CN1882702A

CN1882702A - 用rna干扰进行的协同致死筛选

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Publication number: CN1882702A
Application number: CN 200480034189
Authority: CN
Inventors: P·S·林斯利; M·毛; A·S·金; S·H·弗里恩德; S·R·巴茨; M·A·克莱里
Original assignee: Merck and Co Inc; Rosetta Inpharmatics LLC
Current assignee: Merck and Co Inc; Rosetta Inpharmatics LLC
Priority date: 2003-09-22
Filing date: 2004-09-22
Publication date: 2006-12-20

Abstract

本发明提供了用于鉴定一种细胞类型的细胞与一种试剂，如药物相互作用，例如调节其作用的一种或多种基因。例如，所鉴定的基因可以赋予对药物的抗性或敏感性，即，降低或增加药物的效果。本发明还提供了作为与编码驱动蛋白样动力蛋白的KSP具有协同致死相互作用的基因的STK6和TPX2，以及用于通过调节STK6或TPX2基因的表达和/或STK6或TPX2基因产物的活性而治疗疾病，例如癌症的方法和组合物。本发明还提供了参与对DNA破坏的细胞应答的基因，及其治疗用途。

Description

用RNA干扰进行的协同致死筛选

本申请根据35 U.S.C.119(e)要求2004年3月17日提交的美国临时专利申请No.60/554,284、2004年2月27日提交的美国临时专利申请No.60/548,568，和2003年9月22日提交的美国临时专利申请No.60/505,229的权益，所述申请在此全文引入作为参考。

1.发明领域

本发明涉及用RNA干扰进行相互作用筛选，例如，致死/协同致死(synthetic lethal)筛选的方法和组合物。本发明还涉及与KSP，即驱动蛋白样动力蛋白具有协同致死相互作用的基因，及其治疗用途。本发明还涉及参与对DNA破坏的细胞应答的基因，及其治疗用途。

2.发明背景

RNA干扰(RNAi)是用于阻抑哺乳动物细胞中的基因表达，并且在科学领域产生很多震动的有效方法(Couzin，2002，Science 298：2296-2297；McManus et al.，2002，Nat.Rev.Genet.3，737-747；Hannon，G.J.，2002，Nature 418，244-251；Paddison et al.，2002，Cancer Cell 2，17-23)。RNA干扰在从秀丽新杆线虫到人的进化过程中是保守的，并且被认为在保护细胞不受RNA病毒侵入中起作用。当细胞受到dsRNA病毒感染时，dsRNA被识别和靶定，以便由称作“切割酶(Dicer)”的III型RNA酶进行切割。切割酶酶将RNA“切块”成短的21nt的双链体，称作siRNA或短的干扰RNA，它包括19nt的完全配对的核糖核苷酸和每条链3’末端上的两个未配对的核苷酸。这些短的双链体与称作RISC的多蛋白复合物缔合，并且将这些复合物定位到与siRNA具有序列相似性的mRNA转录物。因此，存在于RISC复合物中的核酸酶切割mRNA转录物，从而取消基因产物的表达。在病毒感染的情况下，该机制将导致病毒转录物的破坏，由此阻止病毒合成。由于siRNAs是双链的，任一链都具有与RISC缔合并且指导具有序列相似性的转录物沉默的潜能。

特异性基因沉默提供了利用人类基因组数据阐释基因功能，鉴定药物靶和开发更特异的治疗的潜能。很多这样的应用为作为它们的目标的靶提供了高度的siRNA特异性。与含有与siRNA序列的部分同一性的转录物的杂交，可以诱导反映除靶基因植物外的未作为目标的转录物的沉默的表型。这会使得鉴定与表型相关的基因变得混乱。文献中的许多报道指出了siRNA的精确特异性，提示了对与siRNA序列的近乎完全的同一性的要求(Elbashir etal.，2001.EMBOJ.20：6877-6888；Tuschl et al.，1999，Genes Dev.13：3191-3197；Hutvagneret al.，Sciencexpress 297：2056-2060)。一项最新的报道表明，完全的序列互补性是siRNA靶定的转录物切割所必须的，而部分互补性将在不进行转录物降解的情况下以微RNA的方式导致翻译阻遏(Hutvagner et al.，Sciencexpress 297：2056-2060)。

对小的调节RNA，包括siRNA和miRNA的功能还没有充分理解。一个普遍存在的问题涉及确定这两类调节RNA的不同沉默途径的机制。miRNA是由基因组表达的调节RNA，并且是从前体茎-环结构加工的，以产生结合于靶mRNA的3′UTR中的序列的单链核酸(Leeet al.，1993，Cell 75：843-854；Reinhart et al.，2000，Nature 403：901-906；Lee et al.，2001，Science 294：862-864；Lau et al.，2001，Science 294：858-862；Hutvagner et al.，2001，Science 293：834-838)。miRNA与仅仅具有部分互补性的转录物序列结合(Zeng et al.，2002，Molec.Cell 9：1327-1333)，并且在不影响稳态RNA水平的情况下阻抑翻译(Lee et al.，1993，Cell 75：843-854；Wightman et al.，1993，Cell 75：855-862)。miRNA和siRNA都由“切割器”加工，并且与RNA诱导的沉默复合物的成分缔合(Hutvagner et al.，2001，Science293：834-838；Grishok et al.，2001，Cell 106：23-34；Ketting et al.，2001，Genes Dev.15：2654-2659；Williams et al.，2002，Proc.Nntl.Acad.Sci.USA 99：6889-6894；Hammond et al.，2001，Science 293：1146-1150；Mourlatos et al.，2002，Genes Dev.16：720-728)。最近的一项报道(Hutvagner et al.，2002，Sciencexpress 297：2056-2060)假设了仅仅通过与靶转录物的互补性程度确定通过miRNA途径对siRNA途径的调节。推测仅仅与mRNA靶具有部分同一性的siRNA与miRNA相似，将在翻译阻抑中起作用，而不是引发RNA降解。

也已经证明，siRNA和shRNA可以用于在体内使基因沉默。利用siRNA和shRNA在体内进行基因沉默的能力，具有使得能够为了治疗用途而选择和开发siRNA的潜能。最近的报道强调了siRNA的潜在治疗应用。Fas介导的细胞凋亡与广泛的肝病谱相关，而可以通过抑制肝细胞的凋亡性死亡保留肝脏。Song(Song et al.2003，Nat.Medicine 9，347-351)用靶定于Fas受体的siRNA对小鼠进行静脉注射。在小鼠肝细胞中，在mRNA和蛋白水平对Fas基因进行沉默，阻止凋亡，并且保护小鼠免受肝炎诱导的肝破坏。这样，沉默Fas表达，保持了通过保护肝细胞免受细胞毒性而防止肝损伤的治疗前景。作为另一个例子，用靶定TNF-α的siRNA对小鼠进行腹膜内注射。抑制了脂多糖诱导的TNF-α基因表达，并且保护这些小鼠免受脓毒症。集中地，这些结果提示siRNA可以在体内起作用，并且具有作为治疗药物的潜能(Sorensen et al.，2003，J.Mol.Biol.327，761-766)。

Martinez等人报道了可以用RNA干扰选择性靶定癌基因突变(Martinez et al.，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：14849-14854)。在该报道中，证明了靶定含点突变的p53的R248W突变体的区域的siRNA使突变p53的表达沉默，但不使野生型p53的表达沉默。

Wilda等报道了可以将靶定M-BCR/ABL融合mRNA的siRNA用于去除白血病细胞中的M-BCR/ABL mRNA和M-BRC/ABL癌蛋白(Wilda et al.，2002，Oncogene 21：5716-5724)。但是，该报道也表明将siRNA与Imatinib(一种小分子ABL激酶酪氨酸抑制剂)联合用于白血病细胞，不进一步增加凋亡的诱导。

美国专利No.6,506,559公开了用于抑制细胞中的靶基因表达的RNA干扰方法。该方法包括将在双链区具有与靶基因中的序列等同的序列的部分或完全双链RNA导入细胞中或导入细胞外环境中。具有相对于靶序列的插入、缺失和单点突变的RNA序列也被发现可有效抑制表达。

美国专利申请公开No.US2002/0086356公开了采用长度为21-23个核苷酸(nt)的RNA片段在果蝇体外系统中的RNA干扰。该专利申请公开教导了当将这些21-23nt片段纯化并且加回到果蝇提取物中时，它们介导不存在长dsRNA时的序列特异性RNA干扰。该专利申请公开也教导了，也可以将具有相同或相似性质的化学合成的寡核苷酸用于靶定特异性mRNA，用于在哺乳动物细胞中降解。

PCT公开WO02/44321公开了长度为19-23nt的双链RNA(dsRNA)诱导果蝇体外系统中的序列特异性转录后基因沉默。该PCT公开教导了通过III型RNA酶样加工反应从长dsRNA产生的短干扰RNA(siRNA)或化学合成的具有突出的3’末端的siRNA双链体，能够介导裂解物中的有效靶RNA切割，并且切割位点位于引导siRNA所跨越的区域的中心附近。该PCT公开也提供了证据，证明dsRNA加工的方向确定了可以通过产生的siRNP复合物切割有义还是反义靶RNA。

美国专利申请公开No.US 2002/016216公开了减弱培养的细胞中靶基因表达的方法，这是通过将双链RNA(dsRNA)以足以减弱靶基因表达的量导入细胞中而实现的，所述双链RNA包含在严格条件下与靶基因的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

PCT公开WO 03/006477公开了工程化的RNA前体，当其在细胞中表达时，由细胞加工，以产生靶定的小干扰RNA(siRNA)，所述小干扰RNA用细胞自身的RNA干扰(RNAi)途径选择性地使靶定的基因沉默(通过切割特异性mRNA)。该PCT公开教导了通过用合适的调节序列将编码这些工程化的RNA前体的核酸分子导入细胞中，可以在时间和空间上，即，在特定时间和/或在特定组织、器官或细胞中选择性地控制工程化的RNA前体的表达。

此处对参考文献的讨论和引用，不应该解释为承认所述参考文献是本发明的现有技术。

3.发明概述

本发明提供了使用RNA干扰鉴定基因或其产物和一种试剂，如药物和/或另一种基因或其产物之间的相互作用，如致死/协同致死相互作用的方法和组合物。本发明还提供了利用STK6激酶或TPX2和驱动蛋白样动力蛋白KSP抑制剂之间的协同致死相互作用而治疗癌症的方法和组合物。本发明还提供了参与对DNA破坏的细胞应答的基因，及其治疗用途。

一方面，本发明提供了鉴定基因的方法，所述基因的产物调节一种试剂对一种细胞类型的细胞的作用。该方法包括(a)使所述细胞类型的一种或多种细胞的大量的组与所述试剂接触，其中每个所述的一种或多种细胞的组包含来自大量的不同siRNA的一种或多种不同的小干扰RNA(siRNA)，所述一种或多种不同的siRNA靶定相同的基因，并且所述大量的不同siRNA包含分别靶定所述细胞类型的细胞中的不同基因的siRNA；(b)将所述试剂对每个所述的一种或多种细胞的组的作用与所述试剂对不包含靶定任一所述不同基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用进行比较；和(c)如果所述试剂对包含靶定所述基因的所述一种或多种不同siRNA的所述一种或多种细胞的组的作用与所述试剂对不包含靶定任一所述不同基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用不同，则鉴定基因为所述的其产物调节所述试剂对所述细胞类型的细胞的作用的基因。在一种实施方案中，包含所述大量siRNA中的一种或多种的每个所述的细胞组是通过在所述接触步骤之前用所述一种或多种siRNA转染而获得的。在一个实施方案中，对每个所述的一种或多种细胞的组分开进行接触步骤(a)。

在一种特定的实施方案中，本发明提供了鉴定基因的方法，所述基因的产物调节一种试剂对一种细胞类型的细胞的作用，所述方法包括(a)用包含来自大量的不同siRNA的一种或多种不同的小干扰RNA(siRNA)的组合物转染所述细胞类型的一种或多种细胞的大量的组中的每一个，所述一种或多种不同的siRNA靶定相同的基因，并且所述大量的不同siRNA包含分别靶定所述细胞类型的细胞中的不同基因的siRNA；(b)使一种或多种细胞的所述大量的组与所述试剂接触；(c)将所述试剂对每个所述的一种或多种细胞的组的作用与所述试剂对没有用靶定任一所述不同基因的siRNA转染的所述细胞类型的细胞的作用进行比较；和(d)如果所述试剂对包含靶定所述基因的所述一种或多种不同siRNA的所述一种或多种细胞的组的作用与所述试剂对不包含靶定任一所述不同基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用不同，则鉴定基因为所述的其产物调节所述试剂对所述细胞类型的细胞的作用的基因。

与所述试剂对不包含靶定任一所述不同基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用相比，所述试剂对包含所述一种或多种不同siRNA的每个所述一种或多种细胞的组的作用可以增强。或者，与所述试剂对不包含靶定任一所述不同基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用相比，所述试剂对包含所述一种或多种不同siRNA的每个所述一种或多种细胞的组的作用可以减弱。

优选地，所述试剂作用于由所述大量siRNA靶定的任一所述不同基因以外的基因或其编码的蛋白。优选地，所述大量siRNA包含靶定至少一种所述不同基因的至少k种不同的siRNA，其中所述k选自2、3、4、5、6和10。更优选地，所述大量siRNA包含靶定所述不同基因中的至少两种不同基因中的每一种的至少k种不同的siRNA，其中所述k选自2、3、4、5、6和10。仍然更优选地，所述大量siRNA包含靶定所述不同基因中的每一种的至少k种不同的siRNA，其中所述k选自2、3、4、5、6和10。

优选地，所述大量不同基因中的至少一种、至少两种、或每一种都包含靶定相同靶基因的2、3、4、5、6或10种不同的siRNA。在一种优选实施方案中，一种或多种siRNA的总siRNA浓度大约与单独使用的单一siRNA的浓度相同，例如100nM。优选地，一种或多种siRNA的总siRNA浓度是用于使作为目标的靶基因沉默的最优浓度。最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，基本不增加沉默的水平。在一种实施方案中，最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，沉默水平的增加不超过5％、10％或20％。在一种优选实施方案中，一种或多种siRNA中包含的每种siRNA的比例相同。在另一种优选实施方案中，一种或多种siRNA中包含的每种siRNA彼此之间的差别小于5％、10％、20％或50％。在一种优选实施方案中，一种或多种siRNA中的至少一种，占一种或多种siRNA的总siRNA浓度的90％、80％、70％、50％或20％以上。在另一种优选实施方案中，一种或多种siRNA中没有一种siRNA占一种或多种siRNA的总siRNA浓度的90％、80％、70％、50％或20％以上。在一种优选实施方案中，选择一种或多种siRNA的组成，包括不同siRNA的数目和每一种siRNA的浓度，使得一种或多种siRNA导致任何不作为靶的基因的沉默小于30％、20％、10％或5％、1％、0.1或0.01％。在另一种实施方案中，一种或多种siRNA中的每一种siRNA的浓度都低于单独使用时的最优浓度。在一种优选实施方案中，一种或多种siRNA中的至少一种siRNA的浓度低于有效达到不存在其它siRNA或不存在其它设计用于使基因沉默的siRNA时的基因沉默的至少30％、50％、75％、80％、85％、90或95％的siRNA浓度。在另一种优选实施方案中，一种或多种siRNA中的每一种不同siRNA的浓度导致的基因沉默低于不存在其它siRNA或不存在其它设计用于使基因沉默的siRNA时的基因沉默的30％、20％、10％或5％。在一种优选实施方案中，每种siRNA的浓度导致的靶基因沉默低于单独使用时导致的靶基因沉默的30％、20％、10％或5％，而所述大量siRNA导致靶基因沉默的至少80或90％。

在一种实施方案中，所述细胞类型是癌细胞类型。在另一种实施方案中，所述作用是生长抑制作用。在一种特定的实施方案中，所述试剂是KSP抑制剂。在优选实施方案中，所述不同的基因包含至少5种、至少10种、至少100种、或至少1000种不同的基因。在一种实施方案中，所述不同的基因是不同的内源基因。

在另一方面，本发明提供了用于鉴定与一种细胞类型的细胞中的初级(primary)靶基因相互作用的基因的方法。该方法包括(a)使所述细胞类型的一种或多种细胞的大量的组与一种试剂接触，其中所述试剂调节所述初级靶基因的表达和/或由所述初级靶基因编码的蛋白的活性，并且其中所述细胞的组包含大量的不同siRNA中的一种或多种不同的siRNA，所述一种或多种不同的siRNA靶定相同的基因，并且所述大量的不同siRNA包含分别靶定所述细胞中的不同次级(secondary)基因的siRNA；(b)将所述试剂对每个所述的一种或多种细胞的组的作用与所述试剂对不包含靶定任一所述不同次级基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用进行比较；和(c)如果所述试剂对包含靶定所述基因的一种或多种不同siRNA的所述一种或多种细胞的组的作用与所述试剂对不包含靶定任一所述不同次级基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用不同，则鉴定基因为所述与所述细胞类型的细胞中的所述初级靶基因相互作用的基因。在一种实施方案中，包含所述大量siRNA中的一种或多种的每个所述的细胞组是通过在所述接触步骤之前用所述一种或多种siRNA转染而获得的。

在一种特定的实施方案中，本发明提供了鉴定与一种细胞类型的细胞中的初级靶基因相互作用的基因的方法，所述方法包括(a)用包含来自大量的不同siRNA的一种或多种不同的小干扰RNA(siRNA)的组合物转染所述细胞类型的一种或多种细胞的大量的组中的每一个，所述一种或多种不同的siRNA靶定相同的基因，并且所述大量的不同siRNA包含分别靶定所述细胞类型的细胞中的不同基因的siRNA；(b)使所述细胞类型的一种或多种细胞的所述大量的组与一种试剂接触，其中所述试剂调节所述初级靶基因的表达和/或由所述初级靶基因编码的蛋白的活性；(c)将所述试剂对每个所述的一种或多种细胞的组的作用与所述试剂对不包含靶定任一所述不同次级基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用进行比较；和(d)如果所述试剂对包含靶定所述基因的一种或多种siRNA的所述一种或多种细胞的组的作用与所述试剂对不包含靶定任一所述不同次级基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用不同，则鉴定基因为所述与所述细胞类型的细胞中的所述初级靶基因相互作用的基因。

在一种实施方案中，所述试剂包括靶定所述初级靶基因并使其沉默的siRNA。在另一种实施方案中，所述试剂包括靶定所述初级靶基因的2、3、4、5、6或10种不同的siRNA。在一种优选实施方案中，所述不同siRNA的每一种都靶定所述初级靶基因。在一种优选实施方案中，所述不同siRNA的总siRNA浓度大约与单独使用的单一siRNA的浓度相同，例如100nM。优选地，所述不同siRNA的总siRNA浓度是用于使初级靶基因沉默的最优浓度。最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，基本不增加沉默的水平。在一种实施方案中，最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，沉默水平的增加不超过5％、10％或20％。在一种优选实施方案中，不同siRNA中包含的每种siRNA的比例相同。在另一种优选实施方案中，不同siRNA中包含的每种siRNA彼此之间的差别小于5％、10％、20％或50％。在一种优选实施方案中，不同siRNA中的至少一种，占不同siRNA的总siRNA浓度的90％、80％、70％、50％或20％以上。在另一种优选实施方案中，不同siRNA中没有一种siRNA占不同siRNA的总siRNA浓度的90％、80％、70％、50％或20％以上。在一种优选实施方案中，选择不同siRNA的组成，包括不同siRNA的数目和每一种siRNA的浓度，使得不同siRNA导致任何不作为靶的基因的沉默小于30％、20％、10％或5％、1％、0.1或0.01％。在另一种实施方案中，每一种siRNA的浓度都低于单独使用时的最优浓度。在一种优选实施方案中，至少一种siRNA的浓度低于有效达到不存在其它siRNA或不存在其它设计用于使基因沉默的siRNA时的基因沉默的至少30％、50％、75％、80％、85％、90或95％的siRNA浓度。在另一种优选实施方案中，每一种不同siRNA的浓度导致的基因沉默低于不存在其它siRNA或不存在其它设计用于使基因沉默的siRNA时的基因沉默的30％、20％、10％或5％。在一种优选实施方案中，每种siRNA的浓度导致的靶基因沉默低于单独使用时导致的靶基因沉默的30％、20％、10％或5％，而所有siRNA一起导致靶基因沉默的至少80或90％。在另一种实施方案中，所述试剂包括由所述初级靶基因编码的蛋白的抑制剂。

与所述试剂对不包含靶定任一所述不同次级基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用相比，所述试剂对所述一种或多种细胞的组的作用可以增强。或者，与所述试剂对不包含靶定任一所述不同次级基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用相比，所述试剂对所述一种或多种细胞的组的作用可以减弱。

优选地，所述大量不同基因中的至少一种、至少两种、或每一种的一种或多种siRNA都包含靶定相同靶基因的2、3、4、5、6或10种不同的siRNA。在一种优选实施方案中，靶定相同靶基因的一种或多种siRNA的总siRNA浓度大约与单独使用的单一siRNA的浓度相同，例如100nM。优选地，一种或多种siRNA的总siRNA浓度是用于使作为目标的靶基因沉默的最优浓度。最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，基本不增加沉默的水平。在一种实施方案中，最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，沉默水平的增加不超过5％、10％或20％。在一种优选实施方案中，一种或多种siRNA中包含的每种siRNA的比例相同。在另一种优选实施方案中，一种或多种siRNA中包含的每种siRNA彼此之间的差别小于5％、10％、20％或50％。在一种优选实施方案中，一种或多种siRNA中的至少一种，占一种或多种siRNA的总siRNA浓度的90％、80％、70％、50％或20％以上。在另一种优选实施方案中，一种或多种siRNA中没有一种siRNA占一种或多种siRNA的总siRNA浓度的90％、80％、70％、50％或20％以上。在一种优选实施方案中，选择一种或多种siRNA的组成，包括不同siRNA的数目和每一种siRNA的浓度，使得一种或多种siRNA导致任何不作为靶的基因的沉默小于30％、20％、10％或5％、1％、0.1或0.01％。在另一种实施方案中，一种或多种siRNA中的每一种siRNA的浓度都低于单独使用时的最优浓度。在一种优选实施方案中，一种或多种siRNA中的至少一种siRNA的浓度低于有效达到不存在其它siRNA或不存在其它设计用于使基因沉默的siRNA时的基因沉默的至少30％、50％、75％、80％、85％、90或95％的siRNA浓度。在另一种优选实施方案中，一种或多种siRNA中的每一种不同siRNA的浓度导致的基因沉默低于不存在其它siRNA或不存在其它设计用于使基因沉默的siRNA时的基因沉默的30％、20％、10％或5％。在一种优选实施方案中，每种siRNA的浓度导致的靶基因沉默低于单独使用时导致的靶基因沉默的30％、20％、10％或5％，而所述大量siRNA导致靶基因沉默的至少80或90％。

