CN102283812A - 一种治疗脑部疾病的纳米粒制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗脑部疾病的纳米粒制剂，其负载的药物是栀子苷或栀子总环烯醚萜苷，载体包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物，乳化剂是聚乙烯醇和选自氢化蓖麻油或吐温-80中的一种，各原料的重量份为：栀子苷或栀子总环烯醚萜苷10～250mg重量份，吐温-80或氢化蓖麻油1～30mg重量份，聚乳酸-羟基乙酸共聚物50～300mg重量份，聚乙烯醇200～500mg重量份。本发明还公开了一种壳聚糖修饰的、以栀子苷或栀子总环烯醚萜苷为负载药物的纳米粒制剂。上述纳米粒制剂通过复乳-溶剂挥发法制备。本发明所述制剂通过鼻腔给药，能够有效地提高栀子苷或栀子总环烯醚萜苷在脑部组织中的浓度，与经胃肠道、肌肉注射等给药途径的栀子苷或栀子总环烯醚萜苷制剂相比，给药量小，病人顺应性好。

Description

一种治疗脑部疾病的纳米粒制剂

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体地说，涉及一种以栀子苷或栀子总环烯醚萜苷为负载药物的治疗脑部疾病的纳米粒制剂。

背景技术

栀子具有清热、泻火、凉血、解毒的功效，中医常用于热证的治疗，是多种中药方剂的主药，如安宫牛黄、黄连解毒汤等。现代研究发现，以栀子苷(Geniposide)为代表的栀子总环烯醚萜苷是栀子的主要有效成分之一。栀子苷纯品为白色粉末，分子式：C₁₇H₂₄O₁₀，分子量：388.366。栀子苷在水中极易溶解，溶解度为0.18g·mL^-1，为亲水性化合物，易溶于乙醇、丙酮、正丁醇等极性有机溶剂，难溶于氯仿、苯、石油醚等亲脂性有机溶剂。

朱晓磊等对于栀子苷及栀子总环烯醚萜苷的药理作用方面做了比较全面深入的研究，表明其在脑缺血级联反应病理过程多个环节的主要靶点，发挥清热泻火，凉血解毒之功，使邪去络通而收醒神之效，对脑缺血损伤具有较好的防治作用(朱晓磊，张娜，李澎涛等.栀子苷阻抑脑缺血损伤级联反应的作用环节探讨[J].中国中药杂志，2004，29(11)：1065-1068)。栀子苷及栀子总环烯醚萜苷对脑缺血损伤所致疾病作用已经引起了药物研究者的注意，多篇专利文献都从不同方面公开了栀子苷的生物活性，如公开号1437973、1437974、1539444、1602893、1460483、1546507等中国发明专利申请公开说明书，都公开了栀子苷、栀子总环烯醚萜苷以及以栀子苷为主要有效成分的药物组合物在治疗脑栓塞、脑出血等疾病上的应用；公开号101385796、101361831等中国发明专利申请公开说明书，还公开了栀子苷或以栀子苷为主要有效成分的清开灵制剂在预防和治疗血管性痴呆方面的作用。

栀子苷或栀子总环烯醚萜苷要发挥上述对脑部疾病的治疗作用，必须使损伤脑区获得有效的药物浓度。但由于血脑屏障(Blood-Brain Barrier，简称BBB)的存在，使得经胃肠道、肌肉注射等给药途径的制剂无法使栀子苷或栀子总环烯醚萜苷在损伤脑区达到有效的药物浓度。如何使有效浓度的栀子苷或栀子总环烯醚萜苷通过血脑屏障，顺利到达脑组织内从而发挥作用，成为栀子苷或栀子总环烯醚萜苷是否能够成功开发出治疗脑部疾病新药的关键。

鼻腔与颅腔在解剖生理上有着独特的联系。嗅神经上皮是中枢神经系统(CNS)与外界直接相接触的唯一组织。被鼻纤毛覆盖的嗅神经感觉神经元的轴突形成束，能够穿过筛板进入颅腔，并且与脑内嗅球的僧帽细胞和丛细胞(mitral and tufted cells)而形成突触连接，这是药物从鼻腔吸收人脑的嗅黏膜上皮通路。鼻腔给药后药物分子滞留于嗅部黏膜而易吸收进人脑脊液，因而可绕过BBB进入CNS，发挥治疗作用。由于上述嗅神经通路和嗅黏膜上皮通路的存在，使得鼻腔已成为向脑内非侵袭性输送药物的有效途径。由于栀子苷及栀子总环烯醚萜苷易溶于水，其本身穿透黏膜的能力差；如果以溶液剂形式滴鼻或喷雾入鼻腔，很容易被鼻腔中的酶降解和被鼻纤毛清除，因此，有必要开发出能够延长栀子苷及栀子总环烯醚萜苷与鼻粘膜接触的时间，提高药物穿透黏膜的能力的鼻腔给药制剂，从而提高栀子苷及栀子总环烯醚萜苷在脑组织中的浓度，减少栀子苷及栀子总环烯醚萜苷的流失。

纳米粒(nanoparticles，NPs)为高分子物质组成的固态胶体粒子，通常对所携带的药物具有缓释、靶向、保护、提高疗效和降低毒副作用等特点。纳米粒的制备方法有多种，包括：乳化-溶剂挥发法、乳化-扩散法、乳化-聚合法、盐析法和超临界流体技术等。不同方法制备的纳米粒大小、类型、药物包封率等理化性质不同，对药物及载体材料的要求也不同。迄今，还没有以栀子苷或栀子总环烯醚萜苷为负载的药物的纳米粒制剂的报道。

而且有研究表明，普通纳米粒，如聚乙二醇为载体的纳米粒进入胞内被溶酶体捕捉，形成内吞小泡；其在早期内体和再循环内体中的环境接近生理环境，而在晚期内体和溶酶体中pH在4～5左右。在细胞摄取后的30min，主要分布于内体溶酶体，直到1h后发现纳米粒从内体-溶酶体逃脱进入胞浆。由于表面的屏蔽作用，使其进入内体-溶酶体之后即便是在酸性环境中，也无法发生表面电荷的改变，因此无法通过电荷吸引的方式发生内体-溶酶体的逃脱进入胞浆。针对鼻粘膜胞吞途径的脑靶向给药载体需要具有逃脱溶酶体效果来减少药物细胞内的吞噬和降解功能，从而提高药物通过血脑屏障、靶向分布于脑组织的效率。

表面修饰的壳聚糖可分别与鼻腔嗅粘膜上选择性高表达的糖基受体N-乙酸氨基葡萄糖或L-岩藻糖特异结合，通过结合的特异性受体把生物信号传达给细胞进行胞吞或胞饮。这种相互作用不仅导致黏附，并且使其通过不同的途径(溶酶体或非溶酶体)内化^[32]，使纳米粒表面在溶酶体内快速转化为正电荷，从而吸附带负电的内体-溶酶体膜，并从其中逃脱进入胞浆，继而进入脑脊液。

发明内容

本发明的目的是提供一种以栀子苷或栀子总环烯醚萜苷为负载的药物的纳米粒制剂，该制剂通过鼻腔给药，能够有效地提高栀子苷或栀子总环烯醚萜苷在脑部组织中的浓度，与经胃肠道、肌肉注射等给药途径的栀子苷或栀子总环烯醚萜苷制剂相比，给药量小，疗效更加确切，病人的顺应性好。

