CN105213432A - 草分枝杆菌口服纳米粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域，具体涉及草分枝杆菌口服纳米粒及其制备方法。本发明所解决的技术问题是提供一种草分枝杆菌口服纳米粒，本发明纳米粒采用包裹技术将草分枝杆菌包裹在载体材料内部，口服给药后可以避免胃肠道消化酶对草分枝杆菌的降解，在药物到达肠道后，通过肠道淋巴结的吸收，进一步被巨噬细胞吞并，释放出药物草分枝杆菌达到治疗效果。同时，草分枝杆菌口服纳米粒可达到草分枝杆菌注射剂型相当的治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及草分枝杆菌口服纳米粒及其制备方法。
背景技术
草分枝杆菌系多功能免疫增强剂，它的主要成分是灭活的草分枝杆菌，对人类是一种非病源性细菌，主要通过免疫应答反应调节机体免疫功能，从而起到治疗的目的。草分枝杆菌的细胞壁成分诱导非特异性免疫刺激和放大作用，进入人体后，激活了机体的免疫系统，达到治疗效果。草分枝杆菌主要可分为体液免疫、细胞免疫、巨噬细胞作用三种方式(朱慕云等，草分枝杆菌在肿瘤临床应用中的价值，2008，P357)。对体液免疫的作用主要体现在增强效应T细胞活性，促使效应T细胞分泌B细胞生长因子，刺激B细胞进入增殖、分化阶段，最终促进特异性抗体形成，临床表现为血清IgG、IgM滴度的增高。对细胞免疫的作用体现在草分枝杆菌能显著增强特异性细胞免疫功能，促进淋巴细胞转化、增殖，促进白细胞介素2、白细胞介素4、肿瘤坏死因子、γ干扰素等各种细胞因子的产生，还可显著增强自然杀伤细胞活性。对巨噬细胞的作用体现在草分枝杆菌能刺激T淋巴细胞，促使其释放巨噬细胞移动抑制因子、巨噬细胞凝集因子、巨噬细胞趋化因子、促有丝分裂因子等，促进单核2巨噬细胞释放大量氧自由基，促进骨髓多能干细胞和脾粒细胞及巨噬细胞的前体增殖，增加白细胞介素1的分泌，最终杀灭病原体。
目前临床使用的草分枝杆菌为注射液，商品名为“乌体林斯”，临床采用深部肌肉注射给药。注射后少数病人可能会出现疲倦、咳痰较多或发热等症状，部分患者局部甚至可能出现肌肉组织坏死，可通过纤维化进行修补，最后形成硬结，但是愈合后在剧烈运动过程可出现疼痛。其次，与口服药物相比，注射药品风险较高，发生不良反应的几率大，而且对生产过程的控制严格，造成成本较高。因此，有必要开发口服的草分枝杆菌制剂避免上述弊端。
发明人也尝试将草分枝杆菌直接制成口服制剂使用，但是发现并无预期的免疫增强作用。参考现有资料(王运芳等，舌下含服乌体林斯治疗儿童反复呼吸道感染，中华儿科杂志，2000，P179)中提及的舌下含服注射液，利用这种给药方式药物能很快被吸收,直接进入血液循环，并且避免肝脏的首过效应，不过由于舌下粘膜吸收面积有限，草分枝杆菌用量剂量较小，而且需要考虑草分枝杆菌对口腔粘膜的刺激性和药物本身的异味，因此有必要开发草分枝杆菌的口服制剂。发明人发现，一般的口服制剂会破坏草分枝杆菌的药效，造成上述原因是因为草分枝杆菌进入胃肠道后会被胃部的消化酶直接分解，因而无法吸收进入体内血液循环发挥疗效。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种草分枝杆菌口服纳米粒，本发明纳米粒采用包裹技术将草分枝杆菌包裹在载体材料内部，口服给药后可以避免胃肠道消化酶对草分枝杆菌的降解，在药物到达肠道后，通过肠道淋巴结的吸收，进一步被巨噬细胞吞并，释放出药物草分枝杆菌达到治疗效果。
具体的，本发明草分枝杆菌口服纳米粒是将已灭活的草分枝杆菌制备成平均粒径在100nm～1μm的口服纳米粒。
纳米粒口服后其主要吸收部位在回肠内集合淋巴结(Peyer’spatches，PP)，功能细胞为微皱褶细胞(MicrofoldCells，M细胞)。纳米粒被吞噬后，通过囊性转运方式转运到M细胞基底面凹腔释放出来，此时纳米粒或以游离状态，或以被巨噬细胞吞噬的状态，随淋巴细胞通过淋巴管从淋巴循环进入血液循环，再分布到各组织器官而发挥疗效。PP的M细胞吞噬在肠道粘膜上皮屏障上打开了一个理想通道，构成了纳米粒非受体转运的主要生理途径。在这一过程中，纳米粒是以完整结构形式被淋巴结内上皮细胞(M细胞)吞噬，再被传递给抗原递呈细胞(APC)，最终导致机体产生免疫应答，生成大量分泌型免疫球蛋白A(sIgA)，这有效地避免了胃肠道消化酶对蛋白质的降解和肝脏对药物的首过效应，对在胃肠道中不稳定药物和抗癌药的定向淋巴系统有着重要的临床意义。同时，胃肠道粘膜组织对粒子的吸收有粒径大小依赖，粒径较小的纳米粒可以更有效地通过PP组织和其它肠系淋巴组织进入血液循环。
本发明草分枝杆菌口服纳米粒的制备方法包括如下步骤：
A、将载体材料溶于有机溶剂中，形成有机相；
B、将草分枝杆菌溶液逐滴加入有机相中，形成初乳；
C、将初乳逐滴加入水相中，形成复乳；
D、挥发复乳中的有机溶剂，离心收集固体物质，用蒸馏水洗涤，干燥后即得草分枝杆菌口服纳米粒。
