CN109265579A - 一种具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒及其制备方法和应用，在pH=7.4的水相环境下，纳米颗粒粒径为150～250nm；在pH=5.0的酸性水相环境下，纳米颗粒粒径为350～500nm，纳米颗粒通过羧甲基化、组氨酸化与硬脂酸化制备得到，能在水相中自组装成纳米颗粒，并且在弱酸环境下产生pH响应性，以快速释放出包载药物，故可将其用于包载疏水性的抗肿瘤药物，以解决疏水性药物在人体内生物利用度较低和肿瘤药物靶向性不足的问题。

Description

一种具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒及其制 备方法和应用
技术领域
本发明公开一种具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒及其制备方法和应用，属高分子载药材料技术领域。
背景技术
白及多糖（polysaccharide of Bletillastriata）是从中药白及中提取的一种天然高分子化合物，又称白及胶、白及甘露聚糖，易溶于热水，微溶于冷水。白及多糖主链结构由β-甘露糖和β-葡萄糖以糖苷键连接而成，甘露糖和葡萄糖相比比例为2.4: 1。白及多糖分子量跨度大，从几万到几十万不等。白及多糖自身具有良好的药理活性，如促进伤口愈合、抗菌、抗老化、抗肿瘤、抗纤维化等，在临床应用已十分广泛，其自身具有良好的生物可降解性和生物相容性，主链结构上含有大量羟基，能够与多种化学活性官能团产生结合,利于修饰和改性。此外，基于白及多糖所表现出对细胞核的亲和能力，可通过对结构进行修饰从而作为靶向给药的药物载体。
组氨酸（Histidine，His）结构中含有咪唑基，在酸性环境下咪唑环会发生质子化，利用此特性，将组氨酸接枝至白及多糖糖链上使白及多糖在弱酸环境下具有pH响应性。另外，通过在多糖结构上修饰硬脂酸基团，可使原本只有亲水性质的白及多糖同时具有疏水性，这样的双亲性结构在水相体系下能自组装形成纳米颗粒。
肿瘤细胞的pH值低于正常细胞，呈弱酸性，组氨酸基团和硬脂酸基团可使该白及多糖衍生物在水相中自组装成纳米颗粒，包载疏水性的药物，并且在弱酸环境下产生pH响应性而释放所搭载的药物，实现针对肿瘤细胞的靶向给药。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒及其制备方法和应用，本发明的目的通过下述技术方案予以实现：
本发明提供一种具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒，通过羧甲基化、组氨酸化与硬脂酸化制备得到，在pH=7.4的水相环境下，其粒径为150～250nm；在pH=5.0的酸性水相环境下，其粒径为350～500nm。
本发明还提供所述具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒的制备方法，具体步骤如下：
（1）羧甲基化：将从中药白及中提取、纯化所得的白及多糖（BSP）100mg～1000mg溶于5～50mL去离子水中，得到均匀的糊状物，加入氢氧化钠溶液15～150mL，混合搅拌10～30分钟，加入2～8g一氯乙酸并充分搅拌混合，将混合物在65～75℃，保温并持续搅拌反应3～4小时，随后调节pH值至7.0，将混合物装进透析袋对去离子水透析1～3天，直至剩余试剂被消除，将透析得到的产物真空干燥处理即得羧甲基化白及多糖（CBSP）；
（2）组氨基化：取步骤（1）中制备的羧甲基化白及多糖（CBSP）粉末100mg～1000mg溶于15～150mL去离子水中，待充分溶解后加入N-羟基丁二酰亚胺（NHS）和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)，充分搅拌1～3小时以活化羧基，再加入组氨酸（L-His），20～30℃搅拌反应18～36小时，反应结束后装进透析袋对去离子水透析1～3天，直至剩余试剂被消除，将透析得到的产物真空干燥处理即得组氨基-羧甲基化白及多糖（His-BSP）；