本发明的另一个目的是提供一种以栀子苷或栀子总环烯醚萜苷为负载的药物、具有溶酶体逃逸效果的纳米粒制剂；与普通纳米粒制剂相比，该溶酶体逃逸型纳米粒制剂能够显著提高药物在脑组织中的浓度。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：

一种治疗脑部疾病的鼻腔给药纳米粒制剂，负载的药物是栀子苷或栀子总环烯醚萜苷，载体包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物，乳化剂是聚乙烯醇和选自氢化蓖麻油或吐温-80中的一种，各原料的重量份为：

栀子苷或栀子总环烯醚萜苷10～250mg重量份，吐温-80或氢化蓖麻油1～30mg重量份，聚乳酸-羟基乙酸共聚物50～300mg重量份，聚乙烯醇200～500mg重量份；

所述纳米粒制剂通过下述方法制备：

栀子苷或栀子总环烯醚萜苷以及选自氢化蓖麻油或吐温-80中的一种溶于水中作为内水相，聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于有机溶剂作为有机相，聚乙烯醇溶于水中作为外水相；将内水相和有机相混合，在冰浴中超声制成初乳；将初乳立即注入到外水相中，在冰浴中超声制成复乳；将复乳注入到含有聚乙烯醇的水溶液中，继续搅拌使有机溶剂完全挥发，低温离心，收集沉淀，加入冻干保护剂甘露醇，冷冻干燥，即得。

本发明优选栀子苷含量不少于25％的栀子总环烯醚萜苷。所述栀子总环烯醚萜苷可以通过如下方法制备：

取栀子粗粉，加6～8倍水煎煮3次，每次30～90分钟，滤过，合并煎煮液，浓缩至每1ml相当1g药材的稠膏状，加入乙醇至含醇量40～70％，放置24小时，取上清液，回收乙醇，再浓缩至每1ml相当2g药材的稠膏，加入乙醇至含醇量70～80％，放置24小时，滤过，滤液浓缩至60℃相对密度为1.05～1.10的清膏，喷雾干燥，即得。

构成内水相时，所述乳化剂优选的是氢化蓖麻油，浓度为5～15g/L。

所述有机相中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度优选为20～30g/L。

所述外水相中，聚乙烯醇的浓度优选为10～15g/L。

构成有机相的所述有机溶剂优选的是二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合溶剂，更优选的是二氯甲烷。

超声制备初乳和复乳时，优选的超声条件是：超声功率200～400W，超声时间2～4分钟。

上述方法制备的纳米粒的表面电位在各个不同pH条件下始终为负，其进入内体-溶酶体之后即便是在酸性环境中，也无法发生表面电荷的改变并以电荷吸引的方式发生内体-溶酶体的逃脱进入胞浆。壳聚糖能够与鼻腔嗅粘膜上选择性高表达的糖基受体N-乙酸氨基葡萄糖或L-岩藻糖特异结合，通过结合的特异性受体把生物信号传达给细胞进行胞吞或胞饮。

因此，本发明还提供一种壳聚糖修饰的纳米粒制剂，所述载体还包括壳聚糖，在各原料中壳聚糖占100～200mg重量份；在制备上述纳米粒制剂时，壳聚糖和聚乙烯醇溶解于水作为外水相。

本发明优选的一种壳聚糖修饰的纳米粒制剂，负载的药物是栀子苷，载体是聚乳酸-羟基乙酸共聚物和壳聚糖，乳化剂是聚乙烯醇、氢化蓖麻油，各原料的重量配比为：

栀子苷或栀子总环烯醚萜苷10～250mg，氢化蓖麻油1～30mg，聚乳酸-羟基乙酸共聚物50～300mg，聚乙烯醇200～500mg，壳聚糖100～200mg；

所述纳米粒制剂通过下述方法制备：

(1)栀子苷和氢化蓖麻油溶于水中作为内水相，其中栀子苷的浓度为30g/L，乳化剂的浓度为10g/L；

(2)聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷作为有机相，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为20g/L；

(3)聚乙烯醇和壳聚糖溶于水中作为外水相，其中聚乙烯醇的浓度为10g/L，壳聚糖的浓度为4g/L；

(4)将所述内水相和有机相按照体积比为内水相∶有机相＝1∶5～10混合，在冰浴中200～400W超声2～4分钟制成初乳；

(5)将所述初乳立即注入到外水相中，所述外水相与有机相的体积比为外水相∶有机相＝5～10∶1；在冰浴中200～400W超声2～4分钟制成复乳；

(6)将所述复乳注入到0.5％g/L的聚乙烯醇水溶液中，继续搅拌4小时，使二氯甲烷完全挥发，4℃下10000r·min^-1离心10min，蒸馏水洗涤三次，收集沉淀；

(7)加入所述沉淀重量8％的甘露醇作为冻干保护剂，冷冻干燥，即得。

上述优选的壳聚糖修饰的纳米粒平均粒径为(204.32±2.36)nm，Zeta电位为(5.13±0.72)mV，包封率和载药量分别为(75.68±1.15)％和(9.87±0.27)％；其在蒸馏水、pH值为5.0～9.2的缓冲液中24h内稳定，冻干纳米粒在4℃放置6个月稳定性良好。

本发明所述纳米粒制剂优选装入鼻用吸入装置制成喷雾剂应用。

本发明所述纳米粒制剂用于治疗的脑部疾病是指脑出血及其后遗症、脑栓塞及其后遗症、血管性痴呆和疱疹病毒病毒性脑炎。

下面通过实验例对本发明作具体说明。

本发明采用复乳-溶剂挥发法制备所述纳米粒，以包封率、粒径为评价指标，考察了各工艺因素对制剂质量的影响，利用中心优化设计对处方进行优化。

实验例1壳聚糖修饰的纳米粒的制备工艺研究

1.1壳聚糖修饰的纳米粒制备工艺设计

采用复乳-溶剂挥发法，以栀子苷水溶液为内水相，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷作为有机相，两相混合，在冰浴中超声形成初乳；将初乳立即注入到含有壳聚糖(CS)的一定浓度聚乙烯醇(PVA)水溶液中，在冰浴中超声制成复乳；将复乳在磁力搅拌(10000r·min^-1)下注入到大量0.5％PVA(w/v)水溶液中，继续搅拌4h使二氯甲烷完全挥发，离心(10000r·min^-1，10min，4℃)，蒸馏水洗涤三次，收集沉淀，冷冻干燥即得所述壳聚糖修饰的纳米粒(CS-PLGA-NPs)。同法制得不含壳聚糖(CS)的纳米粒(PLGA-NPs)。

1.2测定方法的建立

收集并合并纳米粒制备离心后的上清液和两次水洗涤液于100mL棕色瓶中，加水至刻度，摇匀。精确吸取2mL，加甲醇稀释至10mL，按色谱条件测定上清液中的栀子苷含量，按以下公式计算纳米粒的包封率(EE)。

EE(％)＝(投药量-游离药量)/投药量×100％

精密称取冻干纳米粒10mg，加入1mL二甲基亚砜，超声使纳米粒完全溶解，离心(10000r·min^-1，15min)，按色谱条件测定上清液中栀子苷含量，按以下公式计算纳米粒的载药量(LE)。

