Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Superparamagnetické nanocástice na bázi oxidu železa s modifikovaným povrchem, zpusob jejich prípravy a použití
CZ301067B6
Czechia
- Other languages
English - Inventor
Horák@Daniel Syková@Eva Babic@Michal Jendelová@Pavla Hájek@Milan
Worldwide applications
Application CZ20060120A events
2006-02-24
2006-02-24
2007-11-21
2009-10-29
Description
translated from
Oblast techniky
Vynález se týká superparamagnetických nanočásticových sond na bázi oxidů železa s modifikovaným povrchem, způsobu jejich přípravy a použití.
Dosavadní stav techniky
Vývoj lékařské diagnostiky v posledních letech směřuje stále více k ranějšímu stanovení často velmi závažných onemocnění. Součástí těchto nových technik je značení buněk, popř. jejich zob15 rázování pomocí magnetické rezonance (magnetic resonance imaging - MR1). MRI umožňuje vizualizaci vnitřních orgánů člověka a tudíž je velkým přínosem nejen v diagnostice, ale i v léčbě a chirurgii. Lékařská diagnostika vyžaduje použití částic nanometrové velikosti. MRÍ využívá skutečnosti, že magnetické nanočástice vytvářejí magnetické pole a ovlivňují okolní prostředí (Shinkai M„ Functional magnetic particles for medical application, J. Biosci. Bioeng. 94, 60620 613, 2002). Rozsah velikosti částic lze rozdělit podle použití na „velké (celkový průměr cca. > 50 nm) a „malé“ (celkový průměr cca. > 50 nm) částice MR diagnostika jater a sleziny je hlavní aplikační oblastí, jelikož částice této velikostí jsou rychle a téměř úplně vstřebány makrofágy těchto orgánů (Kresse M., Pfefferer D., Lawaczeck R., EP 516,252 A2; Groman Ε, V., Josephson L., U.S. Pat. 4,770,183). Částice nalézají uplatnění také v klinické hypertermii (Hasegawa M., Nagae H., Ito Y., Mitzitani A., Hirose K., Ohgaí M., Yamashita Y., TozawaN., Yamada K., Kito K„ Hokukoku S., WO 92/22586 Al; Gordon R. T., US 4 731 239).
Pro značení buněk je klíčové vyrobit monokrystalické nanočástice oxidu železa dispergovateíné ve vodě, které jsou současně biokompatibilní, superparamagnetické, funkcionalizovatelné ne povrchu a přitom jsou zcela buňkami pohlcovány.
Superparamagnetické oxidy železa (tedy bez „magnetické paměti“) jsou v současné době skupinou látek s nej silnějším kontrastem v MR (Stark D. D., Weissleder R., Elizondo G., Hahn P. F., Saini S., Todd L. E„ Wittenberg J., Ferrucci J. T., Superparamagnetic iron oxide: clinical appli35 cation as a contrast agent for MR imaging of the li ver, Radiology 168,297-301,1988), tudíž jsou za nízké koncentrace obzvláště vhodné pro tkáňové specifické aplikace. Existuje totiž kritická velikost, pod kterou mohou mít částice pouze jednou magnetickou doménu i v nulovém magnetickém poli. Podmínkou pro superparamagnetismus je Κ V ~ k T, kde Κ V je energie anisotropie (Kje konstanta anisotropie, V je objem částice) a k T je tepelná energie pohybu (kje Boltzmano40 va konstanta, T je absolutní teplota). Je-li splněna tato podmínka, magnetizace částice může být vyvolána tepelnou energií k T, jestliže překoná potenciálovou bariéru anisotropické energie. Kritická velikost superparamagnetických Částic u magnetitu je asi 25 nm. Superparamagnetické oxidy železa umožňují zvýšit kontrast tkáně zvýšením relaxační rychlosti vody. S měnící se velikostí, povlakem, tloušťkou, chemickými reakcemi na povrchu a směrujícími ligandami, nano45 částicové sondy mohou být směrovány do specifických orgánů, buněk, nebo se dokonce mohou stát in vivo molekulárními markéry různých nemocí. Velikost krystalického jádra oxidů železa, která dává těmto látkám specifický charakter, je však problematická, protože má podstatný vliv na biologické chování. Malá velikost částic zlepšuje přesné směrování, avšak účinnost materiálu se snižuje vzhledem k vzájemné souvislosti mezi velikostí částice a magnetickým momentem, v důsledku čehož je nutné hledat kompromis mezi dobrou kontrastností materiálu a přesným směrováním (Kresse M., Pfefferer D., Lawaczeck R., Wagner S., Ebert W„ Elste V., Semmler
W., Taupitz M. Gaida J., Herrmann A., Ebert M., Swiderski U., US 2003/0185757). Je pravidlem, že jádro obsahující železo by mělo být co největší, aby bylo dosaženo vysokého zobrazovacího účinku (kontrastu), avšak celkový průměr by měl být malý.