（3）硬脂酸化：取步骤（2）中制备的组氨基-羧甲基化白及多糖His-BSP粉末100～1000mg分散在20～200mL二甲基亚砜（DMSO）中并充分搅拌直至完全溶解制得混合液A；将1.0～1.5mmol硬脂酸（SA）加入到5～15mL二甲基亚砜（DMSO）中，再加入1.0～1.5mmol的N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）和1.2～1.8mmol 的4-二甲氨基吡啶（DMAP），活化2～4小时得到混合液B，将混合液B滴加到混合液A中，在75～85℃，搅拌反应2-～4小时，然后在室温下搅拌反应18～36小时，将反应物用去离子水透析1～3天，以除去二甲基亚砜，然后用等体积的乙酸乙酯重复萃取3～5次，以除去硬脂酸残余物，40℃旋转蒸发以除去残留的乙酸乙酯，将产物真空干燥处理即得组氨基-硬脂酸基-羧甲基化白及多糖（His-SA-BSP）即为白及多糖衍生物纳米颗粒。
步骤（1）氢氧化钠溶液的浓度为3～5mol/L。
步骤（1）采用冰醋酸调节混合物pH值。
步骤（2）N-羟基丁二酰亚胺（NHS）的物质的量与羧甲基化白及多糖中的白及多糖糖单元的物质的量相等。
步骤（2）1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl) 的物质的量是羧甲基化白及多糖中的白及多糖糖单元物质的量的1.4倍。
步骤（2）组氨酸（L-His）按组氨酸与羧甲基化白及多糖中的白及多糖糖单元的摩尔比为0.5～20:1的比例加入。
步骤（1）、步骤（2）和步骤（3）透析截留分子量大于3500的物质。
步骤（1）、步骤（2）和步骤（3）真空干燥的真空度小于10Pa，先在-30℃～-50℃干燥18～24小时，再升温至40℃～60℃干燥6～12小时。
本发明还提供白及多糖衍生物纳米颗粒作为药物载体的应用，利用白及多糖衍生物纳米颗粒包载疏水性药物后靶向传递至肿瘤细胞中并释放药物。
本发明的有益效果为：
（1）本发明通过化学结构修饰的方法制备出组氨基-硬脂酸基-羧甲基化白及多糖的白及多糖衍生物纳米颗粒，使白及多糖具有pH响应性的同时兼具双亲性。
（2）本发明制备的组氨基-硬脂酸基-羧甲基化白及多糖的白及多糖衍生物纳米颗粒可作为一种用于包载疏水性药物的载体，依据目标pH靶向释放药物。
（3）通过控制反应的条件，可以制备出不同羧甲基化、不同组氨酸与不同硬脂酸取代度的产物。
（4）本发明采用的合成方法，不仅原料简单和实验成本低，而且反应速度快，容易控制。
附图说明
图1为实施例1白及多糖（BSP）的傅立叶变换-红外光谱图；
图2为实施例1羧甲基化白及多糖（CBSP）的傅立叶变换-红外光谱图；
图3为实施例1组氨基-羧甲基化白及多糖（His-BSP）的傅立叶变换-红外光谱图；
图4为实施例1组氨基-硬脂酸基-羧甲基化白及多糖（His-SA-BSP）的傅立叶变换-红外光谱图；
图5为实施例1白及多糖（BSP）的核磁共振波谱图；
图6为实施例1羧甲基化白及多糖（CBSP）的核磁共振波谱图；
图7为实施例1组氨基-羧甲基化白及多糖（His-BSP）的核磁共振波谱图；
图8为实施例1组氨基-硬脂酸基-羧甲基化白及多糖（His-SA-BSP）的核磁共振波谱图；
图9为实施例1和实施例2得到的His-SA-BSP1纳米颗粒和His-SA-BSP2纳米颗粒在不同pH条件PBS缓冲液下的Zeta电位；
图10为实施例1和实施例2得到的His-SA-BSP1纳米颗粒和His-SA-BSP2纳米颗粒在不同pH条件（pH=5.0与pH=7.4）PBS缓冲液下的粒径分布；
图11为实施例2得到的His-SA-BSP2纳米颗粒在不同pH条件（pH=5.0与pH=7.4）PBS缓冲液下的透射电镜图；
图12为实施例2得到的His-SA-BSP2纳米颗粒对四种细胞活力的影响；
图13为实施例1和实施例2得到的His-SA-BSP1和His-SA-BSP2两种载药纳米颗粒在不同pH（pH=5.0与pH=7.4）条件PBS缓冲液下的释药情况；
图14为实施例2得到的His-SA-BSP2载药纳米颗粒对三种肿瘤细胞活力的影响（图A为Dox有效含量5μg/mL，图B为Dox有效含量10μg/mL）。
具体实施方式
下面通过实施例和附图进一步阐述本发明的实质性特点和显著的进步，但本发明的保护范围绝非仅局限于实施例。
实施例1
