CN102676699B

CN102676699B - 一种快速检测水环境中肠道病毒主要基因型的方法

Info

Publication number: CN102676699B
Application number: CN201210157470.XA
Authority: CN
Inventors: 吉铮; 王晓昌; 三浦尚之; 佐野大辅; 徐丽梅
Original assignee: Xian University of Architecture and Technology
Current assignee: Xian University of Architecture and Technology
Priority date: 2012-05-21
Filing date: 2012-05-21
Publication date: 2014-01-29
Anticipated expiration: 2032-05-21
Also published as: CN102676699A

Abstract

本发明公开了一种快速检测水环境中肠道病毒主要基因型的方法，该方法根据道病毒RNA在5’非编码区这一段核酸的保守性，利用肠道病毒通用引物进行半巢式PCR扩增，结合DGGE分析方法来鉴定水环境中主要肠道病毒的基因型。由于采用了半巢式PCR，大幅度提高了水环境中肠道病毒检测技术的灵敏度，并具有良好的特异性，同时结合DGGE方法能分离出不通基因型肠道病毒的PCR扩增片段，缩短了确定水环境中肠道病毒主要基因型分析鉴定的时间，避免了大通量测序所产生的昂贵费用，且与环境中常见的其他病原微生物没有交叉反应。适用于地表水、污水等多种水样的检测。

Description

一种快速检测水环境中肠道病毒主要基因型的方法

技术领域

本发明涉及一种水环境中肠道病毒主要基因型的快速检测方法，该方法根据肠道病毒RNA保守序列的通用引物，通过给引物添加GC夹板，利用半巢式PCR-DGGE技术检测肠道病毒主要基因型，适用于水环境中分析肠道病毒主要基因型的快速检测。

背景技术

逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术是以RNA为模板进行逆转录，得到互补DNA（cDNA）的第一条链，再以该cDNA链为模板进行PCR扩增反应，由此可将极微量的RNA在数小时内以几何倍数进行特异性扩增。半巢式PCR（semi-nested PCR）技术是一种变异的PCR技术，其通过使用一对半PCR引物完成核酸片段的扩增。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为半巢式引物（因其一条引物与第一对PCR引物中的一条完全相同，但另外一条引物在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。半巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低；且通过两次PCR扩增后，其检测灵敏度大大提高。因此，半巢式PCR的扩增非常特异，且灵敏度很好。

DGGE即变性梯度凝胶电泳，是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。即将特定的双链DNA片段在含有从低到高的线性变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，随着电泳的进行，DNA片段向高浓度变性剂方向迁移，当它到达其变性要求的最低浓度变性剂处，双链DNA形成部分解链状态，这就导致其迁移速率变慢，由于这种变性具有序列特异性，因此DGGE能根据核酸序列的差异将同样大小的DNA片段很理想地分开，是一种很有用分子标记方法。

现有的关于水环境中肠道病毒基因型分型方法并不多见，且在分析主要基因型时多采用大通量焦磷酸测序的方法，其费用十分昂贵。虽然PCR-DGGE技术已应用于环境微生物的细菌群落多样性检测及亲缘关系鉴定等方面，但目前还没有一套适用于水环境中肠道病毒基因分型的有效方法。

发明内容

针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种水环境中肠道病毒主要基因型的检测方法，以快速分析水环境中主要肠道病毒的基因型，并提高检测的灵敏度和特异性。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术方案：

一种快速检测水环境中肠道病毒主要基因型的方法，其特征在于，包括下列步骤：

步骤一，样品采集：用预先灭菌的采样瓶在水面下0.3m处采集水样，水样采集后放入4℃冰箱内保存；

步骤二，水样的浓缩：将含有肠道病毒的水样加入聚乙二醇（PEG）6000和NaCl，使水样中的聚乙二醇（PEG）6000浓度为8%（vol/vol），NaCl的浓度为2.3%（wt/vol），于4℃过夜，80rpm搅拌混匀，12h后，于9,000×g，4℃离心30min，收集沉淀，将沉淀用1mL的超纯水吹打混匀；