Příklady MR1 kontrastních činidel zahrnují injektovatelná jádra, radionuklidy, diamagnetické, paramagnetické, ferromagnetické, superparamagnetické látky, kontrastní látky obsahující železo (např. oxid železa, železité ionty, citran železitoamonný), gadoliniová činidla (např, diethylentriaminopentaacetát gadolinia) a manganové paramagnetické látky. Typickými komerčními MRI kontrastními Činidly jsou např. Magnevist a Resovist (oba Schering), Omniscan, Feridex, Sinerem a Combinex (všechny tři Advanced Magnetics), Endorem (Guerbet), Clariscan (Nycomed). Na přípravu krystalů obsahujících železo (oxidů železa) se superparamagnetickými vlastnostmi byla popsána celá řada různých metod. Tyto lze třídit podle mnoha aspektů. Dvě základní metody na výrobu superparamagnetických krystalů jsou založeny na spékání za vysoké i o teploty a následném mechanickém rozmělňování nebo chemické syntéze ve vodném roztoku. Pro lékařské aplikace se osvědčily částice vyráběné „mokrými“ syntetickými postupy, naproti tomu slinování je popsáno pro výrobu oxidů železa pro technologické (audio/video média, pigmenty do barev, tonery) a biotechnologické aplikace, jako jsou magnetické separace (Schostek S., Beer A., DE 3 729 697 Al; BorelliN. F., LudererA. A., PanzarinoJ. N., US 4 323 056; Osamu L,
Takeshi H., Toshihiro M., Koují N., JP 60 260 463 A2). Mokrou chemickou syntézu lze rozdělit na „dvoustupňovou syntézu“, kterou se nejprve zvýšením pH připraví jádra obsahující oxid železa, ke kterým je posléze přidáván stabilizátor zajišťující fyzikální a jiné potřebné vlastnosti (Kresse M., Pfefferer D., Lawaczeck R„ Wagner S., Ebert W„ Elste V., Semmler W„ Taupitz M. Gaida J., Herrmann A., Ebert M., Swiderski U., US 2003/0185757). U Jednostupňové syntézy“ jsou oxidy železa připravovány srážením solí železa za přítomnosti stabilizátoru, který jádra povléká v průběhu nukleace, čímž brání agregaci a sedimentaci nanokrystalů. Kromě členění na „dvoustupňové“ aJednostupňové“ metody existuje další rozlišení a to podle typu použitého rozpouštědla, totiž na metody používající vodu (Hasegawa M., Hokukoku S., US 4 101 435; Fuji Rebio K. K„ JP 59 195 161) nebo organická rozpouštědla (Porath J„ Mats L., EP 179 039 A2;
Aoyama S„ Kishimoto M., Manabe T„ ínteraction between polymers and magnetic particles effect on the properties of particulate magnetic recording media, J. Mater. Chem. 2, 277-280, 1992; Norio H., Saturo O., JP 05 026 879 A2). Hrubý produkt je nutné vždy pečlivě přečistit a přebytečné látky a nečistoty tak odstranit. Možností volby je pak sterilizace teplem. V současné době používané oxidy železa se vyznačují polydisperzitou částic vyjádřenou indexem polydisper30 žity PDI >1,3. (PD1 = DJDni kde Dn = Σ D/N a Dw = Σ D-f/Σ D?, N je počet částic, Dt je průměr jednotlivé částice.) Polydisperzní částice mají rozdílné fyzikální a chemické vlastnosti, na rozdíl od monodisperzních, jejichž vlastnosti, včetně magnetických, jsou jednotné. Nevýhodou klasických magnetitových nanočástic dále je, že ve vzdušném prostředí mění své vlastnosti. Jejich chemická nestálost způsobuje, že se vzdušným kyslíkem nekontrolovatelně oxidují, dochází k poklesu magnetické susceptibility, koloid ztrácí stabilitu a nanočástice agregují, což je pro lékařské aplikace nepřijatelné. Proto je lepší čerstvě připravené magnetitové částice ihned po syntéze kontrolované oxidovat na maghemit (y-Fe^Oj), kterýje na vzduchu stálý a své vlastnosti nemění. Obecně je povrch magnetických částic pro lékařské zobrazování pokrýván makromolekulami. Téměř všechny v současné době v lékařství standardně používané nanočástice jsou oxidy železa připravované za přítomnosti polysacharidů dextranu jakožto stabilizující látky (Bacíc G„ Niesman M, R., Bennett H. F., Magin R. L,, Schwarz Η. M., Modulation of water proton relaxation rates by liposomes containing paramagnetic materials, Magn. Reson. Med. 6, 445-58, 1988; Ohgushi M., Nagayama K., Wada A„ Dextran-magnetite: a new relaxation reagent and its application to T2 measurements in gel systems, J. Magn. Reson. 29, 599-601, 1978; Pouliquen D., Le
Jeune J. J., Perdrisot R„ Ermias A„ Jal let P„ Iron oxide nanoparticles for use as an MRI contrast agent: pharmacokinetics and metabolism, Magn. Reson. Imaging 9, 275-283, 1991; Ferrucci J. T„ Stark D. D., Iron oxide-enhanced MR imaging of the liver and spleen: review of the first 5 years, Am. J. Roentgenol. 155, 943-950, 1990). Syntéza takovýchto částic se obvykle provádí podle tzv. Moldayova postupu (Molday R. S., MacKenzie D., Immunospecific ferromagnetic iron-dextran reagents for the labeling and magnetic separation of cells, J. Immunol. Methods 52, 353-367, 1982) a vyžaduje pracné a nákladné čistící postupy. Dextran je však chemicky nestálý, např. depolymeruje v kyselém prostředí a různé další reakce mohou vést až k jeho úplné destrukci v alkalickém prostředí. Navíc buňky pohlcují dextranem pokryté nanočástice nedostatečně, což neumožňuje dokonalé MR sledování buněk, pravděpodobně kvůli poměrně neúčinné endocytóze.
Kromě dextranu je popsáno použití i jiných polysacharidů, jako je arabinogalaktanu (Josephson
L. , Groman Ε. V., Menz E., Lewis J. M., Bengele H., A functionalized superparamagnetic iron oxide colloid as a receptor directed MR contrast agent, Magn. Reson. Imaging 8,637-646,1990), škrobu (Fahlvik A. K., Holtz E., Schroder U., Klaveness 1, Magnetic starch microspheres, biodistribution and biotransformation. A new organ-specific contrast agent for magnetic resonance imaging, Invest. Radiol, 25, 793-797, 1990), glykosoaminoglykanů (KresseM., Wagner S., Pfefferer D., Lawaczeck R., Elste V., Semmler W., Targeting of ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO) particles to tumor cells in vivo by using transferrin receptor pathways, Magn. Reson. Med, 40, 236-42, 1998), nebo proteinů (Widder D. J., Greíf W. L., Widder K. I, Edelman R. R., Brady Τ. I, Magnetite albumin microspheres: a new MR contrast materiál, Am. io J. Roentgenol. 148, 399-404, 1987) jako je např. albumin, nebo syntetických polymerů, např, methakrylátů a organosilanů. Popsána jsou i transfekční činidla zahrnující také polyaminokyseliny (např. polyalaniny, poly(L-argininy), DNA lososích jiker, poly(L-omithiny)), dendrimery, polynukleotidy (Frank J. A., Bulte J. W. M., WO 02/100269 Al), polyglutamát, polyiminy (Van
Zijk P., Goffeney N., Duyn J. H., Bulte J. W. M., WO 03/049604 A3).