一种具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒，通过羧甲基化、组氨酸化与硬脂酸化制备得到，在pH=7.4的水相环境下，其粒径为150～250nm；在pH=5.0的酸性水相环境下，其粒径为350～500nm。
本实施例具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒的制备方法，具体步骤如下：
（1）羧甲基化：
①从中药白及中提取、纯化白及多糖（BSP）
取白及原药材块茎在50℃烘干，粉碎后过80目筛，加入20倍体积的蒸馏水，在70℃的条件下提取4h，将提取液过滤，收集残渣，加入15倍体积的蒸馏水，在70℃下重复提取4h，过滤，合并两次提取液，参照Sevag法进行脱蛋白处理，即加入白及多糖提取液0.3倍体积的三氯甲烷，然后加入三氯甲烷0.2倍体积的正丁醇，剧烈振揺不低于15min，待静止分层，分去变质的蛋白质层，重复四次，直至蛋白质除尽，将白及多糖提取液置于50℃下旋转蒸发浓缩至原体积的1/4，加入3倍体积的95%无水乙醇，析出白色沉淀，静置过夜使沉淀完全，收集沉淀，冷冻干燥，得到白及粗多糖；
称量300mg白及粗多糖溶于20mL去离子水中，通过阴离子交换纤维素柱DEAE-52(4cm×60cm)进行柱层析，以3个柱体积的蒸馏水进行洗脱，流速为24mL/h，每5mL收集在1个试管中，采用苯酚-硫酸法进行多糖含量检测，得到一个洗脱组分，收集该组分冷冻干燥，得冻干粉末；按照质量体积比mg:mL为10:1的比例，将其溶于去离子水中，经Sephadex G-200(2.3cm×90cm)柱层析，以浓度为0.02mol/L的NaCl 洗脱，流速16mL/h，每5mL收集在1个试管中, 采用苯酚-硫酸法进行多糖含量检测，得到一个洗脱组分，收集该组分并置于透析袋中（3500da），冷冻干燥，得纯化白及多糖（BSP）；
②将所得的白及多糖（BSP）100mg溶于5mL去离子水中，得到均匀的糊状物，加入15mL浓度为3mol/L的氢氧化钠溶液，混合搅拌10分钟，加入2g一氯乙酸并充分搅拌混合，将混合物在65℃下搅拌反应4小时，反应结束后待冷却至室温，随后采用冰醋酸调节pH值至7.0，将混合物装进透析袋（3500da）对去离子水透析1天，透析截留分子量大于3500的物质，直至剩余试剂被消除，将透析得到的产物真空干燥处理即得羧甲基化白及多糖（CBSP），真空干燥的真空度为9Pa，先在-30℃干燥24小时，再升温至40℃干燥12小时；
（2）组氨基化：取步骤（1）中制备的羧甲基化白及多糖（CBSP）粉末100mg溶于15mL去离子水中，待充分溶解后加入N-羟基丁二酰亚胺（NHS）和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)，充分搅拌1小时以活化羧基，再加入组氨酸（L-His），25℃搅拌反应24小时，反应结束后装进透析袋对去离子水透析1天，透析截留分子量大于3500的物质，直至剩余试剂被消除，将透析得到的产物真空干燥处理即得组氨基-羧甲基化白及多糖（His-BSP），其中N-羟基丁二酰亚胺（NHS）的物质的量与羧甲基化白及多糖（CBSP）中的白及多糖糖单元的物质的量相等，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)的物质的量是羧甲基化白及多糖（CBSP）中的白及多糖糖单元物质的量的1.4倍，组氨酸与羧甲基化白及多糖（CBSP）中的白及多糖糖单元的摩尔比为0.5:1，真空干燥的真空度为8Pa，先在-30℃干燥24小时，再升温至40℃干燥12小时；
（3）硬脂酸化：取步骤（2）中制备的组氨基-羧甲基化白及多糖（His-BSP）粉末100mg分散在20mL二甲基亚砜（DMSO）中并充分搅拌直至完全溶解制得混合液A；将1.0mmol硬脂酸（SA）加入到5mL二甲基亚砜（DMSO）中，再加入1.0mmol的N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）和1.2mmol的4-二甲氨基吡啶（DMAP），活化2小时得到混合液B，将混合液B滴加到混合液A中，在75℃，搅拌反应4小时，然后在室温下搅拌反应24小时，将反应物装进透析袋（3500da）对去离子水透析1天，透析截留分子量大于3500的物质，以除去二甲基亚砜，然后用等体积的乙酸乙酯重复萃取3次，以除去硬脂酸残余物，40℃旋转蒸发以除去残留的乙酸乙酯，将产物真空干燥处理，真空干燥的真空度为9Pa，先在-30℃干燥24小时，再升温至40℃干燥12小时，即得组氨基-硬脂酸基-羧甲基化白及多糖（His-SA-BSP）即为白及多糖衍生物纳米颗粒，记为His-SA-BSP1。