步骤三，RNA提取：利用RNA提取试剂盒提取病毒RNA；

步骤四，去除基因组DNA：将5μL的RNA和2μL的5×g DNA EraserBuffer混匀，加入1μL的g DNA Eraser，并用无核酸酶超纯水补足至10μL，42℃水浴2min，以去除体系内DNA对RNA的干扰；

步骤五，逆转录：向反应液加入4μL的5×PrimeScript buffer，1μL的PrimeScpript RT Enzyme Mix I，1μL的RT Primer Mix，用无核酸酶超纯水补足至20μL，37℃水浴15min获得逆转录产物，85℃，5s灭活反转录酶，用此反应液作为PCR模板；

步骤六，肠道病毒通用引物及其半巢式PCR扩增：

肠道病毒通用引物包括，第一轮PCR上游引物EV1的核苷酸序列为：5'-CGG CCC CTG AAT GCG GC-3'；第二轮PCR上游引物EVU1-GC的核苷酸序列为：5'-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCCCCG CCC G-CCC CTG AAT GCG GCT AAT-3'（其中GC夹板为5'-CGCCCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G-3′）；下游引物EV2的序列为：5'-CAC CGG ATG GCC AAT CCA-3'；

半巢式PCR扩增包括：

第一轮PCR：取2.5μL的10×Ex Taq Buffer，2μL的dNTP Mixture，10μmol/L上游引物EV1和10μmol/L下游引物EV2各1μL，Ex Taq酶2U，加入模板cDNA2μL，用无菌超纯水补足至25μL，以无菌超纯水作模板为阴性对照，在定性PCR仪上进行扩增；

第二轮PCR：取2.5μL的10×Ex Taq Buffer，2μL的dNTP Mixture，10μmol/L的上游引物EVU1-GC和10μmol/L的下游引物EV2各0.75μL，Ex Taq酶2U，加入1000倍稀释的第一轮PCR产物2μL，用无菌超纯水补足至25μL，以无菌超纯水作模板为阴性对照，在定性PCR仪上进行扩增；

两轮PCR扩增反应条件为：

①95℃预变性5min；

②扩增循环30次：95℃，30s；52℃，30s；72℃，30s；

③72℃延伸5min，4℃冷却；

步骤七，琼脂糖凝胶电泳检测：配制1.5%的琼脂糖凝胶，100V电泳30min，在凝胶成像仪下进行成像检测，确定阳性样本；

步骤八，配制浓度为10%的聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度为0%~100%，将阳性样品进行变性梯度凝胶电泳垂直胶检测，60℃250V电泳6h，以优化变性梯度；

步骤九，配制浓度为10%的聚丙烯酰胺凝胶，选择合适的变性梯度，将阳性样品进行变性梯度凝胶电泳平行胶检测，60℃80V电泳15h，以分离不通肠道病毒的扩增条带，在凝胶成像仪下进行成像检测，将亮带进行割胶纯化；

步骤十，利用载体连接试剂盒将纯化后产品进行载体连接，运用TSS转化法将连接产品转化至感受态细胞内，37℃200rpm培养14~16h，筛选出阳性菌落，在含有Amp的LB液体培养基中培养；

步骤十一，利用质粒提取试剂盒提取质粒，利用连接载体其自身所具有引物进行测序，确定完整的扩增核酸序列，在NCBI的BLAST中进行基因比对，确定基因型及核酸所在正负链；

步骤十二，利用clustal X 1.83进行序列比对分析，建立系统发育树。

本发明的检测方法由于采用了半巢式PCR，大幅度提高了水环境中肠道病毒检测技术的灵敏度，并具有良好的特异性，同时结合DGGE方法能分离出不通基因型肠道病毒的PCR扩增片段，缩短了确定水环境中肠道病毒主要基因型分析鉴定的时间，避免了大通量测序所产生的昂贵费用，且与环境中常见的其他病原微生物没有交叉反应，适用于地表水、污水等多种水样的检测。

附图说明

图1是该方法应用于某校园污水处理系统中化粪池上清液、污水厂进水及杂排水的半巢式PCR检测结果；其中的标记表示：M、marker，1、某校园污水处理系统化粪池上清液（用于垂直胶优化DGGE条件），2、某校园污水处理系统化粪池上清液（用于平行胶分离肠道病毒），3、污水厂进水，4、杂排水，N、NTC。

