠；
（2）活化叶酸的羧基，将叶酸加入到二甲亚砜溶液中，搅拌溶解，再加入N,N′-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶，搅拌反应活化叶酸的羧基；
（3）合成叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒，将第一步中得到的胆固醇疏水改性海藻酸钠溶于二甲亚砜溶液后，再加入第二步中活化的叶酸中，室温下搅拌偶联反应，将产物过滤，透析和洗涤，最后冷冻干燥，得到干燥的叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒；所述海藻酸钠、N,N′-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶和胆固醇的质量比为10:2:1:10；
所述叶酸、N,N′-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的质量比为3:2:1。
2.权利要求1所制备的一种叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠自组装纳米粒，其采用下述方法包载抗肿瘤药物：
以叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒为载体，加入到以阿霉素与其3倍摩尔量的三乙胺混合并溶解于二甲基乙酰胺溶液中，将上述溶液保存在4℃中静置反应24h，然后将混合溶液置于透析袋中，在1/15M, pH 7.4的磷酸盐缓冲液中室温下进行透析，将制备的载药叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒通过孔径为1.0 µm微孔过滤器去除不溶物，收集清澈溶液，冻干，即得到阿霉素叶酸修饰胆固醇疏水改性海藻酸钠纳米粒。
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