KR20140027096A - 광역학 진단 또는 치료를 위한 결합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

광역학 진단 또는 치료를 위한 결합체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 광역학 진단 또는 치료를 위한 아세틸화 생체 적합성 다당류와 프탈로시아닌 화합물의 결합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 생체 적합성 다당류를 아세틸화시키고 아세틸화된 다당류에 프탈로시아닌 화합물을 결합시킨 광역학 진단 또는 치료용 결합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 다당류를 아세틸화시킴으로써 용매에서의 용해도를 높여 여러 가지 화학적 개질이 가능하며, 암세포만을 특이적으로 표적할 수 있고 암세포에 대한 선택성과 축적성이 우수할 뿐만 아니라 근적외선 조사시 암세포를 사멸하는 효과가 우수하고 반면 암세포 이외의 세포에 대해서는 근적외선 조사시에도 세포독성을 나타내지 않아 체내 안정성이 우수한 효과가 있으므로 광역학을 이용한 질병의 진단 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있는 특징이 있다.

Description

광역학 진단 또는 치료를 위한 결합체 및 이의 제조방법{CONJUGATE FOR PHOTODYNAMIC DIAGNOSIS OR THERAPY AND METHOD FOR PREPARING SAME}
본 발명은 광역학 진단 또는 치료를 위한 아세틸화된 생체 적합성 다당류와 프탈로시아닌 화합물이 결합된 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 암세포에 대한 축적률과 표적률이 우수하고 암세포 이외의 세포에 대해서는 안정성이 우수하도록 상기 아세틸화 다당류와 프탈로시아닌 화합물이 결합되어 이루어진 생체 적합성 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
광역학 치료법(Photodynamic Therapy: PDT)은 광민감성 물질(photosensitizer, 이하 "광감각제"라 칭함)을 이용하여 수술 없이 암 등의 난치병을 치료하거나 여드름 등의 병을 치료하는 기술이다. 이러한 광역학 치료법(PDT)은 21세기 초부터 활발한 연구가 진행되어 현재에 이르러는 암의 진단과 치료, 자가골수 이식, 항생제, AIDS 치료, 피부이식 시술이나 관절염 등의 치료에 면역성을 높이기 위해 사용되고 있어 그 응용 범위는 점차 확대되고 있다.
특히, 암의 치료에 사용되는 PDT는 빛에 예민한 반응을 보이는 물질인 광감각제(photosensitizer)를 체내에 투여하면 외부에서 빛을 조사하였을 경우, 체내의 풍부한 산소와 외부 빛에 의한 화학반응으로 단일항산소(singlet oxygen) 또는 자유 라디칼(free radical)이 생성되고, 이런 단일항산소 또는 자유 라디칼이 각종 병변 부위나 암세포의 세포사멸을 유도하여 파괴하는 원리를 이용한 치료법이다.
현재 PDT 요법에 사용되고 있는 광감작제로는 포르피린(porphyrin) 유도체, 클로린(chlorin), 박테리오클로린(bacteriochlorin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 5-아미노레불린산(5-amino- levulinic acid) 유도체 등이 알려져 있으며, 광감작제로서 사이클릭 테트라피롤 유도체는 암세포에 선택적으로 축적될 뿐만 아니라 화합물의 특징상 형광이나 인광을 나타내므로 종양의 조기진단 시약으로도 활용될 수 있는 특징이 있다. 또한, 사이클릭 테트라피롤 내부에 금속이 결합되어 있는 메탈로포르피린(metalloporphyrin)의 경우에는 결합된 금속의 종류에 따라 여러 가지 특성을 나타내기 때문에 메탈로포르피린을 MRI(magnetic resonance imaging)시의 조영제(contrasting agent)로 이용하여 암세포와 같은 종양세포의 조기 진단에 응용되기도 하며, 가장 널리 알려진 광감작제인 5-아미노레불린산 유도체는 사용 방법이 단순하고 분자량이 작아 비교적 피부 침투가 용이하며, 부작용이 적어 안전하다는 장점이 있다. 그리고, 사이클릭 테트라피롤의 피롤 그룹이 벤젠고리로 컨쥬게이션, aza nitrogen으로 연결된 형태인 프탈로시아닌과 프탈로시아닌의 벤젠고리에 벤젠고리가 하나 더 컨쥬게이션된 나프탈로시아닌의 내부에 금속이 결합되어 있는 메탈로프탈로시아닌계(methallophthalocyanine) 화합물의 경우 일반 포르피린 계보다 높은 흡수파장과 몰흡광계수를 갖는 것이 보고되고 있다.
광역학 치료는 정상 세포는 그대로 보존하면서 암세포만 선택적으로 제거할 수 있는 장점이 있고, 대부분 전신 마취의 위험성을 배제할 수 있으며, 간단한 국소 마취만으로도 수술할 수 있는 등 시술이 용이한 장점도 있다.
다만, 광역학 치료는 빛이 투과하지 못하는 부피가 큰 종양세포에는 적용하기 어려우며, 특히 광감작제의 인체 내 대사가 느려 체내에 오랫동안 남아 광독성의 부작용이 발견되고 있고, 종양 내에서의 축적이 어려워서 종양 내의 광감작제의 농도가 낮아 효율적인 치료 효과를 보이지 못한다는 문제점이 있다.
또한 이러한 광역학치료는 광감작제의 반감기가 길어 시술 후 빛이 없는 환경에서 생활해야 하는 불편함이 있으며 종양으로의 축적이 어려운 단점을 가지고 있고 치료 이외의 장기간 동안 치료 화합물이 체내에 누적되어 있기 때문에 이로 인한 각종 체내의 부작용을 유발하기도 한다. 뿐만 아니라 광역학 치료용으로 사용되고 있는 광감작제들의 경우, 대부분이 친수성 제품으로서 피부 침투가 어렵기 때문에 장기간에 걸쳐 여러 차례 치료해야 하므로 치료를 위해 많은 시간이 소요된다는 문제점이 있다.
따라서 암세포에 특이적으로 축적률이 높고, 부작용이 없으며, 치료 효과가 우수할 뿐만 아니라 생체 적합성 다당류를 효율적으로 활용할 수 있는 새로운 광역학 치료제의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 감안하여 이루어진 것으로서, 광감작제인 프탈로시아닌 화합물의 종양세포에서의 축적률을 높임과 동시에 암세포에서만 특이적으로 세포독성을 나타내고 암세포 이외에서는 형광 간섭으로 인한 광독성을 현저히 줄여 주는 새로운 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제공하고자 한다.