Polymerní povlak podstatně zvyšuje velikost částic, což může ovlivnit jejich penetraci a rychlost metabolického odstranění v těle. V poslední době byly v MR zobrazování popsány i disperze holých superparamagnetických nanočástic (nepovleČených polymerem) (Cheng F.-Y,, Su C.-H., Yang Y -S., Yeh C-S., Tsai C,-Y., Wu C.-L., Wu M.-T., Shieh D.-B., Characterization of aqueous dispersions of Fe3O4 nanoparticles and their biomedical applications, Biomaterials 26, 729-738, 2005). Byly připraveny ve vodě a stabilizovány např. citrátovým monomerem (Taupitz
M. , Schnorr J., Wagner S. A., Abramjuk C., Pilgritnm H., Kivelitz D., Schink T., Hansel J„ Laub G., Humogen H., Hamm B., Coronary MR angiography: experimental results with a monomerstabilized blood pool contrast medium, Radiology 222, 120-126, 2002) nebo tetramethyl25 amonium hydroxidem (Cheng F.-Y., Su C.-H., Yang Y.-S., Yeh C-S., Tsai C-Y., Wu C.-L., Wu Μ-T., Shieh D.-B., Characterization of aqueous dispersion of Fe3O4 nanoparticles and their biomedical applications, Biomaterials 26, 729-738, 2005). Tyto nanočástice údajně poskytovaly některé výhody oproti těm, které k ochraně před agregací vyžadovaly přídavek polymeru.
Kmenové buňky mají schopnost diferencovat v jakoukoliv specializovanou buňku organismu a proto stojí ve středu zájmu humánní medicíny, zejména regenerativní medicíny a buněčné terapie, kde lze předpokládat jejich použití (Park H. C,, Shims Y. S., Ha Y., Yoon S. H., Park S. R., Choi Β. H., Park H. S., Treatment of complete spinal cord injury patients by autologous bone marrow cell transplantation and administration of granulocyte-macrophage colony stimulating factor, Tissue Eng. 11, 913-922, 2005; Akiyama Y., Radtke C., Honmou O., Kocsis J. D., Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells, Glia 39, 229-236, 2002; Akiyama Y., Radtke C., Kocsis J. D., Remyelination of the rat spinal cord by transplantation of identified bone marrow stromal cells, J. Neurosci. 22, 66236630, 2002; Hofstetter C. P., Schwarz E. J., Hess D., Widenfalk J., El Manira A., Prockop J. D.,
Olson, L., Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 96, 2199-2204, 2002; Chen J., Li Y., Katakowski M., Chen X., Wang L., Lu D., Intravenous administration of human bone marrow stromal cells induces angiogenesis in the ischemic boundary zone after stroke in rats, Circ. Res 92, 692, 2003; Chen X., Wang L., Lu D., Intravenous administration of human bone marrow stromal cells induces angiogenesis in the ischemic boundary zone after stroke in rats, Circ. Res 92, 692, 2003; Chen J., Zhang Z. G., Li Y., Wang L,, Xu Y. X., Gautam S. C., Intraarterial administration of marrow stromal cells in a rat model of traumatic brain injury, J. Neurosci. Res. 73, 778-786, 2003; Chopp M,, Li Y., Treatment of neural injury with marrow stromal cells, Lancet Neurol. 1, 92-100, 2002; Chopp M., Zhang X. H., Li Y., Wang L., Chen J., Lu D., Spinal cord injury in rat:
treatment with bone marrow stromal cells transplantation, Neuroreport 11, 3001-3005, 2000; Ramon-Cueto A., Plant G. W., Avila J., Bunge Μ. B., Long-distance axonal regeneratíon in the transected adult rat spinal cord ís promoted by olfactory ensheathing glia transplants, J. Neurosci. 18, 3803-3815, 1998; Syková E., Urdziková L., JendelováP., Burian M., Glogarová K., Hájek M., Bone marrow cells - a tool for spinal cord injury repair, Exp. Neurol. 193, 261-262,
2 0 05).
- 3 _
Podstata vynálezu
Předmětem řešení podle vynálezu jsou modifikované superparamagnetické nanočásticové sondy na bázi oxidů železa pro diagnostické a terapeutické použití. Superparamagnetické nanočásticové sondy na bázi oxidů železa, s výhodou magnetitu nebo maghemitu, s modifikovaným povrchem, jsou tvořeny koloidem sestávajícím z částic jejichž velikost je od 2 do 30 nm, s výhodou 2 až 10 nm, a index polydisperzity je menší než 1,3. Jejich povrch je pokryt mono-, di- nebo polysacharidy nebo aminokyselinami nebo poly(aminokyselinami). Sacharidy jsou vybrány ze skupiny tvořené D-arabinosou, D-glukosou, D-galaktosou, D-mannosou, laktosou, maltosou, dextraio ny, dextriny. Aminokyselina nebo poly(aminokyselina) je vybraná ze skupiny zahrnující alanin, glycin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, L-lysin, kyselinu asparagovou a glutamovou. Povrchová vrstva modifikačního činidla tvoří 0,1 až 30 hmotn. %, s výhodou 10 hmotn. % a obsah oxidu železa 70 až 99,9 hmotn. %, s výhodou 90 hmotn. %. Činidla, kterými jsou částice opatřeny na povrchu, umožňují jejich průnik do buněk.