采用W/O/W复乳溶剂蒸发法来制备草分枝杆菌口服纳米粒，其中中间体载体材料多选择疏水性物质，步骤A所述载体材料为聚羟基乙酸、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚丙烯酸树脂Ⅱ、氢化磷脂酰胆碱，载体材料优选聚乳酸-羟基乙酸共聚物。所述溶剂为甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸乙酯-二氯甲烷溶液、丙酮-二氯甲烷溶液、丙酮-乙醇溶液，溶剂优选为二氯甲烷。
所述有机相是将载体材料溶于溶剂所得，其中，有机相的溶液浓度为20mg/mL～130mg/mL，以30mg/mL最优。
注：二氯甲烷简称为DCM，聚乙烯醇简称为PVA，聚乳酸-羟基乙酸共聚物简称为PLGA，聚羟基乙酸简称为PLG，聚乳酸简称为PLA。
为了延长草分枝杆菌口服纳米粒在胃肠道壁或胃肠道特定吸收部位的接触和转运时间,从而促进纳米粒的吸收，外水相采用聚乙烯醇PVA等乳化剂或粘附性较强的壳聚糖等溶液，步骤C所述水相为聚乙烯醇水溶液、甲基纤维素水溶液、泊洛沙姆188水溶液、蔗糖水溶液或壳聚糖稀醋酸溶液；水相以壳聚糖稀醋酸溶液最优。其中，壳聚糖稀醋酸溶液的浓度为2mg/mL～6mg/mL，以3mg/mL最优。
步骤B所述形成初乳采用下述方法制备：以初乳的粒径和多分散系数作为指标，用不同的方法形成初乳，初乳的粒径小于900nm时利于复乳的分散。本发明宜采用超声法或高速剪切分散乳化法制备初乳。以超声法形成初乳方法最优，功率范围200W～500W，超声时间30s～10min，以450W超声5min最优。
如：
采用超声法制备初乳
将草分枝杆菌溶液逐滴加入有机相溶液中，超声形成初乳，再将初乳逐滴加入水相溶液中，以450W超声10min形成复乳，150rpm搅拌过夜使有机溶剂完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
采用高速剪切分散乳化法制备初乳
将草分枝杆菌溶液逐滴加入有机相溶液中，高速剪切分散仪25000rpm分散2min形成初乳，再将初乳逐滴加入水相溶液中，以450W超声10min形成复乳，150rpm搅拌过夜使有机溶剂完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
以初乳的粒径和多分散系数作为指标，发现以超声法形成初乳方法最优，功率范围200W～500W，超声时间30s～10min，以450W超声5min最优。
步骤C所述形成复乳采用下述方法制备：以口服纳米粒最终产品的粒径、多分散系数和包封率作为指标，用不同的方法形成复乳。口服纳米粒的粒径较小时，在吞噬细胞的作用下可穿过肠壁，分布于回肠内集合淋巴结、肠系膜淋巴结等免疫器官；多分散系数小于0.3时体系较稳定；包封率越大，则可以降低药物的泄漏。本发明宜采用超声法、高速剪切分散乳化法、高压均质法制备复乳。以高压均质法形成复乳方法最优，均质压力为300bar～1300bar，循环次数为6～12次，最优为500bar循环9次。
如：
采用超声法制备复乳
将草分枝杆菌溶液逐滴加入有机相溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入水相溶液中，以450W超声10min形成复乳，150rpm搅拌过夜使有机溶剂完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
采用高速剪切分散乳化法制备复乳
将草分枝杆菌溶液逐滴加入有机相溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入水相溶液中，高速剪切分散仪25000rpm分散5min形成复乳，150rpm搅拌过夜使有机溶剂完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
采用高压均质法制备复乳
将草分枝杆菌溶液逐滴加入有机相溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入水相溶液中，高压均质机300bar循环10次形成复乳，150rpm搅拌过夜使有机溶剂完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
以口服纳米粒的粒径、多分散系数和包封率作为指标，发现以高压均质法最优，均质压力为300bar～1300bar，循环次数为6～12次，最优为500bar循环9次。
步骤D所述干燥为真空干燥。
本发明方法各优选条件构成的技术方案如下：
A、将PLGA溶于DCM中，形成有机相，溶液浓度为20mg/mL～130mg/mL；
B、将草分枝杆菌溶液逐滴加入有机相中，采用超声法形成初乳：功率范围200W～500W，超声时间30s～10min，以450W超声5min最优；
C、将初乳逐滴加入浓度为2mg/mL～6mg/mL的壳聚糖稀醋酸溶液中，采用高压均质法形成复乳：均质压力为300bar～1300bar，循环次数为6～12次，以500bar循环9次最优；
