CN105748442B - 一种红景天苷及他莫昔芬的双载药抗乳腺癌纳米制剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种红景天苷及他莫昔芬的双载药抗乳腺癌纳米制剂的制备方法，包括：将载体材料、脂质混合物及他莫昔芬溶解于有机溶剂中制备出油相；将红景天苷溶于去离子水中制备出水相；将所述水相加入到所述油相中，超声乳化形成W/O型初乳，再加入表面活性剂，超声乳化形成W/O/W型复乳后，除去所述有机溶剂，然后进行离心操作，弃去上清液，收集沉淀物得到所述纳米制剂。本发明具有使红景天苷对他莫昔芬起到增敏的作用，拮抗其耐药性，进而还具有能够降低给药剂量从而减缓毒副作用的特点。

Description

一种红景天苷及他莫昔芬的双载药抗乳腺癌纳米制剂的制备 方法
技术领域
本发明涉及中药制剂领域，具体涉及一种红景天苷及他莫昔芬的双载药抗乳腺癌纳米制剂的制备方法。
背景技术
癌症是一种不正常和不可控制生长的细胞，经常导致为恶性肿瘤。它可发生于人体的任何器官和组织。迄今为止，它是最具毁灭性的的疾病因为其高死亡率。乳腺癌是发生在乳腺上的癌症。世界范围内调查可知，乳腺癌是继肺癌之后的第二大常见恶性肿瘤，世界上约1/5的癌症病人是乳腺癌患者。
他莫昔芬，作为一种临床治疗乳腺癌常用药，用于治疗晚期乳腺癌和卵巢癌；临床治疗乳腺癌，通过可抑制雌激素的产生起到治疗作用，有效率一般在30％，雌激素受体阳性患者疗效较好(49％)，阴性患者疗效差(7％)，绝经前和绝经后患者均可使用，而绝经后和60岁以上的人较绝经前和年轻患者的效果为好；在临床使用中，多以枸橼酸盐的形式进行服用，但随着在临床的广泛使用，越来越多的副作用接踵而来，肿瘤细胞对药物产生耐药性，效果降低是其中最大的问题，也是肿瘤化疗的主要障碍。
同时，近代研究发现，中药抗肿瘤具有很多优势，其中改善病人生存质量尤为突出，这集中体现在对西药耐药性及毒副作用的拮抗和缓解；因此，对植物药及植物药来源的成分进行抗肿瘤研究尤为必要。
红景天苷，化学名称2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-葡萄糖苷，2015年药典规定，其含量的高低是衡量红景天药材品质的重要标准，现代药理研究表明，红景天苷具有抗氧化，保护心脏及抗乳腺和肺癌等药理活性；但是，红景天苷虽具有抗乳腺癌的活性，但其单体不稳定、水溶性大，生物利用度不佳，这也是制约其有效利用的问题所在。
纳米制剂作为药物载体，其具有广泛优点，如可降低给药剂量以改善药物的生物利用度；具有缓释及靶向作用；增加药物溶解度，特别是能够使两种药物结合进同一载体以达到协同增敏的作用。
PLGA-PEG-PLGA，是一种新的生物材料，在不同的药物传递系统中应用广泛。由两亲性聚合物PEG(聚乙二醇)和PLGA(聚乳酸-羟基乳酸共聚物)聚合而成，可缓释药物，具有较好的生物相容性和安全性。
发明内容
本发明设计开发了一种红景天苷及他莫昔芬的双载药抗乳腺癌纳米制剂的制备方法，本发明的目的之一是解决单独使用他莫昔芬(Tam)时的药用副作用较大的问题，并且由于他莫昔芬的耐药性使其药效降低的问题，同时，通过本发明的制备方法同时还能解决红景天苷(Sal)单体不稳定、水溶性差、生物利用度不佳的问题。
本发明的目的之二是通过两亲性聚合物PEG(聚乙二醇)和PLGA(聚乳酸-羟基乳酸共聚物)聚合物的纳米制剂作为药物载体，使两种药物能够结合进同一载体达到协同增敏的作用，解决药物溶解度过小，改善药物的生物利用度低及释药速度过快的问题。
本发明设计以PLGA-PEG-PLGA聚合物为载体采用超声复乳化-溶剂挥发法制备红景天苷及他莫昔芬双载药抗乳腺癌纳米粒(Salidroside,Tamoxifen nanoparticles,Sal,Tam-NPs)，其纳米制剂可缓释药物，并且具有较好的生物相容性及安全性，同时，本发明还具有通过红景天苷的使用对他莫昔芬起到增敏的作用，拮抗其耐药性，进而还具有能够降低他莫昔芬给药剂量从而减缓毒副作用的特点。