羧甲基化取代度测定：
将0.05g羧甲基化白及多糖CBSP溶解在20mL浓度为0.1mol/L的HCl标准溶液中，将溶液充分搅拌均匀，之后，用浓度为0.1mol/L的NaOH标准溶液滴定溶液，记录在pH 2.1和pH 4.3时消耗的NaOH标准溶液的体积（V1和V2），取代度（DS）计算如下：
其中，A=（V2-V1）×c/m，m是CBSP的质量（单位：g），c是NaOH标准溶液的浓度（单位：mol/L），理论上白及多糖的最大取代度为1，测得本实施例CBSP羧甲基化取代度平均值为0.42±0.08。
组氨基化取代度测定：
称量10mg组氨基-羧甲基化白及多糖（His-BSP），使用德国Vario ELⅢ元素分析仪进行C、H、N元素分析（氧化炉温：950℃，还原炉温：500℃）得知，His-BSP中C元素含量为39.37%，H元素含量为6.44%，N元素含量为4.31%，则His-BSP中的碳和氮的质量比为：
可计算出本实施例His-BSP组氨基取代度为28.77%。
图1-4分别为本实施例1的傅立叶变换-红外光谱图，图1为白及多糖（BSP）的傅立叶变换-红外光谱图，图2为羧甲基化白及多糖（CBSP）的傅立叶变换-红外光谱图，图3为组氨基-羧甲基化白及多糖（His-BSP）的傅立叶变换-红外光谱图，图4为组氨基-硬脂酸基-羧甲基化白及多糖（His-SA-BSP）的傅立叶变换-红外光谱图；图2中FT-IR图观察到1600、1420和1325（cm-1）处的特征峰，而对比图1中此三处无明显峰存在，证明羧甲基化白及多糖CBSP结构中-CH2COOH基团的存在；图3组氨基-羧甲基化白及多糖（His-BSP）中中观察到1638和1597cm-1处的伸缩振动，这是因为His-BSP结构中His基团的C=N和N-H。
图5-8为实施例1的核磁共振波谱图，图5为白及多糖（BSP）的核磁共振波谱图；图6为羧甲基化白及多糖（CBSP）的核磁共振波谱图；图7为组氨基-羧甲基化白及多糖（His-BSP）的核磁共振波谱图；图8为组氨基-硬脂酸基-羧甲基化白及多糖（His-SA-BSP）的核磁共振波谱图；在图6中发现在δ（ppm）1.826和1.23处出现的新信号，结合在13C-NMR谱中，δ（ppm）173.37（C = O）的新信号以及新δ（ppm）20.30（-CH2-）的出现，此部分数据验证了FT-IR中羧甲基化的结果，都是羧甲基化反应成功的证据，此外，C6的峰从60ppm位移至68.90ppm，并且没有观察到C2-C5信号的变化，这表明C6自身成为羧基甲基化反应的位点；图7为组氨基-羧甲基化白及多糖（His-BSP）中观察到δ（ppm）7.28和8.56处的新峰，其归属于His分子的咪唑基团的-CH；结合His-BSP的FT-IR数据结果表明，His-BSP已成功合成；图8中δ（ppm）2.10和1.45处的新峰归属于硬脂酸（SA）的亚甲基和酯键，这是His-BSP结构中所不存在的，表明His-SA-BSP1成功合成。
实施例2
一种具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒，通过羧甲基化、组氨酸化与硬脂酸化制备得到，在pH=7.4的水相环境下，其粒径为150～250nm；在pH=5.0的酸性水相环境下，其粒径为350～500nm。
本实施例具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒的制备方法，具体步骤如下：
（1）羧甲基化：
①按照实施例1的方法从中药白及中提取、纯化白及多糖（BSP）；
②将所得的白及多糖（BSP）200mg溶于10mL去离子水中，得到均匀的糊状物，加入40mL浓度为4mol/L的氢氧化钠溶液，混合搅拌20分钟，加入5g一氯乙酸并充分搅拌混合，将混合物在70℃下搅拌反应3.5小时，反应结束后待冷却至室温，随后采用冰醋酸调节pH值至7.0，将混合物装进透析袋（3500da）对去离子水透析2天，透析截留分子量大于3500的物质，直至剩余试剂被消除，将透析得到的产物真空干燥处理即得羧甲基化白及多糖（CBSP），真空干燥的真空度为9Pa，先在-40℃干燥20小时，再升温至50℃干燥10小时；