프탈로시아닌에 -COOH 또는 -COOH로 치환된 벤젠 고리를 도입한 프탈로시아닌 화합물 또는 나프탈로시아닌 화합물과, 유기용매에 잘 용해되지 않는 생체 적합성 다당류를 아세틸화하여 화학적 성질을 개질한 상기 다당류를 복합화함으로써, 광감작제의 종양조직 내로의 축적률을 높이며 암세포 외에서는 형광간섭으로 인해 근적외선 조사시에도 세포독성을 띄지 않는 아세틸화된 생체적합성 다당류와 보다 높은 흡광계수와 근적외선 영역에서의 흡수를 보이는 광감각제가 결합된 복합체를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 아세틸화된 생체 적합성 다당류와 광감작제가 결합되어 구성된 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제공한다.
또한 본 발명은 생체 적합성 다당류를 아세틸화시키는 단계; 상기 아세틸화된 생체 적합성 다당류를 유기용매에 용해시키는 단계; 및 상기 생체적합성 다당류에 프탈로시아닌 화합물과 촉매를 첨가하여 상기 광감작제를 상기 생체 적합성 고분자에 결합시키는 단계를 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 아세틸화된 생체적합성 다당류와 프탈로시아닌 화합물을 결합시켜 제조된 것으로서 체내에서 암세포로의 축적이 용이하고 축적이 되지 않은 물질들은 형광간섭에 의해 근적외선 파장의 빛을 쬐어 주더라도 세포독성을 띄지 않는 장점이 있다. 또한, 암세포로의 축적이 이루어지면 암 세포내 효소에 의해 생체적합성 다당류와 광감작제 간의 결합이 끊어지게 되고 이때 근적외선 파장의 빛 조사시 세포독성을 나타내게 됨으로써 근적외선 조사시 항암효과를 극대화 할 수 있으며 형광을 띄게 되어 영상화에도 사용할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 아세틸화된 생체 적합성 다당류에 프탈로시아닌 화합물을 결합시킨 본 발명의 생체 적합성 결합체가 암세포 내에서 세포독성을 나타내는 기작을 나타낸 설명도이다.
도 2는 프탈로시아닌, 나프탈로시아닌, 클로린, 박테리오클로린 광감작제의 흡광도를 나타낸 그림이다.
도 3은 실시예에서 사용한 프탈로시아닌 화합물의 Maldi-TOF 분석결과를 나타낸 그림이다.
도 4는 콘드로이틴설페이트와 프탈로시아닌 화합물이 에스터 결합에 의해 결합된 Ac-Cs-Zn-Pc-COOH 결합체의 구조식을 나타낸 그림이다.
도 5는 Ac-Cs-Zn-Pc-COOH의 NMR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 Ac-Cs-Zn-Pc-COOH의 FT-IR 분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 7 내지 도 11은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 광역학 진단 또는 치료용 결합체(나노미립구)를 광산란 장치 및 전자현미경을 이용하여 관찰한 것으로서, 본 발명의 실시예 1에서 제조된 Ac-Cs-Zn-Pc-COOH가 나노미립구 형태를 이루었을 때의 크기 분포와 형태를 관찰한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 본 발명의 나노미립구, 즉 실시예1에서 제조된 Ac-Cs-Zn-Pc-COOH에 대해 형광간섭 효과가 나타날 때와 나타나지 않을 때의 형광그래프를 비교하여 나타낸 것으로서, 여러 가지 농도의 Ac-Cs-Zn-Pc-COOH를 DMSO상과 Di-water상에서의 형광값을 개질하지 않은 Zn-Pc-COOH와 비교 관찰하여 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 본 발명의 나노미립구, 즉 실시예1에서 제조된 Ac-Cs-Zn-Pc-COOH에 대해 레이저 조사에 따른 단일항산소 생성능을 나타낸 그래프로서, 여기서 ●-: 개질화하지 않은 Zn-Pc-COOH의 DMSO상에서의 산소생성을 나타낸 것이고, -○-, -▼-, -△-: 각각은 본 발명에 따른 나노미립구(Ac-Cs-Zn-Pc-COOH) 1mg, 2mg, 5mg의 DMSO상에서의 산소생성능을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 본 발명의 나노미립구, 즉 실시예2에서 제조된 Ac-Cs-Zn-Pc-COOH 나노미립구 10㎍을 암세포가 없는 배양액 A 및 암세포가 있는 배양액 B에 각각 처리하고 암세포의 효소작용에 의해 분해되어 발색하는 형광의 정도를 이미지로 나타낸 결과이다.
도 15, 16은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 본 발명의 나노미립구, 즉 실시예 1에서 제조된 Ac-Cs-Zn-Pc-COOH 및 대조군으로 사용한 개질화되지 않은 Zn-Pc-COOH를 각각 세포에 흡수시키고, 레이저를 조사한 다음 MTT 시약을 통하여 세포사멸을 관찰한 것을 비교하여 나타낸 그래프이다. 레이저 조사는 총 8분이었고, 도 15에 개질하지 않은 Zn-Pc-COOH의 레이저를 조사하지 않은 것(●-)과 조사한 경우(-○-)의 세포사멸정도를 비교하여 나타내었고, 도 16에 본 발명의 결합체인 Ac-Cs-Zn-Pc-COOH의 레이저를 조사하지 않은 것(●-)과 조사한 경우(-○-) 세포사멸정도를 비교하여 나타낸 것이다.
본 발명은 광감작제인 프탈로시아닌 화합물과 아세틸화된 생체 적합성 다당류가 결합되어 구성된 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제공한다.
본 발명에 따른 프탈로시아닌 화합물과 아세틸화된 생체 적합성 다당류가 결합된 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 암조직 또는 암세포로의 축적률과 표적률을 높이고 암조직 또는 암세포 이외에서는 형광간섭으로 인한 광독성을 현저히 줄여줄 수 있는 새로운 광역학 치료방법의 수단으로서, 아세틸화된 생체 적합성 다당류가 광감작제인 프탈로시아닌 화합물과 결합하고 있는 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제공한다.