本发明提供的技术方案为：
一种红景天苷及他莫昔芬的双载药抗乳腺癌纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：
将载体材料、脂质混合物及他莫昔芬溶解于有机溶剂中构成油相；
将红景天苷溶于去离子水中构成水相；
将所述水相加入到所述油相中去，超声乳化形成W/O型初乳，再加入表面活性剂，超声乳化形成W/O/W型复乳后，除去所述有机溶剂，然后进行离心操作，弃去上清液，收集沉淀物得到所述纳米制剂。
优选的是，载体材料为分子量为7000D～15000D的聚乙二醇聚乳酸乙醇酸共聚物。
优选的是，所述表面活性剂为浓度为1％～2％的聚乙烯醇水溶液。
优选的是，所述脂质混合物为氢化大豆卵磷脂和胆固醇的混合物。
优选的是，所述有机相与所述水相体积比为2:1～8:1。
优选的是，所述超声乳化形成W/O型初乳时，超声功率为10％～15％，超声乳化形成W/O/W型复乳时，超声功率为30％～35％。
优选的是，所述超声操作使用探头式超声乳化仪搅拌，在冰浴条件下进行，每次持续2分钟，并且采用开启5秒，关闭5秒。
优选的是，所述离心操作为12000转/每分钟，持续时间60分钟。
优选的是，所述有机溶剂为二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶剂。
优选的是，所述聚乙烯醇水溶液中的聚乙烯醇分子量为30～70KD。
本发明与现有技术相比较所具有的有益效果：
1、通过使用本发明所提供的制备方法能够提供一种双载药的纳米制剂，其能够有效的降低制药成本、制药工艺，并且在成药后能够提高病人的依从性，减少给药次数；
2、通过筛选PLGA-PEG-PLGA聚合物分子量、表面活性剂浓度等优处方制得Sal,Tam-NPs，其纳米粒的平均粒径约为220nm，均为粒度分布均匀的球形实体粒子，使红景天苷(Sal)及他莫昔芬(Tam)具有稳定的包封率，并且通过稳定性实验表明纳米粒Sal,Tam-NPs更适合低温保存或者冷冻干燥成粉针剂进行储存；
3、Sal,Tam-NPs在酸性和中性介质中均具有缓释的特征，且具有一定的pH敏感性，纳米粒在pH3酸性释放介质中比在pH7释放介质中释放快，这更加有利于药物在肿瘤部位发挥长效作用，降低毒副作用；
4、通过CCK-8法考察制剂和游离药物分别对4T1乳腺癌细胞的毒性，结果提示空载纳米制剂和红景天苷单体的细胞存活率均在95％以上，对4T1细胞没有毒性，聚合物材料具有很好的生物相容性，Sal,Tam-NPs制剂组具有显著的细胞毒性作用，相对于游离药物，Sal,Tam-NPs制剂组对抑制乳腺癌具有更好的效果；
5、通过BABL/c小鼠原位乳腺癌模型，经过不同的给药处理后发现，Sal,Tam-NPs制剂组的小鼠体重降低趋势比其他两组缓慢，小鼠的肿瘤体积增长趋势也明显低于模型组(P<0.01)，同时低于他莫昔芬组，通过观察各荷瘤小鼠的生存期发现，Sal,Tam-NPs制剂组大于模型组和他莫昔芬组，通过Sal,Tam-NPs制剂组的实验可明显延长小鼠的生存期，进而表明通过Sal,Tam-NPs制剂相较于单独使用他莫昔芬具有更好的效果。
附图说明
图1为乳化剂种类对Sal,Tam-NPs的影响的示意图。
图2为初乳中有机相/水相体积比对Sal,Tam-NPs的影响的示意图。
图3为超声强度对Sal,Tam-NPs的影响的示意图。
图4为纳米粒的粒径分布图。
图5为纳米粒的Zeta电位分布图。
图6a为纳米粒的扫描电镜图。
图6b为纳米粒的扫描电镜图。
图6c为纳米粒的扫描电镜图。
图7为红景天苷、他莫昔芬和Sal,Tam-NPs的DSC图谱。