（2）组氨基化：取步骤（1）中制备的羧甲基化白及多糖（CBSP）粉末200mg溶于25mL去离子水中，待充分溶解后加入N-羟基丁二酰亚胺（NHS）和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)，充分搅拌2小时以活化羧基，再加入组氨酸（L-His），30℃搅拌反应18小时，反应结束后装进透析袋对去离子水透析2天，透析截留分子量大于3500的物质，直至剩余试剂被消除，将透析得到的产物真空干燥处理即得组氨基-羧甲基化白及多糖（His-BSP），其中N-羟基丁二酰亚胺（NHS）的物质的量与羧甲基化白及多糖（CBSP）中的白及多糖糖单元的物质的量相等，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)的物质的量是羧甲基化白及多糖（CBSP）中的白及多糖糖单元物质的量的1.4倍，组氨酸与羧甲基化白及多糖（CBSP）中的白及多糖糖单元的摩尔比为10:1，真空干燥的真空度为8Pa，先在-40℃干燥20小时，再升温至50℃干燥10小时；
（3）硬脂酸化：取步骤（2）中制备的组氨基-羧甲基化白及多糖（His-BSP）粉末200mg分散在50mL二甲基亚砜（DMSO）中并充分搅拌直至完全溶解制得混合液A；将1.3mmol硬脂酸（SA）加入到10mL二甲基亚砜（DMSO）中，再加入1.2mmol的N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）和1.5mmol的4-二甲氨基吡啶（DMAP），活化3小时得到混合液B，将混合液B滴加到混合液A中，在80℃，搅拌反应3小时，然后在室温下搅拌反应36小时，将反应物装进透析袋（3500da）对去离子水透析2天，透析截留分子量大于3500的物质，以除去二甲基亚砜，然后用等体积的乙酸乙酯重复萃取4次，以除去硬脂酸残余物，40℃旋转蒸发以除去残留的乙酸乙酯，将产物真空干燥处理，真空干燥的真空度8Pa，先在-40℃干燥20小时，再升温至50℃干燥10小时，即得组氨基-硬脂酸基-羧甲基化白及多糖（His-SA-BSP）即为白及多糖衍生物纳米颗粒，记为His-SA-BSP2。
按照实施例1的方法测得本实施例CBSP羧甲基化取代度平均值为0.52±0.03，His-BSP组氨基取代度为33.68%。
实施例3
一种具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒，通过羧甲基化、组氨酸化与硬脂酸化制备得到，在pH=7.4的水相环境下，其粒径为150～250nm；在pH=5.0的酸性水相环境下，其粒径为350～500nm。
本实施例具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒的制备方法，具体步骤如下：
（1）羧甲基化：
①按照实施例1的方法从中药白及中提取、纯化白及多糖（BSP）；
②将所得的白及多糖（BSP）1000mg溶于50mL去离子水中，得到均匀的糊状物，加入150mL浓度为5mol/L的氢氧化钠溶液，混合搅拌30分钟，加入8g一氯乙酸并充分搅拌混合，将混合物在75℃下搅拌反应3小时，反应结束后待冷却至室温，随后采用冰醋酸调节pH值至7.0，将混合物装进透析袋（3500da）对去离子水透析3天，透析截留分子量大于3500的物质，直至剩余试剂被消除，将透析得到的产物真空干燥处理即得羧甲基化白及多糖（CBSP），真空干燥的真空度为9Pa，先在-50℃干燥18小时，再升温至60℃干燥6小时；
