CN110714083A - 一种hela细胞污染检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了检测Hela细胞污染的引物组，所述引物组包括2对HPV引物序列和2对STK11引物序列。本发明还提供一种HELA细胞污染检测方法。本发明同时利用HELA细胞的两种特性，共同验证细胞系是否有HELA细胞污染。本发明只要用最简单和廉价的琼脂糖凝胶电泳，无需使用昂贵的荧光染料，无需使用荧光PCR、毛细管电泳仪、激光扫描等昂贵大型设备，耗时短、成本低。

Description

一种HELA细胞污染检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种HELA细胞污染检测方法。
背景技术
HeLa细胞株来源于1952年一位美国妇女海莉耶塔·拉克斯(Henrietta Lacks)的子宫颈癌细胞的细胞系。在医学界海拉细胞被广泛应用于肿瘤研究、生物实验或者细胞培养，已经成为医学研究中非常重要的工具。作为第一个被确定能够在体外培养的人宫颈癌细胞系，HeLa细胞广泛应用于宫颈癌的研究，并且在宫颈癌细胞生物学研究和宫颈癌的诊治中发挥着重要作用。此外，HeLa细胞还作为细胞生物学的研究模型，广泛地应用于基础生物学研究。
HeLa细胞株是一种具有无限增殖能力的细胞系，可以连续传代，增殖异常迅速，细胞株不会衰老致死，并可以无限分裂下去；此细胞系跟其它癌细胞相比，感染性极强。因此，是细胞交叉污染的重要来源之一。目前已经被证明污染并完全取代了许多其他细胞系。使用错误和污染的细胞系进行研究实验，将导致研究结果错误，进而造成巨大的经济损失和社会损失。
现有检测方法是利用HELA细胞被HPV病毒感染这一特性，通过PCR的方法扩增HPV病毒的一段序列，从而来判断是否有HELA污染。但是这种方法不能有效分辨出被HPV病毒感染的其它细胞，比如被HPV病毒感染的宫颈癌细胞。因此，仅仅通过检测HPV病毒感染这种方法来判断是否有HELA污染，不能获得准确的判断结果。
因此，寻找一种能准确区分被HPV病毒感染的HELA细胞与其他宫颈癌细胞的检测方法成为本技术领域亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种HELA细胞污染检测方法。发明人通过细胞数据库(http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/sample/overview？id＝1201779)发现HeLa细胞有一个纯合的全基因突变，这个基因就是STK11，其突变类型为全基因缺失。(如图1、2所示)。因此，本发明通过同时利用HELA细胞HPV病毒感染和其全基因缺失这两种特性来共同检测样品中是否有HELA污染。本发明的技术方案通过PCR的方法同时扩增HPV的一段序列和STK11全基因缺失后两侧的一段序列，从而来判断是否有HELA污染，分辨出有HPV病毒感染的其它细胞是否有HELA污染。
本发明的第一个目的在于提供STK11全基因缺失在检测Hela细胞污染中的应用。
本发明的第二个目的在于提供一组检测Hela细胞污染的引物组，包括2对HPV引物序列和2对STK11引物序列，所述HPV引物序列如下：
上游引物5’acgagccgaaccacaacg 3’(SEQ ID NO:1)
下游引物5’agctctgcctgttcgcaa 3’(SEQ ID NO:2)
上游引物5’tgtgtgtccgtggtgtgc 3’(SEQ ID NO:3)
下游引物5’agctctgcctgttcgcaa 3’；(SEQ ID NO:4)
所述STK11引物序列如下：
上游引物5’GCGTCTCCGAGGACCAATG 3’(SEQ ID NO:5)
下游引物5’GGCTCAACACCGTGACTGC 3’(SEQ ID NO:6)
上游引物5’GGATGGCAGGTTCAACCAA3’(SEQ ID NO:7)
下游引物5’CACCGTGACTGCCGACCT 3’(SEQ ID NO:8)。
本发明的第三个目的在于提供一种HELA细胞污染检测方法，包括以下步骤：
(1)抽提待测样品的基因组DNA；
(2)以待测样品基因组DNA作为第一轮PCR模板，以MS751和HELA细胞基因组DNA分别作为PCR阴性对照和阳性对照，用SEQ ID NO:1～2和SEQ ID NO:5～6引物组合进行第一轮PCR；
(3)以第一轮PCR产物作为第二轮PCR模板，用SEQ ID NO:3～4和SEQ ID NO:7～8引物组合进行第二轮PCR；