图8为纳米溶液的稳定性实验结果。
图9a为pH7条件下红景天苷，他莫昔芬单体和在制剂中的累积释放曲线图。
图9b为pH7条件下红景天苷单体和在制剂中的累积释放曲线图。
图10为pH3条件下红景天苷，他莫昔芬单体和在制剂中的累积释放曲线图。
图11为cck-8实验中Sal,Tam-NPs和Tam单药的IC50计算图。
图12为纳米制剂和单药组对4T1细胞的抑制作用的示意图。
图13为给药后小鼠体重的变化的示意图。
图14为给药后小鼠肿瘤体积生长曲线。
图15为给药后小鼠的生存率曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明提供一种红景天苷及他莫昔芬的双载药抗乳腺癌纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：本实验采用超声复乳化-溶剂挥发法，来制备含有水溶性红景天苷(Sal)和脂溶性的他莫昔芬(Tam)两种药物的纳米制剂；首先将一定量聚乙二醇聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA-PEG-PLGA聚合物)，脂质混合物(氢化大豆卵磷脂/胆固醇)及他莫昔芬溶于二氯甲烷和乙酸乙酯，振动搅拌器涡旋混合至溶解构成油相；另将红景天苷溶于适量去离子水构成水相；将水相慢慢加入油相中，在冰浴条件下用探头式超声仪进行超声乳化形成均一的初乳，再加入聚乙烯醇(PVA)水溶液，继续用超声乳化仪搅拌，制成均一的牛奶状复乳液，放入圆底烧瓶中用旋转蒸发仪去除有机溶剂后，用高速离心机离心，弃上清液，收集的沉淀用蒸馏水洗三遍，除掉游离的红景天苷，他莫昔芬和PVA。
在另一种实施例中，载体材料为分子量为7000D～15000D的聚乙二醇聚乳酸乙醇酸共聚物。
在另一种实施例中，表面活性剂为浓度为1％～2％的PVA水溶液。
在另一种实施例中，脂质混合物为氢化大豆卵磷脂和胆固醇的混合物。
在另一种实施例中，有机相与水相体积比为2:1～8:1。
在另一种实施例中，超声乳化形成W/O型初乳时，超声功率为10％～15％，超声乳化形成W/O/W型复乳时，超声功率为30％～35％。
在另一种实施例中，超声操作使用超声乳化仪搅拌，每次持续2分钟，并且开启5秒，关闭5秒。
在另一种实施例中，离心操作为12000转/每分钟，持续时间60分钟。
在另一种实施例中，有机溶剂为二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶剂，所述超声操作在冰浴条件进行操作。
在另一种实施例中，所述PVA水溶液中分子量为30～70KD。
实施例
1.仪器与试药
1.1试验仪器
表1-1实验仪器
1.2试药
表1-2实验试药
2.单因素实验优化纳米制剂处方
2.1超声复乳化-溶剂挥发法制备Sal,Tam-NPs
本实验采用超声复乳化-溶剂挥发法，制备含有水溶性红景天苷和脂溶性的他莫昔芬两种药物的纳米制剂；首先，将一定量PLGA-PEG-PLGA聚合物，脂质混合物(氢化大豆卵磷脂/胆固醇)及他莫昔芬溶于二氯甲烷和乙酸乙酯，振动搅拌器涡旋混合至溶解构成油相；另外，将红景天苷溶于适量去离子水构成水相；将水相慢慢加入油相中，在冰浴条件下用探头式超声仪进行超声乳化形成均一的初乳，再加入PVA水溶液，继续用超声乳化仪搅拌，制成均一的牛奶状复乳液，放入圆底烧瓶中用旋转蒸发仪去除有机溶剂后，用高速离心机离心，弃上清液，收集的沉淀用蒸馏水洗三遍，除掉游离的红景天苷，他莫昔芬和PVA。
2.2 PLGA-PEG-PLGA分子量对纳米制剂的影响
聚合物的理化性质会受其分子量大小的影响，聚合物分子量大小不同，形成的纳米粒也会有所差异，实验中将PLGA-PEG-PLGA的用量固定，分别选择PLGA-PEG-PLGA分子量(MW)为7000D和15000D，取适量Sal,Tam-NPs样品稀释10倍测定不同分子量的聚合物对空载纳米粒的粒径，Zeta电位和分散指数PDI的影响，综合实验数据，选择PLGA-PEG-PLGA分子量为15000D。结果见表1-3。