图2是DGGE平行胶优化变性梯度的电泳检测图；

图3是该方法应用于某校园污水处理系统中化粪池上清液、污水厂进水及杂排水的DGGE垂直胶检测结果；其中的标记表示：A、某校园污水处理系统化粪池上清液（用于平行胶分离肠道病毒），B、污水厂进水，C、杂排水；

图4是依据测序结果建立的系统发育树；

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

按照本发明的技术方案，首先根据肠道病毒在5’非编码区这一区域核酸的保守性，采用肠道病毒通用引物进行半巢式PCR。所述的肠道病毒通用引物包括，第一轮PCR上游引物EV1的核苷酸序列为：5'-CGG CCC CTGAAT GCG GC-3'；第二轮PCR上游引物EVU1-GC的核苷酸序列为：5'-CGCCCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G-CCCCTG AAT GCG GCT AAT-3'（其中GC夹板为5'-CGC CCG CCG CGC CCCGCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G-3'）；下游引物EV2的序列为：5'-CAC CGG ATG GCC AAT CCA-3'。经过在GenBank数据库上比对分析，与该通用引物具有高度相似性的序列都来源于肠道病毒，并未发现相似性较高的其他微生物序列。

以下是发明人给出的具体实施例：

1、设备和试剂

（1）高速冷冻离心机；

（2）离心管；

（3）4℃冰箱；

（4）磁力搅拌器；

（5）金属浴；

（6）定性PCR仪；

（7）紫外凝胶成像仪；

（8）Dcode基因突变检测系统；

（9）聚乙二醇（PEG），分子量6000；

（10）NaCl；

（11）病毒RNA提取试剂盒；

（12）去除基因组DNA试剂盒；

（13）逆转录试剂盒；

（14）定性PCR试剂盒；

（15）载体连接转化试剂盒；

（16）质粒提取试剂盒；

（17）LB液体培养基；

（18）肠道病毒通用引物包括，第一轮PCR上游引物EV1的核苷酸序列为：5'-CGG CCC CTG AAT GCG GC-3'；第二轮PCR上游引物EVU1-GC的核苷酸序列为：5'-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCGCCC CCG CCC G-CCC CTG AAT GCG GCT AAT-3'（其中GC夹板为5'-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G-3'）；下游引物EV2的序列为：5'-CAC CGG ATG GCC AAT CCA-3'。引物均由专业生物工程公司合成。

2.测定程序

（1）样品采集：用预先灭菌的采样瓶采集水样，在水面下0.3m处取水样，水样采集后放入4℃冰箱内保存，6h内进行检测；

（2）水样的浓缩：将含有肠道病毒的水样加入聚乙二醇（PEG）6000和NaCl，使水样中的聚乙二醇（PEG）6000浓度为8%（vol/vol），NaCl的浓度为2.3%（wt/vol），于4℃过夜，80rpm搅拌混匀，12h~14h后，于9,000×g，4℃离心30min，收集沉淀，将沉淀用1mL超纯水吹打混匀；

（3）RNA提取：利用RNA提取试剂盒提取病毒RNA；

（4）去除基因组DNA：将5μL RNA和2μL 5×g DNA Eraser Buffer混匀，加入1μL g DNA Eraser，并用无核酸酶超纯水补足至10μL，42℃水浴2min，以去除体系内DNA对RNA的干扰；

（5）逆转录：向上述反应液加入4μL 5×PrimeScript buffer，1μLPrimeScpript RT Enzyme Mix I，1μL RT Primer Mix，用无核酸酶超纯水补足至20μL，37℃水浴15min获得逆转录产物，85℃，5s灭活反转录酶，用此反应液作为PCR模板；

（6）肠道病毒通用引物及其半巢式PCR扩增：

肠道病毒通用引物包括，第一轮PCR上游引物EV1的核苷酸序列为：5'-CGG CCC CTG AAT GCG GC-3′；第二轮PCR上游引物EVU1-GC的核苷酸序列为：5'-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCGCCC G-CCC CTG AAT GCG GCT AAT-3'（其中GC夹板为5'-CGC CCGCCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G-3′）；下游引物EV2的序列为：5'-CAC CGG ATG GCC AAT CCA-3′；