일반적으로 생체 적합성 다당류는 물에서는 용해도가 좋지만 유기용매에서의 용해도가 낮아 기존의 유기용매에 잘 녹지 않으므로 이러한 다당류는 화학적 결합을 시키기가 어렵다. 그러나 본 발명에 따르면 상기 다당류를 아세틸화하여 유기용매에서의 용해도를 높여줌으로써 여러 가지 화학적인 개질이 가능하게 함에 그 특징이 있다. 나아가 종래의 광감작제만을 이용한 광역학치료제는 소수성이 높아 주사제로 사용하기 적합하지 않을뿐더러 암세포의 축적효율과 표적효율이 낮아 형광간섭을 일으키지 못하여 체내에서 일반세포에도 영향을 미칠 수 있으므로 국부적으로만 투여하여야 했으나 본 발명에 따르면 상기 아세틸화를 통하여 별도의 암세포 표적 물질이 없이 생체적합성 다당류 자체만으로도 암세포 표면에 과발현되어 있는 여러 가지 수용체 중 표적화되는 일부 수용체에 결합하여 암조직으로의 축적효율을 높일 수 있으며 차후에 용이하게 효소작용에 의해 분해가 된다. 이 때 형광간섭이 풀리고 근적외선 파장대에 빛을 조사해주면 암세포를 사멸시킬 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 프탈로시아닌 화합물과 생체 적합성 다당류의 결합은, 암세포 내에서 축적시 효소의 작용에 의해 프탈로시아닌 화합물과 생체 적합성 다당류간의 결합이 절단될 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 아마이드 결합(amide bond), 즉, -CO-NH-결합 또는 에스터 결합(esterbond)일 수 있으며, 생체 적합성 다당류의 CH2OH기와 프탈로시아닌 화합물에 도입된 -COOH기가 결합하여 형성되는 에스터 결합인 것이 바람직하다. 에스터 결합은 아마이드 결합을 비롯한 기타 결합에 비해 체내에서 분해효율이 높아 적은 양의 광감작제만으로도 높은 치료효과를 가질 수 있는 유용함이 있기 때문이다.
또한 본 발명에 따른 상기 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 친수성인 생체적합성 아세틸화 다당류 유도체와 소수성인 광감작제의 균형을 통해 수계에서 안정하게 나노크기의 자기조립체(self-assembly)인 나노겔 또는 나노미립구의 형태를 띨 수 있다.
본 발명에 따른 아세틸화된 다당류에 프탈로시아닌 화합물을 결합시키는 결합체의 제조 방법은 유기용매에 잘 녹지 않는 다당류를 아세틸화시킴으로써 DMSO나 포름아마이드와 같은 유기용매상에서 광감작제인 프탈로시아닌 화합물을 이용하여 제조할 수 있는 유용함을 특징으로 한다. 이하, 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체의 제조방법을 단계별로 보다 상세히 기술한다.
제1단계: 생체 적합성 다당류를 아세틸화하는 단계
본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체의 제조를 위해서는 먼저 생체 적합성 다당류를 아세틸화한다.
상기 다당류는 생체 내에서 생체적합성 및 생분해성이 우수해야 하며, 생체 내에서 안정성이 우수할 뿐만 아니라 암 조직에 효과적으로 축적되는 특성이 필요하다.
본 발명에서 사용할 수 있는 다당류로는 생체 내에서 생체적합성을 갖는 다당류 또는 다당류 유도체라면 모두 사용가능하며, 플루란(pullulan), 히알루론산(hyaluronic acid), 덱스트란(dextran) 또는 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate)를 사용할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시예에서는 콘드로이틴설페이트 유도체를 사용하였다.
본 발명에서 사용할 수 있는 상기 다당류 중에서 플루란은 흑효모(Aureobasidium pullulans (DE BARY) ARN.)로부터 생산한 다당류를 분리 정제하여 얻어지는 물질로서 주성분은 중성다당류이다. 플루란은 물에 잘 녹는 반면, 알코올류와 유류에는 녹지 않는 특성이 있고, 다른 검류에 비해 점도는 낮은 편에 속하나, 산, 알칼리, 열 등에 안정하다. 특히, 피막성 외에 강력한 점착력을 가지고 있고, 평균 분자량은 200,000과 100,000의 2종류가 있으며, 점도는 실온에서 1-2cps이다.
Figure pct00001
＜플루란의 구조식＞
또한, 본 발명에서 사용할 수 있는 다당류인 히알루론산은 황산콘드로이틴 등과 함께 주요한 뮤코다당류로 알려져 있는데 히알루론산은 N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산이 교대로 사슬 모양으로 결합한 화합물이다. 눈의 초자체나 탯줄 등에 존재하며, 점성이 크고 세균의 침입이나 독물의 침투를 막는 데 중요하다. 이것은 식물의 펙틴질과 비슷하며, 히알루로니다아제에 의하여 가수분해된다. 1934년 소의 초자체막으로부터 마이어가 처음으로 얻었고, 초자체막(hyaloid)의 우론산이라는 뜻으로 이름을 붙였다. 여기에 양친성을 주며 유기용매상에서의 용해도를 높이기 위하여 피리딘과 무수아세트산을 포름아마이드상에서 결합시켜준다.
Figure pct00002
＜히알루론산의 구조식＞
또한, 본 발명에서 사용할 수 있는 다당류인 콘드로이틴 설페이트는 연골의 주성분으로 알려진 N-아세틸갈락토사민·우론산(글루쿠론산 또는 이두론산)·황산으로 이루어지는 다당류로 피부·탯줄·육아 등 각종 결합조직에도 함유되어 있다.
우론산의 종류와 황산기의 결합위치에 따라 A, B, C, D, E 등의 형으로 나누어진다.
Figure pct00003
＜콘드로이틴 설페이트의 구조식＞
상기 본 발명에 따른 고분자는 시중에서 판매하고 있는 것을 구입하여 사용하거나, 천연으로부터 당업계에 공지된 방법으로 분리 및 정제하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 고분자 물질에 존재하는 불순물을 제거하고 순도도 높이기 위해 깨끗이 정제하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 아세틸화는 상기 다당류, 즉 상기 고분자를 유기용매에 용해시킨 후, 상기 용해된 용액에 피리딘 및 무수아세테이트를 첨가하여 수행할 수 있으며, 콘드로이틴설페이트를 포름아마이드 용매에 용해시킨 후, 피리딘 및 무수아세테이트를 첨가하여 10∼14시간 동안 상온보다 높은 온도 조건에서 교반시키는 과정을 통해 아세틸화 시킬 수 있다.