D、挥发复乳中的有机溶剂，离心收集固体物质，用水洗涤，干燥后即得草分枝杆菌口服纳米粒。
本发明提供的草分枝杆菌口服纳米粒，平均粒径为100nm～1μm，平均包封率可达30～90％。动物试验提示草分枝杆菌口服纳米粒同乌体林斯注射液一样，对免疫力低下的小鼠具有免疫调节作用；体外T淋巴细胞增殖反应和脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平观察发现草分枝杆菌口服纳米粒与乌体林斯注射液上调免疫功能相当，并且未被胃酸和胃肠道的酶分解。因此，本发明所述的草分枝杆菌口服纳米粒可作为草分枝杆菌的口服制剂，以避免患者注射后的不适反应，提高用药的顺应性；另外，口服制剂比注射制剂的生产控制更容易，更适于规模化生产。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，说明但不限制本发明。
本发明草分枝杆菌口服纳米粒的制备方法包括如下步骤：
A、将载体材料溶于有机溶剂中，形成有机相；
B、将草分枝杆菌溶液逐滴加入有机相中，形成初乳；
C、将初乳逐滴加入水相中，形成复乳；
D、挥发复乳中的有机溶剂，离心收集固体物质，用蒸馏水洗涤，干燥后即得草分枝杆菌口服纳米粒。
其中，形成初乳的条件、形成复乳的条件、水相、有机相等参数的选择原因如下：
1.1形成初乳的方法选择
以初乳的粒径和多分散系数作为指标，用不同的方法形成初乳，初乳的粒径小于900nm时利于复乳分散均匀。
1.1.1超声法
将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLG/DCM溶液中，300W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入PVA水溶液中，以450W超声10min形成复乳，150rpm搅拌过夜使二氯甲烷完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
1.1.2高速剪切分散乳化法
将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLG/DCM溶液中，高速剪切分散仪25000rpm分散2min形成初乳，再将初乳逐滴加入PVA水溶液中，以450W超声10min形成复乳，150rpm搅拌过夜使二氯甲烷完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
以超声法形成初乳方法最优，功率范围200W～500W，超声时间30s～10min，以450W超声5min最优。超声法形成的初乳平均粒径在500nm～900nm左右，高速剪切分散乳化法形成的初乳平均粒径在1μm左右。
1.2形成复乳的方法选择
以口服纳米粒最终产品的粒径、多分散系数和包封率作为指标，用不同的方法形成复乳。口服纳米粒的粒径较小时，在吞噬细胞的作用下可穿过肠壁，分布于回肠内集合淋巴结、肠系膜淋巴结等免疫器官；多分散系数小于0.3时体系较稳定；包封率越高，药物泄漏越少。
1.2.1超声法
将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLG/DCM溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入PVA水溶液中，以450W超声10min形成复乳，150rpm搅拌过夜使二氯甲烷完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
1.2.2高速剪切分散乳化法
将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLG/DCM溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入PVA水溶液中，高速剪切分散仪25000rpm分散5min形成复乳，150rpm搅拌过夜使二氯甲烷完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
1.2.3高压均质法
将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLG/DCM溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入PVA水溶液中，高压均质机300bar循环10次形成复乳，150rpm搅拌过夜使二氯甲烷完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
其中以高压均质法最优，该法制备的草分枝杆菌口服纳米粒的多分散系数最小，高压均质工艺参数均质压力为300bar～1300bar，循环次数为6～12次，最优为500bar循环9次。