Supermagnetické nanočásticové sondy podle vynálezu se připraví tak, že se za teploty 21 °C z vodného 0,1 až 0,2 mol/1 roztoku Fe(III) soli, s výhodou FeCl3, za sonikace o výkonu 350 W po dobu 2 min. působením méně než ekvimolámího množství NH4OH předsráží koloidní Fe(OH)3. K němu se za sonikace po dobu 2 min. přidá 0,1 až 0,2 mol/1 roztok Fe(II) soli, s výhodou FeCk, v molámím poměru FelII/FelI = 2 a směs se vlije do pěti až desetinásobného, s výhodou osminásobného, molámího přebytku 0,5 mol/1 NH4OH. Směs se ponechá 0 až 30 min, s výhodou 15 min., ztrát a poté se sraženina opakovaně, s výhodou 7 až 1 Okřát, magneticky oddělí a promývá deionizovanou vodou o specifickém odporu 18 ΜΩ-cm1. Oproti současnému stavu se nově za sonikace poté přidá 1 až 3 násobek, s výhodou 1,5 násobek, vzhledem kmolámímu množství magnetitu, 0,1 mol/ vodného roztoku citranu sodného, dále se po kapkách přidá 1 až 3 násobek, s výhodou 1,5 násobek vzhledem k magnetitu, 0,7 mol/1 vodného roztoku chlornanu sodného. Opakovaně s výhodou 7 až 1 Okřát, se promývá deionizovanou vodou o specifickém odporu 18 ΜΩ-cm 1 za vzniku koloidu maghenitu, k němuž se po zředění po kapkách, popř. za sonikace po dobu 5 min., přidá vodný roztok modifikačního činidla v hmotn. poměru modifikační činidlo lo/oxid železa = 0,1 až 10, s výhodou 0,2 pro aminokyseliny a poly(aminokyseliny) a 5 pro sacharidy.
Takto připravené nanočástice dosahují podle transmisního elektronového mikroskopu (TEM) velikosti kolem lOnm a s relativně úzkou distribucí velikostí charakterizovanou PDI< 1,3 (obr. 1). Koloidní stabilita částic ve vodě je důsledkem přítomnosti nábojů pocházejících z Fe(III) a z citranových iontů.
Podstatný znak přípravy superparamagnetických nanočásticových sond s modifikovaným povrchem podle vynálezu spočívá v tom, že po srážení následuje pomalé přidávání roztoku modifí40 kačního činidla. Přitom se modifikační činidlo nespecificky adsorbuje na povrch oxidu železa, interakce je důsledkem vodíkové vazby mezi polární -OH skupinou modifikačního činidla a hydroxylovanými a protonovanými místy na povrchu oxidu, popř. náboje činidla interagujícího s cítranem komplexovaným na povrchu oxidu železa. Modifikačním činidlem pokryté nanočástice neagregují, což prokázaly snímky z TEM, podle kterých byla velikost povrchově modifíkova45 ných částic stejná jako u výchozích částic oxidu železa.
Alternativní metoda, která umožňuje přípravu oproti současnému stavu velice malých cca. 2 nm superparamagnetických nanočásticových sond s modifikovaným povrchem a s velmi úzkou distribucí velikosti s PDI <1,1 spočívá v in šitu srážení oxidu železa v roztoku modifikačního činid50 la. Tento způsob přípravy spočívá v tom, že se jeden objemový díl 10 až 60 hmotn. %, s výhodou 50 hmotn. %, vodného roztoku sacharidu nebo polysacharidu smíchá s jedním objemovým dílem vodného roztoku Fe(II) a Fe(III) soli, s výhodou FeCl2 a FeCl3, kde molámí poměr Fe(III)/Fe(II) = 2, za teploty 21 °C se přidá 5 až 15 %, s výhodou 7,5%, roztok NH4OH do dosažení pH 12 a směs se zahřívá při 60 °C po dobu 15 min. Dále se směs sonikuje při 350 W výkonu po dobu
5 min. a poté se promývá dialýzou ve vodě pomocí membrány s mezní molekulovou hmotností
000 po dobu 24 hod. do dosažení pH 7, objem vody se sníží odpařením tak, aby obsah sušiny byl 50 až 100 mg, s výhodou 80 mg, na 1 ml
Nanoěástice se modifikují činidly na bázi poly(aminokyselin) jako je polyalanin, polyglycin, polyglutamin, polyasparagin, polyarginin, polyhistidin nebo polylysin, kyselina asparagová a glutamová, monosacharidů (např. arabinosa, glukosa, manosa, galaktosa), disacharidu (např. laktosa, maltosa) a polysacharidů včetně škrobu, dextranů a dextrinů.
Superparamagnetické nanočásticové sondy s modifikovaným povrchem podle vynálezu jsou io určeny pro značení živých buněk, zejména kmenových. Zvláště široké uplatnění tato metoda nalezne při monitorování buněk vhodných pro buněčnou terapii (např. kmenové buňky kostní dřeně, buňky čichového epitelu, buňky tukové tkáně). Po podání buněk bude možné neinvazivní metodou, pomocí magnetické rezonance, sledovat jejich osud v těle příjemce.
Experimentálně bylo zjištěno, že schopnost směrování superparamagnetických nanočásticových sond podle vynálezu do buněk je podstatně lepší než u částic oxidů železa podle doposud používaných metod. Vychytávání poly(aminokyselinami) modifikovaných nanočástic oxidu železa buňkami je umožněno jejich interakcí se záporně nabitým povrchem buněk a následnou endosomolytickou absorpcí. Nanoěástice jsou tak dopraveny do endosomů, splývají s lysozomy za sou20 časného zániku vesikulámí membrány. Jiný mechanismus transportu nanočásticových sond do buněk může spočívat na manosovém transportéru přítomném na povrchu mnohých typů savčích buněk. V porovnání s Endoremem (koncentrace 0,11 mg Fe3O4/ml média), k úplnému označení buněk byly postačující podstatně nižší koncentrace nanočástic oxidu železa modifikovaných podle vynálezu. Výhodou pak je, že organismus pacienta je podstatně méně zatěžován aplikova25 nými částicemi než je nutné při použití v současnosti komerčně dostupných činidel.