Figure pct00004
＜콘드로이틴설페이트의 아세틸화＞
제2단계: 아세틸화된 생체 적합성 다당류를 유기용매에 용해시키는 단계
상기 아세틸화된 다당류를 유기용매에 용해시키는 과정은 다당류가 유기용매 하에서 충분히 용해될 수 있도록 적당량의 유기용매를 사용하는 것이 바람직하며, 이때 유기용매의 사용량이 너무 많을 경우 DMSO나 포름아마이드와 같이 용매의 종류에 따라 차후에 투석을 통해 제거하는 과정이 매우 번거롭게 되며 유기용매의 사용량이 너무 적을 경우 고분자가 서로 엉겨붙는 현상이 일어날 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 유기용매는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 DMSO, 포름아마이드(formamide) 및 DMF 일 수 있으며, DMSO 또는 포름아마이드일 수 있다.
제3단계: 광감작제를 아세틸화된 생체 적합성 고분자에 결합시키는 단계
제2단계를 통해 아세틸화된 생체 적합성 다당류(즉, 고분자)를 유기용매에 용해시킨 후 여기에 프탈로시아닌 화합물과 촉매를 첨가하여 상기 프탈로시아닌 화합물을 상기 생체 적합성 다당류에 결합시킨다.
프탈로시아닌 화합물과 생체 적합성 다당류의 결합은, 암세포 내에서 축적시 효소의 작용에 의해 프탈로시아닌 화합물과 생체 적합성 다당류간의 결합이 절단될 수 있는 에스터 결합 또는 아마이드 결합을 형성하게 되는데, 생체 적합성 고분자의 CH2OH기와 프탈로시아닌 화합물에 도입된 -COOH기가 결합하여 형성되는 에스터 결합이 될 수 있다.
본 발명에서 상기 프탈로시아닌 화합물은 근적외선에서 형광을 띄며, 소수성이고, 카르복실화된 화합물로서 -COOH기를 포함하는 것을 사용할 수 있으며, 근적외선 범위에 반응하고 -COOH 반응기를 가지는 프탈로시아닌계 화합물이라면 그 종류는 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에 따르면, 상기 프탈로시아닌 화합물은 중심 구조에 금속이온을 포함하고 있는 프탈로시아닌, 이의 유도체, 나프탈로시아닌 또는 이의 유도체일 수 있으며, 이때 상기 중심 금속이온은 Zn, Cu, Al, Ga, Co, Fe, Ni, P 또는 Cr일 수 있다.
더욱 구체적으로, 본 발명에 따른 프탈로시아닌 화합물은 하기 화학식 1의 화합물일 수 있다.
[화학식 1]
Figure pct00005
여기서, 상기 R1R2 ,R3내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-C10알킬기, -COOH, -SO3H,또는 COOH 또는 -SO3H으로 치환되거나 비치환된 벤젠 고리일 수 있으며, 상기 M은 Zn, Cu, Al, Ga, Co, Fe, Ni, P또는 Cr일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 하기 화학식 1-1로 표시되는 프탈로시아닌 화합물을 사용하였다.
[화학식 1-1]
Figure pct00006
본 발명의 일실시예에서 사용한 상기 화학식 1-1의 프탈로시아닌 화합물은, 기존의 광감작제에 비해 600∼800 nm의 근적외선 파장에서 높은 몰흡광계수를 갖기 때문에 표적암 내부까지 깊은 침투력을 갖고, 높은 몰흡광계수 특성으로 인해 소량의 투입으로 원하는 효과를 얻을 수 있다는 점에서 우수한 광역학 치료제로 이용 가능한 물질이다.
상기 결합반응시의 촉매는 프탈로시아닌 화합물의 -COOH기를 활성화시키는 작용을 하는 물질로서, 프탈로시아닌 화합물과 함께 DMSO나 포름아미드 등의 유기용매에 용해시켜 사용하는데, 상기 촉매로는, 예를 들어 4-하이드록시메칠벤조산(4-hydroxymethylbezoic acid;DMAP) 또는 1,3-디사이클로 헥실카보디미드(1,3-dicyclohexyl carbodiimide ;DCC)를 사용할 수 있다.
또한 생체 적합성 다당류에 프탈로시아닌 화합물을 에스터 본드로 결합시키는 반응은 분자량이 상대적으로 큰 다당류와 분자량이 상대적으로 작은 촉매 및 프탈로시아닌 화합물을 반응시키는 것이기 때문에, 바람직하게는 생체 적합성 다당류에 유기용매에 용해된 프탈로시아닌 화합물과 촉매의 혼합용액을 한 방울씩 떨어뜨려 주면서 반응시켜 상기 고분자와 광감작제 사이의 에스터 결합이 충분히 형성될 수 있도록 한다. 또한, 상기 반응은 합성이 잘 될 수 있도록 45∼50시간 정도 수분이 없고 빛이 없는 환경에서 잘 섞어 주면서 반응시킬 수 있다.
이상, 기술된 방법의 반응과정을 통해 생체 적합성 다당류에 프탈로시아닌 화합물이 결합되어 구성된 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제조할 수 있다.
이 때, 상기 결합시키는 과정에서 사용한 유기용매를 제거하는 단계를 추가하는 것이 바람직한데 유기용매의 제거는 당업계에서 통상적으로 사용하는 여과 또는 투석의 방법 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 투석막을 이용하여 유기용매를 제거할 수 있다.
투석막을 통해 유기용매를 제거할 경우에는, 투석막이 열에 약한 특성이 있으므로 투석 과정 시 주변의 온도가 너무 높지 않고 상온을 유지할 수 있도록 유의해야 한다. 보다 구체적으로 DMSO나 포름아마이드와 물이 만날 때 생기는 열에 의해 쉽게 투석막이 손상될 수가 있으므로 반응액을 투석막에 넣기 전에 반응시킨 용기에 약간의 물을 첨가한 후에 식혀준다. 그 후 반응액을 투석막에 넣어서 유기용매가 완전히 제거될 때까지 수조에 넣어서 증류수를 갈아주는 것이 바람직하다.
또한 투석 과정을 거친 반응 용액은 동결 건조하는 단계를 추가할 수 있는데, 동결 건조를 통해 생체 적합성 다당류에 프탈로시아닌 화합물이 결합된 결합체를 용이하게 회수할 수 있다. 상기 동결건조는 당업계에 공지된 방법이라면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 액체 질소를 사용하여 동결 건조시킬 수 있는데, 액체 질소 상에서 약 5분 내지 15분 동안 반응 용액을 완전히 얼려준 다음, 진공 건조기를 이용하여 수분을 완전히 승화시켜 목적하는 결합체를 회수할 수 있다.