在一种实施方案中，每个所述的一种或多种细胞的组是通过在所述接触步骤之前用所述一种或多种不同siRNA转染而获得的。在另一种实施方案中，所述初级靶是KSP。在优选实施方案中，所述不同的次级基因包含至少5种、至少10种、至少100种、或至少1000种不同的基因。在一种实施方案中，所述不同的次级基因是不同的内源基因。在一种实施方案中，所述细胞类型是癌细胞类型。

在另一方面，本发明提供了用于治疗患有癌症的哺乳动物的方法，包括给所述哺乳动物施用治疗足够量的一种试剂，所述试剂调节STK6或TPX2基因的表达和/或由所述STK6或TPX2基因编码的蛋白的活性，其中所述哺乳动物进行一种治疗，所述治疗包括给所述哺乳动物施用治疗足够量的KSP抑制剂。本发明还提供了用于治疗患有癌症的哺乳动物的方法，包括给所述哺乳动物施用i)治疗足够量的一种试剂，所述试剂调节STK6或TPX2基因的表达和/或由所述STK6或TPX2基因编码的蛋白的活性，和ii)治疗足够量的KSP抑制剂。在一种实施方案中，所述试剂减少所述癌症的细胞中所述STK6或TPX2基因的表达。在一种优选实施方案中，所述试剂包括靶定所述STK6或TPX2基因的siRNA。在另一种实施方案中，所述哺乳动物是人，并且所述siRNA可以选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的siRNA。在另一种优选实施方案中，所述试剂包括靶定所述TPX2基因的siRNA。在另一种实施方案中，所述哺乳动物是人，并且所述siRNA可以选自SEQ ID NO：1237、SEQ ID NO：1238和SEQID NO：1239所示的siRNA。

在另一种实施方案中，本发明提供了用于治疗患有癌症的哺乳动物的方法，包括给所述哺乳动物施用i)治疗足够量的第一种试剂，所述第一种试剂调节STK6或TPX2基因的表达和/或由所述STK6或TPX2基因编码的蛋白的活性，和ii)治疗足够量的第二种试剂，所述第二种试剂调节KSP基因的表达和/或由所述KSP基因编码的蛋白的活性。在一种优选实施方案中，所述第一种试剂包括靶定所述TPX2或TPX2基因的siRNA，并且所述第二种试剂包括靶定所述KSP基因的siRNA。在另一种优选实施方案中，所述哺乳动物是人，并且其中所述siRNA选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的siRNA。在另一种优选实施方案中，所述试剂包括靶定所述TPX2基因的siRNA。在另一种实施方案中，所述哺乳动物是人，并且所述siRNA可以选自SEQ ID NO：1237、SEQ ID NO：1238和SEQ ID NO：1239所示的siRNA。

在另一种实施方案中，本发明提供了用于评估细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性的方法，所述方法包括确定所述细胞中的STK6或TPX2基因的表达水平，其中高于预定阈值水平的所述表达水平，表明所述细胞对所述KSP抑制剂的生长抑制作用具有抗性。在一种优选实施方案中，通过包括用一种或多种核苷酸探针测量所述STK6或TPX2基因的表达水平的方法，确定所述STK6或TPX2基因的表达水平，所述一种或多种多核苷酸探针中的每一种都包含所述STK6或TPX2基因中的核苷酸序列。所述一种或多种多核苷酸探针可以是在微阵列上的多核苷酸探针。

在另一种实施方案中，本发明提供了用于评估细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性的方法，所述方法包括确定所述细胞中由STK6或TPX2基因编码的蛋白的丰度水平，其中高于预定阈值水平的所述蛋白的所述丰度水平，表明所述细胞对所述KSP抑制剂的生长抑制作用具有抗性。本发明还提供了用于评估细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性的方法，所述方法包括确定所述细胞中由STK6或TPX2基因编码的蛋白的活性水平，其中高于预定阈值水平的所述活性水平，表明所述细胞对所述KSP抑制剂的生长抑制作用具有抗性。在一种优选实施方案中，所述细胞是人细胞。

在另一种实施方案中，本发明提供了用于调节细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性的方法，包括使所述细胞接触足够量的一种试剂，所述试剂调节STK6或TPX2基因的表达和/或由所述STK6或TPX2基因编码的蛋白的活性。本发明还提供了用于调节哺乳动物中细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性的方法，包括给所述哺乳动物施用治疗足够量的一种试剂，所述试剂调节STK6或TPX2基因的表达和/或由所述STK6或TPX2基因编码的蛋白的活性。本发明还提供了用于调节细胞生长的方法，包括使所述细胞接触i)足够量的一种试剂，所述试剂调节STK6或TPX2基因的表达和/或由所述STK6或TPX2基因编码的蛋白的活性，和ii)足够量的KSP抑制剂。优选地，所述试剂减少所述细胞中所述STK6或TPX2基因的表达。在一种优选实施方案中，所述试剂包括靶定所述STK6基因的siRNA。在另一种实施方案中，所述细胞是人细胞，并且其中所述siRNA选自SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6所示的siRNA。在另一种优选实施方案中，所述试剂包括靶定所述TPX2基因的siRNA。在另一种实施方案中，所述细胞是人细胞，并且所述siRNA可以选自SEQ ID NO：1237、SEQID NO：1238和SEQ ID NO：1239所示的siRNA。

在另一种实施方案中，本发明提供了用于鉴定能够调节细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性的试剂的方法，其中所述试剂能够调节STK6或TPX2基因的表达和/或由所述STK6或TPX2基因编码的蛋白的活性，所述方法包括比较存在所述试剂时所述KSP抑制剂对表达所述STK6或TPX2基因的细胞的抑制作用与不存在所述试剂时所述KSP抑制剂对表达所述STK6或TPX2基因的细胞的抑制作用，其中所述KSP抑制剂的所述抑制作用的差异，鉴定所述试剂能够调节所述细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性。

本发明也提供了用于鉴定能够调节细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性的试剂的方法，其中所述试剂能够调节STK6或TPX2基因的表达和/或由所述STK6或TPX2基因编码的蛋白的活性，所述方法包括：(a)在存在所述试剂的条件下使第一种表达所述STK6或TPX2基因的细胞与所述KSP抑制剂接触，并且测量第一种生长抑制作用；(b)在不存在所述试剂的条件下使第二种表达所述STK6或TPX2基因的细胞与所述KSP抑制剂接触，并且测量第二种生长抑制作用；(c)比较在所述步骤(a)和(b)中测量的所述第一种和第二种抑制作用，其中所述第一种和第二种抑制作用之间的差异，鉴定所述试剂能够调节细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性。在一种优选实施方案中，所述试剂是减少所述STK6或TPX2基因表达的分子。在另一种优选实施方案中，所述试剂包括靶定所述STK6基因的siRNA。在另一种优选实施方案中，所述细胞是人细胞，并且其中所述siRNA选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的siRNA。在另一种优选实施方案中，所述试剂包括靶定所述TPX2基因的siRNA。在另一种实施方案中，所述细胞是人细胞，并且所述siRNA可以选自SEQID NO：1237、SEQ ID NO：1238和SEQ ID NO：1239所示的siRNA。

另一方面，本发明提供了包含一种或多种不同的小干扰RNA(siRNA)的细胞，所述siRNA靶定所述细胞中的STK6或TPX2基因。所述细胞可以是人细胞。所述细胞也可以是鼠细胞。在一种实施方案中，所述细胞是人细胞，并且所述一种或多种不同的siRNA中的每一种都选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的siRNA。在另一种实施方案中，所述细胞是人细胞，并且所述siRNA可以选自SEQ IDNO：1237、SEQ ID NO：1238和SEQ ID NO：1239所示的siRNA。在一种实施方案中，所述细胞通过使用所述一种或多种不同siRNA的组合物转染而产生，其中所述组合物的总siRNA浓度是用于使所述STK6或TPX2基因沉默的最优浓度，其中所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，基本不增加沉默的水平。在一种实施方案中，所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，沉默水平的增加不超过20％以上、10％以上或5％。在一种实施方案中，每种所述不同的siRNA的浓度大约相同。在一种实施方案中，每种所述不同的siRNA各自的浓度彼此之间的差别小于50％、小于20％或小于10％。在另一种实施方案中，所述组合物中没有一种siRNA占所述不同siRNA的所述总siRNA浓度的80％以上、50％以上或20％以上。在另一种实施方案中，所述组合物中的至少一种siRNA的浓度为所述不同siRNA的所述总siRNA浓度的20％以上或50％以上。在另一种实施方案中，选择所述组合物中不同siRNA的数目和每一种siRNA的浓度，使得所述组合物导致任何不作为靶的基因的沉默小于10％、小于1％、小于0.1％、或小于0.01％。

另一方面，本发明提供了用于诊断细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性的微阵列。所述微阵列包含一种或多种多核苷酸探针，其中每一种所述的多核苷酸探针包含STK6或TPX2基因中的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供了用于诊断细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性的试剂盒。所述试剂盒包含置于一个或多个容器中的一种或多种多核苷酸探针，其中每一种所述的多核苷酸探针包含STK6或TPX2基因中的核苷酸序列。本发明还提供了用于筛选一种试剂的试剂盒，所述试剂调节细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性。所述试剂盒包含置于一个或多个容器中的(i)包含一种或多种不同的小干扰RNA(siRNA)的细胞，所述siRNA靶定所述细胞中的STK6或TPX2基因；和(ii)KSP抑制剂。另一方面，本发明提供了用于治疗患有癌症的哺乳动物的试剂盒，该试剂盒包含置于一个或多个容器中的(i)足够量的调节STK6或TPX2基因的表达和/或由所述STK6或TPX2基因编码的蛋白的活性的试剂；和(ii)KSP抑制剂。

在本发明中，KSP抑制剂可以是2003年6月12日提交的PCT申请PCT/US03/18482中描述的(1S)-1-{[(2S)-4-(2，5-二氟苯基)-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基]羰基}-2-甲基丙胺。

本发明还提供了用于鉴定与一种细胞类型的细胞中的初级靶基因相互作用的基因的方法。该方法包括(a)使所述细胞类型的一种或多种细胞接触一种试剂，其中所述试剂调节次级靶基因的表达和/或由所述次级靶基因编码的蛋白的活性，并且其中所述一种或多种细胞表达靶定所述初级靶基因的第一小干扰RNA(siRNA)；(b)比较所述试剂对所述克隆的所述一种或多种细胞的作用与所述试剂对不表达所述第一siRNA的所述细胞类型的细胞的作用；和(c)如果所述试剂对表达所述第一siRNA的所述一种或多种细胞的作用与所述试剂对不表达所述第一siRNA的所述细胞类型的细胞的作用不同，则鉴定所述次级靶基因为与所述细胞类型的细胞中的初级靶基因相互作用的基因。

在一种特定实施方案中，所述方法包括(a)产生表达靶定所述初级靶基因的第一小干扰RNA(siRNA)的所述细胞类型的细胞的克隆；(b)使所述克隆的一种或多种细胞接触一种试剂，其中所述试剂调节次级靶基因的表达和/或由所述次级靶基因编码的蛋白的活性；(c)比较所述试剂对所述克隆的所述一种或多种细胞的作用与所述试剂对不表达所述第一siRNA的所述细胞类型的细胞的作用；和(d)如果所述试剂对表达所述第一siRNA的所述一种或多种细胞的作用与所述试剂对不表达所述第一siRNA的所述细胞类型的细胞的作用不同，则鉴定所述次级靶基因为与所述细胞类型的细胞中的初级靶基因相互作用的基因。

在一些实施方案中，与所述试剂对不表达所述第一siRNA的所述细胞类型的细胞的作用相比，所述试剂对表达所述第一siRNA的所述一种或多种细胞的作用增强。在一些实施方案中，与所述试剂对不表达所述第一siRNA的所述细胞类型的细胞的作用相比，所述试剂对表达所述第一siRNA的所述一种或多种细胞的作用减弱。在一种实施方案中，所述试剂是所述次级靶基因的抑制剂。所述试剂的作用可以是所述细胞类型的细胞对药物或电离辐射的敏感性的改变，所述药物如DNA破坏剂，如拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱、拓扑异构酶II抑制剂，如阿霉素、DNA结合剂，如顺铂、和抗代谢药。

在另一种实施方案中，所述试剂包括一种或多种靶定所述次级靶基因并使其沉默的第二siRNA。优选地，所述一种或多种包括至少k种不同的siRNA，如至少2、3、4、5、6或10种不同的siRNA。在一种优选实施方案中，一种或多种第二siRNA的总siRNA浓度大约与单独使用的单一siRNA的浓度相同，例如100nM。优选地，一种或多种第二siRNA的总siRNA浓度是用于使作为目标的次级靶基因沉默的最优浓度。最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，基本不增加沉默的水平。在一种实施方案中，最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，沉默水平的增加不超过5％、10％或20％。在一种优选实施方案中，一种或多种第二siRNA中包含的每种siRNA的比例相同。在另一种优选实施方案中，一种或多种第二siRNA中包含的每种siRNA彼此之间的差别小于5％、10％、20％或50％。在一种优选实施方案中，一种或多种第二siRNA中的至少一种，占一种或多种siRNA的总siRNA浓度的90％、80％、70％、50％或20％以上。在另一种优选实施方案中，一种或多种第siRNA中没有一种siRNA占一种或多种第二siRNA的总siRNA浓度的90％、80％、70％、50％或20％以上。在一种优选实施方案中，选择一种或多种第siRNA的组成，包括不同siRNA的数目和每一种第二siRNA的浓度，使得一种或多种第二siRNA导致任何不作为靶的基因的沉默小于30％、20％、10％或5％、1％、0.1或0.01％。在另一种实施方案中，一种或多种第二siRNA中的每一种siRNA的浓度都低于单独使用时的最优浓度。在一种优选实施方案中，一种或多种第siRNA中的至少一种siRNA的浓度低于有效达到不存在其它siRNA或不存在其它设计用于使基因沉默的siRNA时的基因沉默的至少30％、50％、75％、80％、85％、90或95％的siRNA浓度。在另一种优选实施方案中，一种或多种第二siRNA中的每一种不同siRNA的浓度导致的基因沉默低于不存在其它siRNA或不存在其它设计用于使基因沉默的siRNA时的基因沉默的30％、20％、10％或5％。在一种优选实施方案中，每种siRNA的浓度导致的靶基因沉默低于单独使用时导致的次级靶基因沉默的30％、20％、10％或5％，而所述大量siRNA导致次级靶基因沉默的至少80或90％。

在一种实施方案中，所述细胞是癌细胞类型。在另一种实施方案中，所述初级靶基因是p53。

在一种优选实施方案中，对大量不同的次级靶基因中的每一种，重复方法的步骤(b)-(d)。大量的次级靶基因可以包含至少5、10、100、1000和5000种不同的基因。

本发明还提供了用于治疗患有癌症的哺乳动物的方法。该方法包括给所述哺乳动物施用治疗足够量的一种试剂，所述试剂调节一种基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白的活性，其中所述哺乳动物进行一种治疗，所述治疗包括给所述哺乳动物施用治疗足够量的包含一种或多种DNA破坏剂的组合物。在一种实施方案中，本发明提供了用于治疗患有癌症的哺乳动物的方法，包括给所述哺乳动物施用i)治疗足够量的一种试剂，所述试剂调节一种基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白的活性，和ii)治疗足够量的包含一种或多种DNA破坏剂的组合物。

优选地，所述试剂使所述基因在所述癌症的细胞中的表达减少。在一种优选实施方案中，所述试剂包括靶定所述基因的siRNA。在特定实施方案中，所述基因是EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、CHEK1或BRCA2。所述试剂也可以是增强所述基因在所述癌症的细胞中表达的试剂。所述一种或多种DNA破坏剂可以包括拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱、拓扑异构酶II抑制剂，如阿霉素、DNA结合剂，如顺铂、抗代谢药或电离辐射。

本发明也提供了用于评估细胞对DNA破坏剂的生长抑制作用的敏感性的方法。所述方法包括确定所述细胞中的一种基因的转录水平，其中低于预定阈值水平的所述转录水平，表明所述细胞对所述DNA破坏剂的生长抑制作用具有敏感性。所述DNA破坏剂可以是拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱、拓扑异构酶II抑制剂，如阿霉素、DNA结合剂，如顺铂、抗代谢药或电离辐射。在一种优选实施方案中，所述基因是EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、CHEK1或BRCA2。在一种优选实施方案中，通过包括用一种或多种核苷酸探针测量所述基因的转录水平的方法，确定所述基因的转录水平，所述一种或多种多核苷酸探针中的每一种都包含所述基因中的核苷酸序列。在一种实施方案中，所述一种或多种多核苷酸探针是在微阵列上的多核苷酸探针。

在另一种实施方案中，本发明提供了用于评估细胞，如人细胞对DNA破坏剂的生长抑制作用的敏感性的方法。所述方法包括确定所述细胞中由一种基因编码的蛋白的丰度水平，其中低于预定阈值水平的所述蛋白的所述丰度水平，表明所述细胞对所述DNA破坏剂的生长抑制作用具有敏感性。本发明还提供了用于评估细胞，如人细胞对DNA破坏剂的生长抑制作用的敏感性的方法，所述方法包括确定所述细胞中由所述基因编码的蛋白的活性水平，其中高于预定阈值水平的所述活性水平，表明所述细胞对所述DNA破坏剂的生长抑制作用具有敏感性。DNA破坏剂可以是拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱、拓扑异构酶II抑制剂，如阿霉素、DNA结合剂，如顺铂、抗代谢药或电离辐射。在一种优选实施方案中，所述基因是EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、CHEK1或BRCA2。

本发明也提供了用于调节细胞对DNA破坏剂的敏感性的方法。该方法包括使所述细胞与足够量的一种试剂接触，所述试剂调节选自EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51的基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白的活性。本发明也提供了用于调节细胞生长的方法，包括使所述细胞接触i)足够量的一种试剂，所述试剂调节选自EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51的基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白的活性；和ii)足够量的DNA破坏剂。DNA破坏剂可以是拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱、拓扑异构酶II抑制剂，如阿霉素、DNA结合剂，如顺铂、抗代谢药或电离辐射。

在一种实施方案中，所述试剂减少所述细胞中所述基因的表达。在一种优选实施方案中，所述试剂包括靶定所述基因的siRNA。在另一种优选实施方案中，所述试剂包括靶定所述基因的2、3、4、5、6或10种不同的siRNA。在一种优选实施方案中，靶定所述基因的不同siRNA的总siRNA浓度大约与单独使用的单一siRNA的浓度相同，例如100nM。优选地，靶定所述基因的不同siRNA的总浓度是用于使所述基因沉默的最优浓度。最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，基本不增加沉默的水平。在一种实施方案中，最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，沉默水平的增加不超过5％、10％或20％。在一种优选实施方案中，不同siRNA中包含的每种siRNA的比例相同。在另一种优选实施方案中，不同siRNA中包含的每种siRNA彼此之间的差别小于5％、10％、20％或50％。在一种优选实施方案中，不同siRNA中的至少一种，占不同siRNA的总siRNA浓度的90％、80％、70％、50％或20％以上。在另一种优选实施方案中，不同siRNA中没有一种siRNA占不同siRNA的总siRNA浓度的90％、80％、70％、50％或20％以上。在一种优选实施方案中，选择不同siRNA的组成，包括不同siRNA的数目和每一种siRNA的浓度，使得不同siRNA导致任何不作为靶的基因的沉默小于30％、20％、10％或5％、1％、0.1或0.01％。在其它实施方案中，不同siRNA中的每一种siRNA的浓度都低于单独使用时的最优浓度。在一种优选实施方案中，不同siRNA中的至少一种siRNA的浓度低于有效达到不存在其它siRNA或不存在其它设计用于使基因沉默的siRNA时的基因沉默的至少30％、50％、75％、80％、85％、90或95％的siRNA浓度。在另一种优选实施方案中，每一种不同siRNA的浓度导致的基因沉默低于不存在其它siRNA或不存在其它设计用于使基因沉默的siRNA时的基因沉默的30％、20％、10％或5％。在一种优选实施方案中，每种siRNA的浓度导致的基因沉默低于单独使用时导致的靶基因沉默的30％、20％、10％或5％，而大量siRNA导致靶基因沉默的至少80或90％。

本发明也提供了用于鉴定能够调节细胞对DNA破坏剂的生长抑制作用的敏感性的试剂的方法，其中所述试剂能够调节选自EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51的基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白的活性，该方法包括比较存在所述试剂时所述DNA破坏剂对表达所述基因的细胞的抑制作用与不存在所述试剂时所述DNA破坏剂对表达所述基因的细胞的抑制作用，其中所述DNA破坏剂的所述抑制作用的差异，鉴定所述试剂能够调节所述细胞对DNA破坏剂的生长抑制作用的敏感性。在一种实施方案中，本发明提供了用于鉴定能够调节细胞对DNA破坏剂的生长抑制作用的敏感性的试剂的方法，其中所述试剂能够调节选自EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51的基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白的活性，该方法包括(a)在存在所述试剂的条件下使第一种表达所述基因的细胞与所述DNA破坏剂接触，并且测量第一种生长抑制作用；(b)在不存在所述试剂的条件下使第二种表达所述基因的细胞与所述DNA破坏剂接触，并且测量第二种生长抑制作用；(c)比较在所述步骤(a)和(b)中测量的所述第一种和第二种抑制作用，其中所述第一种和第二种抑制作用之间的差异，鉴定所述试剂能够调节所述细胞对DNA破坏剂的生长抑制作用的敏感性。