1.3有机相选择
1.3.1PLG/DCM溶液
将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLG/DCM溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入PVA水溶液中，高压均质机500bar循环9次形成复乳，150rpm搅拌过夜使二氯甲烷完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
1.3.2PLA/DCM溶液
将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLA/DCM溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入PVA水溶液中，高压均质机500bar循环9次形成复乳，150rpm搅拌过夜使二氯甲烷完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
1.3.3PLGA/DCM溶液
将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLGA/DCM溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入PVA水溶液中，高压均质机500bar循环9次形成复乳，150rpm搅拌过夜使二氯甲烷完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
1.3.4聚丙烯酸树脂Ⅱ/乙醇溶液
将草分枝杆菌溶液逐滴加入聚丙烯酸树脂Ⅱ/乙醇溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入PVA水溶液中，高压均质机500bar循环9次形成复乳，150rpm搅拌过夜使乙醇完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
1.3.5氢化磷脂酰胆碱/DCM溶液
将草分枝杆菌溶液逐滴加入氢化磷脂酰胆碱/DCM溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入PVA水溶液中，高压均质机500bar循环9次形成复乳，150rpm搅拌过夜使二氯甲烷完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
1.3.6PLGA/甲醇溶液
将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLGA/甲醇溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入PVA水溶液中，高压均质机500bar循环9次形成复乳，150rpm搅拌过夜使甲醇完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
1.3.7PLGA/丙酮溶液
将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLGA/丙酮溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入PVA水溶液中，高压均质机500bar循环9次形成复乳，150rpm搅拌过夜使丙酮完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
1.3.8PLGA/乙酸乙酯溶液
将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLGA/乙酸乙酯溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入PVA水溶液中，高压均质机500bar循环9次形成复乳，150rpm搅拌过夜使乙酸乙酯完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
1.3.9PLGA/乙酸乙酯-二氯甲烷溶液
将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLGA/乙酸乙酯-二氯甲烷溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入PVA水溶液中，高压均质机500bar循环9次形成复乳，150rpm搅拌过夜使有机溶剂完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
1.3.10PLGA/丙酮-二氯甲烷溶液