이후, 동결건조를 통해 얻어진 결합체는 미반응 물질을 제거하기 위하여 상기 DMSO나 포름아마이드 등의 유기용매에 재차 용해한 다음 상기 투석에 의한 용매제거 및 동결건조의 단계를 반복하여 회수할 수 있으며 이에 따라 순도를 높일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 생체 적합성 다당류로서 콘드로이틴설페이트를 피리딘 및 무수아세테이트를 첨가하여 아세틸화 시키고, 광감작제로 프탈로시아닌 화합물을 사용하여 상기 아세틸화된 다당류에 결합시키는 과정을 통해 광역학 진단을 위한 생체 적합성 고분자와 광감작의 결합체를 제조하였으며, 제조 과정을 모식도로 나타내면 다음과 같다.
Figure pct00007
그러므로 본 발명은 아세틸화된 다당류와 프탈로시아닌 화합물을 결합시킨 광역학 진단 또는 치료를 위한 결합체의 제조방법을 제공할 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 방법은, 생체 적합성 다당류를 아세틸화하는 단계; 상기 생체 적합성 다당류를 유기용매에 용해시키는 단계; 및 상기 생체 적합성 다당류에 유기용매에 용해된 프탈로시아닌 화합물과 촉매를 첨가하여 상기 다당류를 상기 프탈로시아닌 화합물에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다.
또한 상기 기술된 방법에 의해 제조된 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 수계에서 안정하게 나노입자, 즉, 나노겔 또는 나노미립구의 형태일 수 있으며, 평균 입자 크기는 100∼250nm 일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 결합체 제조과정에서 소수성인 프탈로시아닌 화합물의 농도를 달리하여 결합체를 제조한 다음, 각 결합체의 크기 및 형태를 동적 광산란 기기 및 전자현미경을 사용하여 측정한 결과, 프탈로시아닌 화합물을 많이 사용 할수록 소수성이 증가하여 서로 응집력이 강해져 결합체(나노미립구)의 크기가 감소하는 것으로 나타났다.
한편, 종래에 사용되던 광역학 진단 또는 치료용 광감작제의 경우, 암세포의 축적률과 표적률이 낮으며 형광간섭을 일으키지 못하기 때문에 빛을 조사하게 되면 체내에서 일반세포, 즉 정상세포에도 세포독성을 나타내므로 치료 효과가 낮고 여러 가지 부작용을 유발하는 문제점이 있었다.
그러나 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 혈액순환시 또는 정상조직에서는 근적외선 조사시에도 세포독성을 나타내지 않는 반면, 암조직 또는 암세포에만 선택적으로 표적, 축적 및 분해되어, 근적외선 파장의 빛을 조사하면 단일항산소 또는 자유라디칼을 생성하여 세포독성을 나타내어 암조직의 세포사멸을 유도함으로써 광역학 치료의 효능을 최대화 할 수 있는 특징이 있다.
나아가 암조직 또는 암세포로의 선택적인 표적을 위해 본 발명의 광역학 진 또는 치료용 결합체는 암세포 표적물질을 추가로 포함할 수 있다. 광역학 치료에서 소수성 광감작제만을 사용하는 경우, 이를 정맥주사하게 되면 혈액 내에서 단백질과 결합하고 이는 세포 표면에 위치하는 수용체를 통해서 세포 내부로 이동되는 것으로 알려져 있는데, 이러한 경우에는 광감작제의 세포선택 특이성이 단순히 광감작제의 소수성 특성에 의해서만 규정되며 또한 조직 또는 세포에서의 잔류 시간도 경우에 따라 많은 차이를 보이므로 바람직하지 않다. 또한, 이는 광역학 치료의 효과를 감소시키며 치료 후 재발 확률을 증가시키는 요인으로 지목되어 왔다.
이러한 문제점을 극복할 수 있는 방법으로는 특정한 부위에 선택적으로 작용하는지의 여부를 단순히 다양한 종류의 광감작제를 사용한 시행착오를 거치면서 선별하는 방법에만 의존하고 있는 것이 현실이다. 그러나 본 발명에서와 같이 광감작제를 효과적으로 조직 특이적으로 전달하기 위해 암세포 표적 물질을 추가적으로 결합시키면 암세포에 대한 선택성을 한층 더 높일 수 있다. 암세포 표면에는 특이한 수용체가 다량 발현되어 있어 정상세포가 아닌 암세포에만 효과적으로 표적 및 침투될 수 있다.
본 발명에 있어서 암세포 표적 물질이란 암세포의 특이한 수용체에 결합할 수 있는 것으로서 상기 암세포 표적물질은, 예를 들어 엽산, 또는 CD133, CD44, CD34 또는 Bcl-2 단백질에 대한 단일클론 항체일 수 있다.
또한, 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 레이저 조사시 세포독성을 유발시킬 수 있는 단일항산소 또는 자유라디칼 생성능을 가지고 있는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에서 제조한 결합체, 즉 나노미립구는 양성대조군으로 사용한 프탈로시아닌 화합물과 단일항산소의 생성정도가 유사한 것으로 나타났다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 암세포로 축적되지 않은 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체가 세포에 독성을 나타내는지를 확인하는 실험을 수행하였는데, 즉, 체내와 유사한 조건인 수계 상에서는 상기 결합체가 나노 미립구의 형태를 구성하여 형광간섭을 일으키기 때문에 근적외선 파장의 빛을 조사하여도 전혀 반응이 없는 것으로 나타났다. 반면, 암세포로 축적된 경우에는 세포독성을 나타내어 암세포의 세포사멸이 증가하는 것으로 나타났다.
따라서 본 발명자들은 이러한 결과를 통해 본 발명의 결합체는 암세포로 축적되지 못할 경우, 빛을 조사하여도 반응성을 나타내지 않으므로 세포독성을 나타내지 않기 때문에 체내에서 안정하며, 암세포 축적된 경우에만 세포독성을 나타내어 치료 효과를 나타낸다는 사실을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 결합체는 암세포에 선택적으로 표적 및 침투되면 암세포의 효소작용, 즉 생체내 효소인 에스터레이즈(esterase)와 같은 효소에 의해 에스터 결합이 절단(분해)되어 형광간섭이 풀림으로써 형광을 띄는 특징이 있다.
따라서 본 발명은 본 발명의 결합체가 암조직 또는 암세포에 선택적으로 축적될 경우, 암세포 내의 효소작용에 의해 형광간섭이 풀리고, 레이저 조사에 의해 암세포에서만 프탈로시아닌 광감작제가 형광발색을 나타낼 수 있기 때문에 이러한 형광 유무를 통해 암을 진단할 수도 있다.