半巢式PCR扩增包括：

第一轮PCR：取2.5μL 10×Ex Taq Buffer，2μL dNTP Mixture，10μmol/L上游引物EV1和10μmol/L下游引物EV2各1μL，Ex Taq酶2U，加入模板cDNA2μL，用无菌超纯水补足至25μL，以无菌超纯水作模板为阴性对照，在定性PCR仪上进行扩增；

第二轮PCR：取2.5μL 10×Ex Taq Buffer，2μL dNTP Mixture，10μmol/L上游引物EVU1-GC和10μmol/L下游引物EV2各0.75μL，Ex Taq酶2U，加入1000倍稀释的第一轮PCR产物2μL，用无菌超纯水补足至25μL，以无菌超纯水作模板为阴性对照，在定性PCR仪上进行扩增；

两轮PCR扩增反应条件为：

①95℃预变性5min；

②扩增循环30次：95℃，30s；52℃，30s；72℃，30s；

③72℃延伸5min，4℃冷却；

（7）琼脂糖凝胶电泳检测：配置1.5%的琼脂糖凝胶，100V电泳30min，在凝胶成像仪下进行成像检测，确定阳性样本；

（8）DGGE条件优化：配制浓度为10%的聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度为0%~100%，将阳性样品进行变性梯度凝胶电泳垂直胶检测，60℃250V电泳6h，以优化变性梯度；

（9）DGGE检测：配制浓度为10%的聚丙烯酰胺凝胶，其合适的变性梯度为10%~40%，将阳性样品进行变性梯度凝胶电泳平行胶检测，60℃80V电泳15h，以分离不通肠道病毒的扩增条带，在凝胶成像仪下进行成像检测，将亮带进行割胶纯化；

（10）连接转化：利用载体连接试剂盒将纯化后产品进行载体连接，运用TSS转化法将连接产品转化至感受态细胞内，37℃200rpm培养14~16h，筛选出阳性菌落，在含有Amp的LB液体培养基中培养；

（11）质粒提取：利用质粒提取试剂盒提取感受态细胞内的质粒，利用连接载体上自身所具有引物进行测序，确定完整的扩增核酸序列，在NCBI的BLAST中进行基因比对，确定基因型及核酸所在正负链；

（12）系统发育树的建立：利用clustal X 1.83进行序列比对分析，建立系统发育树。

参见图1，该图是将本发明的方法应用于某校园污水处理系统中化粪池上清液、污水厂进水及杂排水的半巢式PCR检测结果；图2给出了DGGE平行胶优化变性梯度的电泳检测图；图3是采用本发明的方法应用于某校园污水处理系统中化粪池上清液、污水厂进水及杂排水的DGGE垂直胶检测结果。图4是依据条带1~10的测序结果建立的系统发育树。

表1是经DGGE分离条带后所得基因序列。

表1

从图3可以看出，该方法能够较好地分离出不同肠道病毒基因型的条带，灵敏度较高，是一种实用的检测方法。

本发明的方法与现有的水环境中手足口病病毒定性RT-PCR检测技术相比较，具有以下显著的优点：

（1）良好的特异性：

本发明所设计的肠道病毒通用引物半巢式PCR具有较好的特异性，与环境中常见的其他病原微生物没有交叉反应。

（2）灵敏度大幅度提高

现有的环境水体中肠道病毒定性RT-PCR一般采用普通PCR，或者定量PCR反应，但是经过连续两次成几何倍数增长的半巢式PCR扩增，灵敏度大幅提高。

（3）耗时短、实用性强

以往的水环境中病毒检测多见于肠道病毒通用引物的检测，若进行基因型区分，则需进行较为复杂的血清学分析，或者进行大通量测序；而进行定量检测无法准确分析其主要的基因型及变化情况，难以满足实际的预防检测要求；本发明所采用的方法可直接进行水样中肠道病毒主要基因型的检测，缩短了肠道病毒主要基因型的排查时间。通过后续克隆连接转化，可对其亲缘关系直接进行分析鉴定，是一种实用性较强的检测方法。