Řešení podle vynálezu poskytuje nástroj ke sledování historie a osudu buněk transplantovaných do organizmu, včetně jejich in vivo migrace. Nanočásticové sondy podle vynálezu jsou vhodné pro stanovení diagnos patologií spojených s buněčnou dysfunkcí. Kmenové buňky pacienta se nejprve ex vivo označí - při značení buněk se postupuje tak, že do kompletního kultivačního média se in vitro přidá 5 až 20, s výhodou 10 μί koloidu obsahujícího 0,05 až 45 mg oxidu železa/ml, s výhodou 1 až 5 mg oxidu železa/ml, vztaženo na 1 ml media a buňky se kultivují po dobu 1 až 7 dnů, s výhodou 1 až 3 dny, pri 37 °C a 5% CO2. Během kultivace buňky fagocytují nanoěástice z média do cytoplasmy. Takto označené buňky jsou vpraveny do organismu pacienta, což při použití magnetického pole umožňuje sledovat pohyb, umístění a přežití exogenních buněk MRI zobrazením a odhalit tak patologie související s buněčnými dysfunkcemi.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava výchozích (nepovlečených) superparamagnetických nanočástic oxidu železa 12 ml
0,2 mol/l vodného roztoku FeCl3 bylo smícháno s 12 ml 0,5 mol/l vodného roztoku NH4OH za současné sonikace (Sonicator W-385; Heat Systems-Ultrasonics, Inc., Farmingdale, NY, USA) za teploty místnosti po dobu 2 min. Poté bylo opět za sonikace přidáno 6 ml 0,2 mol/l vodného roztoku FeCl2 a směs vlita do 36 ml 0,5 mol/l vodného roztoku NH4OH. Výsledná sraženina magnetitu byla ponechána zrát po dobu 15 min., magneticky oddělena a opakovaně (7 až 1 Okřát) promývána deionizovanou vodou o specifickém odporu 18 ΜΩαη”1, aby se odstranily všechny po syntéze zbylé nečistoty (včetně NH4CI). Nakonec bylo za sonikace přidáno 1,5 ml 0,1 mol/l roztoku citranu sodného a magnetit oxidován pomalým přidáváním 1 ml 5% roztoku chlornanu sodného. Výše popsaný postup opakovaného promývání pak poskytl výchozí primární koloid. Ke stanovení velikosti nanočástic byl použit dynamický rozptyl světla (DLS), který poskytl prů55 měrný hydrodynamický průměr částic činící 90 ± 3 nm, což svědčí o úzké distribuci velikostí. Ze
snímků z transmisního elektronového mikroskopu, obr. 1, je pak Dn = 6,5 nm a PDI = 1,26. PD1 je index polydisperzity charakterizující šířku distribuce velikostí, PDI = DJDn, kde £>w a Ajsou hmotnostní a číselný střed průměru částic.
Příklad 2
Působení poly(aminokyselin) na superparamagnetické nanočástice oxidu železa - „dvoustupňová syntéza“
V následující kroku bylo do 10 ml výchozího koloidního roztoku obsahujícího nanočástice oxidu železa připravené podle příkladu 1 a zředěného na koncentraci 2,2 mg oxidu železa/ml za míchání přidáno po kapkách 0,01 až 2 ml (typicky 0,2 ml) vodného roztoku poly(aminokyseliny) o koncentraci 0,5 až 10 mg/ml (typicky 1 mg/ml) a směs byla sonikována po dobu 5 min. i 5 Poly(aminokyselinou) může být polyalanin, polyglycin, polyglutamin, polyasparagin, polyarginin, polyhistidin nebo poly(L-lysin), kyselina asparagová a glutamová.
Příklad 3
Působení sacharidů na superparamagnetické nanočástice oxidu železa - „dvoustupňová syntéza“ Různé objemy (0,1 až 5 ml) 4 hmotn. % vodného roztoku sacharidu byly za míchání přidány po kapkách k 10 ml výchozího koloidního roztoku obsahujícího nanočástice oxidu železa připravené podle příkladu 1 a zředěného na koncentraci 2,2 mg oxidu železa/ml a směs sonikována po dobu
5 min. Opakovaně promýváno.
Sacharidem může být D-arabinosa, D~glukosa, D-galaktosa, D-manosa, laktosa, maltosa, dextriny, dextriny.
Příklad 4
In sítu srážení superparamagnetických nanočástic oxidu železa v roztoku sacharidu ml 50 hmotn. % vodného roztoku sacharidu bylo za míchání smícháno s 10 ml vodného roz35 toku obsahujícího 1,51 g FeCl3 x 6 H2O a 0,64 g FeCl2 x 4 H2O; pomalu bylo přidáno 15 ml 7,5% roztoku NH4OH až do dosažení pH 12 a směs byla zahřívána na 60 °C po dobu 15 min. Velké agregáty byly rozbity sonikací (Ultrasonic Homogenizer 4710 Series, Cole-Palmer Instruments, USA, výkon 350 W) po dobu 5 min. Aby se odstranily vodorozpustné soli a přebytečný sacharid, částice se promývaly dialýzou ve vodě membránou Visking (mezní molekulová hmotnost 14 000; Caři Roth GmbH, Německo) po dobu 24 hod. za pokojové teploty (voda byla 5-krát vyměněna, po každé v objemu 2 1) až bylo dosaženo hodnoty pH 7. Objem vody byl snížen odpařováním - sušina: 80 mg oxidu železa/ml koloidu.
Sacharidem může být D-arabinosa, D-glukosa, D-galaktosa, D-manosa, laktosa, maltosa, dextran, dextriny.
Příklad 5
Optická mikroskopie značených buněk
Stromální buňky kostní dřeně (MSC) potkana označené jak výchozími nepovléčenými, tak i povrchově modifikovanými superparamagnetickými nanočásticemi oxidu železa, byly pozorovány v optickém mikroskopu. Buňky označené Endoremern (0,11 mg Fe3O4/ml) sloužily jako kontCZ 301067 B6 rola (obr. 2 a). Nevýhodou Endoremu však byla jeho tendence adherovat k povrchu buněk, navíc se lepil i na dno nádoby.
Buňky v kontaktu s výchozími (nepovlečenými) nanočásticemi připravenými podle příkladu 1 5 proliferovaly a přibližně každá desátá buňka endocytovala nanočástice oxidu železa (obr. 2 b).