나아가 본 발명은 본 발명에 따른 상기 결합체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 '치료'란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 상기 암 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 등의 추가성분을 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 암의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ∼ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ∼ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
상기에서 약학적으로 허용되는 추가성분이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 암 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 결합체 또는 상기 결합체를 포함하는 조성물을 이용하여 질병을 치료 또는 진단할 경우, 사용할 수 있는 광원으로는 이에 제한되지는 않으나, 초음파 조사 방출기, 광방출 다이오드, 레이저 다이오드, 염료 레이저, 할로겐화 금속 램프, 플래쉬 램프, 기계적으로 필터링된 형광 광원, 기계적으로 필터링된 백열, 및 필라멘트 광원으로 이루어진 군 중에서 선택된 생체외 광조사를 위한 광원; 및 광역학 치료용 레이저 파이버 등의 생체내 광조사를 위한 광원으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 상기 광감작제는 600nm 내지 700nm 범위의 근적외선 광선에서 활성을 나타낼 수 있다.
또한 본 발명에 따른 상기 결합체는 친수성의 다당류와 소수성의 프탈로시아닌 화합물을 포함하고 있어 상기 결합체가 나노미립구의 형태로 존재할 수 있는데, 상기 나노미립구는 치료학적 활성을 나타내는 약물 또는 생물제제를 추가로 더 포함할 수 있으며, 바람직하게는 항암제를 포함할 수 있다. 이때 상기 약물 또는 생물제제는 나노미립구 내부에 봉입된 형태로 포함될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
＜ 실시예 1＞ 광역학 진단 또는 치료용 나노미립구의 제조
＜1-1＞ 프탈로시아닌 화합물의 제조
＜1-1-1＞ Precursor R1 의 합성
4-methoxy-3,6-tert-butylphenol 3.66g (15.6mmol) 과 4-nitrophthalonitrile 2.70g (15.6mmol) 을 DMSO 100ml에 넣고 N2를 Purge 이후 reflux 온도까지 승온하였다. Reflux 시작부터 4시간 될 때까지 K2CO3를 2.86g 투입하고, 24시간 동안 유지하였다.
24시간 reflux 후 물 100ml 첨가하여 교반하며, K2CO3와 DMSO 제거하여 약간의 점도가 있는 흰색 물질을 석출하였다. 여기에 에테르를 충분히 넣어 Product만 추출한 이후 증발기로 건조하여 Pale yellow 색상의 product 1-1-1을 얻었다.
＜1-1-2＞ - COOH Precursor R2 의 합성
Pentyl-4-hydroxybenzoate 2.405g (12.37mmol) 과 4-nitrophthalonitrile 2g (11.56mmol)을 무수의 DMSO 82.5ml에 넣고 N2를 Purge 이후 reflux 온도까지 승온하였다. Reflux 시작부터 4시간 될 때까지 매 시간마다 K2CO3를 1.054g 투입하고, 29시간 동안 유지하였고, TLC 상에서 4-nitrophthalonitrile이 사라진 것을 확인하였다.
29시간 reflux 후 증발기로 건조하여 얻어진 짙은 갈색의 product를 EA와 물을 충분히 넣어 모두 녹인 후 추출하였고, 분리된 물 층은 다시 EA를 넣어 여러 번 추출 반복하여 얻어진 solution을 약 150ml만 남을 때까지 증발기로 건조하고 NaHCO3포화 수용액 200ml로 세척하였다. separatory funnel에서 잘 섞어준 후 EA층은 MgSO4를 통과시켜 얻어내고 다시 증발기를 통해 건조하여 짙은 짙은 갈색의 액상 Product를 얻었고, 컬럼을 통해 순수하게 분리된 물질 약 1g의 액상 Product 1-1-2를 얻었다.
＜1-1-3＞ 프탈로시아닌 유도체 합성
상기 제조된 1-1-2 Benzoate 전구체 0.334g과 1-1-1 alkyl 전구체 0.837g을 무수의 펜타놀 50ml에 넣고 ZnCl20.409g을 첨가 후 Ar 가스를 충분히 넣어 주었다. 반응액을 150℃까지 승온한 이후 DBU를 2.25ml를 적하하였고 이후 24시간 reflux를 진행하였다. 24시간 후 증발을 진행하여 진한 청록색의 Product를 얻었다. 얻어진 Product를 MC로 컬럼을 하고 MeOH로 정제하여 청록색 고상 물질 1-1-3을 얻었다.
얻어진 1-1-3을 THF 40ml에 용해한 용액에 LiOHH2O (1g, 23.34mmol)를 methanol: H2O7:3용액에 녹여 섞은 후 75℃까지 승온하여 17시간 reflux를 진행하였다. 17시간 reflux 이후 용액을 증발시킨 후 약 100ml MC에 녹여 0.1M HCl 수용액을 dropwise 하면서 pH2로 적정하고 상온에서 3시간 교반하였다. 이후 물을 충분히 넣어 추출(MgSO4통과)하고 CHCl3과 MeOH로 컬럼을 진행하였고, 최종 Product는 Maldi-TOF로 분자량을 확인하였고 결과는 도 3에 나타내었다.
상기 실시예를 통하여 하기 화학식 1-1의 구조식을 갖는 프탈로시아닌 화합물을 수득하였다.
[화학식 1-1]
Figure pct00008
＜1-2＞ 콘드로이티설페이트의 아세틸화
콘드로이티설페이트(0.5g)을 10ml의 포름아마이드 용매에 용해시켰다. 그 후, 피리딘 55㎕와 무수아세트산 55㎕를 넣어준 후 약간의 온도를 높여주는 조건인 55℃에서 약 12시간 동안 잘 섞어주면서 반응시켰다. 이렇게 해서 반응이 끝난 샘플은 투석막을 통해 투석해 준 다음 동결 건조시켜 회수하였다.