优选地，所述细胞表达靶定初级靶基因的siRNA。在一种实施方案中，所述初级靶基因是p53。

在一种优选实施方案中，所述试剂是减少所述基因表达的分子。在一种优选实施方案中，所述试剂包括靶定所述基因的siRNA。在另一种优选实施方案中，所述试剂包括靶定所述基因的2、3、4、5、6或10种不同的siRNA。在一种优选实施方案中，靶定所述基因的不同siRNA的总siRNA浓度大约与单独使用的单一siRNA的浓度相同，例如100nM。优选地，靶定所述基因的不同siRNA的总浓度是用于使所述基因沉默的最优浓度。最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，基本不增加沉默的水平。在一种实施方案中，最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，沉默水平的增加不超过5％、10％或20％。在一种优选实施方案中，不同siRNA中包含的每种siRNA的比例相同。在另一种优选实施方案中，不同siRNA中包含的每种siRNA彼此之间的差别小于5％、10％、20％或50％。在一种优选实施方案中，不同siRNA中的至少一种，占不同siRNA的总siRNA浓度的90％、80％、70％、50％或20％以上。在另一种优选实施方案中，不同siRNA中没有一种siRNA占不同siRNA的总siRNA浓度的90％、80％、70％、50％或20％以上。在一种优选实施方案中，选择不同siRNA的组成，包括不同siRNA的数目和每一种siRNA的浓度，使得不同siRNA导致任何不作为靶的基因的沉默小于30％、20％、10％或5％、1％、0.1或0.01％。在其它方案中，不同siRNA中的每一种siRNA的浓度都低于单独使用时的最优浓度。在一种优选实施方案中，不同siRNA中的至少一种siRNA的浓度低于有效达到不存在其它siRNA或不存在其它设计用于使基因沉默的siRNA时的基因沉默的至少30％、50％、75％、80％、85％、90或95％的siRNA浓度。在另一种优选实施方案中，每一种不同siRNA的浓度导致的基因沉默低于不存在其它siRNA或不存在其它设计用于使基因沉默的siRNA时的基因沉默的30％、20％、10％或5％。在一种优选实施方案中，每种siRNA的浓度导致的基因沉默低于单独使用时导致的靶基因沉默的30％、20％、10％或5％，而大量siRNA导致靶基因沉默的至少80或90％。

在所述方法中，所述DNA破坏剂可以是拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱、拓扑异构酶II抑制剂，如阿霉素、DNA结合剂，如顺铂、抗代谢药或电离辐射。

本发明也提供了包含一种或多种不同的小干扰RNA(siRNA)的细胞，所述siRNA靶定所述细胞中的选自EPHB3、WEE1、ELK1、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51的靶基因。在一种实施方案中，所述一种或多种siRNA包括2、3、4、5、6或10种不同的siRNA。在一种优选实施方案中，所述一种或多种siRNA的总siRNA浓度大约与单独使用的单一siRNA的浓度相同，例如100nM。优选地，所述一种或多种siRNA的总浓度是用于使作为目标的靶基因沉默的最优浓度。最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，基本不增加沉默的水平。在一种实施方案中，最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，沉默水平的增加不超过5％、10％或20％。在一种优选实施方案中，所述一种或多种siRNA中包含的每种siRNA的比例相同。在另一种优选实施方案中，所述一种或多种siRNA中包含的每种siRNA彼此之间的差别小于5％、10％、20％或50％。在一种优选实施方案中，所述一种或多种siRNA中的至少一种，占所述一种或多种siRNA的总siRNA浓度的90％、80％、70％、50％或20％以上。在另一种优选实施方案中，所述一种或多种siRNA中没有一种siRNA占所述一种或多种siRNA的总siRNA浓度的90％、80％、70％、50％或20％以上。在一种优选实施方案中，选择所述一种或多种siRNA的组成，包括不同siRNA的数目和每一种siRNA的浓度，使得所述一种或多种siRNA导致任何不作为靶的基因的沉默小于30％、20％、10％或5％、1％、0.1或0.01％。在其它方案中，所述一种或多种siRNA中的每一种siRNA的浓度都低于单独使用时的最优浓度。在一种优选实施方案中，所述一种或多种siRNA中的至少一种siRNA的浓度低于有效达到不存在其它siRNA或不存在其它设计用于使基因沉默的siRNA时的基因沉默的至少30％、50％、75％、80％、85％、90或95％的siRNA浓度。在另一种优选实施方案中，所述一种或多种siRNA中的每一种不同siRNA的浓度导致的基因沉默低于不存在其它siRNA或不存在其它设计用于使基因沉默的siRNA时的基因沉默的30％、20％、10％或5％。在一种优选实施方案中，每种siRNA的浓度导致的靶基因沉默低于单独使用时导致的靶基因沉默的30％、20％、10％或5％，而大量siRNA导致靶基因沉默的至少80或90％。

本发明也提供了用于诊断细胞对DNA破坏剂的生长抑制作用的敏感性的微阵列。所述微阵列包含一种或多种多核苷酸探针，其中每一种所述的多核苷酸探针包含选自EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51的一种或多种基因中的核苷酸序列。

本发明也提供了用于诊断细胞对DNA破坏剂的生长抑制作用的敏感性的试剂盒。所述试剂盒包含置于一个或多个容器中的一种或多种多核苷酸探针，其中每一种所述的多核苷酸探针包含选自EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51的基因的核苷酸序列。

本发明也提供了用于筛选调节细胞对DNA破坏剂的生长抑制作用的敏感性的试剂的试剂盒。所述试剂盒包含置于一个或多个容器中的(i)包含一种或多种不同的小干扰RNA(siRNA)的细胞，所述siRNA靶定所述细胞中的选自EPHB3、WEE1、ELK1、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51的基因；和(ii)所述DNA破坏剂。

本发明也提供了用于治疗患有癌症的哺乳动物的试剂盒，所述试剂盒包含置于一个或多个容器中的(i)足够量一种试剂，所述试剂调节选自EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51的基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白的活性；和(ii)所述DNA破坏剂。

在本发明的试剂盒中，所述DNA破坏剂可以是拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱、拓扑异构酶II抑制剂，如阿霉素、DNA结合剂，如顺铂、抗代谢药或电离辐射。

本发明也提供了用于评估一种细胞类型的细胞对药物治疗的反应性的方法，包括(a)使所述细胞类型的一种或多种细胞接触所述药物，其中所述一种或多种细胞表达靶定初级靶基因的第一小干扰RNA(siRNA)，并且其中所述一种或多种细胞接受一种组合物的处理，所述组合物调节一种或多种次级靶基因的表达和/或分别由所述一种或多种次级靶基因编码的蛋白的活性；(b)使所述细胞类型的一种或多种细胞接触所述药物，其中所述一种或多种细胞不表达靶定所述初级靶基因的小干扰RNA(siRNA)，并且其中所述一种或多种细胞接受调节级靶基因的表达和/或由所述次级靶基因编码的蛋白的活性的所述试剂的处理；和(c)比较在步骤(a)中测量的所述药物对所述一种或多种细胞的作用与在步骤(b)中测量的所述药物对所述一种或多种细胞的作用，从而评估所述细胞对所述药物治疗的反应性。在一种实施方案中，所述方法进一步包括对大量不同的次级靶基因中的每一种重复步骤(a)-(b)的步骤(d)。

在一种特定实施方案中，本发明提供了用于评估一种细胞类型的细胞对药物治疗的反应性的方法，该方法包括(a)制备表达靶定初级靶基因的第一小干扰RNA(siRNA)的所述细类型的细胞的克隆；(b)使表达所述第一siRNA的所述克隆的一种或多种细胞接触所述药物，其中所述一种或多种细胞接受调节级靶基因的表达和/或由所述次级靶基因编码的蛋白的活性的试剂的处理；(c)使不表达靶定所述初级靶基因的小干扰RNA(siRNA)的所述细胞类型的一种或多种细胞接触所述药物，其中所述一种或多种细胞接受调节级靶基因的表达和/或由所述次级靶基因编码的蛋白的活性的所述试剂的处理；和(d)比较在步骤(b)中测量的所述药物对所述一种或多种细胞的作用与在步骤(c)中测量的所述药物对所述一种或多种细胞的作用，从而评估所述细胞对所述药物治疗的反应性。在一种实施方案中，所述方法进一步包括对大量不同的次级靶基因中的每一种重复步骤(b)-(d)的步骤。

在一种实施方案中，与所述药物对不表达所述第一siRNA的所述细胞类型的细胞的作用相比，所述药物对表达所述第一siRNA的一种或多种细胞的作用增强。在另一种实施方案中，与所述药物对不表达所述第一siRNA的细胞类型的细胞的作用相比，所述药物对表达所述第一siRNA的一种或多种细胞的作用减弱。

在一种实施方案中，所述组合物包含所述一种或多种次级靶基因的一种或多种抑制剂。在一种优选实施方案中，所述组合物包含靶定所述一种或多种第二靶基因并使其沉默的一种或多种第二siRNA。

在一种实施方案中，所述一种或多种第二siRNA包含至少k种不同的siRNA，其中所述k选自2、3、4、5、6和10。在一种实施方案中，所述试剂中的所述至少k种不同siRNA的总siRNA浓度是使所述次级靶基因沉默的最优浓度，其中所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，基本不增加沉默的水平。在一种实施方案中，所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，沉默水平的增加不超过20％以上、10％以上或5％。在另一种实施方案中，所述至少k种不同siRNA的每一种的浓度大约相同。在另一种实施方案中，至少k种不同siRNA各自的浓度彼此之间的差别小于50％、小于20％或小于10％。在另一种实施方案中，所述试剂中没有一种siRNA占所述不同siRNA的所述总siRNA浓度的80％以上、50％以上或20％以上。在另一种实施方案中，所述试剂中的至少一种siRNA的浓度为所述至少k种不同siRNA的所述总siRNA浓度的20％以上或50％以上。在另一种实施方案中，选择所述试剂中不同siRNA的数目和每一种siRNA的浓度，使得所述试剂导致任何不作为靶的基因的沉默小于10％、小于1％、小于0.1％、或小于0.01％。

在一些实施方案中，所述细胞是癌细胞类型，并且所述初级靶基因是p53。在优选实施方案中，所述大量的次级靶基因至少包含选自下组的不同基因的数目：5、10、100、1000和5000种不同的基因。

在一种实施方案中，所述药物是DNA破坏剂，如选自拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、DNA结合剂和电离辐射的DNA破坏剂。在一种特定的实施方案中，所述DNA破坏剂选自阿霉素、喜树碱和顺铂。

4.附图简述

图1表示STK6的mRNA沉默和生长抑制表型之间的关联。用STK6的六种单独的siRNA转染HeLa细胞。在转染后24小时，收获一组细胞用于RNA分离，并且通过采用按需测定(Assay onDemand)(Applied Biosciences)的TaqMan分析确定STK6mRNA水平。进一步温育另一组细胞(总共72小时)，并且采用Alamar Blue测定在三份孔中评估细胞生长。对每一份的RNA水平(X轴)和细胞生长(Y轴)的值进行归一化，以便模拟转染的对照。对于TaqMan分析，每一个数据点代表以三份测定的单个RNA样品(并且归一化到GUS)；重复实验之间的变异通常＜10％。对于生长测定的确定值，每个数据点代表三次重复测定值的平均值，所述测定值通常偏离平均值＜20％。实线代表沉默和表型之间的理想的1∶1关系。

图2表示STK6和KSP之间的协同致死相互作用。用增加浓度的荧光素酶(阴性对照)和STK6(上图)或PTEN(下图)的siRNA转染HeLa细胞，并且在三天的Alamar Blue测定中测试相对于对照(荧光素酶处理)的生长。在指出的地方，细胞也用25nM KSPi，(1S)-1-{[(2S)-4-(2，5-二氟苯基)-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基]羰基}-2-甲基丙胺处理；在这些条件下测定的HeLa细胞的EC50为大约80nM。所示出的是三次重复测定值的平均值±SD(误差柱)。

图3证明了TP53shRNA的稳定表达有效地使靶基因沉默。用靶定TP53的shRNA质粒(pRS-p53)转染HCT116细胞。示出的是野生型(WT)细胞和用pRS-p53稳定转染的细胞的两个独立克隆(A5和A11)中的TP53mRNA水平。在克隆A5和A11中TP53mRNA水平的沉默＞95％(中间的柱)。将pRS-p53瞬时导入HCT116细胞中，在转染后24小时达到了大约80％的沉默(右边的柱)。

图4表示在siRNA超转染后，通过稳定的shRNA表达维持mRNA的沉默。(A)pRS-p53不影响siRNA导致的CHEK1的沉默，反之亦然。将靶定CHEK1的三种siRNA的集合瞬时转染到WT和pRS-p53稳定转染的HCT116细胞(克隆A11)。通过Taqman分析(分别为左图和右图)测量CHEK1和TP53mRNA水平。(B)超转染的KNSL1siRNA不竞争性抑制pRS-STK6导致的沉默。将STK6和KNSL1siRNA瞬时共转染到WT SW480细胞中，并且将KNSL1siRNA超转染到pRS-STK6稳定转染的SW480细胞中。通过Taqman分析测量STK6mRNA水平。对于左边的一组柱，单独使用或与三种不同的单个KNSL1 siRNA(每种10nM)中的一种一起使用STK6 siRNA(10nM)。KNSL1 siRNA可变地抑制STK6 siRNA导致的沉默。对于右边的两组柱，以10或100nM将KNSL1 siRNA用作稳定表达的STK6shRNA的竞争剂。

图5证明了不存在DNA破坏的条件下的siRNA文库筛选，表明具有和不具有靶定p53的shRNA的细胞之间的良好相关性。用三种siRNA的集合超转染的pRS(仅有载体)细胞(x轴)，所述三种siRNA的每一种都靶定800种基因之一，并且测试生长相关的表型；以相同的方式测定pRS-p53细胞(y轴)。两组数据之间的密切关系表明，siRNA集合的性能很可能不受shRNA的存在的影响，表明shRNA不与siRNA竞争。

图6表示pRS-p53细胞中的CHEK1沉默减少了G2关卡停滞(checkpoint arrest)。仅仅用载体(pRS)稳定转染A549细胞或用对照(luc，荧光素酶)siRNA或CHEK1的三种siRNA的集合超转染pRS-p53细胞。在转染后24小时加入阿霉素(200ng/ml)，并且在加入阿霉素后48小时分析细胞周期谱。与pRS细胞相比，pRS-p53细胞中的TP53mRNA水平减少了大约90％。

图7说明了对顺铂敏感的基因的鉴定。用代表约800种人基因的siRNA集合(3siRNAs/基因，总siRNA浓度为100nM)转染在384孔板上生长的HeLa细胞。转染后四小时，用单独的培养基(或加附形剂)(-药物)或加EC10浓度的顺铂(Cis，+药物)的培养基处理细胞。然后用Alamar Blue测定在转染后72小时测量细胞生长，并且表示为在用荧光素酶siRNA转染的孔中测量的生长％。每个点代表2-4次重复测定值的平均数。

图8表示对不同的药物治疗敏感的基因的比较。按图1所示用siRNA转染HeLa细胞，并且用单独的培养基(或加附形剂)、或加EC10浓度的Cis、阿霉素(Dox)或喜树碱(Campto)的培养基处理细胞。测量细胞生长，并且表示为生长-药物/生长+药物的比例。虚线表示两倍致敏。指出了选定的基因。

图9A-9C表示WEE1的沉默使HeLa细胞对Dox、Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感。图9D-9I表明WEE1的沉默使p53-A549细胞对Dox、Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感，但不使p53+A549细胞对所述DNA破坏敏感。

图10A-10C表明EPHB3的沉默使HeLa细胞和p53-A549C7对Dox、Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感，使p53+A549pRS细胞对Dox、Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感的程度较低。

图11A-11C表明STK6沉默使HeLa细胞和p53-A549C7对Dox、Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感，使p53+A549pRS细胞对Dox、Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感的程度较低。

图12A-12C表明BRCA1的沉默使HeLa细胞和p53-A549C7细胞对Dox、Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感。BRCA的沉默也以较低的程度使p53+A549pRS细胞对Cis诱导的DNA破坏敏感，但不使p53+A549pRS细胞对Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感。

图13A-13B表明BRCA2的沉默使HeLa细胞和p53-A549C7细胞对Dox、Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感。图13C表明BRCA的沉默以较低的程度使p53+A549pRS细胞对Cis诱导的DNA破坏敏感，但不使p53+A549pRS细胞对Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感。

图14A-14B表明CHUK的沉默使HeLa细胞对Dox、Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感。图14C表明CHUK的沉默使p53-A549pRS细胞对Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感。图14D表明CHUK的沉默不使53+A549pRS细胞对Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感。

图15A-C表明CHEK1的沉默对细胞对DNA破坏的敏感性的影响的结果。15A：CHEK1沉默/抑制使HeLa细胞对DNA破坏敏感。15B：CHEK1沉默/抑制使p53-A549细胞对DNA破坏敏感。15C：CHEK1沉默不使HREP细胞对阿霉素敏感。

图16表示siRNA介导的PLK基因的敲除(knockdown)导致了细胞周期停滞和凋亡。

图17表示筛选对KSPi敏感的基因的结果。

图18表示筛选对紫杉醇敏感的基因的结果。

图19：BRCA复合物增强了顺铂活性。以384孔形式用大约2000种基因的siRNA集合(3siRNAs/基因)转染HeLa细胞，然后用顺铂(Y轴)或不用顺铂(X轴)处理。检测两种不同的顺铂浓度，即100ng/ml(约EC10，左图)或400ng/ml(约EC50，右图)。在转染后72小时，用Alamar Blue测定法测量细胞生长。对角线表示两次处理(黑线)之间的一致性，或通过顺铂处理的2倍和3倍致敏(分别为洋红和红线)。

图20：BRCA1的沉默优先使TP53-细胞对DNA破坏敏感。用空载体(pRS，左图)稳定转染A549细胞，或用荧光素酶、BRCA1或BRCA2的siRNA超转染靶定TP53的shRNA(pRS-TP53，右图)，然后用DNA破坏剂顺铂处理。在转染后72小时，用Alamar Blue测量细胞生长。

图21：BRCA1的沉默选择性使TP53-细胞对DNA破坏敏感。用荧光素酶(顶行)或BRCA1(底行)的siRNA转染匹配的TP53阴性(左列)或阳性(右列)A549细胞，然后用DNA破坏剂博莱霉素处理。转染后72小时，固定细胞，用碘化丙锭染色，并且通过流式细胞术分析细胞周期分布。具有2N或4N DNA含量的细胞的相对荧光用箭头表示。用红色标出的格栅表明亚G1(死亡)细胞的数目。

图22表示的结果证明RAD51/阿霉素协同作用在TP53-细胞中更大。

5.发明详述

本发明提供了采用RNA干扰鉴定基因或其产物和一种试剂，例如药物之间的相互作用，如致死/协同致死相互作用的方法和组合物。此处使用的术语“基因产物”包括从基因转录的mRNA和由基因编码的蛋白。本发明也提供了利用STK6激酶(也称作Aurora A激酶)和KSP(驱动蛋白样动力蛋白，也称作KNSL1或EG5)抑制剂(KSPi′s)治疗癌症的方法和组合物。在本公开内容中，通常使用KSPi(1S)-1-{[(2S)-4-(2，5-二氟苯基)-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基]羰基}-2-甲基丙胺

(参见2003年6月12日提交的PCT申请PCT/US03/18482，在此全文引入作为参考)。其它KSPi′s也可以用于本发明。可以预见到使用所述其它KSPi′s的方法也包括在本发明的范围中。本发明也提供了利用DNA破坏反应基因和DNA破坏剂之间的相互作用治疗癌症的方法和组合物。

5.1.用RNA干扰筛选相互作用的方法

本发明提供了鉴定一种细胞类型的细胞中与一种试剂，例如药物相互作用，例如调节其效果的一种或多种基因的方法。此处使用的基因与一种试剂或另一种基因的相互作用包括基因和/或其产物与该试剂或另一种基因/基因产物的相互作用。例如，鉴定的基因可以赋予对药物的抗性或敏感性，即，减少或增强药物的效果。可以采用大量小干扰RNA(每一种都靶定大量不同基因之一)敲除所述细胞类型的细胞中的大量不同基因(敲除细胞)，并且确定敲除的大量不同基因中的哪种或哪些基因调节细胞对所述试剂的反应，从而鉴定所述一种或多种基因。在一种实施方案中，制备大量不同的敲除细胞(敲除文库)，敲除文库中的每一种敲除细胞都包含例如由siRNA敲除的不同基因。在另一种实施方案中，制备大量不同的敲除细胞(敲除文库)，敲除文库中的每一种敲除细胞都包含例如由靶定不同基因的shRNA和siRNA敲除的两种或多种不同的基因。在一种实施方案中，敲除文库包括大量细胞，其中的每一种都表达靶定初级基因的siRNA，并且用靶定次级基因的一种或多种siRNA超转染。对于本领域技术人员显而易见的是，也可以通过其它方法，例如通过使用靶定基因或其产物的反义分子、核酶、抗体或小有机或无机分子制备敲除细胞。可以预见到，所述其它方法中的任意一种以及利用siRNA的方法可以单独使用或组合使用，以制备本发明的敲除文库。可以使用任何用于siRNA沉默的方法，保留允许调节靶基因的沉默水平的方法。下文5.2节描述了可以使用的多种方法。

在一种实施方案中，采用包含一种细胞类型的大量细胞的siRNA敲除文库实施本发明的方法，所述每种细胞都包含大量siRNA之一，所述大量siRNA中的每一种都靶定细胞(即敲除细胞)中大量不同基因之一并且使其沉默(即，敲除)。任何已知的将siRNA导入细胞的方法可以用于此目的。优选地，制备大量细胞中的每一种细胞，并且独立地维持，以便可以对它们进行独立的研究。然后用一种试剂处理大量细胞中的每一种细胞，确定试剂对该细胞的作用。然后将试剂对包含由siRNA沉默的基因的细胞的作用与该试剂对不包含siRNA的细胞，即该细胞类型的正常细胞的作用相比较。鉴定了反应于试剂而表现出改变的敲除细胞。所述敲除细胞中由包含的siRNA沉默的基因是调节所述试剂的作用的基因。优选地，大量siRNA包含靶定细胞中的至少5、10、100或1000种不同的基因并使其沉默的siRNA。在一种优选实施方案中，所述大量siRNA靶定内源基因并使其沉默。

在一种优选实施方案中，敲除文库包含大量不同的敲除细胞，所述细胞具有相同的敲除基因，例如，每种细胞具有不同的靶定相同基因并使其沉默的siRNA。具有相同的敲除基因的大量不同的敲除细胞可以包括至少2、3、4、5、6或10种不同的敲除细胞，其中每一种都包含靶定敲除基因的不同区域的siRNA。在另一种优选实施方案中，敲除文库包含大量不同的敲除细胞，如，至少2、3、4、5、6或10种，其针对敲除文库中的大量不同基因的每一种。在另一种优选实施方案中，敲除文库包含大量不同的敲除细胞，如，至少2、3、4、5、6或10种，其针对敲除文库中的所有不同基因的每一种。