LE(％)＝称取的纳米粒内包封的药物量/称取的纳米粒总质量×100％

色谱条件：TSK-GEL，ODS-100S(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：乙腈-水(15∶85)；流速：1.0mL·min^-1；检测波长：238nm；柱温：25℃；进样量20μL。

1.2.2液相色谱系统的可行性验证

按“1.1”方法分别制备空白纳米粒和载药纳米粒，分别溶解于二甲基亚砜，按色谱条件测定，色谱图见图1。空白纳米粒中无干扰栀子苷测定的物质，表明该色谱系统适用于栀子苷包封率的测定。

1.2.3方法回收率

精确称取空白纳米粒若干份，每份10mg，依次加入0.1mL栀子苷标准溶液配成高、中、低三个浓度的样品，按色谱条件测定上清液中的栀子苷含量。测量值与真实值之比即为回收率，结果见表1。回收率符合方法学的要求。

表1回收率实验结果(n＝3)

1.3中心优化设计

1.3.1单因素实验

1.3.1.1初乳制备中乳化剂的影响

固定内水相为0.5mL栀子苷水溶液(质量浓度为30g/L)；有机相为5mLPLGA的二氯甲烷溶液(质量浓度为20g/L)；外水相为25mL含PVA的水溶液(质量浓度为10g/L)；初乳超声200W×2min；复乳超声200W×2min。分别向内水相中加入乳化剂吐温-80(Tween-80)，PEG-400，氢化蓖麻油，泊洛沙姆-188；有机相中加入乳化剂Span-80，考察加入乳化剂的种类和浓度对纳米粒包封率的影响，结果见表2。

表2初乳制备中乳化剂对包封率和粒径的影响(n＝3)

实验发现不加入乳化剂无法形成稳定的初乳，纳米粒不能有效地包裹药物，导致包封率极低；有机相中加入乳化剂Span-80可形成淡黄色的初乳，但放置1～2min后很快分层；内水相中加入乳化剂氢化蓖麻油或吐温-80后纳米粒的包封率明显提高，中等浓度可形成稳定的白色初乳，因此制备初乳时，内水相需加入氢化蓖麻油或吐温-80为乳化剂，表2结果显示氢化蓖麻油的效果更好。接着考察了不同浓度氢化蓖麻油对纳米粒的包封率和粒径的影响，结果见表3。

表3不同浓度氢化蓖麻油对纳米粒的包封率和粒径的影响(n＝3)

从表3可知，氢化蓖麻油的浓度在5～15g/L时，对纳米粒的包封率和粒径的影响无显著影响。

1.3.1.2内水相与有机相体积比的影响

固定内水相为0.5mL栀子苷的氢化蓖麻油(10g/L)溶液(质量浓度为30g/L)；有机相为PLGA的二氯甲烷溶液(质量为20g/L)；外水相为PVA水溶液(质量浓度为5g/L)；有机相与外水相的体积比(O/We)为1∶5；初乳超声200W×2min；复乳超声200W×2min，考察内水相与有机相的体积比(Wi/O)对纳米粒包封率和粒径的影响，结果见表4，当固定栀子苷与PLGA的质量，即二者比例时，内水相与有机相的体积比对纳米粒的包封率无明显影响。

表4内水相与有机相的体积比(Wi/O)对纳米粒包封率和粒径的影响(n＝3)

1.3.1.3有机相与外水相体积比的影响

固定内水相为0.5mL栀子苷的氢化蓖麻油(10g/L)溶液(质量浓度为30g/L)；有机相为PLGA的二氯甲烷溶液(质量为20g/L)；外水相为PVA水溶液(质量浓度为5g/L)；初乳超声200W×2min；复乳超声200W×2min，考察有机相与外水相的体积比(O/We)对纳米粒包封率和粒径的影响，结果见表5。当形成的初乳与乳化剂PVA的量固定时，有机相与外水相的体积比对纳米粒的包封率无明显影响。

表5有机相与外水相的体积比(O/We)对纳米粒包封率和粒径的影响(n＝3)

1.3.1.4栀子苷质量浓度的影响

固定内水相为0.5mL栀子苷的氢化蓖麻油(10g/L)溶液(质量浓度为30g/L)；有机相为PLGA的二氯甲烷溶液(质量为20g/L)；外水相为PVA水溶液(质量浓度为5g/L)；初乳超声200W×2min；复乳超声200W×2min，考察栀子苷的质量浓度对纳米粒包封率和粒径的影响，结果见表6。随着内水相药物浓度的增加，包封率有所提高，但栀子苷的质量浓度对纳米粒的包封率无显著影响。

表6栀子苷的质量浓度对纳米粒包封率和粒径的影响(n＝3)

1.3.1.5PLGA质量浓度的影响

固定内水相为0.5mL栀子苷的氢化蓖麻油(10g/L)溶液(质量浓度为30g/L)；有机相为PLGA的二氯甲烷溶液；外水相为PVA水溶液(质量浓度为5g/L)；初乳超声200W×2min；复乳超声200W×2min，考察载体材料PLGA浓度对纳米粒包封率和粒径的影响，结果见表7。随着载体材料PLGA浓度的增加，包封率逐渐提高，表明PLGA浓度的质量浓度对纳米粒的包封率有显著影响。

表7PLGA浓度对纳米粒包封率和粒径的影响(n＝3)

1.3.1.6PVA质量浓度的影响

固定内水相为0.5mL栀子苷的氢化蓖麻油(10g/L)溶液(质量浓度为30g/L)；有机相为PLGA的二氯甲烷溶液(质量为20g/L)；外水相为PVA水溶液(质量浓度为5g/L)；初乳超声200W×2min；复乳超声200W×2min，考察乳化剂PVA质量浓度对纳米粒包封率和粒径的影响，结果见表8。

表8PVA质量浓度对纳米粒包封率和粒径的影响(n＝3)

PVA为常用的O/W型乳化剂，它能够在复乳形成过程中吸附在乳滴的表面，增加空间排斥，从而起到分散乳滴、防止乳滴合并的作用。外水相中PVA的浓度决定了其乳化能力的高低。PVA的浓度较高时，乳化能力较强，可以在乳滴表面形成牢固的界面膜，阻碍药物的扩散和流失，包封率相应提高。从表8可知PVA的质量浓度对纳米粒的包封率有明显影响。

1.3.1.7壳聚糖质量浓度的影响

固定内水相为0.5mL栀子苷的氢化蓖麻油(10g/L)溶液(质量浓度为30g/L)；有机相为PLGA的二氯甲烷溶液(质量为20g/L)；外水相为PVA水溶液(质量浓度为5g/L)；初乳超声200W×2min；复乳超声200W×2min，考察壳聚糖(CS)质量浓度对纳米粒包封率和粒径的影响，结果见表9。随着壳聚糖(CS)浓度的增加，包封率逐渐提高，表明壳聚糖(CS)的质量浓度对纳米粒的包封率有显著影响。

表9CS质量浓度对纳米粒包封率和粒径的影响(n＝3)

1.3.1.8超声功率与超声时间的影响

固定内水相为0.5ml栀子苷的氢化蓖麻油(10g/L)溶液(质量浓度为30g/L)；有机相为PLGA的二氯甲烷溶液(质量为20g/L)；外水相为PVA水溶液(质量浓度为5g/L)；考察超声功率与超声时间对纳米粒包封率和粒径的影响，结果见表10。

表10超声功率与超声时间对纳米粒包封率和粒径的影响(n＝3)