将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLGA/丙酮-二氯甲烷溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入PVA水溶液中，高压均质机500bar循环9次形成复乳，150rpm搅拌过夜使有机溶剂完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
1.3.11PLGA/丙酮-乙醇溶液
将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLGA/丙酮-乙醇溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入PVA水溶液中，高压均质机500bar循环9次形成复乳，150rpm搅拌过夜使有机溶剂完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
有机相以PLGA/DCM溶液最优，以PLGA/DCM溶液为有机相时草分枝杆菌口服纳米粒的包封率最高，为82％左右；有机溶剂易于除去。其浓度为20mg/mL～130mg/mL，以30mg/mL最优。
1.4水相的选择
1.4.1聚乙烯醇(PVA)
将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLGA/DCM溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入PVA水溶液中，高压均质机500bar循环9次形成复乳，150rpm搅拌过夜使二氯甲烷完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
1.4.2甲基纤维素
将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLGA/DCM溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入甲基纤维素水溶液中，高压均质机500bar循环9次形成复乳，150rpm搅拌过夜使二氯甲烷完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
1.4.3泊洛沙姆188
将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLGA/DCM溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入泊洛沙姆188水溶液中，高压均质机500bar循环9次形成复乳，150rpm搅拌过夜使二氯甲烷完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
1.4.4蔗糖
将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLGA/DCM溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入蔗糖水溶液中，高压均质机500bar循环9次形成复乳，150rpm搅拌过夜使二氯甲烷完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
1.4.5壳聚糖
将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLGA/DCM溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入壳聚糖稀醋酸溶液中，高压均质机500bar循环9次形成复乳，150rpm搅拌过夜使二氯甲烷完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即为草分枝杆菌口服纳米粒。
水相以壳聚糖稀醋酸溶液最优，其所得草分枝杆菌口服纳米粒的包封率为90％左右，其浓度为2mg/mL～6mg/mL，以3mg/mL最优。
药理实验
(一)草分枝杆菌口服纳米粒对小鼠免疫调节作用的初步研究
一、实验材料：
1、实验动物：
清洁级近交系C57BL/6小鼠，雌性，6-7周龄，体重20±2g。实验过程中自由饮水及进食。每日光照12小时，小鼠(5只/笼)笼均采用中央换气系统通气。
2、实验试剂和主要仪器：
草分枝杆菌口服纳米粒制备如下：将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLGA/DCM溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入壳聚糖稀醋酸溶液中，高压均质机500bar循环9次形成复乳，150rpm搅拌过夜使二氯甲烷完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即可。