在另一种优选实施方案中，敲除文库包含大量不同的具有不同的敲除基因的敲除细胞，每种不同的敲除细胞具有靶定相同基因并使其沉默的两种或多种不同的siRNA。在优选实施方案中，每个不同的敲除细胞可以包含靶定相同基因的不同区域的至少2、3、4、5、6或10种不同的siRNA。

在一种优选实施方案中，根据具有敲除基因的大量不同敲除细胞的反应评估基因与试剂的相互作用，例如，每种细胞具有靶定相同基因并使其沉默的不同siRNA。利用大量不同siRNA的反应，使得能够确定不同siRNA对靶和非靶的作用(参见，例如2004年5月17日提交的Jackson等的国际申请No.PCT/US2004/015439)。

与所述细胞类型的正常细胞相比，试剂对所述细胞类型的细胞的作用在敲除细胞中可以减弱，即，基因的敲除减弱了试剂的作用。在所述细胞中被敲除的所述基因，被认为赋予了对试剂的敏感性。因此，在一种实施方案中，将本发明的方法用于鉴定赋予对试剂的敏感性的一种或多种基因。

与所述细胞类型的正常细胞相比，试剂对所述细胞类型的细胞的作用在敲除细胞中可以增强。在所述细胞中被敲除的所述基因，被认为赋予了对试剂的抗性。因此，在另一种实施方案中，将本发明的方法用于鉴定赋予对试剂的抗性的一种或多种基因。对试剂作用的增强可以是叠加的或协同的。在一种实施方案中，本发明提供了能够调节和/或增强癌细胞中抗癌药，如，癌细胞中KSP抑制剂的生长抑制作用的一种或多种基因。

本发明的方法可以用于评估大量不同的试剂。例如，可以通过本发明的方法评估对在下文的5.4.2节中描述的大量不同DNA破坏剂的敏感性。在一种优选实施方案中，评估敲除文库中每种敲除细胞对大量不同试剂中每一种试剂的敏感性，以产生二维的反应矩阵，其中包含每种试剂对每种敲除细胞的作用的测量值。特定基因指数下基因轴的截距，产生了特定敲除细胞(其中特定基因被敲除)对不同药物的反应曲线。特定药物条件下的药物轴的截距，产生了对药物的基因反应曲线，即，包括药物对敲除文库中的不同敲除细胞的作用的测量值的曲线。表IIA-IIC是对顺铂(表IIA)、喜树碱(表IIB)和阿霉素(表IIC)的基因反应曲线的例子。

本发明的方法可以用于鉴定不同基因间的相互作用，这是通过使用调节，例如阻抑或增强基因表达和/或由基因编码的蛋白的活性的试剂而实现的。所述试剂的例子包括，但不限于，靶定基因或其产物的siRNA、反义分子、核酶、抗体和小有机或无机分子。所述试剂所靶定的基因被称作初级靶。所述试剂可以与敲除文库结合使用，以鉴定调节细胞对试剂的反应的基因。所述初级靶可以不同于敲除文库中表现的大量基因(次级基因)的任意一种。鉴定为调节试剂的作用的基因因此是与初级靶相互作用的基因。

在一种优选实施方案中，本发明提供了使用双重siRNA方法鉴定不同基因之间的相互作用的方法。在一种优选实施方案中，双重RNAi筛选是通过使用破坏初级靶基因的shRNA的稳定体内送递和靶定次级靶基因的siRNA的超转染而实现的。该方法提供了匹配的(同基因的)细胞系对(加或减shRNA)，并且不导致shRNA和siRNA之间的竞争。在该方法中，从瞬时导入或稳定整合到基因组中的重组载体表达短发夹RNA(shRNA)(参见，例如Paddison et al.，2002，GenesDev 16：948-958；Sui et al.，2002，Proc Natl Acad Sci USA 99：5515-5520；Yu et al.，2002，Proc Natl Acad Sci USA 99：6047-6052；Miyagishi et al.，2002，Nat Biotechnol 20：497-500；Paul et al.，2002，Nat Biotechnol 20：505-508；Kwak et al.，2003，J Phannacol Sci 93：214-217；Brummelkamp et al.，2002，Science 296：550-553；Bodenetal.，2003，Nucleic Acids Res 31：5033-5038；Kawasaki et al.，2003，Nucleic Acids Res 31：700-707)。可以通过编码shRNA的任何合适载体表达(经shRNA)破坏初级基因的siRNA。该载体也可以编码可用于选择克隆的标记物，所述克隆中将载体或其足够部分整合到宿主基因组中，以便表达shRNA。本领域公知的任何标准方法可以用于将载体送递到细胞中。在一种实施方案中，通过用含有载体的质粒转染合适的细胞而制备表达shRNA的细胞。然后可以通过合适的标记物选择细胞。然后挑选克隆，检测以用于敲除。在一种优选实施方案中，shRNA的表达受到诱导型启动子的控制，使得在需要时可以打开其靶基因的沉默。siRNA的诱导型表达特别适用于靶定必须基因。

在一种实施方案中，shRNA的表达受到受调节的启动子的控制，所述启动子使得能够调节靶基因的沉默水平。这使得能够筛选特定细胞，所述细胞中的靶基因被部分敲除。如此处所使用的，“受调节的启动子”是指在合适的诱导剂存在时可以被激活的启动子。“诱导剂”是指任何可以用于通过激活受调节的启动子而激活转录的分子。诱导剂可以是，但不限于，肽或多肽、激素或有机小分子。也可以使用诱导剂的类似物，即，如同诱导剂一样激活受调节的启动子的分子。不同类似物诱导的受调节的启动子的活性水平可以不同，从而使得受调节的启动子的活性水平的调节更灵活。载体中受调节的启动子可以是本领域公知的任何哺乳动物转录调节系统(参见，例如，Gossen et al，1995，Science 268：1766-1769；Lucas et al，1992，Annu.Rev.Biochem.61：1131；Li et al.，1996，Cell 85：319-329；Saez et al.，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：14512-14517；和Pollock et al.，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：13221-13226)。在优选实施方案中，以剂量和/或类似物依赖性方式调节受调节的启动子。在一种实施方案中，通过包括将诱导剂的浓度调节到受调节的启动子能够反应的浓度的方法，将受调节的启动子的活性水平调节到需要的水平。可以根据所需的靶基因沉默水平，确定通过施用特定浓度的诱导剂获得的受调节的启动子活性的所需水平。

在一种实施方案中，使用四环素调节的基因表达系统(参见，例如Gossen et al，1995，Science 268：1766-1769；美国专利No.6,004,941)。tet调节的系统使用原核生物的tet阻遏物/操纵子/诱导物系统的成分调节真核细胞中的基因表达。这样，本发明提供了使用tet调节系统调节与一个或多个tet操纵子序列连接的shRNA的表达。该方法包括将编码激活转录的融合蛋白的载体导入细胞。融合蛋白包含在四环素或四环素类似物存在下与tet操纵子序列结合的第一多肽，所述四环素或四环素类似物与激活细胞中的转录的第二多肽可操作性连接。通过调节四环素或四环素类似物的浓度，调节tet操纵子连接的shRNA的表达。

在其它实施方案中，可以使用蜕皮激素调节的基因表达系统(参见，例如，Saez et al.，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：14512-14517)或MMTV糖皮质激素反应元件调节的基因表达系统(参见，例如，Lucas et al，1992，Annu.Rev.Biochem.61：1131)调节shRNA的表达。

在一种实施方案中，使用编码嘌呤霉素抗性标记物并且驱动从H1(RNA Pol III)启动子表达shRNA的pRETRO-SUPER(pRS)载体。可以通过本领域公知的标准方法制备pRS-shRNA质粒。在一种实施方案中，pRS-shRNA从文库质粒集合解卷积，这是通过用该集合转化细菌，并且寻找仅仅含有感兴趣的质粒的克隆。优选地，19聚体siRNA序列与用于序列特异性PCR的合适正向和反向引物一起使用。通过序列特异性PCR鉴定质粒，并且通过测序证实。通过用pRS-shRNA质粒转染合适的细胞制备表达shRNA的细胞。通过合适的标记物，如嘌呤霉素选择细胞，并且维持直到集落明显。然后挑选克隆，并且检测以用于敲除。

在另一种实施方案中，由质粒，如pRS-shRNA表达shRNA。通过pRS-shRNA进行的敲除，可以通过用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染细胞而实现。

在一种优选实施方案中，通过选择含空pRS载体或pRS-shRNA的稳定克隆而制备匹配的细胞系(+/-初级靶基因)。

然后采用制备的shRNA初级靶克隆的细胞进行次级靶基因的沉默。可以采用任何已知的RNA干扰方法完成次级靶基因的沉默(参见，例如5.2节)。例如，可以用siRNA和/或编码shRNA的质粒转染，以使次级靶基因沉默。在一种实施方案中，用靶定次级靶基因的一种或多种siRNA超转染制备的shRNA初级靶克隆的细胞。在一种实施方案中，将靶定次级基因的一种或多种siRNA直接转染到细胞中。在另一种实施方案中，采用一种或多种合适的质粒，经shRNA将靶定次级基因的一种或多种siRNA转染到细胞中。可以在转染后24小时收获RNA，并且通过TaqMan分析评估敲除。在一种优选实施方案中，将含有靶定次级靶基因的不同序列区域的至少k种(k＝2、3、4、5、6或10)不同的siRNA的siRNA集合用于超转染细胞。在另一种优选实施方案中，将含有靶定两种或多种不同的次级靶基因的至少k种(k＝2、3、4、5、6或10)不同的siRNA的siRNA集合用于转染细胞。

在一种优选实施方案中，集合的总siRNA浓度大约与单独使用的单一siRNA的浓度相同，例如100nM。优选地，siRNA集合的总浓度是用于使作为目标的靶基因沉默的最优浓度。最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，基本不增加沉默的水平。在一种实施方案中，最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，沉默水平的增加不超过5％、10％或20％。在一种优选实施方案中，选择集合的组成，包括集合中不同siRNA的数目和每一种不同siRNA的浓度，使得siRNA的集合导致任何不作为靶的基因的沉默小于30％、20％、10％或5％、1％、0.1或0.01％。在另一种优选实施方案中，不同siRNA的集合中包含的每种不同的siRNA的浓度大约相同。在另一种优选实施方案中，集合中包含的不同的siRNA的浓度彼此之间的差别小于5％、10％、20％或50％。在一种优选实施方案中，不同siRNA的集合中的至少一种siRNA，占集合的总siRNA浓度的90％、80％、70％、50％或20％以上。在另一种优选实施方案中，不同siRNA的集合中没有一种siRNA占不同siRNA的总siRNA浓度的90％、80％、70％、50％或20％以上。在其它实施方案中，集合中的每一种siRNA的浓度都低于单独使用时的最优浓度。在一种优选实施方案中，集合中的每一种不同的siRNA的浓度低于有效达到不存在其它siRNA或不存在其它设计用于使基因沉默的siRNA时的基因沉默的至少30％、50％、75％、80％、85％、90或95％的siRNA浓度。在另一种优选实施方案中，集合中的每一种不同siRNA的浓度导致的基因沉默低于不存在其它siRNA或不存在其它设计用于使基因沉默的siRNA时的基因沉默的30％、20％、10％或5％。在一种优选实施方案中，每种siRNA的浓度导致的基因沉默低于单独使用时导致的靶基因沉默的30％、20％、10％或5％，而大量siRNA导致靶基因沉默的至少80或90％。

在一种实施方案中，本发明提供了用于鉴定表现出与初级靶基因的协同致死相互作用的一种或多种基因的方法。在该方法中，用作为细胞类型中的初级靶基因的抑制剂的试剂对敲除文库进行筛选。因此，鉴定为增强试剂的作用的基因，是与初级靶具有协同致死相互作用的基因。在一种优选实施方案中，所述试剂是靶定初级靶并且使其沉默的siRNA。

确定试剂对细胞的作用的方法取决于待评估的特定作用。例如，如果试剂是抗癌药物，并且待评估的作用是药物的生长抑制作用，则可以使用MTT测定或alamarBlue测定(参见，例如5.2节)。本领域技术人员人员能够基于待评估的特定作用选择本领域公知的方法。

在另一种实施方案中，本发明提供了确定一种试剂对特定细胞的生长的作用，所述特定细胞的初级靶基因和次级靶基因沉默。在一种优选实施方案中，按照上文所述制备匹配的细胞系(+/-初级靶基因)。然后用对照siRNA(如荧光素酶)或靶定次级靶基因的一种或多种siRNA超转染两种细胞系。在暴露或不暴露于所述试剂的条件下检查细胞周期谱。可以用本领域公知的标准方法进行细胞周期分析(参见下文5.2节)。在一种实施方案中，将每个孔的上清液与通过胰蛋白酶消化而收获的细胞合并。然后以合适的速度离心混合物。然后用冰冷的70％醇将细胞固定合适的时间段，如约30分钟。可以用PBS洗涤固定的细胞一次，然后重悬，例如重悬于0.5ml含有碘化丙锭(10微克/ml)和RNA酶A(1mg/ml)的PBS中，在合适的温度，如37℃下温育合适的时间段，如30分钟。用流式细胞仪进行流式细胞分析。在一种实施方案中，用亚G1细胞群测量细胞死亡。初级靶基因和次级靶基因沉默的细胞中的G1细胞群的增加，表明在所述试剂存在下初级和次级靶基因的协同致死作用。

在一种特定实施方案中，本发明提供了用于鉴定基因的方法，所述基因的敲除增强KSP抑制剂对肿瘤细胞的生长抑制作用。在一种实施方案中，用该方法鉴定基因，所述基因的敲除在亚最优浓度，即低于EC10的浓度的KSPi存在下抑制肿瘤细胞生长。在一种实施方案中，制备并使用含有靶定以下11种基因中的每一种的3种siRNA的siRNA敲除文库：CDC20、ROCK2、TTK、FZR1、BUB1、BUB3、BUB1B、MAD1L1、MAD2L1、DNCH1和STK6(参见表1)。在＜EC10浓度(25nM)的KSPi，即(1S)-1-{[(2S)-4-(2，5-二氟苯基)-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基]羰基}-2-甲基丙胺(参见2003年6月12日提交的PCT申请PCT/US03/18482)存在或不存在的条件下将这些siRNA中的每一种导入HeLa细胞，并且确定细胞的反应。一种STK6(STK6-1)的siRNA表现出KSPi存在下对肿瘤细胞生长的显著抑制。

用STK6的三种额外的siRNA进一步检查生长抑制活性，并且评估所有6种siRNA诱导STK6沉默和生长抑制的能力。在不同的siRNA中，在STK6沉默水平和生长抑制之间存在良好的相关性(图1)。该相关性表明生长抑制是由于靶活性(即，STK6破坏)。然后在2003年6月12日提交的PCT申请PCT/US03/18482中描述的(1S)-1-{[(2S)-4-(2，5-二氟苯基)-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基]羰基}-2-甲基丙胺存在或不存在的条件下，用靶定荧光素酶的对照(阴性对照)滴定STK6-1(图2)。KSPi的添加将STK6-1剂量反应曲线向左移动了约5-10倍。KSPi的该浓度没有增强由荧光素酶siRNA导致的对细胞生长的作用。相反，对靶定PTEN的siRNA的剂量反应曲线没有被KSPi移动，所述PTEN与STK-6对细胞生长具有相似的作用。其它靶定STK6的siRNA也增强KSPi对细胞生长的作用。由此，STK6的破坏增强了KSPi对细胞生长的作用。通过采用STK6和KSP的siRNA的组合的研究，获得了对此的进一步支持(表1)，所述组合表现出比任一单独的siRNA更强的生长抑制活性。由于用于这些实验中的KSPi浓度自身不影响细胞生长，KSPi对STK6siRNA活性的作用表现为协同的，而不是叠加的。

在另一种特定实施方案中，本发明提供了用于确定p53和CHEK1之间的协同致死作用的方法。制备了p53基因沉默的稳定克隆。pRS-TP53 1026 shRNA质粒从TP53的文库质粒集合解卷积，这是通过用该集合转化细菌，并且寻找仅仅含有感兴趣的质粒的克隆。所使用的序列如下：pRS-p53 1026 19聚体序列：GACTCCAGTGGTAATCTAC(SEQ ID NO：43)；序列特异性PCR的引物：正向：GTAGATTACCACTGGAGTC (SEQ ID NO：44)，反向：CCCTTGAACCTCCTCGTTCGACC(SEQ ID NO：45)。通过序列特异性PCR鉴定质粒，并且通过测序进行证实。通过用带有pRS-TP531026质粒的FuGENE 6(Roche)转染HCT116细胞，制备稳定的p53克隆。48小时后将细胞分配到加有1ug/ml嘌呤霉素的10cm培养皿中，维持直到集落明显(5-7天)。将克隆挑选到96孔板，在1ug/ml嘌呤霉素中维持，并且使用TP53和hGUS Pre-Developed测定试剂(AppliedBiosystems)，通过TaqMan检验敲除。为了通过pRS-TP531026质粒测量瞬时敲除，用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染HCT116细胞，在24小时后收获RNA。通过TaqMan评估TP53转录物水平。

来源于结肠肿瘤细胞系HCT116的多个嘌呤霉素抗性TP53shRNA克隆(pRS-p53)的分析表明不同水平的靶沉默(通过TaqMan确定为50％-96％)。图3表明克隆A5和A11中的TP53表达水平，所述克隆表现出最高水平的沉默。这些克隆中的TP53沉默超过了通过瞬时转染将pRS-p53送递到HCT116细胞后24小时观察到的沉默(图3)。转染效率可能限制TP53shRNA在瞬时转染中的有效性。或者，具有更高TP53沉默水平的细胞在克隆生长过程中获得了生长优势。采用靶定STK6的shRNA(pRS-STK6：pRS-STK6 2178 19聚体序列：CATTGGAGTCATAGCATGT(SEQ ID NO：46))，也观察到了稳定克隆中的一定范围的沉默。但是，这些克隆没有达到与TP53细胞系中观察到的一样高程度的沉默，其沉默也不超过在瞬时测定中获得的沉默。这可能表示抗高水平STK6沉默的选择，因为STK6是培养物中的肿瘤细胞生长的必须基因。

为了检验HCT116克隆中的TP53沉默是否与siRNA竞争，用CHEK1特异性siRNA的集合超转染该克隆的细胞。CHK1集合含有以下三种siRNA：CUGAAGAAGCAGUCGCAGUTT(SEQ ID NO：99)；AUCGAUUCUGCUCCUCUAGTT(SEQID NO：98)；和UGCCUGAAAGAGACUUGUGTT(SEQ ID NO：100)。发现该siRNA集合竞争性降低TP53靶定的siRNA的沉默活性。示出了用10nM或100nM Oligofectamine(Invitrogen)转染的siRNA。对于CHK1集合，以33.3nM同时转染三种siRNA，总共送递100nM。在转染后24小时收获RNA，并且使用CHK1或TP53和hGUS Pre-Developed测定试剂(AppliedBiosystems)，通过TaqMan分析评估敲除。如图4A所示，shRNA和siRNA集合不竞争性抑制每种其它靶的沉默。然后测定由相同序列的瞬时转染的siRNA或稳定表达的shRNA的已知竞争性siRNA导致的抑制。如图4B所示，三种单独的靶定KNSL1(KNSLI210：GACCUGUGCCUUUUAGAGATT(SEQ ID NO：47)；KNSLI211：GACUUCAUUGACAGUGGCCTT(SEQ ID NO：48)；KNSLI212：AAAGGACAACUGCAGCUACTT(SEQ ID NO：49))的siRNA竞争性抑制由靶定STK6的共转染的siRNA达到的沉默(左边的柱)。相反，稳定转染的细胞系中同源STK6shRNA导致的沉默不受KNSL1siRNA的超转染的影响，即使以高10倍的浓度加入竞争剂siRNA时也是如此(中间和右边的柱)。这些实验表明，在稳定表达的shRNA和瞬时转染的siRNA之间几乎没有竞争。这与一起转染彼此竞争的、靶定不同mRNA的两种不同siRNA时的观察结果相反，其中有效降低了使用的一种或两种siRNA的效率。用大约800种基因的siRNA集合瞬时转染pRS和pRS-p53HCT116细胞(参见下文实施例3)，并且通过Alamar Blue测定法测量对细胞生长的作用。观察到了对pRS细胞和pRS-p53细胞中所述大约800种siRNA的集合的几乎相同的反应，没有显示沉默的竞争性抑制。

随后，评估CHEK1 siRNA集合在稳定表达TP53shRNA的细胞中的超转染，以确定是否可以将其用于研究这些分子之间的遗传相互作用(SL)。通过选择含有空pRS载体或pRS-p53的A549肺癌细胞系而制备匹配的细胞系+/-TP53表达。后一种细胞表现出＞90％的TP53mRNA沉默。然后用对照荧光素酶siRNA(luc，100nM)或CHEK1siRNA集合(总共100nM；3种siRNA的每一种33nM)超转染两种细胞系，在暴露或不暴露于DNA破坏剂阿霉素(Dox，图5)的情况下检验它们的细胞周期谱。在缺乏Dox的情况下，pRS-p53细胞的细胞周期谱没有明显不同于pRS细胞的细胞周期谱。CHEK1siRNA的瞬时转染也没有影响不存在Dox情况下的细胞周期谱。但是，在Dox存在的情况下，如对表达功能性TP53的细胞所预期的，pRS转染的细胞表现出了G1和G2/M停滞。CHEK1siRNA的超转染导致了越过G2关卡，并且在G1阻断的细胞数目增加。因为细胞保留TP53功能，它们在G1期停滞并且不回到S期。

相反，pRS-p53细胞失去了在G1停滞的能力，并且主要反应于Dox处理而在G2期停滞，这与TP53在G1关卡的作用一致。通过lucsiRNA超转染发现pRS-p53细胞的细胞周期谱没有改变(图5)。lucsiRNA甚至没有导致TP53反应的部分恢复(以及G1峰的相应增加)，表明该siRNA几乎没有产生对TP53沉默和表型的竞争性抑制。因此，预计不存在CHEK1 siRNA集合导致的TP53沉默的竞争性抑制。实际上，反应于Dox处理，用CHEK1瞬时转染的pRS-p53细胞在它们的细胞周期谱表现出了显著改变，在S期的细胞比例显著增加，并且具有亚G1(死细胞)量的DNA。在pRS和pRS-p53稳定转染的HCT116细胞种也观察到了相似的发现。因此，由TP53介导的G1关卡和CHEK1介导的G2关卡的同时破坏，对TP53-肿瘤细胞是致死的，但对TP53+肿瘤细胞不是致死的。