超声过程是通过外加能量使体系中的粒子再分散，超声功率过小或超声时间过短都不能使体系分散到粒径足够小且均匀，且超声功率过大或超声时间过长则会使新生成的粒子再次被破坏，导致包封率降低，综合考虑选择中等强度(200～400W)、短时间(2～4min)超声。

1.3.1.9冷冻干燥工艺考察

1.3.1.9.1添加剂种类及浓度的影响

为保证冻干粉末中固形物能保持原体积，不塌陷，不皱缩，再分散性良好，在冷冻干燥过程中，常常加入一些低分子的糖类，目的是保护纳米粒胶体溶液在冷冻过程中不被破坏，称之为冻干保护剂。以冻干针剂的外观、色泽和再分散性为指标，分别考察了葡萄糖、乳糖和甘露醇为支架剂的用量和比例。

实验设计方案见表11。按表中设计分别称取冻干保护剂，加入到CS-PLGA-NPs胶体溶液中，使其完全溶解，按常规方法置超低温(-80℃)冷柜中预冻，然后在冷冻干燥机中按程序冻干，得到各处方冻干品，结果表11。

表11冻干保护剂对冻干纳米粒制剂的影响

实验结果表明，以葡萄糖、乳糖为冻干保护剂的冻干品，再分散性不理想，而且增大了胶体溶液的粘度，以甘露醇为冻干保护剂的冻干品，分散性优于前两种，以8％的甘露醇为冻干保护剂的冻干品外观、颜色、分散性均比较理想，因此，选定8％的甘露醇为CS-PLGA-NPs的冻干保护剂。

1.3.1.9.2冻干制备工艺

根据冷冻干燥的基本原理和实验结果，最后确定冷冻干燥工艺为：取制备的CS-PLGA-NPs胶体溶液样品，加入8％的甘露醇，搅拌使其溶解，分装入西林瓶中，每瓶2mL，置于-80℃超低温冷柜中预冻8h，然后迅速移入冷冻干燥机中，在负压下维持真空度不再增加，关闭制冷开关，程序升温至25℃，程序维持24h，取出后立即压盖密封，即得CS-PLGA-NPs冻干品，见图2。

按照上述工艺分别制备三批CS-PLGA-NPs冻干粉。肉眼观察纳米粒冻干粉外观均匀，呈疏松状物，表面光洁细腻，具有足够的强度，振摇后能整块脱落。

1.3.2中心优化设计

根据优化的处方，在单因素考察实验的基础上，选取对栀子苷纳米粒制备工艺影响较显著的PLGA质量浓度(X₁)，CS质量浓度(X₂)，PVA质量浓度(X₃)三个因素进行中心优化设计。选择各因素的水平，以平均粒径(Y₁)，载药量(Y₂)，包封率(Y₃)为评价指标，并利用Hassan的方法，选择综合指标Y₄(OD)，来考察各个指标的综合效果，对各个指标进行归一化处理。以平均粒径，载药量，包封率，OD值为指标，对各因素用SAS统计软件进行二项式拟合，绘制各个指标与影响较显著的因素的三维效应面图，见图3。

1.3.2.1艺优化参数结果

工艺优化实验各因素设定水平及相应真实值见表12，实验结果见表13。

表12中心优化实验各因素设定水平及相应真实值

表13中心优化实验设计及结果

多元线性回归方程为：

Y₁＝223.757+4.486x₁+76.750x₂-22.452x₃(r＝0.531，P＝0.142)

Y₂＝9.871-0.166x₁+0.224x₂+0.121x₃(r＝0.670，P＝0.020)

Y₃＝18.917+1.276x₁+2.211x₂+1.203x₃(r＝0.661，P＝0.024)

Y₄＝0.189-0.001x₁-0.026x₂+0.051x₃(r＝0.382，P＝0.457)

二项式方程为：

Y₁＝3106.062-68.132x₁-372.736x₂-313.557x₃-0.176x₁x₂+0.199x₁x₃-4.926x₂x₃+1.783x₁ ²+62.785x₂ ²+15.341x₃ ²(r＝0.929，P＝0.003)

Y₂＝-6.957+0.515x₁+2.033x₂+1.646x₃+0.011x₁x₂+0.015x₁x₃-0.046x₂x₃-0.022x₁ ²0.196x₂ ²-0.082x₃ ²(r＝0.947，P＝0.001)

Y₃＝-124.334+8.417x₁+14.441x₂+12.771x₃+0.057x₁x₂+0.079x₁x₃-0.067x₂x₃-0.204x₁ ²-1.588x₂ ²-0.644x₃ ²(r＝0.956，P＝0.001)

Y₄＝-4.459+0.275x₁+0.377x₂+0.346x₃+0.004x₁x₂+0.003x₁x₃+0.014x₂x₃-0.008x₁ ²-0.077x₂ ²-0.020x₃ ²(r＝0.922，P＝0.004)

采用SPSS13.0统计软件，以粒径、载药量、包封率及OD值4个评价指标分别对各因素(自变量)进行多元线性回归和二项式方程拟合。从拟合方程的复相关系数r值和P值可见，4个指标均采用二项式方程拟合效果较好。3个因素对粒径、载药量和包封率均有影响。粒径、载药量、包封率及OD值的效应面图见图3～6。由图3～6可知，选择效应面图上平均粒径小，包封率，载药量，综合指标大的区域，求得制备工艺的最佳因素。各因素的最佳预测值见表14。

表14纳米粒最佳制备工艺

1.3.3最佳处方工艺的验证

根据自变量最优预测值，选取最佳工艺条件为载体材料PLGA质量浓度为20g/L，壳聚糖CS质量浓度为4g/L，乳化剂PVA质量浓度为10g/L，根据优化的处方，按照下述工艺条件制备三批样品，分别测定其平均粒径(Y₁)，载药量(Y₂)，包封率(Y₃)，OD值(Y₄)，结果见表15。

最佳工艺条件：内水相为30g/L的栀子苷的氢化蓖麻油(10g/L)溶液；有机相为20g/L的PLGA的二氯甲烷溶液；外水相为4g/L的CS的PVA水溶液(5g/L)的；三相的体积比为内水相∶有机相∶外水相＝0.1∶1∶5；将内水相和有机相按照体积比混合，在冰浴中超声(200W，2min)形成初乳；将初乳立即注入到外水相中，在冰浴中超声(200W，2min)制成复乳；将复乳在磁力搅拌(10000r·min^-1)下注入到大量0.5％g/LPVA水溶液中，继续搅拌4h使二氯甲烷完全挥发，离心(10000r·min^-1，10min，4℃)，蒸馏水洗涤三次，收集沉淀，加入8％甘露醇冷冻干燥即得壳聚糖修饰的栀子苷纳米粒(CS-PLGA-NPs)。

表15最佳处方工艺验证(X₁＝20，X₂＝4，X₃＝10)(n＝3)

^＊Bias(％)＝(预测值-测定值)/预测值×100％

由表15可知，各考察指标与预测值差异较小，验证了工艺条件的可行性，表明批间重现性良好。

实验例2实施例1最佳工艺条件制备的纳米粒评价

2.4.1形态观察

取“1.3.3”项下制备的纳米粒(CS-PLGA-NPs)以及同法制备的没有壳聚糖修饰的纳米粒(PLGA-NPs)，将其均匀分散在样品台上，喷金后用扫描电镜(SEM)放大15000倍观察干态纳米粒的球形及分散性，结果见图7。制备的栀子苷纳米粒表面光滑，形态圆整，分散性良好，粒径分布均匀，从而可以避免在药物释放过程中出现“突释”，使释药过程相对平稳。