＜1-3＞ 아세틸화된 콘드로이티설페이트와 광감작제의 결합
상기 ＜1-2＞에서 동결건조로 회수된 아세틸화된 콘드로이티설페이트 50mg을 수분을 제거한 유기용매인 DMSO 또는 포름아마이드 10ml에 각각 용해시켰다. 한편 광감작제로서 ＜1-1＞에서 제조한 프탈로시아닌 화합물을 1mg, 2mg, 5mg을 각각 DMAP 및 DCC와 함께 DMSO나 포름아마이드 3ml에 충분히 녹여 -COOH기를 활성화시켰다. 아세틸화된 콘드로이틴설페이트가 녹아있는 상기 유기용매 10ml에 -COOH기가 활성화된 상기 각각의 광감작제 용액 3ml을 한 방울씩 떨어뜨린 후 잘 섞어주면서 약 48시간 동안 충분히 에스터 결합 반응을 시켰고, 반응이 끝난 용액은 상기 실시예 ＜1-2＞의 방법과 동일한 과정을 통해 회수하여 냉동 보관함으로써 본 발명에 따른 광역학 치료 또는 진단용 결합체인 나노미립구를 제조하고 각각의 샘플에 대해 각각 Ac-Cs-Zn-Pc-COOH1, Ac-Cs-Zn-Pc-COOH2 및 Ac-Cs-Zn-Pc-COOH3이라 칭하였다.
도 4는 콘드로이틴설페이트와 화학식 1-1의 프탈로시아닌 화합물이 에스터 결합에 의해 결합된 Ac-Cs-Zn-Pc-COOH 결합체의 구조식을 보여주며, 또한 도 6에 나타난 바와 같이 Ac-Cs-Zn-Pc-COOH의 FT-IR 분석 결과를 보면, Ac-Cs-Zn-Pc-COOH 데이터가 생체적합성 고분자와 프탈로시아닌 화합물의 결합의 특성인 에스터 결합 특성을 나타내는 1730cm-1에서 피크가 나타남을 확인하였다.
＜ 실시예 2＞ 나노미립구의 특성 분석
＜2-1＞ 나노미립구의 크기 및 형태 측정
상기 실시예 1에서 제조한 아세틸화된 콘드로이틴설페이트에 프탈로시아닌 화합물을 결합시킨 생체적합물질 샘플 세 개를 1mg/ml의 농도로 녹여서 동적광산란(Dynamic light scattering, DLS)을 사용하여 크기를 측정하고 전자현미경(Field emissionscanning electromicroscopy, FE-SEM)을 이용하여 형태를 확인하였다. 이때 정확한 사이즈의 측정을 위해 0.1M의 NaCl로 희석하여 사이즈를 측정하였다. 상기 결과는 도 7 내지 도 11로서 각각 나타내었다. 생체 적합성 다당류인 콘드로이틴설페이트에 프탈로시아닌 화합물이 에스터 결합으로 결합되어 형성된 나노미립구의 크기 및 형태는 도 9 내지 도 11에 나타낸 바와 같이 100∼800nm에 분포하며 약 230nm에 집중되어 있는 것으로 나타났다. 또한 3A에 있어서 큰 입자는 광감작제의 양이 적은 경우(Ac-Cs-Zn-PC-COOH1)를 나타내고 작은 입자는 광감작제의 양이 많은 경우(Ac-Cs-Zn-Pc-COOH2)를 나타내므로, 광감작제가 다당류에 많이 결합될수록 소수성이 증가하여 서로 응집력이 강해져 미립구의 크기가 감소한다는 것을 알 수 있었다.
＜2-2＞형광간섭의 유무 확인
상기 실시예 1에서 수득한 Ac-Cs-Zn-Pc-COOH 를 DMSO와 Di-water에 여러 가지 농도로 각각 용해한 후 KODAK 이미지 스테이션과 형광 스펙트로포토미터를 이용하여 형광현상을 확인해 보았다(도 12). 650∼750nm의 파장 범위에서 측정시에 DMSO 즉 유기용매상(A)에서는 농도에 따라 형광의 세기와 이미지와 다르게 나타났지만 Di-water에서는 자체 형광간섭이 일어나 DMSO에 비하여 월등히 낮은 형광이 나타났다. 이는 Ac-Cs-Zn-COOH가 유기용매 상에서는 미립구가 형성되지 않아 형광간섭이 일어나지 않는 반면 Di-water상에서 나노미립구를 만들면서 형광간섭현상이 일어난 결과라고 생각된다. 이러한, 결과를 통해 본 발명자들은 광역학 치료에서 암세포로 축적이 되지 않은 나노미립구의 경우, 세포독성을 띄지 않기 때문에 체내에서 안정하게 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
＜2-3＞ 나노미립구의 단일항산소 생성능 평가
상기 실시예 1의 Ac-Cs-Zn-Pc-COOH 결합체를 광역학 진단 또는 치료제로서의 사용 가능성을 검증하기 위하여 개질화되지 않은 실시예 1-1에서 제조한 프탈로시아닌계 광감작제와 비교하여 레이저 조사에 따른 단일항산소 생성능을 측정하였다. 먼저 Ac-Cs-Zn-Pc-COOH 결합체와 개질화하지 않은 프탈로시아닌계 광감작제를 유기용매인 DMF와 PBS 2ml에 각각 (프탈로시아닌계 광감작제 1.5㎍/ml) 용해 한 후, 단일항산소를 검출할 수 있는 소량의 9,10-디메틸안트라센(9,10-dimethylanthracene)을 넣어주어 20㎍/ml의 농도로 맞춰주었다. 프탈로시아닌계 광감작제가 단일항산소를 생성할 수 있는 것으로 알려진 670nm 파장의 레이저를 사용하여, 40초 간격으로 레이저를 조사한 후 형광 스펙트로포토미터(Spectro- fluorephotometer)를 이용하여 Ex 360nm, Em 380∼550nm에서 형광을 측정하였다. 상기 실험 수행의 결과, 도 13에서 보는 바와 같이 본 발명의 Ac-Cs-Zn-Pc-COOH 결합체는 개질화하지 않은 Zn-Pc-COOH와 거의 동일한 단일항산소를 생성할 수 있음을 확인하였다. 이에 따라 본 발명의 나노미립구가 표적 세포(암세포)내에서 단일항산소의 생성을 통해 암세포를 사멸시킬 수 있음을 알 수 있었다.