在另一种实施方案中，本发明提供了确定p53和BRCC复合物的一个成员，如BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51之间的协同致死作用的方法。在该实施方案中，使用了通过稳定表达靶定TP53的短发夹RNA(shRNA)产生的匹配的一对TP53阳性和阴性细胞。用BRCA1或BRCA2的siRNA集合超转染TP53阳性或阴性细胞，用顺铂处理，并且用Alamar Blue分析细胞生长(图20)。当用BRCA1或BRCA2siRNAs(IC50约0.1nM)转染时，TP53阴性细胞对顺铂比用对照siRNA(荧光素酶，IC50约1nM)转染时敏感约10倍。在更低的顺铂浓度，BRCA1或BRCA2破坏后对顺铂的敏化作用甚至更显著。BRCA1或BRCA2破坏后，TP53阳性细胞对顺铂较不敏感(IC50约0.4nM)。在该分析中，BRCA1或BRCA2破坏后对顺铂的敏化作用在数量级上与在CHEK1破坏后的敏化作用相似(数据未示出)。也可以用细胞周期分析，研究BRCA1和BRCA2破坏后对DNA破坏剂的敏化作用。用BRCA1或BRCA2的siRNA集合超转染TP53阳性和阴性细胞，用一些DNA破坏剂(顺铂、喜树碱、阿霉素和博莱霉素)中的一种处理，并且通过流式细胞术分析细胞周期破坏。在所有情况下，TP53阴性细胞在BRCA1和BRCA2破坏后比在荧光素酶转染的细胞中对DNA破坏剂更敏感(数据未示出)。BRCA1破坏后这些细胞对博莱霉素的反应示于图21。BRCA1破坏在用博菜霉素处理TP53阴性细胞后，比处理TP53阳性细胞导致了更多的亚G1细胞(死亡细胞)。所述结果表明，缺乏TP53的细胞在BRCA1破坏后对DNA破坏更敏感。

使用的细胞系可以是HeLa细胞、TP53阳性A549细胞或TP53阴性A549细胞。在一种实施方案中，通过稳定转染靶定TP53的短发夹RNA(shRNA)，制备了匹配的TP53阳性和阴性细胞对(monthlyhighlt highlight，Nov.2003)。用100nM(每种siRNA 33nM)的siRNA集合(每个基因三种siRNA的集合)转染细胞，或用100nM的单一siRNA转染细胞。使用了以下siRNA：Luc对照、BRCA1、BRCA2和BARD1集合。然后用各种浓度的DNA破坏剂处理转染的细胞。细胞周期分析中使用的每种试剂的浓度如下：对于HeLa细胞，使用阿霉素(10nM)、喜树碱(6nM)、顺铂(400ng/ml)、丝裂霉素C(40nM)、博莱霉素(100ng/ml)；对于其它细胞，使用阿霉素(200nM)、喜树碱(200nM)、顺铂(2ug/ml)丝裂霉素C(400nM)、博莱霉素(5ug/ml)。

在一种实施方案中，按如下进行siRNA转染：在转染前一天，将2000(或100)微升选定的细胞系，如在DMEM/10％胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)中生长至约90％汇合的宫颈癌HeLa细胞(ATCC，Cat.No.CCL-2)以45,000(或2000)细胞/孔种植在6孔(或96孔)组织培养板上。对于每次转染，将70微升OptiMEM(Invitrogen)与来自20微摩尔储液的5微升siRNA(Dharmacon，Lafayette，CO)混合。对于每次转染，将20微升OptiMEM与5微升Oligofectamine试剂(Invitrogen)混合，并且在室温下温育5分钟。然后将25微升OptiMEM/Oligofectamine混合物与75微升OptiMEM/siRNA混合物混合，并且在室温下温育15-20分钟。将100(或10)微升转染混合物等分到6孔(或96孔)板的每个孔中，并且在37℃和5％CO2的条件下温育4小时。

4小时后，将100微升/孔的含有或不含有DNA破坏剂的DMEM/10％胎牛血清加入每个孔，以达到上文所述的每种试剂的终浓度。将板在37℃和5％CO2的条件下再温育68小时。分析来自6孔板的样品的细胞周期谱，用Alamar Blue测定法分析来自96孔板的样品的细胞生长。

对于细胞周期分析，将来自每个孔的上清液与通过胰蛋白酶消化而收获的细胞混合。然后以1200rpm将混合物离心5分钟。用冰冷的70％乙醇将细胞固定约30分钟。用PBS将固定的细胞洗涤一次，重新悬浮在0.5ml含有碘化丙锭(10微克/ml)和RNA酶A(1mg/ml)的PBS中，并且在37℃下温育30分钟。用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson)进行流式细胞分析，并且用FlowJo软件(TreeStar，Inc)分析数据。用亚G1细胞群测量细胞死亡。如果(siRNA+DMSO)样品和(Luc+药物)样品的亚G1细胞群的总和大于(siRNA+药物)样品的亚G1细胞群，我们确定siRNA沉默对DNA破坏的敏化。

对于Alamar Blue分析，除去96孔板的培养基，加入100uL/孔含有10％(vol/vol)alamar Blue试剂(BioSource International，Inc)和百分之一体积1M Hepes缓冲液组织培养试剂的完全培养基。然后将板在37℃下温育1-4小时，通过用SPECTRAMax Gemini-Xs光谱荧光计(Molceular Devices)在544nm激发和在590nm检测发射而测量荧光。对背景(无细胞)校正荧光信号。DNA破坏剂存在下的细胞反应(存活)测量为不存在DNA破坏剂条件下的对照细胞生长的百分比。

5.2.用于RNA干扰和细胞测定的方法和组合物

可以将任何基因沉默的标准方法用于本发明(参见，例如，Guo etal.，1995，Cell 81：611-620；Fire et al.，1998，Nature 391：806-811；Grant，1999，Cell 96：303-306；Tabara et al.，1999，Cell 99：123-132；Zamore et al.，2000，Cell 101：25-33；Bass，2000，Cell 101：235-238；Petcherski et al.，2000，Nature 405：364-368；Elbashir et al.，Nature 411：494-498；Paddison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：1443-1448)。可以根据本领域公知的方法设计靶定基因的siRNA(参见，例如2004年5月17日提交的Jackson等的美国临时专利申请No.60/572,314，和Elbashir et al.，2002，Methods 26：199-213，在此全文引入每一篇的完整内容作为参考)。

可以使用仅仅与靶基因具有部分序列同源性的siRNA(参见，例2004年5月17日提交的Jackson等的国际申请No.PCT/US2004/015439，在此全文引入其完整内容作为参考)。在一种实施方案中，使用包含与基因转录物的序列相同的11-18个核苷酸的有义链连续核苷酸序列的siRNA(但该siRNA不与转录物中的任何序列具有全长同源性)使基因沉默。优选地，连续核苷酸序列是siRNA分子的中心区。中心区中的连续核苷酸序列可以是siRNA中不从3’端开始的任何一段连续的核苷酸序列。例如，11个核苷酸的连续核苷酸序列可以是核苷酸序列2-12、3-13、4-14、5-15、6-16、7-17、8-18或9-19。在一种优选实施方案中，连续核苷酸序列的长度是11-16、11-15、14-15、11、12或13个核苷酸。

在另一种实施方案中，使用包含与基因转录物的序列相同的9-18个核苷酸的3’有义链连续核苷酸序列的siRNA(但该siRNA不与转录物中的任何连续序列具有全长同源性)使基因沉默。在本申请中，3′9-18个核苷酸的序列是一段连续的核苷酸，它从第一对碱基开始，即，它不包含两个碱基的3’突出端。因此，当指出特定核苷酸序列位于siRNA的3’端时，不考虑2碱基突出端。在优选实施方案中，连续核苷酸序列的长度是9-16、9-15、9-12、11、10或9个核苷酸。

可以用本领域公知的任何方法进行RNA干扰。在一种实施方案中，通过给细胞提供siRNA诱导基因沉默，模拟切割酶切割的产物(参见，例如Elbashir et al.，2001，Nature 411，494-498；Elbashir et al.，2001，Genes Dev.15，188-200，在此全文引入所有文献作为参考)。合成的siRNA双链体保持了与RISC缔合的能力，并且指导mRNA转录物的沉默。siRNA可以化学合成，或来源于通过重组切割酶进行的双链RNA的切割。可以采用本领域公知的标准方法，用siRNA转染细胞。

在一种实施方案中，按如下进行siRNA转染：在转染前一天，将100微升选定的细胞，如在DMEM/10％胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)中生长至约90％汇合的宫颈癌HeLa细胞(ATCC，Cat.No.CCL-2)以1500细胞/孔种植在96孔组织培养板上(Corning，Coming，NY)。对于每次转染，将85微升OptiMEM(Invitrogen)与来自20微摩尔储液的5微升系列稀释的siRNA(Dharmacon，Denver)混合。对于每次转染，将5微升OptiMEM与5微升Oligofectamine试剂(Invitrogen)混合，并且在室温下温育5分钟。然后将10微升OptiMEM/Oligofectamine混合物与OptiMEM/siRNA混合物分配到每个试管中，混合，并且在室温下温育15-20分钟。将10微升转染混合物等分到96孔板的每个孔中，并且在37℃和5％CO2的条件下温育4小时。

用于基因沉默的另一种方法是导入shRNA，即短发夹RNA(参见，例如Paddison et al.，2002，Genes Dev.16，948-958；Brummelkampet al.，2002，Science 296，550-553；Sui，G.et al.2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，5515-5520，在此全文引入所有上述文献作为参考)。在该方法中，从作为具有间插的环状序列的反向重复序列的质粒(或病毒)表达需要的siRNA以形成发夹结构。随后通过切割酶加工得到的含发夹结构的RNA转录物，以制备用于进行沉默的siRNA。可以在细胞中稳定表达基于质粒的shRNA，使得能够在体外和体内，例如在哺乳动物中进行长期基因沉默(参见，McCaffrey et al.2002，Nature418，38-39；Xia et al.，2002，Nat.Biotech.20，1006-1010；Lewis et al.，2002，Nat.Genetics 32，107-108；Rubinson et al.，2003，Nat.Genetics33，401-406；Tiscornia et al.，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100，1844-1848，在此全文引入所有上述文献作为参考)。这样，在一种实施方案中，使用基于质粒的shRNA。

在一种优选实施方案中，将从重组载体表达的shRNA瞬时导入或稳定整合到基因组中(参见，例如Paddison et al.，2002，Genes Dev16：948-958；Sui et al.，2002，Proc Natl Acad Sci USA 99：5515-5520；Yu et al.，2002，Proc Natl Acad Sci U SA 99：6047-6052；Miyagishi etal.，2002，Nat Biotechnol 20：497-500；Paul et al.，2002，Nat Biotechnol20：505-508；Kwak et al.，2003，J Phamacol Sci 93：214-217；Brummelkamp et al.，2002，Science 296：550-553；Boden et al.，2003，Nucleic Acids Res 31：5033-5038；Kawasaki et al.，2003，Nucleic AcidsRes 31：700-707)。可以通过任何合适的编码shRNA的载体(经shRNA)表达破坏靶基因的siRNA。载体也可以编码用于选择特定克隆的标记物，所述克隆中载体或其足够部分整合到了宿主基因组中，以便表达shRNA。可以用本领域公知的任何方法将载体送递到细胞中。在一种实施方案中，通过用包含载体的质粒转染合适的细胞而制备表达shRNA的细胞。然后可以通过合适的标记物选择细胞。然后挑选克隆，进行检验以用于敲除。在一种优选实施方案中，shRNA的表达处于诱导型启动子的控制下，以便当需要时可以打开其靶基因的沉默。siRNA的诱导型表达特别适用于靶定必须基因。

在一种实施方案中，shRNA的表达处于受调节的启动子的控制下，所述启动子使得能够调节靶基因的沉默水平。这使得能够筛选靶基因被部分敲除的细胞。此处使用的“受调节的启动子”是指当存在合适的诱导剂时可以被激活的启动子。“诱导剂”可以是任何可以被用于通过激活受调节的启动子而激活转录的分子。诱导剂可以是，但不限于，肽或多肽、激素或有机小分子。也可以使用诱导剂的类似物，即，与诱导剂一样激活受调节的启动子的分子。由不同类似物诱导的受调节的启动子的活性水平可以不同，这样使得受调节的启动子的活性水平调节更灵活。载体中受调节的启动子可以是本领域公知的任何哺乳动物转录调节系统(参见，例如Gossen et al，1995，Science 268：1766-1769；Lucas et al，1992，Annu.Rev.Biochem.61：1131；Li et al.，1996，Cell 85：319-329；Saez et al.，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：14512-14517；和Pollock et al.，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：13221-13226)。在优选实施方案中，以剂量和/或类似物依赖性方式调节受调节的启动子。在一种实施方案中，通过包括将诱导剂的浓度调节到受调节的启动子有反应的浓度的方法，将受调节的启动子的活性水平调节到需要的水平。可以基于靶基因的需要的沉默水平，确定通过施用特定浓度诱导剂而获得的受调节的启动子的需要的活性水平。

在一种实施方案中，使用编码嘌呤霉素抗性标记物并且驱动从H1(RNA Pol III)启动子表达shRNA的pRETRO-SUPER(pRS)载体。可以通过本领域公知的标准方法制备pRS-shRNA质粒。在一种实施方案中，pRS-shRNA从文库质粒集合解卷积，这是通过用该集合转化细菌，并且寻找仅仅含有感兴趣的质粒的克隆。优选地，19聚体siRNA序列与用于序列特异性PCR的合适正向和反向引物一起使用。通过序列特异性PCR鉴定质粒，并且通过测序证实。通过用pRS-shRNA质粒转染合适的细胞制备表达shRNA的细胞。通过合适的标记物，如嘌呤霉素选择细胞，并且维持直到集落明显。然后挑选克隆，并且检测以用于敲除。在另一种实施方案中，由质粒，如pRS-shRNA表达shRNA。通过pRS-shRNA进行的敲除，可以通过用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染细胞而实现。

在另一种方法中，可以将siRNA体内送递到动物，如人的器官或组织中(参见，例如Song et al.2003，Nat.Medicine 9，347-351；Sorensenet al.，2003，J.Mol.Biol.327，761-766；Lewis et al.，2002，Nat.Genetics32，107-108，在此全文引入所有上述文献作为参考)。在该方法中，将siRNA的溶液静脉内注射到动物中。然后siRNA可以到达目的器官或组织，并且有效减少靶基因在动物器官或组织中的表达。

可以使用本领域公知的任何合适的增殖或生长抑制测定来测定细胞生长。在一种优选实施方案中，用MTT增殖测定(参见，例如vande Loosdrechet，et al.，1994，J.Immunol.Methods 174：311-320；Ohno et al.，1991，J.Immunol.Methods 145：199-203；Ferrari et al.，1990，J.Immunol.Methods 131：165-172；Alley et al.，1988，CancerRes.48：589-601；Carmichael et al.，1987，Cancer Res.47：936-942；Gerlier et al.，1986，J.Immunol.Methods 65：55-63；Mosmann，1983，J.Immunological Methods 65：55-63)来测定一种或多种试剂在抑制细胞生长中的作用。用选定浓度的一种或多种候选试剂处理细胞选定的时间段，如4-72小时。然后细胞与合适量的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)一起温育选定的时间段，如1-8小时，使得存活的细胞将MTT转化为不溶的甲

的细胞内沉积物。除去上清液中包含的过量MTT后，加入合适的MTT溶剂，如DMSO溶液，以溶解甲

然后通过确定例如570nm处的光密度，测量与存活细胞的数目成比例的MTT浓度。可以测定大量不同浓度的候选试剂，以便确定导致50％抑制的候选试剂的浓度。

在另一种优选实施方案中，使用细胞增殖的alamarBlue^TM测定来筛选可以用于抑制细胞生长的一种或多种候选试剂(参见，例如Page etal.，1993，Int.J.Oncol.3：473-476)。alamarBlue^TM测定测量细胞呼吸，并且将其用作存活细胞数目的量度。增殖细胞的内环境比非增殖细胞的内环境具有更高的还原性。例如，在增殖过程中，NADPH/NADP，FADH/FAD，FMNH/FMN和NADH/NAF的比值增加。这些代谢中间产物可以还原alamarBlue，因此，可以用于监测细胞增殖。通过alamarBlue测量的处理的样品中的细胞数目可以表示为相对于未处理的对照样品中的细胞数目的百分比。可以通过吸光度或荧光分光光度法测量alamarBlue还原。在一种实施方案中，通过吸光度确定alamarBlue还原，并且采用以下公式计算为还原百分比：

其中：

λ₁＝570nm

λ₂＝600nm

(ε_redλ₁)＝155,677(570nm处还原的alamarBlue的摩尔消光系数)

(ε_redλ₂)＝14,652(600nm处还原的alamarBlue的摩尔消光系数)

(ε_oxλ₁)＝80,586(570nm处氧化的alamarBlue的摩尔消光系数)

(ε_oxλ₂)＝117,216(600nm处氧化的alamarBlue的摩尔消光系数)

(Aλ₁)＝570nm处测试孔的吸光度

(Aλ₂)＝600nm处测试孔的吸光度

(A’λ₁)＝570nm处含有培养基加alamarBlue但没有添加细胞的阴性对照孔的吸光度

(A’λ₂)＝600nm处含有培养基加alamarBlue但没有添加细胞的阴性对照孔的吸光度。优选地，从含有样品的孔的％还原减去不含细胞的孔的％还原，以确定高于背景的％还原。

可以采用本领域公知的标准方法进行细胞周期分析。在一种实施方案中，将每个孔的上清液与通过胰蛋白酶消化收获的细胞合并。然后以合适的速度离心混合物。然后用冰冷的70％乙醇将细胞固定合适的时间段，如约30分钟。可以用PBS洗涤固定的细胞一次，然后重悬，例如重悬于0.5ml含有碘化丙锭(10微克/ml)和RNA酶A(1mg/ml)的PBS中，在合适的温度，如37℃下温育合适的时间段，如30分钟。用流式细胞仪进行流式细胞分析。在一种实施方案中，用亚G1细胞群测量细胞死亡。例如，如果用试剂处理的样品的亚G1细胞群大于未用试剂处理的样品的亚G1细胞群，则认为细胞对试剂敏感。

5.3.KSP相互作用基因及其产物的用途

本发明提供了利用与KSP相互作用的基因(“KSP相互作用基因”)，如STK6或TPX2基因、其产物及抗体来鉴定与KSP相互作用基因或蛋白相互作用的蛋白或其它分子的方法和组合物。在一种优选实施方案中，本发明提供了STK6或TPX2基因作为所述KSP相互作用基因。本发明也提供了利用KSP相互作用基因，如STK6或TPX2基因、产物及抗体来筛选调节KSP相互作用基因表达或调节KSP相互作用基因或蛋白与其它蛋白或分子的相互作用的方法和组合物。本发明还提供了利用KSP相互作用基因，如STK6或TPX2基因、产物及抗体来筛选可以用于调节对KSP抑制剂(KSPi)的生长抑制作用的抗性和/或增强KSP抑制剂在细胞或生物体中的生长抑制作用的方法和组合物。本发明还提供了利用KSP相互作用基因，如STK6或TPX2基因、产物及抗体来诊断由KSP相互作用基因介导的对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性和用于与使用KSP抑制剂的疗法联合治疗疾病的方法和组合物。

5.3.1.确定与KSP相互作用基因或其产物相互作用的蛋白或其它分子的方法

可以使用任何适于检测蛋白-蛋白相互作用的方法来鉴定KSP相互作用蛋白，如STK6或TPX2蛋白与另一种细胞蛋白之间的相互作用。也可以采用本领域公知的方法确定KSP相互作用基因，如STK6或TPX2基因与其它细胞分子之间的相互作用。

可以使用的传统方法包括免疫共沉淀、交联和通过梯度或层析柱共纯化。利用诸如这些的程序，使得能够鉴定与KSP相互作用基因产物相互作用的细胞蛋白。一旦得到分离，所述细胞蛋白可以被鉴定，然后可与标准技术结合使用，用于鉴定与其相互作用的蛋白。例如，可以用本领域公知的技术，如Edman降解技术(参见，例如Creighton，1983，″Proteins：Structures and Molecular Principles″，W.H.Freeman& Co.，N.Y.，pp.34-49)确定与KSP相互作用基因产物相互作用的细胞蛋白的至少一部分氨基酸序列。可以将获得的氨基酸序列作为产生可以用于筛选编码所述细胞蛋白的基因序列的寡核苷酸混合物的指导。例如，可以通过标准杂交或PCR技术完成筛选。用于制备寡核苷酸混合物和筛选的技术是本领域公知的(参见，例如Ausubel，supra.，and PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，1990，Innis，M.et al.，eds.Academic Press，Inc.，New York)。

此外，可以使用导致同时鉴定编码与KSP相互作用蛋白相互作用的细胞蛋白的基因。这些方法包括，例如，利用与公知的λgt11文库的抗体探测技术相似的方式，用标记的KSO相互作用蛋白探测表达文库。

详细描述了检测蛋白的体内相互作用的一种方法，即双杂合系统，只是为了说明，而不是限制。描述了该系统的一种形式(Chien etal.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：9578-9582)，并且可以从Clontech(Palo Alto，CA)商购。

简言之，采用这样的系统，构建了编码两种杂合蛋白的质粒：一种由与KSP相互作用基因产物融合的转录激活蛋白的DNA结合域组成，另一种由与作为cDNA文库的一部分重组到该质粒中的cDNA编码的未知蛋白融合的转录激活蛋白的激活域组成。将DNA结合域融合质粒和cDNA文库转化到含有报道基因(如HBS或lacZ)的啤酒糖酵母株，所述酵母株的调节区含有转录激活物的结合位点。任何单独的杂合蛋白都不能激活报道基因的转录：DNA结合域杂合蛋白不能，因为它不提供激活功能，激活域杂合蛋白不能，因为它不能定位到激活物的结合位点。两种杂合蛋白的相互作用重建了功能性激活蛋白，并且导致报道基因的表达，通过报道基因产物的测定可以对其进行检测。