Buňky v kontaktu se superparamagnetickými nanočásticemi modifikovanými D-manosou podle Jednostupňové metody4' (připravené srážením insitu v koncentrovaném roztoku D-manosy podle příkladu 4) dobře proliferovaly již při koncentraci 0,02 mg oxidu železa/ml, aniž se tvořily shluky nanočástice adherujících na povrch buněk (obr. 2 c).
io
Ze sledování buněk v kontaktu se superparamagnetickými nanočásticemi modifikovanými Dmanosou podle „dvoustupňové metody44 (až po syntéze) podle příkladu 3 lze usuzovat na optimální koncentraci D-manosy přidávané do koloidu činící 12,8 mg D-manosy na ml koloidu, která zaručí označení cca. 50 % buněčné populace (obr. 2 d).
Maximálního označení buněk (téměř ze 100%) bylo dosaženo nanočásticemi modifikovanými poly(L-lysinem) (0,02 mg poly(L-lysinu) na ml koloidu (obr. 2 e)).
Příklad 6
Transmisní elektronová mikroskopie buněk značených superparamagnetickými nanočásticemi oxidu železa
Transmisní elektronová mikroskopie MSC buněk značených superparamagnetickými nanočásticemi oxidu železa modifikovanými D-manosou podle příkladu 3 a poly(L-lysinem) podle příkladu 2 je ukázána na obr. 3. Patrné jsou četné shluky obou typů superparamagnetických nanočástic uvnitř buněk značených nanočásticemi modifikovanými jak D-manosou, tak i poly(Llysinem). Shluky nanočástic byly rovnoměrně rozmístěny v buněčné cytoplazmě a nebylo patrné, že by se hromadily na buněčné membráně.
Příklad 7
Kvantitativní stanovení buněk značených superparamagnetickými nanočásticemi oxidu železa
Superparamagnetické nanočástice oxidu železa modifikované jak poly(L-lysinem) podle příkladu 2, tak i D-manosou podle příkladu 3, byly úspěšně endocytovány MSC buňkami (jak vyplývá z obr. 2 a 3. MSC buňky byly pěstovány dvojmo na nepokrytých šesti-jamkových kultivačních destičkách v hustotě 105 buněk/mm2. Endorem a nanočástice modifikované poIy(L-lysinem) nebo D-manosou byly přidány do kultivačního média (10 μΙ/ml) a buňky inkubovány po dobu 72 hod. Po vymytí přebytečné kontrastní látky kultivačním médiem byly buňky fixovány 4% roztokem paraformaldehydu v 0,1 mol/1 fosfátovém pufru (PBS) a barveny na železo za vzniku ferrokyanidu železitého (Berlínská modr). Počet označených i neoznačených buněk byl stanoven v invertovaném mikroskopu (Axiovert 200, Zeiss) počítáním náhodně zvolených pěti polí na jamku a dvou jamek na každý experiment (tabulka 1). Buňky na každém snímku byly ručně označeny jako pozitivní nebo negativní na Berlínskou modř; počet označených buněk byl pak spočítán pomocí Image analysis toolbox v programu Matlab 6.1 (The MatchWorks, Natick, MA, USA). Nejlepšího označení buněk bylo dosaženo nanočásticemi obsahujícími 0,02 mg po!y(L50 lysinu) na ml koloidu.
Tabulka 1. Procento stromálních buněk kostní dřeně (MSC) označených in vitro superparamagnetickými nanočásticemi _ Ί CZ 301067 B6
| Nepoví ečený oxid železa | i PLL oxid železa (0.02 mg PLL/ml) | Manosa oxid železa | Endorem | |
| MSC (potkan) | 27,9 | 92,2 | 50,8 | 60,0 |
| MSC (lidské) | netestováno | 87,5 | netestováno | 65,2 |
Příklad 8
Relaxivita buněk značených superparamagnetickými nanočásticemi oxidu železa modifikovanými poly(L-lysinem)
Aby byla dále ověřena přítomnost poly(L-lysinem) modifikovaných superparamagnetických io nanočástic oxidu železa připravených podle příkladu 2 v buňkách kostní dřeně (MSCs), byly připraveny vzorky se suspenzí Endoremu a poly(L-lysinem) modifikovaných superparamagnetických částic v 4% roztoku želatiny a vzorky se suspenzí buněk značených Endoremem a poly(L-lysinem) modifikovanými superparamagnetickými částicemi s různým počtem buněk v želatině, Následně byly změřeny relaxační časy a získány MR obrazy těchto vzorků.
Ke stanovení Tt a T2 relaxačních časů byl použit relaxometr Broker Minispec 0,5 T. Hodnoty byly přepočteny na protonové relaxivity R( = 1/Tj, R2 = 1/T2 a vztaženy na skutečné koncentrace Π = R)/c (s“'/mM), r2 = R2/c (s’l/mM), případně jsou vztaženy na počet buněk v 1 ml, kde R2 a Ri jsou korigovány na želatinu. Hodnoty relaxivit jsou uvedeny v tabulkách 2 a 3. Z tabulky 3 je zřejmé, že hodnota r2 superparamagnetických nanočástic oxidu železa modifikovaných poly(Llysinem) podle příkladu 2 je podstatně vyšší než u Endoremu.
Tabulka 2. Hodnoty η superparamagnetických nanočástic oxidu železa modifikovaných 25 poly(L-lysinem) (PLL) a Endoremu
| PLL oxid železa | Relaxivita η suspenze kontrastní látky v želatině (s''/mM Fe) 17,4 | Relaxivita η suspenze značených buněk v želatině (s'l/milion buněk/ml) 0,32 |
| Endorem | 19,6 | 0,18 |
Tabulka 3. Hodnoty r2 superparamagnetických nanočástic oxidu železa modifikovaných poly(L- lysinem) (PLL) a Endoremu
| Relaxivita Γ2 suspenze | Relaxivita Γ2 suspenze | |
| kontrastní látky v želatině | značených buněk v želatině | |
| (s'l/mM Fe) | (s^/million buněk/ml) | |
| PLL oxid železa | 213 | 4,29 |
| Endorem | 126 | 1,24 |
Spektrofotometricky stanovený průměrný obsah železa činil po mineralizací 35,9 pg Fe na buňku u poly(L-lysinem) modifikovaných nanočástic oxidu železa a 14,6 pg Fe/buňku u buněk značených Endoremem.