（2）组氨基化：取步骤（1）中制备的羧甲基化白及多糖（CBSP）粉末1000mg溶于150mL去离子水中，待充分溶解后加入N-羟基丁二酰亚胺（NHS）和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)，充分搅拌3小时以活化羧基，再加入组氨酸（L-His），20℃搅拌反应36小时，反应结束后装进透析袋对去离子水透析3天，透析截留分子量大于3500的物质，直至剩余试剂被消除，将透析得到的产物真空干燥处理即得组氨基-羧甲基化白及多糖（His-BSP），其中N-羟基丁二酰亚胺（NHS）的物质的量与羧甲基化白及多糖（CBSP）中的白及多糖糖单元的物质的量相等，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)的物质的量是羧甲基化白及多糖（CBSP）中的白及多糖糖单元物质的量的1.4倍，组氨酸与羧甲基化白及多糖（CBSP）中的白及多糖糖单元的摩尔比为20:1，真空干燥的真空度为8Pa，先在-50℃干燥18小时，再升温至60℃干燥6小时；
（3）硬脂酸化：取步骤（2）中制备的组氨基-羧甲基化白及多糖（His-BSP）粉末1000mg分散在200mL二甲基亚砜（DMSO）中并充分搅拌直至完全溶解制得混合液A；将1.5mmol硬脂酸（SA）加入到15mL二甲基亚砜（DMSO）中，再加入1.5mmol的N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）和1.8mmol的4-二甲氨基吡啶（DMAP），活化4小时得到混合液B，将混合液B滴加到混合液A中，在85℃，搅拌反应2小时，然后在室温下搅拌反应18小时，将反应物装进透析袋（3500da）对去离子水透析3天，透析截留分子量大于3500的物质，以除去二甲基亚砜，然后用等体积的乙酸乙酯重复萃取5次，以除去硬脂酸残余物，40℃旋转蒸发以除去残留的乙酸乙酯，将产物真空干燥处理，真空干燥的真空度为9Pa，先在-50℃干燥18小时，再升温至60℃干燥6小时，即得组氨基-硬脂酸基-羧甲基化白及多糖（His-SA-BSP）即为白及多糖衍生物纳米颗粒，记为His-SA-BSP3。
按照实施例1的方法测得本实施例CBSP羧甲基化取代度平均值为0.55±0.07，His-BSP组氨基取代度为36.34%。
对实施例1和实施例2制备的白及多糖衍生物纳米颗粒进行性能测试，具体如下：
（1）His-SA-BSP1和His-SA-BSP2的纳米颗粒的在不同pH缓冲液下的Zeta电位测定
Zeta电位对于纳米颗粒的稳定性至关重要，分别配制pH为5.0和7.4的PBS缓冲液，将His-SA-BSP1和His-SA-BSP2的纳米颗粒加入至缓冲液中，使其浓度不低于1mg/mL，充分搅拌使其均匀地分散在缓冲液中；通过高灵敏度Zeta电位分析仪测试His-SA-BSP1和His-SA-BSP2的纳米颗粒在不同pH缓冲液环境下的Zeta电位，如图9所示，从图中可知，在pH值为7.4时，His-SA-BSP1的Zeta电位约为-11mV；当pH降至5.0时，该值反转至7mV，这意味着纳米颗粒具有响应环境pH水平而改变其zeta电位的能力；同样的，对于His-SA-BSP2，当pH从7.4降至5.0时，Zeta电位从-12mV逆转至12mV，这是因为纳米颗粒结构中咪唑环的不饱和氮上的孤对电子的质子化-去质子化效应；因此，酸性条件可以触发咪唑基团电离并驱使纳米颗粒进入溶胀状态，一旦离子化的单体通过强静电而相互排斥，纳米颗粒链段将聚集成较大的颗粒并变得越来越不稳定。
（2）His-SA-BSP1和His-SA-BSP2纳米颗粒的在不同pH缓冲液下的粒径测定以及TEM分析
分别配制pH为5.0和7.4的PBS缓冲液，将步骤（1）中制备的纳米颗粒加入至缓冲液中，使其浓度不低于1mg/mL，充分搅拌使其均匀地分散在缓冲液中，通过动态光散射仪测试His-SA-BSP1和His-SA-BSP2纳米颗粒在不同pH缓冲液环境下的粒径以及粒径分布曲线，通过测试表明，His-SA-BSP1在pH=7.4的PBS缓冲液条件下的粒径是194.31±5.21nm，多分散系数（以下简称PDI）为0.189±0.016，在pH=5.0的PBS缓冲液条件下的粒径是364.03±7.14nm，PDI为0.195±0.022；His-SA-BSP2在pH=7.4的PBS缓冲液条件下的粒径是214.99±4.32nm，PDI为0.170±0.014，在pH=5.0的PBS缓冲液条件下的粒径是427.59±6.88nm，PDI为0.205±0.019，如图10所示，以上数据结合粒径分布图表明该纳米颗粒在缓冲液中分布范围较窄，随着缓冲液pH值的减小，粒径增大；图11为实施例2得到的His-SA-BSP2纳米颗粒在不同pH条件（pH=5.0与pH=7.4）PBS缓冲液下的透射电镜图，图中观察到纳米颗粒在pH7.4下呈球形且规则的形状，在pH 5.0下，纳米颗粒已经膨胀和受损，这与图10中粒径测试结果一致。