可以将双杂合系统或相关的方法用于筛选与“诱饵”基因产物相互作用的蛋白的激活域文库。举例说明，但不是限制，KSP相互作用基因产物可以用作诱饵基因产物。总基因组或cDNA序列与编码激活域的DNA融合。与DNA结合域融合的该文库和编码诱饵KSP相互作用基因产物的杂合体的质粒被共转染到酵母报道株中，筛选得到的转化体中表达报道基因的那些。例如，但不是限制，诱饵KSP相互作用基因序列，如KSP相互作用基因的编码序列，可以克隆到载体中，使得它翻译融合于编码GAL4蛋白的DNA结合域的DNA。纯化这些菌落，分离负责报道基因表达的文库质粒。然后用DNA测序鉴定由文库质粒编码的蛋白。

可以用本领域中常规实施的方法制备细胞系的cDNA文库，来自该文库的与诱饵KSP相互作用基因产物相互作用的蛋白是待检测的。根据此处描述的特定系统，例如，可以将cDNA片段插入载体，使得它们翻译融合于GAL4的转录激活域。该文库可以与诱饵KSP相互作用基因-GAL4融合质粒共转化到酵母株中，该酵母株含有由包含GAL4激活序列的启动子驱动的lacZ基因。与诱饵KSP相互作用基因产物相互作用的、由cDNA编码的融合于GAL4转录激活域的蛋白，将重构活性GAL4蛋白，并且因此驱动HIS3基因的表达。可以通过在含有基于半固体琼脂的缺乏组氨酸的培养基的陪替氏培养皿上的生长，检测表达HIS3的菌落。然后可以从这些菌株纯化cDNA，并且用本领域常规实施的技术生产和分离诱饵KSP相互作用基因-相互作用蛋白。

可以通过本领域公知的标准方法确定KSP相互作用基因及其调节剂之间的相互作用。

5.3.2.筛选试剂的方法

本发明提供了筛选调节KSP相互作用蛋白，如STK6或TPX2的表达或调节其与其它蛋白或分子的相互作用的方法。

5.3.2.1.筛选测定

设计了以下测定，以鉴定一些化合物，其结合于KSP相互作用基因或基因产物、结合于与KSP相互作用基因产物相互作用的其它细胞蛋白、结合于受KSP相互作用基因产物影响的细胞组分，如蛋白、或结合于干扰KSP相互作用基因或基因产物与其它细胞蛋白的相互作用的化合物以及调节KSP相互作用基因的活性(即，调节STK6或TPX2基因表达水平和/或调节STK6或TPX2基因产物的活性水平)的化合物。还可以利用鉴定结合于KSP相互作用基因调节序列(如启动子序列)的化合物的测定，参见，例如Platt，K.A.，1994，J.Biol.Chem.269：28558-28562，在此全文引入作为参考，所述化合物可以调节KSP相互作用基因的表达水平。所述化合物可以包括，但不限于，能够影响KSP相互作用基因或一些参与包含KSP相互作用基因的途径的其它基因的表达的小有机分子，或其它细胞蛋白。鉴定所述细胞蛋白的方法描述于上文5.3.1节。所述细胞蛋白可以参与KSP抑制剂的生长抑制作用的调节。此外，在这些化合物中，包括了影响KSP相互作用基因的表达和/或其基因产物的活性，并且可以用于调节对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性的化合物。

所述化合物可以包括，但不限于，肽，如可溶性肽，包括，但不限于，有Ig尾的融合肽，和随机肽文库的成员；(参见，例如Lam，K.S.et al.，1991，Nature 354：82-84；Houghten，R.et al.，1991，Nature 354：84-86)，以及组合化学衍生的分子文库，所述文库由D-和/或L-构型氨基酸组成、磷酸肽(包括，但不限于随机或部分简并的、定向的磷酸肽文库，参见，例如Songyang，Z.etal.，1993，Cell 72：767-778)、抗体(包括，但不限于多克隆、单克隆、人源化、抗独特型、嵌合或单链抗体，和FAb、F(ab′)₂和FAb表达文库片段、及其表位结合片段)和小有机或无机分子。

经过如此处描述的测定鉴定的化合物可以用于，例如，调节KSP相互作用基因产物的生物功能，以及用于改善对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性和/或增强KSP抑制剂的生长抑制作用。用于检测化合物的有效性的测定在下文5.3.2.2.节中讨论。

可以设计体外系统，以鉴定能够结合于本发明的KSP相互作用基因产物的化合物。鉴定的化合物可以用于，例如，调节野生型和/或KSP相互作用基因产物突变体的活性，可以用于阐明KSP相互作用基因产物的生物功能，可以在鉴定破坏正常KSP相互作用基因产物相互作用，或自身破坏所述相互作用的化合物的筛选中使用。

用于鉴定结合于KSP相互作用基因产物的化合物的原则包括在足以使KSP相互作用基因产物和测试化合物相互作用并结合的条件和时间中制备这两种成分的反应混合物，由此形成可以在反应混合物中除去和/或检测的复合物。可以采用多种方式进行所述测定。例如，进行测定的一种方法包括将KSP相互作用基因产物或测试物质锚定到固相上，并且在反应结束时检测锚定在固相上的KSP相互作用基因产物/测试化合物复合物。在所述方法的在一种实施方案中，可以将KSP相互作用基因产物锚定在固体表面，并且可以直接或间接标记未锚定的测试化合物。

在实践中，可以方便地将微量滴定板用作固相。可以通过非共价或共价附着，将锚定的成分固定化。可以通过简单地用蛋白溶液包被固体表面并干燥，完成非共价附着。或者，可以用待固定的蛋白的特异性固定化抗体，优选单克隆抗体将蛋白锚定到固体表面。可以提前制备表面并储存。

为了进行该测定，将未固定的成分加入含有锚定的成分的包被的表面。反应完成后，在形成的任何复合物保持固定在固体表面的条件下除去未反应的成分(如，通过洗涤)。可以采用多种途径完成锚定在固体表面上的复合物的检测。当预标记了前面未固定的成分时，固定在表面上的标记的检测表明形成了复合物。当没有预标记前面未固定的成分时，可以用间接标记来检测锚定在表面上的复合物，例如，采用前面未固定的成分的特异性标记抗体(抗体随后可以用标记的抗Ig抗体进行直接标记或间接标记)。

或者，可以在液相中进行反应，从未反应的成分分离反应产物，并且检测复合物；例如，用KSP相互作用基因产物或测试化合物的特异性固定化抗体锚定溶液中形成的任何复合物，用可能的复合物的其它成分的特异性标记抗体检测锚定的复合物。

KSP相互作用基因或基因产物可以在体内与一种或多种细胞内或细胞外分子，如蛋白相互作用。所述分子可以包括，但不限于，通过如上文5.3.1节描述的方法鉴定的核酸分子和蛋白。为了讨论的目的，在此将所述分子称作“结合配偶体”。破坏KSP相互作用基因产物的结合的化合物可以用于调节KSP相互作用基因产物的活性。破坏KSP相互作用基因产物的结合的化合物可以用于调节KSP相互作用基因的表达，例如通过调节KSP相互作用基因的调节剂的结合。所述化合物可以包括，但不限于诸如上文5.3.2.1节描述的肽等，其能够接近KSP相互作用基因产物。

用于鉴定干扰KSP相互作用基因产物及其细胞内或细胞外结合配偶体的相互作用的化合物的测定系统的基本原理包括在足以使KSP相互作用基因产物和结合配偶体相互作用并结合的条件和时间中制备包含这两种成分的反应混合物，由此形成复合物。为了测试化合物的抑制活性，在测试化合物存在和不存在的条件下制备反应混合物。测试化合物最初可以包括在反应混合物中，或可以在加入KSP相互作用基因产物及其结合配偶体之后的时间加入。在没有测试化合物的条件下或与安慰剂一起温育对照反应混合物。然后检测KSP相互作用蛋白和结合配偶体之间任何复合物的形成。在对照反应中形成复合物，但在含有测试化合物的反应混合物中不形成复合物，表明化合物干扰KSP相互作用蛋白和相互作用的结合配偶体之间的相互作用。此外，在含有测试化合物和正常KSP相互作用蛋白的反应混合物中的复合物形成，也可以与含有测试化合物和突变KSP相互作用蛋白的反应混合物中的复合物形成进行比较。在需要鉴定破坏突变体，但不破坏正常KSP相互作用蛋白的化合物的情况下，该比较是重要的。

可以以非均相或均相形式进行干扰KSP相互作用基因产物及其结合配偶体的相互作用的化合物。非均相测定包括将KSP相互作用基因产物或结合配偶体锚定在固相上，并且在反应结束时检测锚定在固相上的复合物。在均相测定中，在液相中进行整个反应。在任一种方法中，可以改变加入反应物的顺序，以获得关于测试的化合物的不同信息。例如，通过例如竞争而干扰KSP相互作用基因产物和结合配偶体之间的相互作用的测试化合物可以通过以下方法鉴定：在测试物质存在下进行反应，即通过在加入KSP相互作用蛋白和相互作用的结合配偶体之前或同时将测试物质加入反应混合物。或者，通过在形成复合物之后将测试化合物加入反应混合物，可以检测破坏预先形成的复合物的测试化合物，如置换复合物的成分之一的具有更高结合常数的化合物。下文简要描述了各种形式。

在非均相测定系统中，将KSP相互作用基因产物或相互作用的结合配偶体锚定在固相上，而直接或间接标记未锚定的物质。在实践中，可以方便地利用微量滴定板。可以通过非共价或共价附着，将锚定的物质固定化。可以简单地通过用KSP相互作用基因产物或结合配偶体溶液包被固体表面并干燥，完成非共价附着。或者，可以用待固定的物质的特异性固定化抗体，将物质锚定到固体表面。可以提前制备表面并储存。

为了进行该测定，在有或没有测试化合物的条件下将固定的物质的配偶体暴露于包被的表面。反应完成后，除去未反应的成分(例如，通过洗涤)和保持固定在固体表面的任何形成的复合物。可以用多种方式完成锚定在固体表面的复合物的检测。当预先标记了未固定的物质时，固定在表面上的标记的检测表明形成了复合物。当没有预先标记未固定的物质时，可以用间接标记来检测锚定在表面上的复合物，例如，采用最初未固定的物质的特异性标记抗体(抗体随后可以用标记的抗Ig抗体进行直接标记或间接标记)。根据添加反应成分的顺序，可以检测抑制复合物形成或破坏预先形成的复合物的测试化合物。

或者，可以在存在或不存在测试化合物的条件下，在液相中进行反应，从未反应的成分分离反应产物，并且检测复合物；例如，用结合成分之一的特异性固定化抗体锚定溶液中形成的任何复合物，用其它配偶体的特异性标记抗体检测锚定的复合物。同样，根据添加反应剂到液相的顺序，可以鉴定抑制复合物形成或破坏预先形成的复合物的测试化合物。

在本发明的一种替代实施方案中，可以使用均相测定。在该方法中，制备KSP相互作用蛋白和相互作用的结合配偶体的预先形成的复合物，其中标记了KSP相互作用基因产物或其结合配偶体，但由于复合物形成，该标记产生的信号被淬灭(参见，例如Rubenstein的美国专利No.4,109,496，其利用该方法进行免疫测定)。与预先形成的复合物中的物质之一竞争并且置换该物质的测试物质的添加，将导致产生高于背景的信号。以此方式，可以鉴定破坏KSP相互作用蛋白/结合配偶体相互作用的测试物质。

在一种具体的实施方案中，可以制备KSP相互作用基因产物，以采用重组DNA技术进行固定。例如，可以采用融合载体，如pGEX-5X-l，使KSP相互作用基因的编码区与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因融合，融合方式使得在得到的融合蛋白中保持其结合活性。可以纯化相互作用的结合配偶体，并且用于采用本领域常规实施的方法产生单克隆抗体。例如，可以通过本领域常规实施的方法，用放射性同位素¹²⁵I标记抗体。在非均相测定中，可以将GST融合蛋白，如GST-STK6或GST-TPX2融合蛋白锚定于谷胱甘肽-琼脂糖珠。然后，可以以允许发生相互作用和结合的方式在测试化合物存在或不存在的条件下加入相互作用的结合配偶体。在反应结束时，可以洗去未结合的物质，可以将标记的单克隆抗体加入系统中，并且使其与复合的成分结合。可以通过测量保持与谷胱甘肽-琼脂糖珠缔合的放射性的量，检测KSP相互作用蛋白和相互作用的结合配偶体之间的相互作用。测试化合物对相互作用的成功抑制，将导致测量的放射性减少。

或者，可以在不存在固体谷胱甘肽-琼脂糖珠的条件下，将融合蛋白，如GST-STK6基因融合蛋白和相互作用的结合配偶体一起混合在液体中。可以在这些物质相互作用之时或之后加入测试化合物。然后，可以将该混合物加入谷胱甘肽-琼脂糖珠，洗去未结合的物质。同样，可以通过加入标记的抗体并且测量与珠缔合的放射性而检测KSP相互作用基因产物/结合配偶体相互作用的抑制程度。

在另一种实施方案中，可以采用相应于KSP相互作用蛋白和/或相互作用的结合配偶体的结合域的肽片段替代这两种全长蛋白中的一种或两种来使用这些技术(在结合配偶体是蛋白的情况下)。可以使用本领域常规实施的任何数目的方法来鉴定和分离结合位点。这些方法包括，但不限于，编码蛋白之一的基因的诱变和筛选共免疫沉淀测定中结合的破坏。然后可以选择编码复合物中第二种物质的基因中的补偿突变。编码各自蛋白的基因的序列分析将揭示相应于参与相互作用的结合中的蛋白的区域。或者，可以用本节中上文所描述的方法将一种蛋白锚定于固体表面，并且使其与其结合配偶体相互作用并结合，所述结合配偶体已经用蛋白水解酶，如胰蛋白酶处理。洗涤后，包含结合域的标记的短肽可以保持与固体材料缔合，其可以通过氨基酸测序分离并鉴定。同样，一旦获得了编码结合配偶体的基因，可以对短基因片段进行工程化以表达蛋白的肽片段，然后可以检测所述片段的结合活性，并且纯化或合成。

例如，但不是限制，可以按照本节中上文的描述，通过制备GST-STK6或GST-TPX2融合蛋白并使其与谷胱甘肽琼脂糖珠结合而将STK6或TPX2基因产物锚定于固体材料。可以用放射性同位素，如35S标记相互作用的结合配偶体，并且用蛋白水解酶，如胰蛋白酶切割。然后可以将切割产物加入锚定的GST-STK6或GST-TPX2融合蛋白，并且使结合发生。洗去未结合的肽后，可以通过公知方法洗脱代表结合配偶体结合域的标记的结合材料，纯化，并且分析氨基酸序列。可以合成产生如此鉴定的肽，或采用重组DNA技术与合适的易化蛋白融合。

5.3.2.2.筛选调节和/或增强KSP抑制剂的生长抑制作用的化合物

可以进一步筛选调节KSP相互作用基因的表达和/或KSP相互作用蛋白的相互作用的任何试剂，如5.3.2.1节鉴定的化合物、KSP相互作用蛋白的抗体等调节和/或增强KSP抑制剂在细胞中的生长抑制作用的能力。可以将本领域公知的任何合适的增殖或生长抑制测定用于该目的。在一种实施方案中，将候选试剂和KSP抑制剂施用于细胞系的细胞，并且确定生长抑制作用的改变。优选地，用不同浓度的候选试剂与不同浓度KSPi的组合确定生长抑制作用的改变，以便确定导致50％抑制的候选试剂和KSPi的浓度的一种或多种组合，即，IC50。

在一种优选实施方案中，用MTT增殖测定(参见，例如van deLoosdrechet，et al.，1994，J.Immunol.Methods 174：311-320；Ohnoet al.，1991，J.Immunol.Methods 145：199-203；Ferrari et al.，1990，J.Immunol.Methods 131：165-172；Alley et al.，1988，Cancer Res.48：589-601；Carmichael et al.，1987，Cancer Res.47：936-942；Gerlieret al.，1986，J.Immunol.Methods 65：55-63；Mosmann，1983，J.Immunological Methods 65：55-63)来筛选与KSPi组合用于抑制细胞生长的候选试剂。用选定浓度的候选试剂和KSPi处理细胞4-72小时。然后细胞与合适量的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)一起温育1-8小时，使得存活的细胞将MTT转化为不溶的甲

的细胞内沉积物。除去上清液中包含的过量MTT后，加入合适的MTT溶剂，如DMSO溶液，以溶解甲然后通过确定570nm处的光密度，测量与存活细胞的数目成比例的MTT浓度。可以测定大量不同浓度的候选试剂，以便确定导致50％抑制的候选试剂和KSPi的浓度。

在另一种优选实施方案中，使用细胞增殖的alamarBlue^TM测定来筛选与KSPi组合用于抑制细胞生长的候选试剂(参见，例如Page etal.，1993，Int.J.Oncol.3：473-476)。alamarBlue^TM测定描述于上文5.2节。在一种特定实施方案中，进行alamarBlue^TM测定，以确定靶定KSP相互作用基因的siRNA的转染滴度曲线是否由于选定浓度的KSPi，如25nM(1S)-1-{[(2S)-4-(2，5-二氟苯基)-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基]羰基}-2-甲基丙胺的存在而改变。用STK6 siRNA转染细胞。siRNA转染后4小时，在存在或不存在KSPi的条件下加入100微升/孔的DMEM/10％胎牛血清，将板在37℃和5％CO2的条件下温育68小时。从孔中除去培养基，并且用含有10％(vol/vol)alamarBlue^TM试剂(Biosource International Inc.，Camarillo，CA)和0.001体积的1M Hepes缓冲液组织培养试剂(Invitrogen)的DMEM/10％胎牛血清(Invitrogen)替换。将板在37℃温育2小时，然后采用Softmax Pro 3.1.2软件(Molecular Devices)在SpectraMaxplus读板器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上，在570和600nm波长读数。将存在或不存在25nM(1S)-1-{[(2S)-4-(2，5-二氟苯基)-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基]羰基}-2-甲基丙胺的条件下用一定滴度的STK6siRNA转染的孔的还原百分比与荧光素酶siRNA转染的孔进行比较。不存在KSPi时对0nM荧光素酶siRNA转染的孔计算的％还原数值被认为是100％。

5.3.2.3.鉴定的化合物

在该筛选中鉴定的化合物包括证明了选择性调节细胞中KSP相互作用基因表达和调节和/或增强KSP抑制剂的生长抑制作用的能力的化合物。这些化合物包括，但不限于，siRNA、反义分子、核酶、三螺旋、抗体和多肽分子、aptamrs和小有机或无机分子。

在该筛选中鉴定的化合物也包括调节KSP相互作用蛋白与其它蛋白或分子的相互作用的化合物。在一种实施方案中，在该筛选中鉴定的化合物是调节KSP相互作用蛋白与其相互作用配偶体的相互作用的化合物。在另一种实施方案中，在该筛选中鉴定的化合物是调节KSP相互作用基因与转录调节剂的相互作用的化合物。

5.3.3.诊断

可以将多种方法用于诊断和预后性评估由于KSP相互作用基因，如STK6或TPX2的调节缺陷导致的细胞对KSP抑制剂，如(1S)-1-{[(2S)-4-(2，5-二氟苯基)-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基]羰基}-2-甲基丙胺的生长抑制作用的抗性，和用于鉴定具有对KSP抑制剂的生长抑制作用具有抗性的倾向的受试者。

在一种实施方案中，该方法包括确定细胞中KSP相互作用基因表达水平，其中高于预定阈水平的表达水平表明细胞具有KSPi抗性。优选地，预定阈水平是KSP相互作用基因的正常表达水平的至少2倍、4倍、8倍或10倍。在另一种实施方案中，本发明提供了评估细胞中的KSPi抗性的方法，包括确定细胞中由KSP相互作用基因编码的蛋白的丰度水平，其中高于预定阈水平的丰度水平表明细胞具有KSPi抗性。在另一种实施方案中，本发明提供了评估细胞中的KSPi抗性的方法，包括确定哺乳动物细胞中由KSP相互作用基因编码的蛋白的活性水平，其中高于预定阈水平的活性水平表明细胞具有KSPi抗性。优选地，丰度或活性的预定阈水平是KSP相互作用蛋白的正常丰度或活性水平的至少2倍、4倍、8倍或10倍。

所述方法可以，例如，使用试剂如KSP相互作用基因核苷酸序列和针对相互作用基因产物，包括其肽片段的抗体。具体地，所述试剂可以用于，例如(1)检测KSP相互作用基因中突变的存在，或检测KSP相互作用基因的mRNA相对于正常表达水平的超量表达或表达不足；和(2)检测KSP相互作用基因产物相对于KSP相互作用蛋白正常水平的超量丰度或丰度不足。

例如，可以通过使用包含此处描述的至少一种特异性KSP相互作用基因核酸或抗KSP相互作用蛋白抗体试剂的试剂盒进行此处描述的方法，所述方法可以方便地用于例如临床设置中，以诊断具有与KSP相互作用基因相关的病症或异常的患者。

为了检测KSP相互作用基因中的突变，可以将任何具核的细胞用作基因组核酸的起始来源。为了检测KSP相互作用基因的表达或KSP相互作用基因产物，可以使用表达了KSP相互作用基因的任何细胞类型或组织。

基于核酸的检测技术描述于下文5.3.3.1节。肽检测技术描述于下文5.3.3.2节。

5.3.3.1.KSP相互作用基因表达的检测

可以利用许多技术检测细胞或组织中KSP相互作用基因，如STK6或TPX2的表达，例如KSP相互作用基因转录物的细胞水平和/或突变的存在或缺乏。可以将来自任何具核细胞的核酸用作所述测定技术的起始点，并且可以根据本领域技术人员公知的标准核酸制备程序进行分离。例如，可以使用均包含KSP相互作用基因中的核苷酸序列的一种或多种多核苷酸探针测量KSP相互作用基因的表达水平，确定KSP相互作用基因的表达水平。在本发明的特别优选的实施方案中，将该方法用于诊断人类癌症对采用KSPi的治疗的抗性。

可以将DNA用于生物样品的杂交或扩增测定中，以检测涉及KSP相互作用基因的结构的异常，包括点突变、插入、缺失和染色体重排。所述测定可以包括，但不限于，Southern分析，单链构象多态性分析(SSCP)、DNA微阵列分析和PCR分析。