(4)琼脂糖凝胶电泳检测第二轮产物，判断待检细胞是否被Hela细胞污染。
优选地，所述第一轮PCR反应体系为：10×PCR buffe、引物SEQ ID NO:1～2和SEQID NO:5～6、DNTP(10um)、DNA模板、Pfu DNA polymerase，dd H2O补至20μl；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性50s，57℃退火40s，72℃延伸45s，28个循环，72℃终延伸5min，4℃保温。
优选地，所述所述第二轮PCR反应体系为：10×PCR buffe、引物SEQ ID NO:3～4和SEQ ID NO:7～8、DNTP(10um)、第一次PCR产物、Pfu DNApolymerase，dd H2O补至15.2μl；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸25s，28个循环，72℃终延伸5min，4℃保温。
本发明的有益效果：本发明利用了HELA细胞STK11全基因缺失的独特性结合HELA细胞被HPV病毒感染的特点，同时扩增STK11全基因缺失位点的前后一段序列和HPV的一段序列，共同验证细胞系是否有HELA细胞污染。本发明能准确的区分被HPV病毒感染的HELA细胞与其他细胞，比如宫颈癌细胞。能有效得检测出样品中是否被HELA细胞污染。
附图说明
图1为细胞数据库中HELA细胞的综合信息的网页截图。
图2为细胞数据库中HELA细胞的突变信息的网页截图。
图3为实施例样品的检测结果。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
1、PCR引物的设计
根据STK11全基因缺失后的基因序列以及HPV基因序列设计和通过人工合成的方式获得2对HPV引物序列和2对STK11引物序列，引物序列如表1所示：
表1：
Figure BDA0002227504770000041
2、检测方法
(1)分别抽提待测样品、MS751细胞和Hela细胞的基因组DNA并定量。
(2)以基因组DNA作为第一轮PCR模板，分为5组，分组如下：
样品DNA、样品DNA+1％HeLa DNA、MS751 DNA+1％HeLa DNA、MS751 DNA和HeLaDNA。
用A组引物组合进行第一轮PCR；本步骤A组引物为：
上游引物5’acgagccgaaccacaacg 3’(SEQ ID NO:1)
下游引物5’agctctgcctgttcgcaa 3’(SEQ ID NO:2)
上游引物5’GCGTCTCCGAGGACCAATG 3’(SEQ ID NO:5)
下游引物5’GGCTCAACACCGTGACTGC 3’(SEQ ID NO:6)。
第一次PCR扩增反应体系，如表2所示：
表2：
Figure BDA0002227504770000051
第一次PCR扩增条件的设置如下：
Figure BDA0002227504770000052
(3)以第一轮PCR产物作为第二轮PCR模板，用B组引物组合进行第二轮PCR，本步骤B组引物为：
上游引物5’tgtgtgtccgtggtgtgc 3’(SEQ ID NO:3)
下游引物5’agctctgcctgttcgcaa 3’(SEQ ID NO:4)
上游引物5’GCGTCTCCGAGGACCAATG 3’(SEQ ID NO:7)
下游引物5’GGCTCAACACCGTGACTGC 3’(SEQ ID NO:8)
第二次PCR反应体系，如表3所示：
表3：
Figure BDA0002227504770000061
第二次PCR扩增条件的设置如下：
Figure BDA0002227504770000062
(4)琼脂糖凝胶电泳检测第二轮产物，判断待检细胞是否被Hela细胞污染。
3、检测结果
通过上述方法检测获得的结果如图3所示，作为阳性对照的HELA细胞在HPV条带位置和STK11条带的位置均出现目的条带，可见本发明设计的引物能同时扩增目两条明显的目的条带，通过本发明的检测方法能有效的体现HELA细胞的两种特性，即同时具有被HPV感染和STK11全基因缺失的特性。与作为阴性对照的MS751细胞相比，MS751中仅在HPV条带位置出现目的条带，说明MS751细胞仅被HPV病毒感染，而未被HELA细胞污染。MS751+1％HeLa中在HPV条带位置和STK11条带的位置均出现目的条带，说明MS751+1％HeLa同时被HPV病毒和HELA细胞感染。样品+1％HeLa中在HPV条带位置和STK11条带的位置均出现目的条带，说明样品+1％HeLa同时被HPV病毒和HELA细胞感染。样品中在HPV条带位置和STK11条带的位置均没有出现目的条带，说明样品即没有感染HPV也没有被HELA细胞污染。