乌体林斯注射液(即草分枝杆菌F.U.36注射液)、草分枝杆菌口服纳米粒、0.9％氯化钠注射液、结核分枝杆菌纯化蛋白衍生物(PPD)，胞内分枝杆菌纯化蛋白衍生物(PPDB)，淋巴细胞分离液，噻唑蓝(MTT)，十二烷基硫酸钠(SDS)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，γ-干扰素(IFN-γ)ELISPOT检测试剂盒
RPMI-1640细胞培养基(含青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL，β-巯基乙醇5×10-5mol/L，Ｌ-谷氨酰胺2mmol/L，丙酮酸钠1mmol/L，Hepes20mmol/L，胎牛血清(FBS)，完全培养基为加10％FBS的RPMI-1640培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)
超净工作台、恒温水浴锅、倒置光学显微镜、细胞分析仪、高速低温离心机、CO2培养箱、全自动定量绘图酶标仪、酶联斑点分析仪
二、试验方法：
1、小鼠T淋巴细胞增殖试验：
将C57BL/6小鼠分成4组，分别为生理盐水灌胃组、乌体林斯注射液肌注组、乌体林斯注射液灌胃组、草分枝杆菌口服纳米粒灌胃组。每2周给药一次，共免疫2次。末次免疫后4天，处死小鼠，无菌取脾，分离脾细胞，经小鼠淋巴细胞分离液分出单个核细胞(MNC)，用完全培养基悬浮细胞，计数调节细胞浓度至2.5×106/mL。将细胞悬液铺至96孔板，分别添加PPD、PPDB，培养72h，加入MTT溶液，培养4h后离心弃上清。然后加入SDS-DMF细胞裂解液，培养过夜，测OD值。
2、小鼠脾脏淋巴细胞IFN-γ细胞因子的测定：
将淋巴细胞悬液分装至预先包被好抗IFN-γ细胞因子的特异性捕获抗体的PVDF孔板，分别加入刺激抗原PPD、PPDB，培养36h，弃去细胞悬液，PBS洗板，加入生物素标记单抗，室温2h。弃去反应液，PBS洗板，加入酶标亲和素，室温1h。弃去反应液，PBS洗板，每孔加入底物液，反应30min，至斑点明显出现即可中止反应，将板内液体弃去用蒸馏水冲洗并晾干，以酶联斑点分析仪读取分析斑点数。
三、实验结果：
1、小鼠T淋巴细胞增殖试验：
与对照组相比，乌体林斯注射液肌注组、草分枝杆菌口服纳米粒灌胃组以PPD、PPDB诱导的特异性T淋巴细胞增殖都显著增强；乌体林斯注射液灌胃组以PPD、PPDB诱导的特异性T淋巴细胞增殖不明显。
表1小鼠T淋巴细胞增殖试验各组OD值
2、小鼠脾脏淋巴细胞IFN-γ细胞因子的测定：
与对照组相比，乌体林斯注射液肌注组、草分枝杆菌口服纳米粒灌胃组以PPD诱导的分泌IFN-γ细胞因子的淋巴细胞有少量增加，以PPDB诱导的分泌IFN-γ细胞因子的淋巴细胞明显增多；乌体林斯注射液灌胃组以PPD、PPDB诱导的分泌IFN-γ细胞因子的淋巴细胞增多不明显。
表2小鼠脾脏淋巴细胞IFN-γ细胞因子测定的斑点数
四、实验小结：
实验中通过体外T淋巴细胞增殖反应和脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平观察乌体林斯注射液和草分枝杆菌口服纳米粒的免疫调节作用，两种试验的结果基本一致，说明乌体林斯注射液和草分枝杆菌口服纳米粒免疫小鼠后对T淋巴细胞增殖反应的影响，即上调小鼠的免疫功能。草分枝杆菌口服纳米粒灌胃组的实验结果与乌体林斯注射液肌注组的实验结果一致，乌体林斯注射液灌胃组的实验结果与对照组无明显区别，表明草分枝杆菌口服纳米粒未被胃酸和胃肠道的酶分解，起到了上调小鼠免疫功能的作用。
实验中给小鼠分别免疫乌体林斯注射液和草分枝杆菌口服纳米粒，小鼠的体外脾淋巴细胞经抗原刺激培养后均明显增殖，小鼠以PPDB诱导的脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平明显增多，表明乌体林斯注射液和草分枝杆菌口服纳米粒对正常状态的动物免疫系统具有正向调节作用。
(二)草分枝杆菌口服纳米粒对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用
一、实验材料：
1、实验动物：
清洁级KM小鼠，雌雄各半，6-7周龄，体重20±2g。实验过程中自由饮水及进食。每日光照12小时，小鼠(5只/笼)笼均采用中央换气系统通气。
2、实验试剂和主要仪器：
草分枝杆菌口服纳米粒制备如下：将草分枝杆菌溶液逐滴加入PLGA/DCM溶液中，450W超声5min形成初乳，再将初乳逐滴加入壳聚糖稀醋酸溶液中，高压均质机500bar循环9次形成复乳，150rpm搅拌过夜使二氯甲烷完全挥发，15000rpm离心30min收集，用蒸馏水洗涤离心3次，真空干燥后即可。
乌体林斯注射液(即草分枝杆菌F.U.36注射液)、草分枝杆菌口服纳米粒、0.9％氯化钠注射液、荧光素标记抗小鼠抗体FITC-CD4、PE-CD3、PE-CY5-CD8及相应荧光标记同型阴性抗体FITC-IgG2b、PE-IgG、PE-Cy5-IgG2，IL-2、IL-4、IFN-γELISA试剂盒，IgA、IgG和IgMELISA试剂盒
