CN1857224A - 一种c-FLIP反义寡核苷酸纳米粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域,是一种c-FLIP反义寡核苷酸纳米粒的制备方法。本发明采用复乳-干燥法制备c-FLIP反义寡核苷酸纳米粒制剂。将适量c-FLIP-ASODN(600μg)溶于超纯水中,作为水相;将适量聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA RG503H)溶于二氯甲烷中,作为油相;将水相与油相混合,冰浴条件下超声乳化形成初乳;取泊洛沙姆188(Poloxamer188)溶液加至初乳中,冰浴条件下再次超声乳化得到复乳;将复乳加至聚乙烯醇(PVA)溶液中,室温下低速搅拌挥发有机溶剂,然后用离心收集沉淀,水洗后,制成冻干粉即可。本发明制备方法所得的纳米粒粒径分布范围窄,平均粒径小,载药量大,有机溶剂挥发较彻底,吸附的PVA少,使用更为安全。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,是一种c-FLIP反义寡核苷酸纳米粒的制备方法。
背景技术
反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)即为人工合成长度为10-30个碱基的DNA分子及其类似物,通过Watson-Crick碱基配对,与特定的mRNA或DNA发生特异性结合,从而抑制或封闭基因的表达,使其丧失活性,达到基因治疗的目的。c-FLIP蛋白是细胞凋亡过程中的抑制蛋白,已证实c-FLIP表达于多种肿瘤中,从而使肿瘤细胞产生凋亡障碍。c-FLIP-ASODN序列为:5′-
ACT TGT CCC TGC TCC
TTG AA-3′,Mr=6 000,下划线部分为硫代修饰提高其稳定性[Bannerman DD,Tupper JC,Ricketts WA,et al.Aconstitutive cytoprotective pathway protects endothelial cells from li-popolysaccharide-induced apoptosis [J]. J Biol Chem,2001,276(18):14924-14932.]。它可在mRNA水平抑制c-FLIP表达,从而恢复肿瘤细胞的凋亡敏感性。
眼眶横纹肌肉瘤(RMS)为儿童期最常见的原发性眶内恶性肿瘤,该肿瘤恶性度高,发展迅速,死亡率高,严重威胁患儿的生命。目前主要采取手术与放、化疗结合的综合治疗,但治疗效果不理想,预后较差。c-FLIP在RMS中高表达,而针对c-FLIP的ASODN,成为重建RMS肿瘤细胞凋亡机制的有效基因治疗方法。
然而未经包裹修饰的单纯ASODN片段为亲水性的聚阴离子,生物膜的通透性差,在体液中易受核酸酶的降解,并且对肿瘤组织缺乏靶向性,使其应用受到了限制。因此,选择安全有效的导入载体成为这项基因治疗技术开展的关键。作为非病毒类载体系统新成员的纳米粒(nanoparticles,NP),因其稳定性远好于脂质体,且克服了病毒载体的生物毒性,原料来源广泛,安全性高,成为研究的热点。经过纳米材料包裹,可对ASODN起到保护和控释作用。尤其在各种可作为传递ASODN的纳米粒载体中,聚乳酸-聚羟乙酸(PolyD,L-lacticco-glycolic acid,PLGA)是经过美国FDA批准应用于临床的一种高分子聚合体,成为基因载体的良好选择。已有报道采用二次超声乳化和溶剂挥发技术,PLGA制备成纳米粒用于传递c-FLIP-ASODN。制备步骤简要描述如下:c-FLIP-ASODN(600μg)冻干粉适量溶于150ml超纯水中,作为水相;将适量(50mg)PLGA溶于1.5ml乙酸乙酯中,作为油相;将水相与油相混合,冰浴条件下超声乳化20s(功率20W),形成初乳;取3ml1%PVA溶液加至初乳中,冰浴条件下再次超声乳化20s(功率20W),形成复乳;将复乳加至30ml 0.3%PVA溶液中,37℃水浴搅拌(400r/min)挥发有机溶剂乙酸乙酯,然后用高速离心机20000r/min离心10min,收集沉淀,超纯水洗涤3次,制成冻干粉备用。[聂有华,魏锐利,李国栋等,载c-FLIP反义寡核苷酸聚乳酸-聚羟乙酸纳米粒的制备及评价。第二军医大学学报,2005,26(5):547-550.]该方法实用有效、简便易行,但在制备过程中存在有机溶剂及聚乙烯醇(PVA)残留较多的情况,它们对正常细胞都存在一定的毒性;同时制得的纳米粒存在粒径分布范围偏广(50-150nm)、平均粒径较大(95.5nm)、载药量低(0.579%)的缺陷。