由图3的结果可知，本发明的检测方法能准确的检测出被HELA细胞污染的样品和仅被感染HPV而未被HELA细胞污染的其他细胞。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州吉妮欧生物科技有限公司
<120> 一种HELA细胞污染检测方法
<130> 9.30
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
acgagccgaa ccacaacg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
agctctgcct gttcgcaa 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tgtgtgtccg tggtgtgc 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
agctctgcct gttcgcaa 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gcgtctccga ggaccaatg 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
ggctcaacac cgtgactgc 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ggatggcagg ttcaaccaa 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
caccgtgact gccgacct 18

Claims (5)

1.STK11全基因缺失在检测Hela细胞污染中的应用。
2.一组检测Hela细胞污染的引物组，其特征在于，包括2对HPV引物序列和2对STK11引物序列，所述HPV引物序列如下：
上游引物序列如SEQ ID NO:1所示；
下游引物序列如SEQ ID NO:2所示；
上游引物序列如SEQ ID NO:3所示；
下游引物序列如SEQ ID NO:4所示；
所述STK11引物序列如下：
上游引物序列如SEQ ID NO:5所示；
下游引物序列如SEQ ID NO:6所示；
上游引物序列如SEQ ID NO:7所示；
下游引物序列如SEQ ID NO:8所示。
3.一种HELA细胞污染检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)抽提待测样品的基因组DNA；
(2)以待测样品基因组DNA作为第一轮PCR模板，以MS751和HELA细胞基因组DNA分别作为PCR阴性对照和阳性对照，用SEQ ID NO:1～2和SEQ ID NO:5～6引物组合进行第一轮PCR；
(3)以第一轮PCR产物作为第二轮PCR模板，用SEQ ID NO:3～4和SEQ ID NO:7～8引物组合进行第二轮PCR；
(4)琼脂糖凝胶电泳检测第二轮产物，判断待检细胞是否被Hela细胞污染。
4.如权利要求3所述的HELA细胞污染检测方法，其特征在于，所述第一轮PCR反应体系为：10×PCR buffe、引物SEQ ID NO:1～2和SEQ ID NO:5～6、DNTP(10um)、DNA模板、PfuDNA polymerase，dd H2O补至20μl；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性50s，57℃退火40s，72℃延伸45s，28个循环，72℃终延伸5min，4℃保温。
5.如权利要求3所述的HELA细胞污染检测方法，其特征在于，所述所述第二轮PCR反应体系为：10×PCR buffe、引物SEQ ID NO:3～4和SEQ ID NO:7～8、DNTP(10um)、第一次PCR产物、Pfu DNA polymerase，dd H2O补至15.2μl；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸25s，28个循环，72℃终延伸5min，4℃保温。
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