Claims

1.一种快速检测水环境中肠道病毒主要基因型的方法，其特征在于，肠道病毒主要基因型是指CVA11、EV90、EV79、CVA22、EV96、Echo25、PV1、EV76、CVA5和PV2，包括下列步骤：

步骤一，样品采集：

用预先灭菌的采样瓶采集水样，在水面下0.3m处取水样，水样采集后放入4℃冰箱内保存；

步骤二，水样的浓缩：

将含有肠道病毒的水样加入聚乙二醇（PEG）6000和NaCl，使水样中的聚乙二醇（PEG）6000浓度为8%（vol/vol），NaCl的浓度为2.3%（wt/vol），于4℃，80rpm搅拌混匀，12h后，于9,000×g，4℃离心30min，收集沉淀，将沉淀用1mL超纯水吹打混匀；

步骤三，RNA提取：

利用RNA提取试剂盒提取病毒RNA；

步骤四，去除基因组DNA：

将5μL RNA和2μL的5×gDNA Eraser Buffer混匀，加入1μL的gDNAEraser，并用无核酸酶超纯水补足至10μL，42℃水浴2min，以去除体系内DNA对RNA的干扰；

步骤五，逆转录：

向上述反应液加入4μL5×PrimeScript buffer，1μL PrimeScpript RTEnzyme Mix I，1μL RT Primer Mix，用无核酸酶超纯水补足至20μL，37℃水浴15min获得逆转录产物，85℃，5s灭活反转录酶，用此反应液作为PCR模板；

步骤六，肠道病毒通用引物及其半巢式PCR扩增：

肠道病毒通用引物包括，第一轮PCR上游引物EV1的核苷酸序列为：5'-CGG CCC CTG AAT GCG GC-3'；

第二轮PCR上游引物EVU1-GC的核苷酸序列为：5'-CGC CCG CCGCGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G-CCC CTG AATGCG GCT AAT-3'，其中，GC夹板为：5'-CGC CCG CCG CGC CCC GCGCCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G-3'；

下游引物EV2的序列为：5'-CAC CGG ATG GCC AAT CCA-3'；

半巢式PCR扩增包括：

第一轮PCR：取2.5μL10×Ex Taq Buffer，2μL dNTP Mixture，10μmol/L上游引物EV1和10μmol/L下游引物EV2各1μL，Ex Taq酶2U，加入模板cDNA2μL，用无菌超纯水补足至25μL，以无菌超纯水作模板为阴性对照，在定性PCR仪上进行扩增；

第二轮PCR：取2.5μL10×Ex Taq Buffer，2μL dNTP Mixture，10μmol/L上游引物EVU1-GC和10μmol/L下游引物EV2各0.75μL，Ex Taq酶2U，加入1000倍稀释的第一轮PCR产物2μL，用无菌超纯水补足至25μL，以无菌超纯水作模板为阴性对照，在定性PCR仪上进行扩增；

两轮PCR扩增反应条件为：

①95℃预变性5min；

②扩增循环30次：95℃，30s；52℃，30s；72℃，30s；

③72℃延伸5min，4℃冷却；

步骤八，配制浓度为10%的聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度为0%～100%，将阳性样品进行变性梯度凝胶电泳垂直胶检测，60℃，250V电泳6h，以优化变性梯度；

步骤九，配制浓度为10%的聚丙烯酰胺凝胶，其合适的变性梯度为10%～40%，将阳性样品进行变性梯度凝胶电泳平行胶检测，60℃，80V电泳15h，以分离不同肠道病毒的扩增条带，在凝胶成像仪下进行成像检测，将亮带进行割胶纯化；

步骤十，利用载体连接试剂盒将纯化后产品进行载体连接，运用TSS转化法将连接产品转化至感受态细胞内，37℃，200rpm培养14～16h，筛选出阳性菌落，在含有Amp的LB液体培养基中培养；

步骤十一，利用质粒提取试剂盒提取质粒，利用连接载体上自身所具有引物进行测序，确定完整的扩增核酸序列，在NCBI的BLAST中进行基因比对，确定基因型及核酸所属正负链；

步骤十二，利用clustal X1.83进行序列比对分析，建立系统发育树。