＜2-4＞ 암세포의 효소작용에 의한 형광간섭의 풀림측정실험
1x104의 세포수로 분주한 HeLa 세포를 96 웰 플레이트에서 배양한 후, 상기 세포들에 본 발명의 나노미립구를 10㎍으로 처리한 다음, KODAK 이미지 스테이션 기기를 이용하여 형광현상을 관찰하였다. 이때, 대조군으로는 HeLa 세포가 없는 배양액에 본 발명의 나노미립구를 처리한 것을 사용하였다. 그 결과 도 14에 나타낸 바와 같이, HeLa 세포가 없는 일반 배양액의 웰에서는 형광간섭이 풀리지 않았지만 HeLa 세포가 분주되어있는 배양액의 웰에서는 배양시간이 경과할수록 형광간섭이 풀려 형광을 띄는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서, 본 발명자들은 상기 결과를 통해 본 발명에서 제조한 나노미립구의 경우 암세포에 표적 및 축적되면 암세포의 효소작용에 의해 형광간섭이 풀리고, 이후 근적외선 파장의 빛을 조사하면 광감작제에 의해 암세포를 사멸시키는 과정을 통해 암을 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
＜2-5＞ 세포 독성 평가실험
상기 실시예 1에서 제조한 본 발명에 따른 나노미립구에 대해 세포독성 시험을 수행하였다. 먼저 암세포로서 HeLa 세포를 10％의 FBS와 1％의 페니실린이 포함되어 있는 RPMI1640 배양액에서 5％ CO2및 37℃의 온도조건에서 배양하였다. 이어서 세포 독성 실험은 상기 배양된 HeLa 세포를 96 well 플레이트에 1×104세포수로 분주하여 24시간 동안 배양시킨 후, 이튿날 본 발명에 따른 나노미립구(1.25mg의 광감작제가 첨가된 나노미립구)를 농도별로 희석하여 100㎕씩 각 웰에 첨가하였다.
이후, 나노미립구가 세포에 작용할 수 있도록 12시간 더 배양기에서 배양시켜 준 다음, 근적외선 파장대의 빛(670nm)에서 1.2 J/cm2의 양으로 조사하였다. 이때 샘플에 대해 농도와 처리시간은 같으나 상기 빛만을 조사해주지 않은 세포들과 대조군으로서 함께 비교하였다. 이후 다시 배양기에서 하루 동안 배양시켰다.
마지막으로 배양이 끝난 세포에 MTT 시약 (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl- 2H-tetrazolium bromide)을 20㎕씩 넣어 주고 3∼4시간 동안 다시 배양 시켜주었다. 4시간 후 배양액과 MTT 시약 등을 모두 제거해 주고 DMSO 150㎕씩을 가하여 세포에 형성된 청자색을 띠는 비수용성 포르마잔(formazan)을 용해시켰다. 그 후 ELIZA 분석기를 이용하여 595nm에서 흡광도를 측정함으로써 형성된 포르마잔의 양을 비교하여 세포의 생존률 및 복합체의 세포 독성을 알 수 있었다(도 15, 16).
그 결과, 도 15, 16에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 제조한 개질하지 않은 Zn-Pc-COOH 및 나노미립구를 세포에 각각 첨가하여 배양한 후 근적외선을 조사하지 않은 경우에는 조사시간에 무관하게 세포사멸이 일어나지 않은 반면, 근적외선을 조사한 경우에는 조사시간에 비례하여 세포사멸이 발생하여 세포 생존률이 감소하는 것을 알 수 있었다. 이에 따라 광감작제는 상기 실시결과와 같이 빛을 조사한 경우에만 단일항산소를 생성하여 세포를 사멸할 수 있음을 다시 한번 확인할 수 있었고, 나노미립구의 경우 세포에 첨가되면 고분자에 의해 고립된 형광간섭이 효소에 의해 풀려 정상적인 단일항산소를 생성하여 세포사멸을 일으키는 것을 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다.
본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
산업상 이용가능성
본 발명은 체내에서 암세포로의 축적이 용이하고 축적이 되지 않은 물질들은 형광간섭에 의해 근적외선 파장의 빛을 쬐어 주더라도 세포독성을 띄지 않을 수 있다. 또한, 암세포로의 축적이 이루어지면 암 세포내 효소에 의해 생체적합성 다당류와 광감작제 간의 결합이 끊어지게 되고 이때 근적외선 파장의 빛 조사시 세포독성을 나타내게 됨으로써 근적외선 조사시 항암효과를 극대화 할 수 있으며 형광을 띄게 되어 영상화에도 사용할 수 있다.

Claims (14)

  1. 프탈로시아닌 화합물과 아세틸화된 생체 적합성 다당류가 결합되어 구성된 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프탈로시아닌 화합물은 중심 구조에 금속이온을 포함하고 있는 프탈로시아닌, 이의 유도체, 나프탈로시아닌 또는 이의 유도체인 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 프탈로시아닌 화합물의 중심 금속이온은 Zn, Cu, Al, Ga, Co, Fe, Ni, P 또는 Cr인 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 프탈로시아닌 화합물은 근적외선에서 형광을 띄며, COOH기를 포함하는 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 프탈로시아닌 화합물은 하기 화학식 1의 화합물인 광역학 진단 또는 치료용 결합체:
    [화학식 1]
    Figure pct00009

    여기서,
    상기 R1내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-C10알킬기, -COOH, -SO3H,또는 COOH 또는 -SO3H으로 치환되거나 비치환된 벤젠 고리이며, 상기 M은 Zn, Cu, Al, Ga, Co, Fe, Ni, P 또는 Cr이다.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 생체 적합성 다당류는 플루란(pullulan), 히알루론산(hyaluronic acid), 덱스트란(dextran) 또는 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate)인 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 생체 적합성 고분자에 암세포 표적 물질이 추가로 결합된 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 암세포 표적 물질은 엽산, CD133, CD44, CD34 또는 Bcl-2 단백질에 대한 단일클론 항체인 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
  9. 생체 적합성 다당류를 아세틸화시키는 단계;
    상기 아세틸화된 생체 적합성 다당류를 유기용매에 용해시키는 단계; 및
    상기 생체적합성 다당류에 프탈로시아닌 화합물과 촉매를 첨가하여 상기 광감작제를 상기 생체 적합성 고분자에 결합시키는 단계를 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 생체 적합성 다당류는 플루란(pullulan), 히알루론산(hyaluronicacid), 덱스트란(dextran) 및 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체의 제조 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 프탈로시아닌 화합물은 중심 구조에 금속이온을 포함하고 있는 프탈로시아닌, 이의 유도체, 나프탈로시아닌 또는 이의 유도체인 광역학 진단 또는 치료용 결합체의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 프탈로시아닌 화합물의 중심 금속이온은 Zn, Cu, Al, Ga, Co, Fe, Ni, P 또는 Cr인 광역학 진단 또는 치료용 결합체의 제조 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 촉매는 4-하이드록시메틸벤조익에시드(4-hydroxymethylbezoicacid; DMAP) 또는 1,3-디사이클로 헥실카보디미드(1,3-dicyclohexylcarbodiimide; DCC)인 광역학 진단 또는 치료용 결합체의 제조 방법.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 포함하는 암 치료용 조성물.
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