表1-3 PLGA-PEG-PLGA分子量对Sal,Tam-NPs的影响
2.3表面活性剂浓度对纳米粒制备的影响
聚乙烯醇(PVA)作为表面活性剂广泛应用于聚合物纳米制剂的制备。聚乙烯醇(PVA)的种类和浓度对纳米粒的药剂学性质有一定的影响。聚乙烯醇(PVA)加快有机相在水相中的分散度，而且在纳米粒表面形成一层亲水性膜，阻止了粒子间的团聚，增强体系的稳定性，形成的纳米粒径较小包封率较高。但是表面活性剂浓度继续增大，常会造成外相过于黏稠，增强溶液的粘滞性，降低其稳定性。故本实验将使用的体积量固定(4mL)，制备Sal,Tam-NPs，考察1％，2％的PVA溶液作为外相乳化剂，对纳米粒包封率的影响。通过表1-4结果发现1％PVA所得纳米粒具有更高的包封率。
表1-4聚乙烯醇溶液浓度对Sal,Tam-NPs的影响
2.4初乳乳化剂的选择
实验中分别选择了氢化大豆卵磷脂(HSPC)和卵磷脂两种表面活性剂，制备Sal,Tam-NPs，考察初乳乳化剂对纳米粒的粒径，Zeta电位，分散指数PDI和包封率的影响。通过表1-5和图1结果可见，在选择氢化大豆卵磷脂(HSPC)时纳米粒具有更小的粒径和PDI，包封率也较高。
表1-5乳化剂种类对Sal,Tam-NPs的影响
2.5初乳中有机相/水相体积比的选择
有机相与水相体积比可以影响纳米粒的包封率，实验控制有机相/水相体积比分别为2:1，3:1，5:1和8:1，测定纳米制剂的包封率考察初乳中有机相/水相体积比对纳米粒的影响。综合实验数据，实验中选择初乳有机相/水相体积比为5:1(图2)具体结果见表1-6。
表1-6初乳中有机相/水相体积比对Sal,Tam-NPs的影响
2.6超声强度对纳米粒的选择
制备此聚合物纳米粒的过程中，需通过探头超声仪来分散纳米粒使之成型，但是强度过大容易导致纳米粒破坏，且随着超声频率的上升，有机相与水相乳化时间缩短，乳化不均匀，制备的纳米粒径大小不一。功率太小则纳米粒粒径较大且不均匀。因此，适当的超声强度对纳米粒的质量具有重要影响。结果见表1-7及图3实验数据，实验选择初乳15％，复乳35％的超声强度。
表1-7超声强度对纳米粒的影响
2.7最优处方制备Sal,Tam-NPs
通过单因素筛选生物降解材料PLGA-PEG-PLGA的分子量、初乳乳化剂种类、初乳油相和水相体积比及超声强度，最终建立了以下处方：
精密称取40.08mg载体材料PLGA-PEG-PLGA(MW：15000D)聚合物，脂质混合物(8.30mg氢化大豆卵磷脂/1.73mg胆固醇)及5.02mg他莫昔芬溶于900μL二氯甲烷和100μL乙酸乙酯，振动搅拌器涡旋混合至溶解构成油相；另将2.05mg红景天苷溶于200μL去离子水构成水相；将水相慢慢加入油相中，在冰浴条件下用探头式超声仪进行超声乳化(15％，2min，开启5s，关闭5s)形成均一的W/O型初乳，再加入1％PVA(MW：30-70KD)水溶液4mL，继续用超声乳化仪搅拌(35％，2min，开启5s，关闭5s)，制成W/O/W复乳，放入圆底烧瓶中用旋转蒸发仪去除有机溶剂(20min)，用高速离心机离心(12000g/min，60min)，弃上清液，收集沉淀用蒸馏水洗三遍，除掉游离的红景天苷，他莫昔芬和PVA后加入pH7.4的PBS缓冲液复溶或冷冻干燥保存，进行下一步的表征。
3.红景天苷/他莫昔芬双载药抗乳腺癌纳米制剂的表征
3.1 Sal,Tam-NPs纳米粒的粒径分布和Zeta电位