（3）His-SA-BSP2纳米颗粒对细胞活力的影响
使用CCK-8（细胞计数试剂盒-8）测定来测定实施例2制备的His-SA-BSP2纳米颗粒对人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7、人胃癌细胞HGC27和人肝细胞HL7702细胞系的细胞毒性，将细胞接种到96孔板（每孔2.5×10 3个细胞）上并培养24小时，随后加入不同浓度的His-SA-BSP2纳米颗粒（最后的浓度分别为200μg/mL，400μg/mL和600μg/mL），并孵育48小时，将不含有纳米颗粒处理下的细胞设定为阴性对照，然后将CCK-8溶液（10μL）加入各孔中并进一步温育（2小时，37℃），使用酶标仪测量吸光度（450nm），细胞存活率计算如下：细胞存活率=（实验组吸光值-空白组吸光值）/(对照组吸光值-空白组吸光值)×100%，测试结果如图12所示，即使His-SA-BSP2纳米颗粒浓度达到600μg/mL，细胞存活率仍保持在90％以上，这表明His-SA-BSP是无毒的并且是生物相容的并且可以用作抗癌剂的递送系统。
（4）His-SA-BSP1和His-SA-BSP2载阿霉素纳米颗粒在不同pH环境下的释放
①搭载阿霉素纳米颗粒的制备
首先，需对盐酸阿霉素进行除去盐酸盐的预处理，将3mg Dox-HCL溶解在10mL 二甲基亚砜（DMSO）中并加入30mg三乙胺（TEA），在37℃的黑暗环境下搅拌4小时以除去盐酸盐，之后，将His-SA-BSP1和His-SA-BSP2样品（6mg）分散在4mL DMSO中，然后加入到之前制备的溶液中，并将混合物在37℃下搅拌过夜，将混合物在300mL的PBS（pH7.4,0.01M）缓冲液中在黑暗中透析72小时，在整个过程中，每12小时用新鲜PBS溶液替换透析液以除去游离的阿霉素Dox，最后将装载阿霉素Dox的纳米颗粒溶液冻干，得到粉红色粉末，分别命名为Dox-His-SA-BSP1和Dox-His-SA-BSP2；
②载阿霉素纳米颗粒的不同pH环境下体外释放
分别将步骤（1）中制备的Dox-His-SA-BSP1载药纳米颗粒5mg溶解于pH值为7.4和5.0的PBS缓冲液（缓冲液体积为5mL）中，待溶解后转移到透析袋（3500Da）中，然后分别将其浸泡于pH值为7.4和5.0的新鲜PBS缓冲液（缓冲液体积为25mL）中，后续实验全程在黑暗条件下进行（37℃，100rpm），在预定的时间点，收集3mL释放溶液，同时加入同体积、同pH值的PBS缓冲液，测定释放介质中阿霉素Dox的量；Dox-His-SA-BSP2组的实验也按照上述方法进行，根据上述实验数据绘制释放曲线，如图13所示，图中显示整个释放过程可分为三个阶段：快速释放（0-8小时），具有恒定释放速率（8-48小时）的零级释放和近乎平衡的状态（48-120小时），详细而言，当pH值为5.0和7.4时，His-SA-BSP1的阿霉素Dox累积释放量分别为39.98％和20.51％，当pH值为5.0和7.4时，His-SA-BSP2的阿霉素Dox累积释放量分别为58.04％和24.16％，表明酸性较强的环境有助于更快的释放速率，也进一步证实了组氨基His基团对pH敏感性的影响。
（5）His-SA-BSP2载药纳米颗粒对肿瘤细胞的抑制
为了研究包载阿霉素Dox的纳米颗粒对人肝癌细胞HepG2，人乳腺癌细胞MCF-7，人胃癌细胞HGC27的影响，将三种肿瘤细胞与Dox-His-SA-BSP2的溶液共培养，阿霉素Dox包载量分别为5μg/mL与10μg/mL，将阿霉素Dox溶液（5μg/mL与10μg/mL）设定为对照组，按照CCK-8法进行本部分测试，实验结果如图14所示，图A为Dox有效含量5μg/mL，图B为阿霉素Dox有效含量10μg/mL，从图中可以看出，游离的阿霉素Dox和包载阿霉素Dox的纳米颗粒均以剂量依赖的方式对三种肿瘤细胞显示出抑制作用，从结果中观察到，与游离阿霉素Dox相比，纳米颗粒组的细胞抑制具有统计学差异，相比游离阿霉素Dox，Dox-His-SA-BSP2载药纳米颗粒对肿瘤细胞的活力影响更大，肿瘤细胞活力更小，综合上述分析可知，具有小尺寸的pH敏感性纳米颗粒易于通过胞吞作用直接渗透到肿瘤细胞中，这表明针对肿瘤细胞抑制率的增强。