发明内容
本发明提供了一种有机溶剂及PVA残留少、粒径分布范围窄、平均粒径较小、载药量提高的c-FLIP反义寡核苷酸纳米粒制备的方法。本发明采用复乳-干燥法,是对上述制备方法的改进,通过对有机溶剂和分散介质的改变,增加了纳米粒使用的安全性及纳米粒粒径大小的可控性,同时载药量增加。一是有机溶剂以二氯甲烷替代了乙酸乙酯,因为二氯甲烷较乙酸乙酯的沸点低、易挥发,这样有机溶剂残留少,更加安全;二是在形成复乳的过程中分散介质以泊洛沙姆188(Poloxamer188)替代了聚乙烯醇(PVA)。Poloxamer188(Pluronic F68)是目前可用于静脉注射的水包油乳化剂之一,更为安全,且用其制备的乳剂,乳粒小,吸收率高。因此本发明采用Poloxamer188水溶液加入初乳后形成复乳,制备的纳米粒的粒径比较一致,物理性质更加稳定,平均粒径较小,载药量增加;另外,在形成复乳后,再与致孔剂PVA结合,减少了制备过程中PVA的使用与吸收,增加了使用的安全性。
具体方法为:
1.组分与配比:
c-FLIP反义寡核苷酸 330-1650μg
聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA RG503H) 15-80mg
Poloxamer188 0.1%-5%(w/v)
聚乙烯醇(PVA) 0.2-0.6%(w/v)
二氯甲烷 0.5-2.4ml
缓冲液 75-350μl
2.制备c-FLIP反义寡核苷酸纳米粒:
(1)制备油相:按配比将PLGA溶于有机溶剂二氯甲烷制成油相,浓度为30mg~50mg/ml;
(2)制备内水相:按配比将c-FLIP反义寡核苷酸溶于缓冲液形成内水相,缓冲液可选自PBS(PH=7.4)和TE缓冲液;
(3)制备纳米粒:将内水相加入上述油相冰浴超声乳化形成初乳,按配比将Poloxamer188水溶液加入至初乳,继续冰浴超声乳化,形成复乳,将复乳倒入PVA水溶液中,室温下继续低速搅拌4小时(搅拌速度为300~600rpm)形成纳米粒,用水洗涤,离心收集沉淀,冷冻干燥即可得纳米粒干粉。
上述制备所得的c-FLIP反义寡核苷酸纳米粒粒径圆整、大小较均匀,粒径集中分布在50-80nm内,平均65.77nm;平均包封率达到48%,平均载药量为0.697%;体外释药于第17.9天达到最终基本稳定的平台期;能有效保护寡核苷酸的水解。
具体实施方式
现结合实施例,对本发明作详细描述:
实施例1:复乳-干燥法制备c-FLIP反义寡核苷酸纳米粒
取反义寡核苷酸660μg溶于150ul的缓冲液中(PBS pH=7.4)作为内水相,将50mg PLGA(RG503H)溶于1.5ml二氯甲烷中作为油相,将内水相加入到油相冰浴超声乳化20s(功率为20W)得初乳,将1%(w/v)poloxamer188水溶液3ml加入至初乳,继续冰浴超声乳化30s(功率为20W)形成复乳,将复乳倒入30ml 0.3%(w/v)的PVA水溶液中,室温下低速搅拌4小时(搅拌速度为400rpm),挥发去除有机溶剂,离心收集纳米粒,超纯水洗涤三次,冷冻干燥,得到本发明纳米粒。
本发明制备方法所得的纳米粒粒径分布范围窄,平均粒径小,载药量大,有机溶剂挥发较彻底,吸附的PVA少,使用更为安全。
Claims (2)
1.一种c-FLIP反义寡核苷酸纳米粒的制备方法,按如下比例操作:
(1)制备油相:将聚乳酸-羟基乙酸共聚物15-80mg溶于有机溶剂二氯甲烷0.5-2.4ml制成油相;
(2)制备内水相:将c-FLIP反义寡核苷酸330-1650μg溶于缓冲液75-350μl形成内水相,缓冲液为PH=7.4的PBS或TE缓冲液;
(3)制备纳米粒:将内水相加入上述油相冰浴超声乳化形成初乳,将0.1%-5%泊洛沙姆188水溶液加入至初乳,继续冰浴超声乳化,形成复乳,将复乳倒入0.2-0.6%聚乙烯醇水溶液中,室温下以300-600rpm继续搅拌形成纳米粒,水洗后,离心收集沉淀,冷冻干燥即可得纳米粒干粉制剂。
2.按权利要求1所述的制备方法,其特征在于:制备油相时所用的聚乳酸-羟基乙酸共聚物50mg,所用的二氯甲烷为1.5ml;制备内水相时,所用的c-FLIP反义寡核苷酸为660μg,所用的缓冲液为PH7.4的PBS 150μl;制备纳米粒时所用的泊洛沙姆188水溶液浓度为1%,用量为3ml,所用的聚乙烯醇水溶液浓度为0.3%,用量为30ml。
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