分别精密吸取0.5mL纳米粒溶液(四批)，加4.5mL的去离子水分散使其稀释至适宜的浓度，在室温下采用激光粒度分析仪分别测定纳米粒的粒径，Zeta和分散指数PDI。纳米粒在水溶液中的行为类似于荷电胶体粒子，即各粒子荷电较少时，粒子间斥力相应减弱，各粒子间易聚集和融合。Zeta电位与纳米粒的稳定性密切相关，测定Zeta电位可预测纳米粒的稳定性。一般来说，高Zeta电位值体系因各粒子间斥力较大而体系较为稳定。通过分别平行制备四批Sal,Tam-NPs纳米粒取均值得纳米粒粒径为226.5±14.5nm，Zeta为-1.905±0.64，绝对值相对较低，但分布均匀；PDI为0.2775，粒径分布较窄。具体结果见表1-8和图4及图5。
表1-8 Sal，Tam-NPs纳米粒的粒径分布，Zeta电位和PDI
3.2包封率的测定方法
精密量取离心冲洗的纳米粒沉淀复溶溶液1mL，加入5倍体积的乙腈，超声6min对纳米粒进行破解，然后再加入5倍体积的甲醇来沉淀聚合物，0.22μm有机系微孔滤膜过滤样品，取其续滤液，为包封药物；另将离心后的上清液及洗涤液混合均匀，精密量取1mL，加入5倍的甲醇沉淀聚合物，0.22μm有机系微孔滤膜过滤样品取其续滤液为上清液及洗涤液中游离药物。用UPLC分别测定其中的药物浓度。按下式计算包封率。
包封率EE(％)＝1-Wi/W0*100％ 公式(1)
式中Wi为包封药物含量；W0为Sal,Tam-NPs纳米溶液中药物总量。
3.3 Sal,Tam-NPs纳米粒的包封率结果
平行制备4批Sal,Tam-NPs纳米粒，进行包封率的测定，具体结果见表1-9。红景天苷在纳米制剂中的包封率为3.87％，他莫昔芬的包封率为55.6％。
表1-9 Sal,Tam-NPs纳米粒的包封率
3.4 Sal,Tam-NPs纳米粒的形态
按优化处方制备Sal,Tam-NPs纳米溶液，溶液呈半透明乳白色略带蓝色乳光。实验采用场发射电子扫描电子显微镜观察纳米粒的形态，首先将冷冻干燥的样品用导电性好的粘合剂粘在金属样品台上，然后放在真空蒸发器中喷镀一层50-300埃厚的金属膜，提高样品导电性，改善图像质量。即可在扫描电镜加速电压10kV时观察粒子的形态。由图6a、图6b及图6c可见，双载药纳米粒外形圆整，均成球形。
3.5 Sal,Tam-NPs纳米粒的差示扫描量热法(DSC)分析
差示扫描量热法(Differential Scanning Calorimetry，DSC)在药品检测中应用广泛。DSC分析主要从放热和吸热过程的变化来判断药物在纳米粒中放热理化状态。主要的热变化包括熔解，分解，重结晶和热容的变化等。分别称取冻干的Sal tam-NPs，Sal，Tam，PLGA-PEG-PLGA和物理混合物(与制剂中相同比例的Sal，Tam,空白纳米粒)5-10mg放入标准的铝坩埚内，以空铝坩埚为参比，在氮气保护下，升温速率10℃/min,扫描范围30-300℃，气体流速，50mL/min，分别绘制DSC曲线图。
由图7所示，可见红景天苷在161.02℃有明显的吸热峰，他莫昔芬在100.08℃有吸热峰，物理混合物中两物质都出现了吸热峰，与单体空载纳米粒、PLGA-PEG-PLGA及双载药纳米粒均无明显的吸热峰。通过DSC分析，了解药物在纳米粒基质中的状态为分子分散无定形态还是结晶态。
3.6 Sal,Tam-NPs纳米粒的稳定性
将Sal,Tam-NPs纳米溶液置于西林瓶中，放置冰箱4℃保存，于第0，6，12，16天取样观察并测定其粒径，评价其稳定性。结果见表1-10和图8。综合实验数据得Sal,Tam-NPs纳米溶液在4℃保存12天内基本稳定。
Sal,Tam-NPs纳米溶液置于常温下超过7天会有沉淀产生，可能是因为此纳米粒表面积大，表面能高，为热力学不稳定体系，容易发生聚集。也有可能是因为该纳米溶液的Zeta电位绝对值较低。在4℃环境保存时，其稳定性显著提高，提示所制得的纳米粒更适合低温保存或者冷冻干燥成粉针剂进行保存。
表1-10纳米粒稳定性结果
3.7 Sal,Tam-NPs纳米粒的体外释药性能考察