Claims (10)

1.一种具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒，其特征在于，在pH=7.4的水相环境下，其粒径为150～250nm；在pH=5.0的酸性水相环境下，其粒径为350～500nm。
2.权利要求1所述具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）羧甲基化：将白及多糖100～1000mg溶于5～50mL去离子水中，得到均匀的糊状物，加入氢氧化钠溶液15～150mL，混合搅拌10～30分钟，加入2～8g一氯乙酸搅拌混合，将混合物在65～75℃，保温并持续搅拌反应3～4小时，随后调节pH值至7.0，将混合物对去离子水透析1～3天，将透析得到的产物真空干燥处理即得羧甲基化白及多糖；
（2）组氨基化：取步骤（1）中制备的羧甲基化白及多糖粉末100～1000mg溶于15～150mL去离子水中，待充分溶解后加入N-羟基丁二酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，搅拌1～3小时，再加入组氨酸，20～30℃搅拌反应18～36小时，反应结束后对去离子水透析1～3天，将透析得到的产物真空干燥处理即得组氨基-羧甲基化白及多糖；
（3）硬脂酸化：取步骤（2）中制备的组氨基-羧甲基化白及多糖粉末100～1000mg分散在20～200mL二甲基亚砜中并充分搅拌直至完全溶解制得混合液A；将1.0～1.5mmol硬脂酸加入到5～15mL二甲基亚砜中，再加入1.0～1.5mmol的N,N'-二环己基碳二亚胺和1.2～1.8mmol 的4-二甲氨基吡啶，活化2～4小时得到混合液B，将混合液B滴加到混合液A中，在75～85℃，搅拌反应2～4小时，再在室温下搅拌反应18～36小时，将反应物用去离子水透析1～3天，然后用等体积的乙酸乙酯重复萃取3～5次，40℃旋转蒸发，将产物真空干燥处理即得白及多糖衍生物纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）氢氧化钠溶液的浓度为3～5mol/L。
4.根据权利要求2所述具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）采用冰醋酸调节混合物pH值。
5.根据权利要求2所述具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（2）N-羟基丁二酰亚胺的物质的量与羧甲基化白及多糖中的白及多糖糖单元的物质的量相等。
6.根据权利要求2所述具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（2）1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的物质的量是羧甲基化白及多糖中的白及多糖糖单元物质的量的1.4倍。
7.根据权利要求2所述具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（2）组氨酸按组氨酸与羧甲基化白及多糖中的白及多糖糖单元的摩尔比为0.5～20:1的比例加入。
8.根据权利要求2所述具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）、步骤（2）和步骤（3）透析截留分子量大于3500的物质。
9.根据权利要求2所述具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）、步骤（2）和步骤（3）真空干燥的真空度小于10Pa，先在-30℃～-50℃干燥18～24小时，再升温至40℃～60℃干燥6～12小时。
10.权利要求1所述具有pH响应性的两亲性白及多糖衍生物纳米颗粒的应用，其特征在于，白及多糖衍生物纳米颗粒作为药物载体的应用。
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