流式细胞仪、高速低温离心机、全自动定量绘图酶标仪、恒温水浴锅
二、实验方法：
1、动物分组、造模、给药：
将小鼠分成正常对照组、模型对照组、乌体林斯注射液肌注组、乌体林斯注射液灌胃组、草分枝杆菌口服纳米粒灌胃组。除正常对照组外，其余4组造环磷酰胺免疫功能低下小鼠模型。每只小鼠每天分别腹腔注射环磷酰胺注射液(按80mg/kg的量给药，0.2mL/10g)，连续3d。造模4组第4天给药，一周后再给药一次。
2、检测指标：
第2次给药后3h处死5组小鼠，取血，经流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群。按照ELISA试剂盒说明书步骤进行操作，测定细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平，测定IgA、IgG和IgM含量。
三、实验结果：
1、对小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响：
结果显示，与正常对照组相比，模型对照组CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+明显减少；乌体林斯注射液灌胃组与模型对照组无明显区别；乌体林斯注射液肌注组和草分枝杆菌口服纳米粒灌胃组与正常对照组相比CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均明显增加，且两组之间无明显区别。
表3对小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响
| 组别 | CD3+ | CD4+ | CD8+ | CD4+/CD8+ |
| 正常对照组 | 52.16±3.35 | 32.18±2.94 | 23.76±3.06 | 1.369±0.28 |
| 模型对照组 | 40.35±3.98 | 23.73±3.65 | 15.86±3.97 | 1.482±0.26 |
| 乌体林斯注射液肌注组 | 60.84±3.94 | 44.61±2.87 | 22.58±3.54 | 1.985±0.31 |
| 乌体林斯注射液灌胃组 | 42.59±3.45 | 24.65±3.97 | 15.64±3.48 | 1.542±0.26 |
| 草分枝杆菌口服纳米粒灌胃组 | 61.34±3.64 | 43.25±2.68 | 21.85±3.14 | 1.989±0.33 |
2、对细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ水平的影响
结果显示，与正常对照组相比，模型对照组IL-2、IL-4、IFN-γ明显减少；乌体林斯注射液灌胃组与模型对照组无明显区别；乌体林斯注射液肌注组和草分枝杆菌口服纳米粒灌胃组与模型对照组相比IL-2、IL-4、IFN-γ均明显增加，且两组之间无明显区别。
表4对细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ水平的影响
| 组别 | IL-2 | IL-4 | IFN-γ |
| 正常对照组 | 139.48±5.01 | 52.68±2.69 | 59.68±4.36 |
| 模型对照组 | 96.89±5.36 | 45.62±2.45 | 50.86±4.31 |
| 乌体林斯注射液肌注组 | 135.69±5.97 | 53.46±2.75 | 60.78±4.75 |
| 乌体林斯注射液灌胃组 | 98.64±5.56 | 44.65±2.84 | 51.33±3.94 |
| 草分枝杆菌口服纳米粒灌胃组 | 128.68±4.95 | 51.46±1.97 | 58.57±3.78 |
3、对IgA、IgG和IgM含量的影响
结果显示，与正常对照组相比，模型对照组IgA、IgG和IgM明显减少；乌体林斯注射液灌胃组与模型对照组无明显区别；乌体林斯注射液肌注组和草分枝杆菌口服纳米粒灌胃组与模型对照组相比IgG和IgM均明显增加，且两组之间无明显区别。
表5对IgA、IgG和IgM含量的影响
| 组别 | IgA | IgG | IgM |
| 正常对照组 | 0.985±0.146 | 8.643±1.268 | 0.624±0.082 |
| 模型对照组 | 0.789±0.152 | 5.261±1.245 | 0.384±0.071 |
| 乌体林斯注射液肌注组 | 0.801±0.168 | 8.542±1.341 | 0.652±0.098 |
| 乌体林斯注射液灌胃组 | 0.779±0.136 | 5.412±1.398 | 0.401±0.085 |
| 草分枝杆菌口服纳米粒灌胃组 | 0.805±0.175 | 8.795±1.652 | 0.632±0.068 |
四、实验小结：