pH7.4的磷酸缓冲盐溶液(2.5％w/v吐温80)和pH3.0的冰醋酸溶液为溶出介质，采用小杯法测定Sal,Tam-NPs制剂组和溶液组(Sal+Tam)(每组三个样品)在不同条件下的体外释放情况。具体操作步骤为：取三批制备的Sal，Tam-NPs混悬液(药物浓度：Sal，0.3μg/mL；Tam，3μg/mL)0.5mL于即用型纤维素透析袋(8000D 24mm宽)中，置于100mL具塞锥形瓶中，加入50mL溶出介质。将锥形瓶放置于透皮扩散仪中，37℃，120r/min，分别在0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0、48.0、72.0h平行取释放液0.5mL，同时补充等量的同温度溶出介质。过0.22μm滤膜，采用UPLC法测定Sal，Tam-NPs的体外释药，计算在两种介质下的红景天苷和他莫西芬的累积释放百分率(测定一定时间点释放介质中的药物量，加上已经取走的所有药物的量，除以已知的药物的总量即为药物的累积释放率)。根据药物在释放介质中的饱和溶解度可知，本实验所用得释放基质体积满足漏槽条件的要求。
用GraphPad Prism对所得的结果进行处理，以时间为横坐标，累积释放率作为纵坐标，得到相应的释药曲线图见图9a、图9b及图10所示；由释药曲线可见，在pH7释放介质中，对照组中Sal在2h内基本释放完全，达(97.7±3.32)％，纳米粒相对于对照组有显著的缓释效果，4h内的释放百分率为(58.57±3.1)％；对照组Tam在72h内释放百分率为(68.15±8.9)％，纳米粒中120h内的释放百分率为(53.2±3.0)％，纳米粒相对于对照组也有缓释效果。
在pH3释放介质中，对照组中Sal在4h内基本释放完全，达(99.97±10.7)％；纳米粒相对于对照组有显著的缓释效果，8h内的释放百分率为(100.0±4.1)％。对照组Tam在2h内释放百分率为(62.4±5.0)％，纳米粒中8h内的释放百分率为(67.3±2.7)％，纳米粒相对于对照组也具有明显的缓释效果。
由以上结果提示纳米粒在酸性环境中更容易释放。这种释放行为更有益于药物在肿瘤部位发挥作用，并可降低对正常组织的毒性。
4.CCK-8细胞毒性试验
4.1 4T1细胞培养
用倒置显微镜观察培养瓶中细胞的状态，主要看细胞的伸展和增殖状况，当细胞长到培养瓶底面积的80％左右时开始进行细胞传代。传代时弃去原培基，2mL PBS漂洗2次，加入2mL0.25％胰蛋白酶(含EDTA)，37℃消化大概2min，轻拍瓶壁使细胞脱落，加入3mLDMEM全培养基终止消化。倒入50mL无菌离心管，1000r·min-1离心3min。弃去上清液，加入3mL全培养基，用吸管吹打均匀后，取1mL细胞悬液加入75cm2培养瓶，补加9mL全培养基，放入37℃，5％CO2培养箱中培养。
4.2 Sal，Tam-NPs纳米制剂对4T1细胞的毒性研究
收集指数生长期细胞，调节细胞浓度，以8×103个/mL浓度接种到96孔细胞培养板中，100μL/孔。每个实验条件设置三个复孔，37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
弃去培养基，分别加入用DMEM高糖培养基稀释的待测药物100μL/孔，待测药物分为5组。即空白纳米粒组(按双载药制剂组稀释的浓度稀释)、双载药纳米粒组(按包封率计算Tam的浓度7.5*10-5，1.5*10-6，3*10-7，3*10-8，3*10-9；Sal的浓度2.3*10-6，4.6*10-7，9*10-8，9*10-9，3*10-10)、他莫昔芬、红景天苷组、他莫昔芬组和红景天苷组(与制剂组一致)，每组的每个浓度设3个平行孔，37℃避光，5％CO2培养24h。加入含10％(v/v)CCK-8 DMEM高糖培养基100μL/孔，设置3个平行对照孔(含有细胞培养基和CCK-8)和空白孔(含有CCK-8，无细胞培养液)，37℃避光，5％CO2培养2h后。CCK-8法检测，用酶标仪于450nm处测定细胞的OD值并记录结果，按公式(2)计算细胞存活率，并求其IC50值，考察药物对细胞影响。实验平行重复三次。
细胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]*100％ (2)
As:实验孔(含细胞的培养基，CCK-8、药物)
Ab:空白孔(含CCK-8，无细胞培养基)
Ac:对照孔(含细胞的培养基，CCK-8)
由图11得，游离Tam对4T1乳腺癌细胞的IC505.62μg/mL，Sal，Tam-NPs制剂组的IC503.34μg/ml，说明制剂组对乳腺癌细胞的体外增殖有显著的抑制作用，具有更好的体外抗癌效果。
图12的结果提示：在各浓度条件下空载纳米制剂对4T1细胞的体外增殖无抑制作用，没有毒性，具有良好的生物相容性；游离sal在各浓度条件下细胞存活率均在95％以上，对4T1细胞也没有毒性；Tam，Sal+Tam和Sal,Tam-NPs组随着药物浓度的增加，对细胞体外增殖的抑制作用也逐渐增强，且Sal,Tam-NPs纳米制剂的细胞存活率均比其它组低，在浓度(Tam)为3*10-7～7.5*10-5范围内时双载药制剂组的细胞存活率为19.29％～56.95％，而游离Tam组的细胞存活率为54.18％～79.88％，且当药物浓度在10-5(p<0.005)，10-6(p<0.05)，10-7mol/l(p<0.05)范围时，Sal,Tam-NPs组与Tam组细胞存活率有统计学差异，在各浓度下与空载纳米制剂和Sal组也具有极显著性差异。
5.体内药效学研究
5.1细胞培养和小鼠原位乳腺癌模型建立
将4T1乳腺癌细胞株进行传代培养扩增，收集指数生长期细胞，调节细胞浓度为2*106/mL，随机的选取18只健康BABL/c小鼠，在小鼠的左侧第四个乳腺脂肪垫皮下接种细胞悬液，每只小鼠接种0.1mL左右，建立实验组小鼠原位乳腺癌动物模型，至第7天全部造模成功。
5.2体内药效学研究
运用随机方法将18只荷瘤小鼠编号并分为A，B，C三组，每组6只。于当天开始按以下方式给予处理：A组为未治疗组给予生理盐水0.5mL腹腔注射；B组为他莫昔芬组给予注射Tam-LPNPs 0.5mL(12mg/kg)腹腔注射；C组为Sal,Tam-NPs组0.5mL腹腔注三组均为隔日给药一次。
5.3肿瘤体积、小鼠体重的测量
实验成瘤后，每两天测定各组小鼠的瘤体积、体重并且记录统计剩余小鼠的生存期。用游标卡尺测量18只荷瘤小鼠的肿瘤大小，以肿瘤的长径为a，横径为b，记录至实验第30天。然后运用公式(3)计算肿瘤体积。作为一种优选，运用SPSS17.0统计软件将所得数据运用软件进行统计学分析。具体公式为：V＝a*b2/2(3)
在实验第32天，编号记录小鼠死亡率。
5.4体内药效试验结果
在小鼠接种4T1细胞7天，接种部位出现瘤结节时开始给药，通过不同的给药处理后，由图13结果显示，Sal,Tam-NPs制剂组的小鼠体重降低趋势(22.6g-21.08g)虽然与其他两组比较没有统计学差异，但比模型组(22.3g-20.4g)和他莫昔芬组(23.33g-19.5g)降低缓慢，具体结果见表1-11。
由图14结果图可得，给药20天后，Sal,Tam-NPs制剂组的小鼠肿瘤体积增长趋势(94.56-1095.33mm3)比模型组(132.5-1460.1mm3)和他莫昔芬组(102.75-1205.77)的均缓。Sal,Tam-NPs组的肿瘤体积增长趋势与模型组比较具有显著差异(P<0.01)具有统计学意义。
通过给药前后32天实验后，记录小鼠的生存率，如图15所示，发现Sal,Tam-NPs组的荷瘤小鼠存活率为66.7％，均比模型组(16.7％)和他莫昔芬组(50％)高。