Příklad 9
In vitro MR zobrazení buněk značených superparamagnetickými nanočásticovými sondami ío Zobrazování označených buněk in vitro je výhodné k prokázání citlivosti MRI a současně k napodobení průběhu signálu v mozkové tkáni. MSC buňky potkana byly označeny superparamagnetickými nanočásticemi modifikovanými poly(L-lysinem) podle příkladu 2 a byla připravena suspenze buněk v 4% roztoku želatiny o koncentraci 4000, 2000, 1600, 1200, 800, 400 a 200 buněk na μί. Neoznačené MSC buňky potkana byly suspendovány v 4% roztoku želatiny o koncentraci 4000,1200 a 200 buněk na μί.
Tyto buněčné vzorky byly následně zobrazeny 4,7 T spektrometrem Broker pomocí standardní turbospinové sekvence (parametry sekvence: repetiční čas TR = 2000 ms, efektivní echočas TE = 42,5 ms, turbofaktor = 4, počet akvizic AC = 16, zobrazené pole FOV = 64 x 64 mm, matrice
MTX = 512 x 512, tloušťka vrstvy 0,75 mm, nastavená geometrie poskytuje srovnatelnou velikost voxelů jako u in vivo měření) a sekvence gradientového echa (TR = 180 ms, TE - 12 ms, stejná geometrie zobrazení).
Při použití obou sekvencí poskytují buňky značené superparamagnetickými nanočásticemi modi25 fikovanými poly(L-lysinem) (obr. 4 A, B), popř. D-manosou, vynikající kontrast ve srovnání s buňkami neznačenými. Viditelný kontrast v MR obrazu byl pozorován i u vzorku, jehož každý obrazový voxel obsahoval průměrně pouhé 2,3 buňky. Podobná řada experimentů byla uvedena v předcházející práci (Jendelová P., Herynek V., DeCroos J., Glogarová K., Andersson B., Hájek M„ Syková E., Imaging the fate of implated bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles, Magn. Reson. Med. 50, 767-776, 2003), kde MR zobrazení želatinových fantomů ukázalo hypointenzivní signál při koncentraci nad 625 buněk na μί.
Příklad 10
Jn vivo MR zobrazení buněk značených superparamagnetickými nanočásticovými sondami
Potkani kmene Wistar byli anestezováni pasivní inhalací 1,5 až 2% isofloranu ve vzduchu. Dýchání bylo monitorováno v průběhu měření. Potkani byli sledováni 3 dny po transplantaci v 4,7 T spektrometru Broker vybaveném povrchovou cívkou tuzemské výroby. Jednoduché sagitální, koronální a příčné snímky byly získány rychlou gradientovou echo sekvencí pro lokalizaci následujících T2- a T2*-vážených obrazu měřených standardní turbospinovou sekvencí (TR = 2000 ms, TE = 42,5 ms, turbofaktor = 4, AC - 16, FOV - 30 x 30 mm, matrice MTX 256 x 256, tloušťka vrstvy 0,75 mm) a sekvencí gradientového echa (TR = 180 ms, TE = 12 ms, stejná geometrie zobrazení). Obr. 4 C dokazuje, že buňky označené superparamagnetickými nanočásticemi oxidu železa modifikovanými poly(L-lysinem) podle příkladu 2 byly jasně rozeznatelné také in vivo. Buněčné implantáty označené superparamagnetickými nanočásticemi oxidu železa byly zřetelné jako hypointensivní plocha přibližně 1 mm2 s ostrým ohraničením podél místa vpichu. Neoznačené buněčné implantáty byly viditelné na MR snímcích jako tkáňová nehomogenita bez hypointenzivního signálu (obr. 4 C).
n
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1. TEM snímek výchozích (nepovlečených) superparamagnetických nanočástic oxidu železa.
Obrázek 2. Mikroskopické sledování stromálních buněk kostní dřeně označených (a) Endoremem (kontrolní experiment, koncentrace 0,11 mg Fe^/ml), (b) výchozími nepovlečenými superparamagnetickými nanočásticemi oxidu železa, (c) superparamagnetickými nanočásticemi oxidu železa modifikovanými D-manosou podle ,jednostupňové metody“ (koncentrace 0,022 mg io oxidu žele2a/ml), (d) superparamagnetickými nanočásticemi oxidu železa modifikovanými Dmanosou podle „dvoustupňové metody“ (koncentrace 0,022 mg oxidu železa/ml) a (e) superparamagnetickými nanočásticemi oxidu železa modifikovanými poly(L-lysinem) (koncentrace
0,022 mg oxidu železa/ml). Měřítko (a-d) - 100 pm, (e) - 50 pm.
Obrázek 3. TEM snímky MSC buněk značených superparamagnetickými nanočásticemi oxidu železa modifikovanými (a) D-manosou a (b) poly(L-lysinem).
Obrázek4. A:Želatinové fantomy obsahující (a) 100 000, (b) 200 000, (c) 400 000, (d) 600 000, (e) 800 000, (f) 1 000 000 a (g) 2 000 000 buněk značených superparamagnetickými nanočásticemi oxidu železa modifikovanými poly(L—lysinem) a kontrolní vzorky s (h) 100 000, (i) 600 000 a (j) 2 000 000 neznačených buněk.
B: Želatinové fantomy obsahující (a, b) 100 000 buněk značených superparamagnetickými částicemi oxidu železa modifikovanými poly(L-lysinem) a (c, d) neznačených buněk v 0,5 ml. Snímky (a, c) byly získány v standardní turbospinové echo sekvenci, (b, d) pomocí gra25 dientové echo sekvence. I když gradientová echo sekvence poskytuje horší poměr signál/šum, vyšší citlivost poly(L-lysinem) modifikovaných nanočástic oxidu železa výrazně zvyšuje poměr kontrast/šum.