实验中乌体林斯注射液肌注组和草分枝杆菌口服纳米粒灌胃组可以提高免疫功能低下小鼠的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平，提高细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平，提高IgG和IgM的含量，且乌体林斯注射液肌注组和草分枝杆菌口服纳米粒灌胃组无明显区别，表明草分枝杆菌口服纳米粒对免疫功能低下小鼠有免疫调节作用，且其免疫调节作用与乌体林斯注射液相当。
综上，本发明草分枝杆菌口服纳米粒，采用包裹技术将草分枝杆菌包裹在载体材料内部，口服给药后可以避免胃肠道消化酶对草分枝杆菌的降解，在药物到达肠道后，通过肠道淋巴结的吸收，进一步被巨噬细胞吞并，释放出药物草分枝杆菌达到治疗效果。同时，草分枝杆菌口服纳米粒可达到草分枝杆菌注射剂型相当的治疗效果。
Claims (10)
1.草分枝杆菌口服纳米粒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
A、将载体材料溶于有机溶剂中，形成有机相；
B、将草分枝杆菌溶液逐滴加入有机相中，形成初乳；
C、将初乳逐滴加入水相中，形成复乳；
D、挥发复乳中的有机溶剂，离心收集固体物质，用水洗涤，干燥后即得草分枝杆菌口服纳米粒。
2.根据权利要求1所述的草分枝杆菌口服纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤A所述载体材料为聚羟基乙酸、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚丙烯酸树脂Ⅱ、氢化磷脂酰胆碱；载体材料优选聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
3.根据权利要求1所述的草分枝杆菌口服纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤A所述溶剂为甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸乙酯-二氯甲烷溶液、丙酮-二氯甲烷溶液、丙酮-乙醇溶液；溶剂优选二氯甲烷。
4.根据权利要求1所述的草分枝杆菌口服纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤A所述有机相的溶液浓度为20mg/mL～130mg/mL；优选30mg/mL。
5.根据权利要求1所述的草分枝杆菌口服纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤C所述水相为聚乙烯醇水溶液、甲基纤维素水溶液、泊洛沙姆188水溶液、蔗糖水溶液或壳聚糖稀醋酸溶液。
6.根据权利要求1所述的草分枝杆菌口服纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤C所述水相为壳聚糖稀醋酸溶液；壳聚糖稀醋酸溶液浓度为2mg/mL～6mg/mL，以3mg/mL最优。
7.根据权利要求1所述的草分枝杆菌口服纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤B所述形成初乳采用下述方法制备：采用超声法或高速剪切分散乳化法制备初乳；
优选的，采用超声法制备初乳的条件为：功率范围200W～500W，超声时间30s～10min；优选功率范围450W，超声时间5min。
8.根据权利要求1所述的草分枝杆菌口服纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤C所述形成复乳采用下述方法制备：采用超声法、高速剪切分散乳化法、高压均质法制备复乳；
优选的，采用高压均质法制备复乳的条件为：均质压力为300bar～1300bar，循环次数为6～12次；优选均质压力为500bar，循环次数为9次。
9.根据权利要求1所述的草分枝杆菌口服纳米粒的制备方法，其特征在于：优选步骤如下：
A、将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷中，形成有机相，溶液浓度为20mg/mL～130mg/mL；
B、将草分枝杆菌溶液逐滴加入有机相中，采用超声法形成初乳：功率范围200W～500W，超声时间30s～10min，以450W超声5min最优；
C、将初乳逐滴加入浓度为2mg/mL～6mg/mL的壳聚糖稀醋酸溶液中，采用高压均质法形成复乳：均质压力为300bar～1300bar，循环次数为6～12次，以500bar循环9次最优；
D、挥发复乳中的有机溶剂，离心收集固体物质，用水洗涤，干燥后即得草分枝杆菌口服纳米粒。
10.权利要求1-9任一项所述的草分枝杆菌口服纳米粒的制备方法所得的草分枝杆菌口服纳米粒。
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