2.4.2粒径测定

取“1.3.3”项下制备的纳米粒(CS-PLGA-NPs)以及同法制备的没有壳聚糖修饰的纳米粒(PLGA-NPs)适量，以双蒸水适当稀释后，用纳米粒度分析仪测定纳米粒的平均粒径及粒径分布，结果见图8。最优处方工艺制备的纳米粒平均粒径为CS-PLGA-NPs(204.32±2.36)nm，PLGA-NPs(150.15±0.35)nm，粒径分布较窄。

2.4.3Zeta电位测定

取“1.3.3”项下制备的纳米粒(CS-PLGA-NPs)以及同法制备的没有壳聚糖修饰的纳米粒(PLGA-NPs)适量，以双蒸水适当稀释后，用Zeta电位仪测定其Zeta电位，结果见图9和图10。最优处方工艺制备的CS-PLGA-NPs的Zeta电位为(5.13±0.72)mV，PLGA-NPs的Zeta电位为(-12.04±1.21)mV。在不同pH条件下，CS-PLGA-NPs的Zeta电位为正，而PLGA-NPs的Zeta电位始终为负。

2.4.4载药量和包封率的测定

取“1.3.3”项下制备的纳米粒(CS-PLGA-NPs)10mg，按照“1.2”项下记载的方法测定并计算载药量和包封率。CS-PLGA-NPs纳米粒的平均包封率为(75.68±1.15)％，载药量为(9.869±0.27)％，批间重现性良好。

2.4.5DSC表征

分别对栀子苷；PLGA；壳聚糖；栀子苷、PLGA与栀子苷的物理机械混合物(室温混合24h后的干燥产品)；最佳工艺条件下制备的空白PLGA纳米粒；最佳工艺条件下制备的PLGA纳米粒；最佳工艺条件下制备的壳聚糖修饰空白PLGA纳米粒；最佳工艺条件下制备的壳聚糖修饰PLGA纳米粒进行DSC测定，精密称量各样品重量后，测试温度：0～200℃·min^-1，升温速率10℃·min^-1。见图11，由图可知，载药纳米粒中无栀子苷的吸热特征峰，表明栀子苷不是简单的吸附在纳米粒表面，而是被有效的包裹于PLGA载体材料中；且壳聚糖修饰PLGA纳米粒表面出现壳聚糖的特征峰，证明壳聚糖结合在PLGA表面。

2.4.6红外表征

取“1.3.3”项下制备的纳米粒(CS-PLGA-NPs)以及同法制备的没有壳聚糖修饰的纳米粒(PLGA-NPs)适量，分别测定其红外光谱，结果见图12。通过比较壳聚糖修饰前后在特征区吸收峰的变化情况，PLGA-NPs位于1753.07cm^-1峰位的PLGA载体材料的-CO特征吸收峰较明显，而CS-PLGA-NPs位于1753.07cm^-1峰位的吸收峰明显减弱甚至消失。说明壳聚糖能够有效包覆于PLGA-NPs的表面，从而减弱了PLGA-NPs的特征吸收峰。

实施例3实施例1最佳工艺条件制备的纳米粒在体鼻黏膜吸收

3.1实验动物模型及实验装置

选择体重(300±20)g的雄性大鼠，乌拉坦(1.2g/kg)麻醉，然后将其固定在鼠板上进行手术：在颈部做一切口，气管内插入聚乙烯套管与大气相通；另一根管子通过食道插至鼻腔后部，将鼻颚的通道封闭，以防止药液从鼻腔流入嘴里；再取一根聚乙烯管同插入大鼠鼻腔后部的管子相连接，管子的另一端与药液接触。将盛有药液的容器置于37℃恒温水浴中，恒流泵使药液通过鼻腔循环，定时(0，10，20，30，40，60，90，120min)取样测定循环液中药物浓度，以确定药物吸收量和计算吸收速率常数。

将相同浓度栀子苷纳米粒与栀子苷溶液的经时吸收量作图，见图13。由图13可知，栀子苷纳米粒每个时间点的经时吸收量均大于相同浓度的栀子苷溶液，表明栀子苷纳米粒吸收更加完全。

3.2鼻黏膜毒性评价

将空白(生理盐水)组、栀子苷溶液组、PLGA-NPs和CS-PLGA-NPs组经大鼠鼻腔给药2h后，鼻腔解剖，组织切片(纵切)和HE染色后光镜观察鼻黏膜形态变化。结果见图14。

组织切片的制备：将鼻黏膜样本于10％甲醛溶液中脱钙48h，取出切成2～3mm的组织块，以冷的0.2mol/L二甲砷酸钠缓冲液(pH＝7.6)漂洗20min，继而于-20℃经60％→70％→80％→95％→100％乙醇脱水，每次20min。将组织块移置于盛有Hemapun 948甲液的模具底部，置-20℃浸泡过夜，取出包埋模具滴加Hemapun 948乙液2～3滴使成全包埋液，再放入-20℃冰箱中聚合48h直至硬的树脂块形成。包埋块经修饰后用切片机切成5μm厚的切片，蒸馏水展开，贴片。滴加碘化丙啶染色10min，PBS漂洗2次，每次3min，室温晾干。

由图14可知，空白组对照，鼻黏膜结构清楚，黏膜上纤毛整齐浓密，黏膜下腺体、血管清晰可见；栀子苷溶液组、PLGA-NPs和CS-PLGA-NPs组，给药侧(右)大鼠鼻黏膜均完整，结构清楚，细胞密度不变，黏膜上纤毛整齐浓密，黏膜下腺体、血管清晰可见，与未给药侧(左)及空白对照组无差别。可初步判定栀子苷溶液及其制剂无明显的鼻纤毛毒性。

实验例4纳米粒鼻腔给药脑内分布的研究

4.1实验动物模型及实验装置

选择体重为(300±20)g的雄性大鼠，随机分为三组，每组32只。乌拉坦(1.2g/kg)麻醉，将大鼠仰卧，作气管插管。手术完成后约15min分别鼻腔给予25μL PLGA-NPs和CS-PLGA-NPs的混悬液(将纳米粒分散于生理盐水中)；栀子苷溶液组，给药剂量均为2mg/kg。给药后分别于(5，10，15，30，60，120，240，360)min处死大鼠，断头，收集血样和分离脑组织，血浆(plasma)、脑组织(brain tissue)样品均于-20℃冷冻保存，48h内测定。每个时间点重复做4只大鼠。

取大鼠嗅球(OB)、嗅区(OT)、小脑(CL)和大脑(CR)等脑组织，精密称重，加两倍量生理盐水，捣碎使成匀浆。将血样于3500r·min^-1离心10min，取血浆0.5mL或脑匀浆(大脑为0.5g)，加乙腈1mL，漩涡混合1min，18000r·min^-1离心10min，吸取上清液，转移至另一离心管中，下层同法提取一次，合并上清液，50℃水浴通氮气吹干，残渣用200μL甲醇溶解，离心，取上层液20μLHPLC分析。