用于检测KSP相互作用基因特异性突变的所述诊断方法可以包括，例如，接触并且温育包括重组DNA分子、克隆的基因或其简并变体的核酸，其获自样品，如衍生自具有一种或多种包括重组DNA分子、克隆的基因或其简并变体的标记的核酸试剂的患者样品或其它合适的细胞来源，接触和温育的条件有利于这些试剂与KSP相互作用基因中与其互补的序列进行特异性退火。优选地，这些核酸试剂的长度是至少15-30个核苷酸。温育后，将所有未退火的核酸从核酸：KSP相互作用基因分子杂交体中除去。然后检测进行了杂交的核酸的存在(如果存在任何所述分子)。采用所述检测方案，可以将来自目的细胞类型或组织的核酸固定在例如膜的固体支持物上，或固定在例如微量滴定板或聚苯乙烯珠的表面的塑料表面。在该情况下，在温育后，可以容易将未退火的标记的核酸试剂除去。用本领域技术人员公知的标准技术，完成了剩余的、退火的、标记的KSP相互作用基因核酸试剂的检测。与核酸试剂退火的KSP相互作用基因可以与从正常KSP相互作用基因序列预计的退火模式进行比较，以便确定是否存在KSP相互作用基因突变。

用于检测患者样品或其它合适的细胞来源中的KSP相互作用基因特异性核酸分子的替代诊断方法可以包括它们的扩增，例如通过PCR扩增(在Mullis，K.B.，1987，美国专利No.4,683,202)，然后用本领域技术人员公知的技术检测扩增的分子。可以将得到的扩增序列与如果核酸扩增时仅仅含有正常拷贝的KSP相互作用基因的情况下所预期的那些进行比较，以便确定是否存在KSP相互作用基因突变。

在所述杂交和/或PCR分析优选的KSP相互作用基因的核酸序列中，包括检测KSP相互作用基因剪接位点突变存在的那些。

此外，可以进行公知的基因型分析技术，以鉴定在KSP相互作用基因中携带突变的个体。所述技术包括，例如，使用限制片段长度多态性(RFLPs)，其包括使用的特异性限制酶的识别位点之一中的序列变异。

此外，已经描述了分析可以用于鉴定KSP相互作用基因中的突变的DNA多态性的方法，所述方法利用限制酶位点之间不同数目的短串连重复DNA序列的存在。例如Weber(美国专利No.5,075,217，在此全文引入该文献作为参考)描述了(dC-dA)n-(dG-dT)n短串连重复序列区块中的基于长度多态性的DNA标记物。估计(dC-dA)n-(dG-dT)n区块的平均分隔是30,000-60,000bp。空间上紧密邻近的标记物表现出高频率共遗传，并且对鉴定诸如KSP相互作用基因内的突变的基因突变和诊断与KSP相互作用基因中的突变相关的疾病和病症特别有用。

Caskey等(美国专利No.5,364,759，在此全文引入该文献作为参考)描述了用于检测短的三和四核苷酸重复序列的DNA谱分析。该方法包括提取目的DNA，如KSP相互作用基因，扩增提取的DNA，并且标记重复序列以形成个体DNA的基因型图谱。

也可以测定KSP相互作用基因的表达水平。例如，可以分离并且利用如上文描述的杂交或PCR技术检验已知或怀疑表达KSP相互作用基因的细胞类型或组织，如表现KSPi抗性的癌症细胞类型的RNA。分离的细胞可以衍生自细胞培养物或患者。取自培养物的细胞的分析可以是用作基于细胞的基因治疗技术的部分，或检验化合物对KSP相互作用基因表达的作用的细胞评估中的必要步骤。所述分析可以揭示KSP相互作用基因的表达模式的定量和定性方面，包括KSP相互作用基因表达的激活或灭活。

在所述检测方案的一种实施方案中，从目的RNA分子合成cDNA分子(如，通过将RNA分子逆转录为cDNA)。然后将cDNA内的序列用作核酸扩增反应，如PCR扩增反应等使用的模板。用作该方法的逆转录和核酸扩增步骤中的合成起始试剂(如引物)的核酸试剂选自KSP相互作用基因核酸试剂。所述核酸试剂的优选长度是至少9-30个核苷酸。为了检测扩增产物，可以用放射性或非放射性标记的核苷酸进行核酸扩增。或者，可以制备足够的扩增产物，使得可以通过使用任何合适的核酸染色方法，如，通过标准溴化乙锭染色显示产物。

此外，可以“原位”进行所述KSP相互作用基因表达测定，即，直接对从活检物或切除物获得的患者组织的组织切片(固定和/冷冻的)进行测定，从而不必进行核酸纯化。可以将KSP相互作用基因的核酸用作所述原位程序中的探针和/或引物(参见，例如Nuovo，G.J.，1992，″PCR In Situ Hybridization：Protocols And Applications″，Raven Press，NY)。

或者，如果可以获得足量的合适细胞，可以进行标准Northern分析，以确定KSP相互作用基因的mRNA表达水平。

也可以用DNA微阵列技术评估细胞或组织中的KSP相互作用基因表达，如KSP相互作用转录物的细胞水平和/或突变的存在或缺乏。在所述技术中，可以将均包含KSP相互作用基因的序列的一种或多种多核苷酸探针用于监测KSP相互作用基因的表达。因此，本发明提供了包含多核苷酸探针的DNA微阵列，所述探针包含KSP相互作用基因的序列。

可以将任何形式的DNA微阵列技术与本发明结合使用。在一种实施方案中，通过将KSP相互作用基因的cDNA片段，如全长cDNA、ESTs等的PCR产物沉积在合适的表面上，制备斑点cDNA微阵列(参见，例如DeRisi et al.，1996，Nature Genetics 14：457-460；Shalon etal.，1996，Genome Res.6：689-645；Schena et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：10539-11286；和Duggan et al.，Nature GeneticsSupplement 21：10-14)。在另一种实施方案中，通过光刻技术在表面上原位合成含有与KSP相互作用基因的序列互补的寡核苷酸的高密度寡核苷酸阵列(参见，例如，Fodor et al.，1991，Science 251：767-773；Pease et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：5022-5026；Lockhart et al.，1996，Nature Biotechnology 14：1675；McGall et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：13555-13560；美国专利Nos.5,578,832；5,556,752；5,510,270；5,858,659；和6,040,138)。该形式的微阵列技术对检测单核苷酸多态性(SNPs)特别有用(参见，例如Hacia et al.，1999，Nat Genet.22：164-7；Wang et al.，1998，Science280：1077-82)。在另一种实施方案中，通过喷墨技术在表面上原位合成含有与KSP相互作用基因的序列互补的寡核苷酸的高密度寡核苷酸阵列(参见，例如Blanchard，1998年9月24日公开的国际专利申请公开WO 98/41531；Blanchard et al.，1996，Biosensors andBioelectronics 11：687-690；Blanchard，1998，in Synthetic DNA Arraysin Genetic Engineering，Vol.20，J.K.Setlow，Ed.，Plenum Press，New York at pages 111-123)。在另一种实施方案中，可以将允许进行电子严格性控制的DNA微阵列与包含KSP相互作用基因的序列的多核苷酸探针结合使用(参见，例如美国专利No.5,849,486)。

5.3.3.2.KSP相互作用基因产物的检测

可以按照此处的描述，将抗野生型或突变的KSP相互作用基因产物或其保守变体或肽片段的抗体用作KSPi抗性的诊断和预后剂。可以将所述诊断方法用于检测KSP相互作用基因的表达水平的异常，或KSP相互作用基因产物的结构和/或产物的时间、组织、细胞或亚细胞定位的异常。

由于KSP相互作用基因产物是细胞内的基因产物，下文描述的抗体和免疫测定方法在评估治疗KSP相互作用基因的调节缺陷导致的病症，如增殖性疾病的效果的体外应用中具有重要性。如下文所述的抗体或抗体片段可以用于体外筛选可能的治疗化合物，以确定它们对KSP相互作用基因表达和KSP相互作用肽生产的作用。可以鉴定对KSP相互作用的调节缺陷相关的病症具有有益作用的化合物，并且确定治疗有效剂量。

也可以使用例如体外免疫测定方法来评估对KSP相互作用基因的调节缺陷相关的病症的基于细胞的基因治疗的效力。可以体外使用抗KSP相互作用肽的抗体来确定在遗传工程化以产生KSP相互作用肽的细胞中完成的KSP相互作用基因表达水平。此处公开的证据表明，KSP相互作用基因产物是细胞内基因产物，所述测定优选是用细胞裂解物或提取物进行的。所述分析使得能够确定获得体内疗效必须的转化细胞数目，以及优化基因替代方案。

待分析的组织或细胞类型通常包括已知或怀疑表达KSP相互作用基因的那些，如，KSPi抗性癌症细胞类型。此处使用的蛋白分离方法可以是，例如，Harlow和Lane中描述的那些(Harlow，E.andLane，D.，1988，″Antibodies：A Laboratory Manual″，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)，在此全文引入作为参考。分离的细胞可以衍生自细胞培养物或患者。取自培养物的细胞的分析可以用于检验化合物对KSP相互作用基因表达的作用。

用于检测KSP相互作用基因产物或其保守变体或肽片段的优选诊断方法可以包括，例如免疫测定，其中通过KSP相互作用基因产物或其保守变体或肽片段与抗KSP相互作用基因产物特异性抗体的相互作用对其进行检测。

例如，可以将结合KSP相互作用蛋白的抗体或抗体片段用于对KSP相互作用基因产物或其保守变体或肽片段的存在进行定量或定性检测。这可以通过例如使用与光学显微镜、流式细胞术、或荧光检测结合的荧光标记的抗体(参见该节下文)的免疫荧光技术完成。如果所述KSP相互作用基因产物在细胞表面表达，所述技术是特别优选的。

用于本发明的抗体(或其片段)可以额外进行组织学使用，如用于免疫荧光或免疫电子显微镜，用于KSP相互作用基因产物或其保守变体或肽片段的原位检测。可以通过从患者除去组织学标本，并且将其施用于本发明的标记的抗体，完成原位检测。优选通过将标记的抗体(或片段)覆盖到生物样品上而施用抗体(或片段)。通过使用所述程序，不仅可以确定KSP相互作用基因产物或其保守变体或肽片段的存在，也可以确定其在受检组织中的分布。采用本发明，本领域技术人员将很容易认识到，可以改进多种组织学方法(如染色程序)中的任意一种，以完成所述原位检测。

KSP相互作用基因产物或其保守变体或肽片段的免疫测定通常包括在能够鉴定KSP相互作用基因产物或其保守变体或肽片段的可检测性标记的抗体存在下温育样品，如生物流体、组织提取物、新收获的细胞、或在细胞培养物中温育过的细胞的裂解物，并且通过本领域公知的任何技术检测结合的抗体。

可以使生物样品接触和固定在固相支持物或载体，如硝酸纤维素或其它能够固定细胞、细胞颗粒或可溶蛋白的固体支持物上。然后可以用合适的缓冲液洗涤支持物，随后用可检测性标记的KSP相互作用蛋白特异性抗体处理。然后可以第二次用缓冲液洗涤固相支持物以除去未结合的抗体。然后可以通过常规方法检测固体支持物上的结合的标记物的量。

“固相支持物或载体”意欲表示能够结合抗原或抗体的任何支持物。公知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙二醇、聚乙二醇、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁石。载体的性质可以是某种程度可溶的或不溶的，以用于本发明的目的。支持材料基本可以具有任何可能的结构构型，只要偶联的分子能够结合抗原或抗体。因此，支持物构型可以是球形的，如珠或圆柱形，如位于测试槽内表面或杆的外表面。或者，表面可以是平的，如片、测试条等。优选的支持物包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员知道用于结合抗体或抗原的许多其它合适的载体，或能够通过使用常规实验而确定。

可以根据公知方法确定给定批次的抗KSP相互作用基因产物抗体的结合活性。本领域技术人员能够通过常规实验确定每次测定的可操作和最优测定条件。

能够可检测性标记KSP相互作用基因肽特异性抗体的途径之一是通过将其与酶连接，并且用于酶免疫测定(EIA)(Voller，A.，″TheEnzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)″，1978，DiagnosticHorizons 2：1-7，Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，MD)；Voller，A.et al.，1978，J.Clin.Pathol.31：507-520；Butler，J.E.，1981，Meth.Enzymol.73：482-523；Maggio，E.(ed.)，1980，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，FL，；Ishikawa，E.etal.，(eds.)，1981，Enzyme Immunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo)。与抗体结合的酶将与合适的底物，优选发色底物反应，反应方式使得产生能够通过例如分光光度、荧光法或通过肉眼观察方法检测的化学部分。可以用于检测性标记抗体的酶包括，但不限于，苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-5-甾体类异构酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油酯、脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。可以通过使用酶的发色底物的比色法完成检测。也可以通过肉眼比较与相似制备的标准物的底物的酶促反应程度，完成该检测。

也可以用多种其它免疫测定中的任意一种完成检测。例如，通过放射性标记抗体或抗体片段，可以通过使用放射免疫测定(RIA)检测KSP相互作用肽(参见，例如Weintraub，B.，Principles ofRadioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques，The Endocrine Society，March 1986，在此引入作为参考)。可以通过诸如使用γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影的方法检测放射性同位素。

也可以用荧光化合物标记抗体。当将荧光标记的抗体暴露于具有合适波长的光时，然后由于荧光，可以检测其存在。在大多数通常使用的荧光标记的化合物中，包括荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。

也可以用荧光发射金属，如¹⁵²Eu或其它镧系金属可检测性标记抗体。可以用诸如二乙三胺戊酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属螯合基团将这些金属与抗体连接。

也可以通过将抗体与化学发光化合物偶联而检测抗体。然后通过检测在化学反应过程中产生的荧光的存在而确定化学发光标记的抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子是鲁米诺、异鲁米诺、heromatic acridinium酯、咪唑、acridinium盐和草酸酯。

同样，可以用生物发光化合物标记本发明的抗体。生物发光是生物系统中发现的一类化学发光，其中催化蛋白增加了化学发光反应的效率。通过检测发光的存在，确定生物发光蛋白的存在。用于标记目的的重要生物发光化合物是荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。

5.3.4.调节KSP相互作用基因表达的方法

可以根据本发明，使用多种治疗方法体内调节KSP相互作用基因，如STK6或TPX2的表达。例如，可以对siRNA分子工程化，并且用于在体内使KSP相互作用基因沉默。也可以对反义DNA分子进行工程化，并用于体内阻断KSP相互作用RNA的翻译。或者，可以设计核酶分子，以体内切割和破坏KSP相互作用mRNA。在另一种方案中，设计寡核苷酸以便与KSP相互作用基因的5’区(包括编码序列上游的区)杂交，并且形成可以用于阻断或减少KSP相互作用基因转录的三螺旋结构。如果需要，也可以设计寡核苷酸以便与负调节剂的结合位点杂交和形成三螺旋结构，以便阻断与负调节剂的结合并且增强KSP相互作用基因的转录。

在一种优选实施方案中，设计siRNA、反义分子、核酶和三螺旋核苷酸以抑制一种或多种KSP相互作用蛋白同工型的翻译或转录，并且对其它可能与KSP相互作用基因共有一个或多个基序的其它基因的表达影响最小。为达到该目的，应该基于KSP相互作用基因特有的相关序列设计所使用的寡核苷酸。

例如，但不是限制，寡核苷酸不应该落在KSP相互作用基因的核苷酸序列与其基因的核苷酸序列同源性最高的区域。在反义分子的情况下，所述序列优选选自上文的列表。序列的长度优选是至少18个核苷酸，以便实现与靶mRNA序列的足够强的退火，从而阻止序列的翻译。Izant et al.，1984，Cell，36：1007-1015；Rosenberg et al.，1985，Nature，313：703-706。

在“锤头”型核酶的情况下，核酶的靶序列优选选自上文的列表。核酶是具有高度特异的内切核酸酶活性的RNA分子。锤头核酶包含核苷酸序列与靶RNA的至少一部分互补的杂交区，和适合切割靶RNA的催化区。杂交区包含九(9)个或更多个核苷酸。因此，本发明的锤头核酶具有与上文列出的序列互补的杂交区，并且长度是至少9个核苷酸。所述核酶的构建和生产是本领域公知的，并且更完全地描述于Haseloff et al.，1988，Nature，334：585-591。

本发明的核酶也包括RNA内切核酸酶(此后称作“Cech型核酶”)，如在Tetrahymena Thermophila中天然存在(称作IVS或L-19IVS RNA)，并且被Thomas Cech及其合作者充分描述的核酶(Zaug，et al.，1984，Science，224：574-578：Zaug and Cech，1986，Science，231：470-475；Zaug，et al.，1986，Nature，324：429-433；UniversityPatents Inc.的公开的国际专利申请No.WO88/04300；Been et al.，1986，Cell，47：207-216)。Cech内切核酸具有8个与靶RNA序列杂交的碱基对活性位点，在其后发生靶RNA的切割。

对于与KSP相互作用基因的5’末端杂交并且与其形成三螺旋结构，并且可以用于阻断转录的寡核苷酸，它们优选与表达水平不受影响的其它基因中不存在的KSP相互作用基因的5’末端的序列互补。所述序列也优选不包括KSP相互作用基因的启动子中甚至略微与所述其它基因同源的区域。可以通过本领域公知的多种方法施用前述化合物，包括，但不限于，使用脂质体作为送递载体。当处于抗降解形式时，也可以使用裸DNA或RNA分子，所述抗降解是通过修饰末端，通过形成环状分子，或通过使用更迭键，包括硫代磷酸酯键和硫代磷酰修饰的键。此外，可以通过促进转运而送递核酸，其中将核酸分子缀合于聚赖氨酸或转铁蛋白。也可以通过多种病毒载体，包括，但不限于逆转录病毒、痘苗病毒、AAV和腺病毒中的任意一种，将核酸转运到细胞中。

或者，可以构建编码或作为所述反义分子、核酶、三螺旋或KSP相互作用基因核酸分子的重组核酸分子。该核酸分子可以是RNA或DNA。如果核酸编码RNA，该序列优选与调节元件可操作性连接，以便产生足够拷贝的需要的RNA产物。调节元件可以允许序列的组成型或调节型转录。可以在体内，即，在生物的细胞中将编码一种或多种RNA的转移载体，如细菌质粒或病毒RNA或DNA转染到细胞中。(如，Llewellyn et al.，1987，J.Mol.Biol.，195：115-123；Hanahanet al.1983，J.Mol.Biol.，166：557-580)。一旦位于细胞内，转移载体可以复制，并且由细胞聚合酶转录，以产生RNA，或者可以将其整合到宿主细胞的基因组。或者，可以通过微量操作技术，如微量注射，将包含编码一种或多种RNA的序列的转移载体转染到细胞中或导入细胞，使得转移载体或其部分整合到宿主细胞的基因组中。

RNAi也可以用于敲除KSP相互作用基因的表达。在一种实施方案中，与从KSP相互作用基因转录的mRNA的同源区杂交的21-23个核苷酸的双链RNA分子被用于降解mRNA，从而使KSP相互作用基因的表达“沉默”。优选地，dsRNA具有杂交区，如，19个核苷酸的双链区，其与KSP相互作用基因的编码序列的序列互补。可以将任何靶定KSP相互作用基因，如人类STK6或TPX2基因的合适的编码序列的siRNA用于本发明。作为示例性的实施方案，根据标准选择规则(参见，例如Elbashir et al.，2002，Methods 26：199-213，在此全文引入作为参考)设计靶定KSP相互作用基因的编码区的21个核苷酸的双链siRNA。

可以使用任何用于导入siRNA的标准方法。在一种实施方案中，通过给细胞呈递靶定KSP相互作用基因的siRNA而诱导基因沉默(参见，例如，Elbashir et al.，2001，Nature 411，494-498；Elbashir et al.，2001，Genes Dev.15，188-200，在此全文引入所有上述文献作为参考)。siRNA可以化学合成，或者衍生自通过重组切割酶对双链RNA的切割。用于导入使KSP相互作用基因沉默的双链DNA(dsRNA)的另一种方法是shRNA，即，短发夹RNA(参见，例如Paddison et al.，2002，Genes Dev.16，948-958；Brummelkamp et al.，2002，Science296，550-553；Sui，G.et al.2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，5515-5520，在此全文引入所有上述文献作为参考)。在该方法中，从质粒(或病毒)表达靶定KSP相互作用基因的siRNA，其作为反向重复序列，具有间插的环序列以形成发夹结构。随后通过切割酶加工得到的含有发夹的RNA转录物，以产生用于沉默的siRNA。可以在细胞中稳定表达基于质粒的shRNA，使得在体外和体内都可以在细胞中进行长期基因沉默(参见，McCaffrey et al.2002，Nature 418，38-39；Xia et al.，2002，Nat.Biotech.20，1006-1010；Lewis et al.，2002，Nat.Genetics 32，107-108；Rubinson et al.，2003，Nat.Genetics 33，401-406；Tiscornia et al.，2003，Proc.AM.Acad.Sci.USA100，1844-1848，在此全文引入所有上述文献作为参考)。也可以将靶定KSP相互作用基因的siRNA体内送递到哺乳动物，如人类的器官或组织中(参见，例如Song et al.2003，Nat.Medicine 9，347-351；Sorensen etal.，2003，J.Mol.Biol.327，761-766；Lewis et al.，2002，Nat.Genetics32，107-108，在此全文引入所有上述文献作为参考)。在该方法中，将siRNA的溶液静脉内注射到哺乳动物中。然后siRNA可以到达目的器官或组织，并且有效减少哺乳动物器官或组织中靶基因的表达。

5.3.5.调节KSP相互作用蛋白的活性和/或其途径的方法

可以通过调节KSP相互作用蛋白与其结合配偶体之间的相互作用而调节KSP相互作用蛋白的活性。在一种实施方案中，可以用试剂，如抗体、aptamers、小有机或无机分子抑制所述结合配偶体的结合，以便调节KSPi抗性。在另一种实施方案中，可以用试剂，如抗体、aptamers、小有机或无机分子抑制KSP相互作用蛋白调节途径中蛋白的活性，以便调节KSPi抗性。

5.3.6.通过靶定KSP相互作用基因和/或基因产物而进行癌症治疗

可以用上文所述调节KSP相互作用基因或蛋白，如STK6或TPX2基因或蛋白的表达和/或活性的方法和/或组合物与KSPi联合治疗患有癌症的患者。具体地，可以将所述方法和/或组合物与KSPi联合使用，用于治疗患有表现出KSP相互作用基因或蛋白介导的KSPi抗性的癌症的患者。所述疗法可以用于治疗癌症，包括，但不限于，横纹肌肉瘤、成神经细胞瘤和成胶质细胞瘤、小细胞肺癌、骨肉瘤、胰腺癌、乳腺和前列腺癌、鼠黑素瘤和白血病，以及B细胞淋巴瘤。