表1-11给药前后荷瘤小鼠的前后体重和肿瘤体积
6、小结
通过筛选PLGA-PEG-PLGA聚合物分子量、表面活性剂浓度等优处方制得Sal,Tam-NPs，其纳米粒的平均粒径约为220nm，均为粒度分布均匀的球形实体粒子，红景天苷的包封率在3.87％左右，他莫昔芬可达到55.6％左右。另通过DSC测定结果表明，Sal和Tam的特征吸热峰在Sal,Tam-NPs中消失，表明红景天苷和他莫昔芬是以无定形的状态分散于纳米粒中。稳定性实验表明实验制得的纳米粒Sal,Tam-NPs更适合低温保存或者冷冻干燥成粉针剂进行储存。
实验考察了Sal,Tam-NPs在不同条件下的体外释放行为，结果纳米粒在酸性环境和中性介质中均具有缓释的特征，且具有一定的pH敏感性。纳米粒在pH3酸性释放介质中比在pH7释放介质中释放快，有利于药物在肿瘤部位发挥长效作用，降低毒副作用。
采用CCK-8法考察了制剂和游离药物分别对4T1乳腺癌细胞的毒性，首先结果提示空载纳米制剂和Sal的细胞存活率均在95％以上，对4T1细胞没有毒性，聚合物材料具有很好的生物相容性。Sal,Tam-NPs制剂组具有显著的细胞毒性作用，相对于游离药物，制剂组对抑制乳腺癌具有更好的效果。
通过BABL/c小鼠原位乳腺癌模型，经过不同的给药处理后发现，Sal,Tam-NPs制剂组的小鼠体重降低趋势比其他两组缓慢。小鼠的肿瘤体积增长趋势也明显低于模型组(P<0.01)，同时低于他莫昔芬组。通过观察各荷瘤小鼠的生存期发现，Sal,Tam-NPs制剂组大于模型组和他莫昔芬组。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (5)

1.一种红景天苷及他莫昔芬的双载药抗乳腺癌纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将载体材料、脂质混合物及他莫昔芬溶解于有机溶剂中构成油相；
将红景天苷溶于去离子水中构成水相；
将所述水相加入到所述油相中去，超声乳化形成W/O型初乳，再加入表面活性剂，超声乳化形成W/O/W型复乳后，除去所述有机溶剂，然后进行离心操作，弃去上清液，收集沉淀物得到所述纳米制剂；
所述载体材料为分子量为7000D～15000D的聚乙二醇聚乳酸乙醇酸共聚物；
所述表面活性剂为浓度为1％～2％的聚乙烯醇水溶液；
所述脂质混合物为氢化大豆卵磷脂和胆固醇的混合物；
所述有机相与所述水相体积比为2:1～8:1；
所述超声乳化形成W/O型初乳时，超声功率为10％～15％，超声乳化形成W/O/W型复乳时，超声功率为30％～35％。
2.如权利要求1所述的红景天苷及他莫昔芬的双载药抗乳腺癌纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述超声操作使用探头式超声乳化仪搅拌，在冰浴条件下进行，每次持续2分钟，并且采用开启5秒，关闭5秒。
3.如权利要求2所述的红景天苷及他莫昔芬的双载药抗乳腺癌纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述离心操作为12000转/每分钟，持续时间60分钟。
4.如权利要求3所述的红景天苷及他莫昔芬的双载药抗乳腺癌纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶剂。
5.如权利要求4所述的红景天苷及他莫昔芬的双载药抗乳腺癌纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯醇水溶液中的聚乙烯醇分子量为30～70KD。
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