4.2鼻腔给药后血浆中药物浓度测定结果

CS-PLGA-NPs经大鼠鼻腔给药后，血中浓度逐渐升高，120min后血药浓度趋于平稳，见图15。而PLGA-NPs先于60min血中出现一个峰值，此后药物浓度略有下降。栀子苷溶液组则具有较高的血药浓度，给药30min即达峰值，随后浓度显著降低。三种剂型(PLGA-NPs、CS-PLGA-NPs和栀子苷溶液)给药后血浆中的AUC_0→360min分别为(9377±1128)、(8962±1330)和(17114±3327)ng·min/mL。

4.3鼻腔给药后脑组织中药物浓度测定结果

两种纳米粒经鼻给药后，在脑中均呈持续上升的趋势，于6h脑中浓度最高。栀子苷溶液在脑组织中浓度30min即达峰值，其后浓度显著降低。结果见表16、表17、表18及图16。其药代动力学参数中C_max和T_max由实测值计算，AUC采用线性梯形面积法求算。

表16PLGA-NPs纳米粒鼻腔药后脑组织中药物平均浓度(n＝4)

表17CS-PLGA-NPs纳米粒鼻腔药后脑组织中药物平均浓度(n＝4)

表18栀子苷溶液鼻腔药后脑组织中药物平均浓度(n＝4)

4.4脑靶向性的评价结果

4.4.1两种纳米粒的脑靶向性评价结果

为了评价两种纳米粒鼻腔给药后的脑内靶向性，进一步计算了纳米粒的AUC_brain/AUC_plasma，结果如表19所示。CS-PLGA-NPs鼻腔给药后，各脑组织与血浆AUC的比值明显高于PLGA-NPs，其中CS-PLGA-NPs在各脑组织AUC_0→360min为PLGA-NPs的1.19～1.49倍。可见CS修饰的PLGA-NPs纳米粒脑靶向性有所改善。

表19CS-PLGA-NPs和PLGA-NPs鼻腔给药后脑组织平均浓度(n＝4)

^a：F＝AUC_CS-PLGA-NPs/AUC_PLGA-NPs

^＊与PLGA-NPs相比，p＜0.01

4.4.2纳米粒组与溶液组的脑靶向性评价结果

为了证实纳米粒组具有良好的生物黏附性以及鼻→脑直接转运途径的存在，统一拟用AUC_brain/AUC_plasma来进行脑靶向性的比较。结果PLGA-NPs、CS-PLGA-NPs和栀子苷溶液组经鼻腔给药后各脑组织与血浆AUC_0→360min的比值(AUC_brain/AUC_plasma)如图17所示。

由图17可知，各脑组织的AUC_0→360min值呈现明显的组织分布差异，将各剂型在各脑组织中直接转运百分率的大小排序，结果如下：

CS-PLGA-NPs：嗅球(OB)＞嗅区(OT)＞小脑(CL)＞大脑(CR)；

PLGA-NPs：嗅球(OB)＞嗅区(OT)＞小脑(CL)＞大脑(CR)；

栀子苷溶液：嗅球(OB)＞小脑(CL)＞大脑(CR)＞嗅区(OT)；

AUC_brain/AUC_plasma：CS-PLGA-NPs＞PLGA-NPs＞栀子苷溶液。

同时，根据AUC_0→360min比值的大小，可以大致将各剂型进行排序：

嗅球(OB)：CS-PLGA-NPs＞PLGA-NPs＞栀子苷溶液；

嗅区(OT)：CS-PLGA-NPs＞PLGA-NPs＞栀子苷溶液；

大脑(CR)：CS-PLGA-NPs＞PLGA-NPs＞栀子苷溶液；

小脑(CL)：CS-PLGA-NPs＞PLGA-NPs＞栀子苷溶液。

实验表明，本发明所述栀子苷纳米粒和壳聚糖修饰的栀子苷纳米粒与溶液剂相比，经鼻腔给药后，都能够提高栀子苷在脑组织中的分布浓度；壳聚糖修饰的栀子苷纳米粒能促进药物经鼻腔直接转运入脑，其脑靶向性高于非壳聚糖修饰的栀子苷纳米粒。

实验例5栀子苷鼻腔给药对局造性脑缺血大鼠的治疗作用

5.1实验方法

采用线栓法制备脑缺血模型，分别灌胃(ig)、静脉注射(iv)、肌肉注射(im)、鼻腔给药(ns)给予(25mg/mL)栀子苷溶液，选用脑含水量及脑梗死面积、SOD、MDA、NOS为评价指标，比较其药效。

5.1.1分组及给药

动物随机分为6组，即假手术组、模型组、栀子苷ig、iv、im、ns组、每组大鼠给三次药，分别是手术前给药一次、术后4小时给第二次、12小时给第三次，24小时后处死大鼠，取脑。

5.2动物模型的制备

5.2.1栓子制备

4-0号直径0.25mm尼龙线，用手术刀片切制成等长(40mm)的线段，此切制方法能使断端平整无毛刺，酒精浸泡消毒，生理盐水冲洗。将头端3mm涂黑，并在距离前端18mm处作标记。然后用手术镊夹持线段一端，将线段头端3mm埋于硅胶中(也可将其靠近热源烫钝呈鼓锤状)。在硅胶凝固前使线段头端3mm表面均匀包裹一薄层硅胶，头端要圆钝，避免形成锐尖或弯钩。晾干后线栓头端用游标卡尺筛选，取头端直径为0.26-0.30mm的线栓，使用前肝素浸润。

5.2.2模型的建立

根据改良longa制备：用10％水合氯醛(35mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，腹面向上，剪除颈部毛发并用碘酊及酒精消毒。取颈正中切口，钝性分离右侧胸锁乳突肌与胸骨舌肌之间的肌间隙，暴露颈总动脉(CCA)和迷走神经，眼科弯镊挑出CCA，结扎CCA的近心端。向上分离右侧颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，继续沿ICA向上分离翼腭动脉(PPA)(ICA的第一个分支)，分离后不结扎。在近CCA分叉处结扎ECA，用小动脉夹夹住CCA的远心端，在此处放一打好结的丝线，暂时不收紧丝线。在丝线下端用眼科剪剪一小口，将制备好的线栓经该切口顺CCA插入。收紧丝线以防止其中的栓线滑出和出血，松开动脉夹.沿CCA经ICA将栓线缓慢送至颅内，遇阻力而止，稍微回撤。以分叉处为标记，栓线插入长度约为19.0±0.1mm此时栓线头正好位于大脑中动脉(MCA)的起始部位，阻断了MCA的血流。缝合切口。假手术组只分离CCA、ICA、PPA而不插线结扎。各组动物在手术中均以白炽灯加热保温，室温控制在25-28℃。在分离动脉过程中要保护沿着颈外动脉、颈总动脉走行的迷走神经，避免刺激气管。否则会使大鼠呼吸道分泌物增多，严重时窒息死亡。

5.3标本采集

5.3.1神经功能缺陷评分

采用longa的评分方法，缺血24h后评分。评分标准：0分：无神经损伤症状；1分：不能伸展对侧前肢；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾斜；4分：不能自发行走.意识丧失。0与4分的动物弃之不用。

5.3.2血清的采集

大鼠10％水合氯醛麻醉后，心脏取血，将血放于100×12mm塑料试管中，直立放置于4℃冰箱内2小时，待血液完全凝固后，3000rpm离心15min，分离血清，将血清分成两份转移到0.5mL有盖EP管中，-20℃冰箱保存待测。