C; Potkaní hemisféry s (a) 90 000 implantovanými neznačenými buňkami a (b) 22 000, (c) 45 000 a (d) 90 000 buňkami značenými superparamagnetickými nanočásticemi oxidu železa modifikovanými poly(L-lysÍnem). MR zobrazení bylo snímáno 3 dny po implantaci.
Průmyslová využitelnost
Řešení podle vynálezu je využitelné v humánní a veterinární medicíně, biologii a mikrobiologii.
Claims (7)
Hide Dependent
translated from
Claims (7)
Hide Dependent
translated from
- 40 PATENTOVÉ NÁROKY1. Superparamagnetické nanočásticové sondy na bázi oxidů železa, s výhodou magnetitu nebo maghemitu, s modifikovaným povrchem, vyznačující se tím, že jsou pokryty mono-,45 di- nebo polysacharídy ze skupiny zahrnující D-arabinosu, D-glukosu, D-galaktosu, D-manosu, laktosu, maltosu, dextrany a dextriny nebo aminokyselinami nebo poly(aminokyselinami) ze skupiny zahrnující alanin, glycin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, L-lysin, kyselinu asparagovou a glutamovou, a tvoří koloid sestávající z částic s úzkou distribucí velikostí o indexu polydísperzity menším než 1,3, jejichž střední velikost je od 0,5 do 30 nm, s výhodou 1 až 10 nm,50 obsah oxidu železa tvoří 70 až 99,9 % hmotn., s výhodou 90 % hmotn., obsah modifikačního činidla tvoří 0,1 až 30 % hmotn., s výhodou 10 % hmotn.
- 2, Superparamagnetické nanočásticové sondy podle nároku 1, vyznačující se tím, že jejich velikost je menší než 2 nm a index polydisperzity menší než 1,1.
- 3. Způsob přípravy superparamagnetických nanočásticových sond podle nároku L vyznačující se tím, že se za teploty 21 °C z vodného 0,1 až 0,2 mol/l roztoku Fe(III) soli, s výhodou FeCl3, za sonikace působením méně než ekvimolámího množství NH4OH předsráží5 koloidní Fe(OH)3, k němuž se za sonikace přidá roztok Fe(II) soli, s výhodou FeCb, v molámím poměru FelII/FelI ~ 2, a směs se vlije do pěti až desetinásobného, s výhodou osminásobného, molámího přebytku 0,5 mol/l NH4OH, směs se ponechá 0 až 30 min., s výhodou 15 min., zrát a poté se sraženina opakovaně, s výhodou 7 až 1 Okřát, magneticky oddělí a promývá deionizovanou vodou, dále se za sonikace přidá 1 až 3 násobek, s výhodou 1,5 násobek, vzhledem k molár10 nímu množství magnetitu, 0,1 mol/l vodného roztoku citranu sodného, dále se po kapkách přidá 1 až 3 násobek, s výhodou 1,5 násobek vzhledem k magnetitu, 0,7 mol/l vodného roztoku chlornanu sodného a opakovaně, s výhodou 7 až 1 Okřát, se promývá deionizovanou vodou za vzniku koloidu maghemitu, k němuž se po zředění po kapkách, s výhodou za sonikace po dobu 5 min., přidá vodný roztok modifikačního činidla v hmotn. poměru modifikační činidlo/oxid železa = 0,115 až 10, s výhodou 0,2 pro aminokyseliny a poly(aminokyseliny) a 5 pro sacharidy.
- 4. Způsob přípravy superparamagnetických nanočásticových sond podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jeden objemový díl 10 až 60 % hmotn., s výhodou 50 % hmotn., vodného roztoku sacharidu, disacharidu nebo polysacharidů, jako je D-arabinosa, D-glukosa, D20 galaktosa, D-manosa, laktosa, maltosa, dextran a dextriny, smíchá s jedním objemovým dílem vodného roztoku Fe(II), a Fe(III) soli, s výhodou FeCl2 a FeCl3, kde molámí poměr Fe(ÍII)/Fe(II) je 2, za teploty 21 °C se přidá 5 až 15%, s výhodou 7,5%, roztok ΝΕ,ΟΗ do dosažení pH 12 a směs se zahřívá při 60 °C po dobu 15 min, dále se směs sonikuje při 350 W výkonu po dobu 5 min a poté se promývá dialýzou v destilované vodě pomocí membrány s mezní molekulovou25 hmotností 14 000 po dobu 24 h do dosažení pH 7, objem vody se sníží odpařením tak, aby obsah sušiny byl 50 až 100 mg, s výhodou 80 mg, na 1 ml.
- 5. Použití superparamagnetických nanočásticových sond podle nároků 1 a 2 pro označení buněk používaných v magnetické resonanci za účelem sledování jejich pohybu, umístění, přežití30 a diferenciace zejména při zjišťování patologií s buněčnou dysfunkcí a regenerace tkání.
- 6. Použití superparamagnetických nanočásticových sond podle nároků 1 a 2 pro označení a sledování buněk podaných pro účely buněčné terapie, zejména embryonálních kmenových buněk, fetálních kmenových buněk, kmenových buněk dospělého jedince, včetně kmenových buněk35 kostní dřeně, buněk čichového epitelu, buněk tukové tkáně, v organismu příjemce pomocí magnetické rezonance.
- 7. Způsob označování buněk, zvláště pak adherentních, pro sledování osudu transplantovaných buněk v organismu magnetickou rezonancí pomocí superparamagnetických nanočásticových40 sond podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že do kompletního kultivačního média se in vitro přidá 5 až 20, s výhodou 10 μΐ koloidu obsahujícího 0,05 až 45 mg oxidu železa/ml, s výhodou 1 až 5 mg oxidu železa/ml, vztaženo na 1 ml média a buňky se kultivují po dobu l až 7 dnů, s výhodou 1 až 3 dny, pri 37 °C a 5% CO2.3 výkresy-11CZ 301067 B6