5.4脑梗死面积的测定

缺血24h后，立即断头处死大鼠，剪开颅骨取出大脑用4E的生理盐水冲洗后，置于-20℃低温冰箱中快速冷冻15分钟后。由前向后每隔2mm切取组织片若干片，置于2％的TTC生理盐水溶液中保持37℃孵育约30分钟，TTC被线粒体内过氧化氢酶还原，可见脑片中皮质梗死区不染色而呈现白色，所有未受损脑组织呈红色。先用photoshop软件处理图片，再用Osiris 4软件算面积。另取部分大鼠脑组织置于冰盘上，沿大脑中动脉梗死区中心冠状切4mm厚的切片，放于10％福尔马林中固定，备用做病理切片。

5.5脑组织含水量的测定

快速剥出大鼠脑组织。分别称重，然后置于90-100℃烘箱内烘干至恒重(5天后两次检查无变化)。分别称量大脑组织干重。按下式计算大脑半球的含水量。

含水量(％)＝(湿重-干重)/湿重×100％。

5.6试剂盒的测定

根据试剂盒说明书进行SOD、NOS及MDA试剂盒的操作，并用722可见分光光度计进行检测。

5.7统计学处理

运用spss16.0 for windows软件进行数据统计分析，实验结果以

表示，采用oneWay-ANOVA、Independent Samples Test进行组间比较。

5.8实验结果

5.8.1神经学评分

造模缺血24h后采用Longa的评分方法评分，结果显示假手术对照组：0分；造模缺血组：2-3分；造模组与假手术组及正常组比较有极明显的差异(p＜0.01)。种给药组与模型组比较无明显差异。说明造模成功。

5.8.2药效指标考察

栀子苷可降低大鼠脑缺血/再灌注后神经病学评分及梗塞范围，降低脑组织MDA，NOS含量及升高SOD活性。缺血时NOS诱导大量的NO迅速产生，此NO具有神经毒作用，能引起细胞和缺血后神经元迟发性损伤的重要因素。结果见表20。

表20不同给药途径的药学指标比较(n＝10，

)

注：^＊p＜0.05与模型组比较具有显著性差异，^＊＊p＜0.01与模型组比较具有极显著性差异；

^△p＜0.05与假手术组比较具有显著性差异，^△△p＜0.01与假手术组比较具有极显著性差异。

实验结果表明，栀子苷对局造性脑缺血大鼠的有显著的治疗作用，能够减少脑梗死面积，降低脑含水量，降低脑组织中SOD、NOS、MDA的含量，其中静脉注射给药组的疗效最好，鼻腔给药组次之。但鼻腔给药作为非侵入性的给药方式适应临床上需长期给药的患者。

附图说明

图1是空白纳米粒和载药纳米粒的液相色谱图，A是空白纳米粒的液相色谱图，B是载药纳米粒的液相色谱图，1是栀子苷峰。

图2是CS-PLGA-NPs冷冻干燥曲线。

图3是纳米粒平均粒径(Y₁)与CS质量浓度(X₁)，PLGA质量浓度(X₂)，PVA质量浓度(X₃)三个因素的效应面图。

图4是载药量(Y₂)与CS质量浓度(X₁)，PLGA质量浓度(X₂)，PVA质量浓度(X₃)三个因素的效应面图。

图5是包封率(Y₃)与CS质量浓度(X₁)，PLGA质量浓度(X₂)，PVA质量浓度(X₃)三个因素的效应面图。

图6是OD值(Y₄)与CS质量浓度(X₁)，PLGA质量浓度(X₂)，PVA质量浓度(X₃)三个因素的效应面图。

图7是最佳工艺条件下制备的CS-PLGA-NPs和PLGA-NPs的扫描电镜图(SEM，×15000)，其中A是CS-PLGA-NPs的SEM图，B是PLGA-NPs的SEM图。

图8是最佳工艺条件下制备的CS-PLGA-NPs和PLGA-NPs的粒径分布图，其中A是CS-PLGA-NPs的粒径分布图，B是PLGA-NPs的粒径分布图。

图9是最佳工艺条件下制备的CS-PLGA-NPs和PLGA-NPs的Zeta电位分布图，其中A是CS-PLGA-NPs的Zeta电位分布图，B是PLGA-NPs的Zeta电位分布图。

图10是最佳工艺条件下制备的CS-PLGA-NPs和PLGA-NPs的Zeta电位在不同pH时的变化曲线，其中1是CS-PLGA-NPs的Zeta电位变化曲线，2是PLGA-NPs的Zeta电位变化曲线。

图11是各种样品的DSC曲线，其中1代表栀子苷，2代表PLGA，3代表最佳工艺条件下制备的空白PLGA纳米粒，4代表最佳工艺条件下制备的PLGA纳米粒，5代表栀子苷、PLGA与栀子苷的物理机械混合物，6代表最佳工艺条件下制备的壳聚糖修饰空白PLGA纳米粒，7代表最佳工艺条件下制备的壳聚糖修饰PLGA纳米粒，8代表壳聚糖。

图12是最佳工艺条件下制备的CS-PLGA-NPs和PLGA-NPs的红外光谱图，其中A是CS-PLGA-NPs的红外光谱图，B是PLGA-NPs的红外光谱图。

图13是栀子苷纳米粒(CS-PLGA-NPs)与栀子苷溶液的经鼻黏膜的经时吸收曲线，其中1表示250μg/ml CS-PLGA-NPs，2表示160μg/ml CS-PLGA-NPs，3表示80μg/mlCS-PLGA-NPs，4表示40μg/ml CS-PLGA-NPs；1′表示250μg/ml栀子苷溶液，2′表示160μg/ml栀子苷溶液，3′表示80μg/ml栀子苷溶液，4′表示40μg/ml栀子苷溶液。

图14是鼻黏膜组织切片图，其中A是空白组，B是栀子苷溶液组，C是PLGA-NPs纳米粒组，D是CS-PLGA-NPs纳米粒组。

图15是最佳工艺条件下制备的CS-PLGA-NPs和PLGA-NPs鼻腔给药后血浆的浓度变化曲线，其中1表示PLGA-NPs纳米粒组，2表示CS-PLGA-NPs纳米粒组，3表示栀子苷溶液组。

图16是最佳工艺条件下制备的CS-PLGA-NPs和PLGA-NPs鼻腔给药后脑组织中的浓度变化曲线，其中A是嗅球中的浓度变化曲线，B是嗅区中的浓度变化曲线，C是大脑中的浓度变化曲线，D是小脑中的浓度变化曲线；各图中1表示PLGA-NPs纳米粒组，2表示CS-PLGA-NPs纳米粒组，3表示栀子苷溶液组。：

图17是最佳工艺条件下制备的CS-PLGA-NPs、PLGA-NPs和栀子苷溶液组经鼻腔给药后各脑组织与血浆AUC_0→360min的比值(AUC_brain/AUC_plasma)，其中1表示PLGA-NPs纳米粒组，2表示CS-PLGA-NPs纳米粒组，3表示栀子苷溶液组。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但下述实施例不能理解为对本发明的限制。

实施例1壳聚糖修饰的栀子苷纳米粒的制备

(1)栀子苷和氢化蓖麻油溶于水中作为内水相，其中栀子苷的浓度为30g/L，氢化蓖麻油的浓度为10g/L；

(2)聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷作为有机相，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为20g/L；

(3)聚乙烯醇和壳聚糖溶于水中作为外水相，其中聚乙烯醇的浓度为10g/L，壳聚糖的浓度为4g/L；

(4)将0.5ml所述内水相和5ml有机相混合，在冰浴中400W超声4分钟制成初乳；

(5)将所述初乳立即注入到25ml外水相中，在冰浴中200W超声2分钟制成复乳；

(6)将所述复乳注入到大量0.5％g/L聚乙烯醇水溶液中，继续搅拌4小时，使二氯甲烷完全挥发，4℃下10000r·min^-1离心10min，蒸馏水洗涤三次，收集沉淀；

(7)加入所述沉淀重量8％的甘露醇作为冻干保护剂，冷冻干燥，即得。

实施例2栀子苷纳米粒的制备

(1)栀子苷和氢化蓖麻油溶于水中作为内水相，其中栀子苷的浓度为30g/L，氢化蓖麻油的浓度为10g/L；

(2)聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷作为有机相，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为20g/L；

(3)聚乙烯醇溶于水中作为外水相，其中聚乙烯醇的浓度为10g/L；

(4)将0.5ml所述内水相和5ml有机相混合，在冰浴中200W超声4分钟制成初乳；

(5)将所述初乳立即注入到25ml外水相中，在冰浴中400W超声2分钟制成复乳；

(6)将所述复乳注入到大量0.5％g/L聚乙烯醇水溶液中，继续搅拌4小时，使二氯甲烷完全挥发，4℃下10000r·min^-1离心10min，蒸馏水洗涤三次，收集沉淀；

(7)加入所述沉淀重量8％的甘露醇作为冻干保护剂，冷冻干燥，即得。实施例3栀子总环烯醚萜苷的制备

取栀子粗粉1kg，加6倍水煎煮3次，每次30分钟，滤过，合并煎煮液，浓缩至稠膏状1000ml(每1ml相当药材1g)，加入95％乙醇730ml至含醇量40％，放置24小时，取上清液，回收乙醇，浓缩至无醇味的稠膏500ml(每1ml相当药材2g)，加入95％乙醇2700ml至含醇量80％，放置24小时，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10(60℃)，干燥，得到干膏130g，经紫外分光光度法测定栀子苷总环烯醚萜苷的含量为55％，高效液相测定栀子苷含量为27.2％。

实施例4壳聚糖修饰的栀子总环烯醚萜苷纳米粒的制备

(1)栀子总环烯醚萜苷和氢化蓖麻油溶于水中作为内水相，其中栀子苷的浓度为40g/L，氢化蓖麻油的浓度为15g/L；

(2)聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷作为有机相，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为20g/L；

(3)聚乙烯醇和壳聚糖溶于水中作为外水相，其中聚乙烯醇的浓度为10g/L，壳聚糖的浓度为4g/L；

(4)将0.5ml所述内水相和5ml有机相混合，在冰浴中200W超声2分钟制成初乳；

(5)将所述初乳立即注入到25ml外水相中，在冰浴中200W超声2分钟制成复乳；

(6)将所述复乳注入到大量0.5％g/L聚乙烯醇水溶液中，继续搅拌4小时，使二氯甲烷完全挥发，4℃下10000r·min^-1离心10min，蒸馏水洗涤三次，收集沉淀；

(7)加入所述沉淀重量8％的甘露醇作为冻干保护剂，冷冻干燥，即得。

Claims (10)

1.一种治疗脑部疾病的纳米粒制剂，其特征在于：负载的药物是栀子苷或栀子总环烯醚萜苷，载体包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物，乳化剂是聚乙烯醇和选自氢化蓖麻油或吐温-80中的一种，各原料的重量份为：

栀子苷或栀子总环烯醚萜苷10～250mg重量份，吐温-80或氢化蓖麻油1～30mg重量份，聚乳酸-羟基乙酸共聚物50～300mg重量份，聚乙烯醇200～500mg重量份；

所述纳米粒制剂通过下述方法制备：

栀子苷或栀子总环烯醚萜苷以及选自氢化蓖麻油或吐温-80中的一种溶于水中作为内水相，聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于有机溶剂作为有机相，聚乙烯醇溶于水中作为外水相；将内水相和有机相混合，在冰浴中超声制成初乳；将初乳立即注入到外水相中，在冰浴中超声制成复乳；将复乳注入到含有聚乙烯醇的水溶液中，继续搅拌使有机溶剂完全挥发，低温离心，收集沉淀，加入冻干保护剂甘露醇，冷冻干燥，即得。

2.根据权利要求1所述的纳米粒制剂，其特征在于：栀子总环烯醚萜苷中栀子苷的含量不少于25％。

3.根据权利要求1所述的纳米粒制剂，其特征在于：构成内水相时，所述乳化剂为氢化蓖麻油，浓度为5～15g/L。

4.根据权利要求1所述的纳米粒制剂，其特征在于：所述有机相中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为20～30g/L。

5.根据权利要求1所述的纳米粒制剂，其特征在于：所述外水相中聚乙烯醇的浓度为10～15g/L。

6.根据权利要求1所述的纳米粒制剂，其特征在于：所述有机溶剂是二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合溶剂。

7.根据权利要求1所述的纳米粒制剂，其特征在于：超声制备初乳和复乳时，超声功率为200～400W，超声时间为2～4分钟。

8.根据权利要求1至7任一权利要求所述的纳米粒制剂，其特征在于：所述载体还包括壳聚糖，在各原料中壳聚糖占100～200mg重量份；在制备所述纳米粒制剂时，壳聚糖和聚乙烯醇溶解于水作为外水相。

9.根据权利要求8所述的纳米粒制剂，其特征在于：负载的药物是栀子苷，载体是聚乳酸-羟基乙酸共聚物和壳聚糖，乳化剂是聚乙烯醇、氢化蓖麻油，各原料的重量份为：

栀子苷10～250mg重量份，氢化蓖麻油1～30mg重量份，聚乳酸-羟基乙酸共聚物50～300mg重量份，聚乙烯醇200～500mg重量份；壳聚糖100～200mg重量份；

所述纳米粒制剂通过下述方法制备：

(1)栀子苷和氢化蓖麻油溶于水中作为内水相，其中栀子苷的浓度为30g/L，氢化蓖麻油的浓度为10g/L；

(2)聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷作为有机相，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为20g/L；

(3)聚乙烯醇和壳聚糖溶于水中作为外水相，其中聚乙烯醇的浓度为10g/L，壳聚糖的浓度为4g/L；

(4)将所述内水相和有机相按照体积比为内水相∶有机相＝1∶5～10混合，在冰浴中200～400W超声2～4分钟制成初乳；

(5)将所述初乳立即注入到外水相中，所述外水相与有机相的体积比为外水相∶有机相＝5～10∶1；在冰浴中200～400W超声2～4分钟制成复乳；

(6)将所述复乳注入到0.5％g/L聚乙烯醇水溶液中，继续搅拌4小时，使二氯甲烷完全挥发，4℃下10000r·min^-1离心10min，蒸馏水洗涤三次，收集沉淀；

(7)加入所述沉淀重量8％的甘露醇作为冻干保护剂，冷冻干燥，即得。

10.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7或9所述的纳米粒制剂，其特征在于：所述纳米粒制剂装入鼻用吸入装置制成喷雾剂。

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