在优选实施方案中，本发明的方法和/或组合物与KSPi联合用于治疗患有表现出STK6或TPX2介导的KSPi抗性的癌症的患者。在所述实施方案中，调节STK6或TPX2的表达和/或活性，以赋予癌细胞对KSPi的敏感性，从而赋予或增强KSPi治疗的有效性。

在联合治疗中，可以在施用KSPi之前、同时或之后施用一种或多种本发明的组合物。在一种实施方案中，在施用KSPi之前施用本发明的组合物。可以通过本领域技术人员熟悉的常规实验确定施用本发明的组合物和KSPi之间的时间间隔。在一种实施方案中，在KSP相互作用蛋白水平达到需要的阈值之后给予KSPi。可以通过采用上文描述的任何技术确定KSP相互作用蛋白的水平。

在另一种实施方案中，与KSPi同时施用本发明的组合物。

在另一种实施方案中，也在施用KSPi之后施用一种或多种本发明的组合物。当KSPi的半衰期长于治疗中使用的一种或多种本发明的组合物时，所述施用可以是特别有益的。

本领域技术人员可以理解，可以使用本发明的组合物和KSPi的不同施用时间的任意组合。例如，当KSPi的半衰期长于本发明的组合物时，优选在施用KSPi之前或之后施用本发明的组合物。

施用本发明的组合物的频率或间隔取决于需要的KSP相互作用蛋白水平，可以通过上文描述的任何技术确定该水平。当KSP相互作用蛋白水平改变为高于或低于需要的水平，可以增加或减少本发明的组合物的施用频率。

可以通过本领域公知的任何方法评估单独或与KSPi联合施用本发明的组合物的效果或益处，例如，通过基于测量存活率、副作用、KSPi的剂量要求或其任意组合的方法。如果本发明的组合物的施用在患者中实现了任意一种或多种益处，如增加存活率、减少副作用、降低KSPi的剂量要求，则认为本发明的组合物加强了KSPi治疗，并且认为该方法是有效的。

5.3.7.通过与其它靶定有丝分裂的药物联合靶定STK6基因而治疗癌症

发明人也发现，STK6也与靶定有丝分裂的其它药物，如紫杉醇相互作用。图18示出了STK6使Hela细胞对紫杉醇治疗敏感。因此，本发明也提供了上文所述的调节STK6表达和/或活性以便与靶定有丝分裂的药物，如紫杉醇联合治疗癌症患者的方法和组合物。具体地，所述方法和/或组合物可以与紫杉醇联合使用，以治疗患有表现出STK6介导的紫杉醇抗性的癌症的患者。所述疗法可以用于治疗癌症，包括，但不限于，横纹肌肉瘤、成神经细胞瘤和成胶质细胞瘤、小细胞肺癌、骨肉瘤、胰腺癌、乳腺和前列腺癌、鼠黑素瘤和白血病，以及B细胞淋巴瘤。

5.4.与DNA破坏剂相互作用的基因和基因产物及其用途

本发明提供了在治疗疾病中利用与DNA破坏剂相互作用的基因和基因产物的方法和组合物。所述基因通常被称作“DNA破坏反应基因”。由所述基因编码的基因产物，如蛋白，通常被称作“DNA破坏反应基因产物”。本发明也提供了利用这些基因及其产物筛选调节基因/基因产物的表达/活性，和/或调节基因或蛋白与其它蛋白或分子的相互作用的方法和组合物。本发明进一步提供了利用这些基因和基因产物筛选用于调节细胞对DNA破坏剂的生长抑制作用的敏感性和/或增强细胞或生物中DNA破坏剂的生长抑制作用的试剂的方法和组合物。本发明也提供了利用这些基因和基因产物诊断对DNA破坏剂的生长抑制作用的抗性或敏感性，和用于与采用一种或多种DNA破坏剂的疗法联合治疗疾病的方法和组合物。

5.4.1.与DNA破坏剂相互作用的基因和基因产物

本发明提供了能够减弱或增强DNA破坏剂的细胞杀伤的基因。这些基因可以与下文5.4.2节描述的DNA破坏剂联合使用。这些基因的用途描述于下文5.4.3和5.4.4节。

在一种实施方案中，本发明提供了能够使DNA破坏剂的细胞杀伤减弱或增强至少1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍和1.9的基因，如cis，dox或campto。在一种优选实施方案中，本发明提供了以下基因，其沉默使DNA破坏剂导致的细胞杀伤增强至少2.0倍：BRCA2、EPHB3、WEE1和ELK1。图8显示了BRCA2、EPHB3、WEE1和ELK1的沉默使DNA破坏剂导致的细胞杀伤增强至少2倍。本发明提供了通过与包括施用DNA破坏剂的疗法联合调节，例如增强所述基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白的活性而治疗癌症的方法。

本发明也提供了能够减弱或增强特定类型的DNA破坏剂导致的细胞杀伤的基因。表IIA示出了特定基因，其沉默增强或减弱通过DNA结合剂，如DNA沟结合剂，如DNA小沟结合剂；DNA交联剂；嵌入剂；和DNA加合物形成剂导致的细胞杀灭。在一种实施方案中，本发明提供了如表IIA所列的基因，其沉默使DNA结合剂，如cis的细胞杀伤增强了至少1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍和1.9倍，所述基因如基因IDs 752-806(1.5倍)，基因IDs 771-806(1.6倍)，基因IDs784-806(1.7倍)，基因IDs 789-806(1.8倍)和基因IDs 793-806(1.9倍)。在一种优选实施方案中，本发明提供了以下基因，其沉默使DNA结合剂，如cis导致的细胞杀伤增强了至少2倍：BRCA1、BRCA2、EPHB3、WEE1、ELK1、RPS6KA6、BRAF、GPRK6、MCM3、CDC42、KIF2C、CENPE、CDC25B、和C20orf97。在另一种实施方案中，本发明提供了以下基因，其沉默使DNA结合剂，如cis导致的细胞杀伤减弱了至少2倍：PLK(参见图16)。本发明提供了通过与包括施用DNA破坏剂的疗法联合调节，例如增强或减弱所述基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白的活性而治疗癌症的方法。

本发明也提供了能够减弱或增强拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱导致的细胞杀伤的基因。在一种实施方案中，本发明提供了如表IIB所列的基因，其沉默使拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱导致的细胞杀伤增强了至少1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍和1.9倍，所述基因如基因IDs 635-807(1.5倍)，基因IDs 673-807(1.6倍)，基因IDs 702-807(1.7倍)，基因IDs 727-807(1.8倍)和基因IDs 749-807(1.9倍)。在一种优选实施方案中，本发明提供了以下基因，其沉默使拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱导致的细胞杀伤增强了至少2倍，所述基因如NM_139286、TOP3B、WASL、STAT4、CHEK1、BCL2、NM_016263、TOP2B、TGFBR1、MAPK8、RHOK、NM_017719、TERT、ANAPC5、NM_021170、SGK2、C20orf97、CSF1R、EGR2、AATK、TCF3、CDC45L、STAT3、PRKY、BMPR1B、KIF2C、PTTG1、NM_019089、FOXO1A、STK4、SRC、ELK1、NM_018492、RASA2、GPRK6、BLK、ABL1、HSPCB、PRKACA、CCNE2、CTNNBIP1、NM_013367、FRAT1、PIK3C2A、NM_017769、XM_170783、NM_016457、XM_064050、STK6、RALBP1、ELK1、NF1、STAT5A、WEE1、PTK6、RPS6KA6、BRCA1、EPHB3和BRCA2。在另一种优选实施方案中，本发明提供了以下基因，其沉默使拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱导致的细胞杀伤增强了至少3倍，所述基因如XM_064050、STK6、RALBP1、ELK1、NF1、STAT5A、WEE1、PTK6、RPS6KA6、BRCA1、EPHB3和BRCA2。在另一种实施方案中，本发明提供了以下基因，其沉默使拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱导致的细胞杀伤减弱了至少2倍，所述基因如PLK、CCNA2、MADH4、NFKB1、RRM2B、TSG101、DCK、CDC5L、CDCA8、NM_006101、INSR。本发明提供了通过与包括施用拓扑异构酶I抑制剂的疗法联合调节，例如增强或减弱所述基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白的活性而治疗癌症的方法。

本发明也提供了能够减弱或增强拓扑异构酶II抑制剂，如阿霉素导致的细胞杀伤的基因。在一种实施方案中，本发明提供了如表IIC所列的基因，其沉默使DNA结合剂，如阿霉素导致的细胞杀伤增强了至少1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍和1.9倍，所述基因如基因IDs 657-830(1.5倍)，基因IDs 685-830(1.6倍)，基因IDs 723-830(1.7倍)，基因IDs 750-830(1.8倍)和基因IDs 767-830(1.9倍)。在一种优选实施方案中，本发明提供了以下基因，其沉默使拓扑异构酶II抑制剂，如阿霉素导致的细胞杀伤增强了至少2倍，所述基因如PTK2、KRAS2、BRA、FZD4、RASAL2、CENPE、CCNH、MAP4K3、MAP4K2、ERBB3、RHOK、MYO3A、AXIN1、INPP5D、NM_018401、NEK1、TGFBR1、XM_064050、STAT4、MAP3K1、CCNE2、STK6、HDAC4、CTNNA1、EIF4EBP1、ACVR2B、CDC42、MAPK8、BLK、WEE1、KIF26A、TCF1、NM_019089、NOTCH4、HDAC3、PIK3CB、CCNG2、TLK2、XM_066649、MCM3、ELK1、PTK6、ABL1、FZD4、XM_70783、CHUK、SRC、NM_016263和C20orf97。在另一种优选实施方案中，本发明提供了以下基因，其沉默使拓扑异构酶II抑制剂，如阿霉素导致的细胞杀伤增强了至少3倍，所述基因如ELK1、PTK6、ABL1、FZD4、XM_170783、CHUK、SRC、NM_016263和C20orf97。在另一种实施方案中，本发明提供了以下基因，其沉默使拓扑异构酶II抑制剂，如阿霉素导致的细胞杀伤减弱了至少2倍，所述基因如PLK(参见图16)。本发明提供了通过与包括施用拓扑异构酶II抑制剂的疗法联合调节，例如增强或减弱所述基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白的活性而治疗癌症的方法。

在一种优选实施方案中，本发明提供了CHEK1、BRCA1、BARD1和RAD51作为能够增强DNA破坏剂对p53细胞的杀伤的基因。

在另一种优选实施方案中，本发明提供了WEE1作为能够减弱或增强DNA破坏剂导致的细胞杀伤的基因。Wee1是首先在裂殖酵母-粟酒裂殖糖酵母中鉴定的有丝分裂负调节蛋白(Russell and Nurse，1987 Cell 49：559-67)。Wee1-突变体具有短的G2期，并且在野生型细胞的一半大小时进入有丝分裂(因此命名为wee)。在超量表达有丝分裂诱导剂cdc25的细胞中，wee1活性是防止过早有丝分裂导致的致死作用(有丝分裂事故)所必须的。wee1的人类同源物是通过粟酒裂殖糖酵母温度依赖性weel-、cdc25超量表达突变体的反式互补而克隆的(Igarashi et al.，1991，Nature 353：80-83)。裂殖酵母中人类wee1的超量表达产生了来自细胞周期G2-M转变的抑制的延长细胞。该人类wee1克隆明显小于其酵母对应物，并且后来发现缺乏一部分氨基末端序列(Watanabe et al.，1995，EMBO 14：1878-91)。

单拷贝人类wee1基因位于11号染色体上(Taviaux and Demaille，1993，Genomics 15：194-196)。wee1基因是16.96kb，具有11个外显子，编码4.23kb的mRNA转录物。94kDa人类Wee1蛋白包含646个氨基酸。根据Aceview，即，公共可获得的实验性cDNA数据库的集成分析(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Acembly/av.cgi？c＝locusid&org＝9606&1＝7465)，可能存在6种通过可变剪接产生的更小的wee1蛋白异构体。在多种人类细胞，如肺成纤维细胞、胚胎成纤维细胞、宫颈癌HeLa细胞、结肠腺癌、膀胱癌(Igarashi et al.，1991，Nature 353：80-83)、子宫、血管、肝、眼、脾、膀胱、皮肤、软骨和多种肿瘤细胞系(UniGene，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)中发现了wee1表达。也在小鼠、大鼠、秀丽纤杆线虫、果蝇和啤酒糖酵母中发现了wee1样蛋白，小鼠和大鼠的646个氨基酸的蛋白具有最高的相似程度(分别是89％和91％)(UniGene)。全长的人Wee1序列具有5个具有最高PEST评分的节段，催化性激酶结构域位于C末端中(Watanabe et al.，1995，EMBO 14：1878-91)。保守的Lys114残基似乎对weel激酶活性是关键的(McGowan andRussell，1993，EMBO 12：75-85)。

在多个物种中鉴定了其它的Wee1相关激酶。非洲爪蟾Wee1是母体表达的(卵母细胞)，而Wee2在非分裂组织中是在合子中表达的。在哺乳动物中，相关的Myt1具有与Wee1相似的磷酸化活性(综述于Kellogg，2003，J.Cell Sci.116：4883-4890)。也在人类中鉴定了Wee1B，其几乎仅在成熟卵母细胞中表达(Nakanishi et al.，2000，Genes to Cells 5：839-847)。

Wee1是一种属于Ser/Thr蛋白激酶家族的核酪氨酸激酶。Wee1通过抑制细胞周期的G2/M转变时的Cdc-细胞周期蛋白B激酶而确保在有丝分裂前完成DNA复制。Cdc2的ATP结合位点中的Thr14和Tyr15残基的磷酸化抑制其活性；Wee1酪氨酸激酶使N末端的Tyr15残基磷酸化。第二种相关的蛋白激酶，即Mik1(Myt1)，使Thr14和Tyr15上的Cdc2磷酸化。Cdc2活性是进展到有丝分裂所必须的。关键的Tyr15残基的去磷酸化是由Cdc25催化的，Cdc25与Wee1的作用相反。Wee1和Cdc25活性的平衡确定了进入有丝分裂(综述于Kellogg，2003，J.Cell Sci.116：4883-4890；Pendergast，1996，Curr.Opin.Cell Biol.8：174-181)。

Wee1活性在细胞周期中高度受调节。在S和G2期，Wee1活性增加，平行增加蛋白水平。由于Wee1的过度磷酸化和降解，Wee1活性在有丝分裂时受抑制(Watanabe et al.，1995，EMBO 14：1878-91；McGowan and Russell，1993，EMBO 12：75-85)。最近在非洲爪蟾和裂殖酵母中的研究证明了Cdk1(Cdc2)可以使wee1磷酸化，表明了阳性反馈环模型，其中小量有丝分裂Cdk1灭活Wee1，并且随后引起了有丝分裂Cdk1的显著增加。Tome-1也通过在G2期靶定Wee1以通过SCF进行蛋白水解破坏而促进减数分裂进入。APC^CDH1通过在G1破坏Tome-1和细胞周期蛋白B而使得Wee1在S期恢复(综述于Lim and Surana，2003，Mol.Cell11：845-851)。

已经提出了Wee1在细胞凋亡中的新作用。参与非洲爪蟾中的细胞凋亡的Crk可以通过其SH2结构域与Wee1结合。外源性Wee1以Crk依赖性方式加速非洲爪蟾卵的细胞凋亡(Smith et al.，2000，J.CellBiol.151：1391-1400)。在缺乏核输出因子Crm1结合的条件下，这些Crk-Wee1复合物也促进哺乳动物细胞中的细胞凋亡(Smith et al，2002，Mol.Cell.Biol.22：1412-1423)。涉及HIV蛋白R(Vpr)的研究也涉及细胞凋亡事件中的Wee1(Yuan，et al.，2003，J.Virol.77：2063-2070)。Vpr导致与Cdc2灭活相关的G2停滞，并且延长的G2停滞导致细胞凋亡。Wee1在Vpr诱导的凋亡HeLa细胞和γ射线照射的凋亡HeLa细胞中被除去。Wee1的超量表达减弱了Vpr诱导的细胞凋亡，并且通过siRNA导致的Wee1除去，诱导了凋亡性死亡。这些研究中Wee1水平和细胞凋亡事件的明显冲突和通过Wee1进行的细胞凋亡诱导的机制还没有阐明。

如果DNA被破坏，细胞周期抑制剂的作用是重要的。细胞分裂的阻断获得了DNA修复的时间，并且使破坏的DNA的复制和分离最少。遗传完整性的两个细胞周期“关卡”在G1期(在DNA合成前)和G2期(恰好在有丝分裂前)。失去这些关卡控制，促进了细胞进化为癌症(综述于Hartwell and Kastan，1994，Science 266：1821-8)。

缺陷型Wee1表达可以消除G2关卡，促进肿瘤细胞增殖。已经发现Wee1在结肠癌细胞中显著受抑制(综述于Lee和Yang，2001，Cell.Mol.Life Sci.58：1907-1922)。Wee1表达的缺乏也与较差的预后和较高的非小细胞肺癌复发率相关(Yoshida et al.，2004，Ann.Onco.15：252-256)。

相反，与周围的硬化组织相比，Wee1水平和激酶活性在肝细胞癌中也升高(Masaki et al.，2003，Hepatology 37：534-543)。

或者，G2关卡的消除可以增强对G1关卡缺陷型肿瘤细胞的化疗。很多肿瘤细胞缺乏功能性p53基因，并且不表现G1关卡。尽管正常细胞在放疗或化疗导致的DNA破坏后将在G1停滞，癌细胞将依赖于G2关卡而进行DNA修复。因此，G2关卡的消除对癌细胞比对正常细胞更有害。由于Wee1对Cdc2的负调节和Wee1对细胞凋亡的减弱，已经用选择性抑制Wee1的化合物的化学文库筛选检索抑制G2关卡的抗癌剂(Wang et al.，2001，Cancer Res.61：8211-8217)。PD0166285Wee1激酶抑制剂证明了对Cdc2磷酸化的抑制、对G2停滞的消除和使放疗对p53突变细胞系的杀灭敏感。在一种实施方案中，本发明提供了用PD166285与DNA破坏剂联合治疗癌症的方法。

Wee1激活也可能参与类风湿性关节炎的病理。类风湿性滑膜细胞生长是肿瘤样的；细胞具有大量的细胞质、大细胞核和核型改变。这些转化的细胞存在于人类RNA和动物模型的软骨和骨中。类风湿性滑膜细胞生长是无组织的并且是不依赖于贴壁的。类风湿性滑膜中的C-Fos/Ap-1转录因子增加。Kawasaki等(Kawasaki et al.，2003，Onco.22：6839-6844)证明了Wee1由c-Fos/AP-1反式激活；与骨关节炎细胞相比，Wee1在类风湿性滑膜细胞中显著增加。这些滑膜细胞也表现出增加的四倍体性质。灭活Wee1可以缓解RNA中存在的一些关节破坏。

US20030087847A1描述了用核酸分子抑制Chk1活性的方法，作为消除G2关卡并且选择性使p53缺陷型肿瘤对化疗敏感的途径。Chk1使Cdc25上的抑制性残基磷酸化，Cdc25是Cdc2的激活剂。EP1360281A2描述了Wee1核苷酸和氨基酸序列，表达重组Wee1的方法，和鉴定调节Wee1活性的化合物的方法。

在另一种优选实施方案中，本发明提供了作为能够减弱或增强DNA破坏剂导致的细胞杀伤的基因的EPHB3。受体酪氨酸激酶(RTK)是具有细胞外配体结合域和细胞内激酶结构域的跨膜蛋白。具有14个成员的Eph受体包含最大的RTK亚家族。Eph受体的细胞外部分包含推定的免疫球蛋白(Ig)区(配体结合域)，随后是富含半胱氨酸的区域和单个跨膜片段附近的两个III型纤连蛋白重复(Connor and Pasquale，1995Oncogene 11：2429-2438；Labrador etal.，1997，EMBO 16：3889-3897)。细胞质部分包含高度保守的酪氨酸激酶结构域，其侧翼是保守性较低的近膜区和C末端尾(sterileα基序和PDZ结合基序)。根据胞外域的序列同源性，将Eph受体分为两组。EphA受体以高亲和力与ephrin-A配体相互作用，该受体通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚，固定于细胞表面。EphB受体优先结合跨膜ephrin-B配体。对于每一组，受体可以与一个以上的配体结合，并且每个配体可以与一个以上的受体结合。在A和B亚组之间具有较少的受体-配体串话(综述于Orioli and Klein，1997Trends in Genetics13：354-359；Pasquale，1997Curr.Biol.9：608-615)。Eph受体仅仅能够通过膜结合或人工成簇的ephrin激活；而可溶性配体确实结合受体，它们不引起受体自磷酸化(Davis et al.，1994Science 266：816-819)。Eph受体和ephrin是独特的，因为它们介导双向的信号传递。由于它们的膜结合状态，Eph受体和ephrin被认为介导细胞-细胞相互作用而不是长范围功能。

Eph受体的表达是独特但重叠的，表明独特但冗余的功能。Eph受体的表达在神经组织中最高，但也存在于许多组织中。表达在发育的胚胎中较高，但也存在于成年组织中。受体-配体相互作用通常导致细胞排斥，这些排斥作用参与发育中的轴突导向、突触形成、神经系统的区段模式、血管发生和细胞迁移。这些受体也可以参与成年的神经细胞、血管发生和肿瘤发生(综述于Dodelet and Pasquale，2000Oncogene 19：5614-5619；Zhou，1998Pharmacol.Ther.77：151-181；Pasquale，1997Curr.Opin.Cell Biol.9：608-615)。细胞排斥或去粘附似乎是由Eph受体和许多信号传递分子，如Nck、Ras-GAP、Src、SHEP1和SHP2之间的相互作用介导的(Wilkinson，2001Neurosci.Rev.2：155-164)。

存在8种EphA受体(EphA 1-8)和6种EphB(EphB 1-6)受体，它们都编码大约1000个氨基酸的蛋白。在许多物种，如鸡、大鼠、小鼠和人类中鉴定了Eph基因。EphB3也称作Hek2、Sek4、Mdk5、Cek10或Tyro 6，它可以与配体ephrin-B 1-3相互作用(Pasquale，1997，Curr.Opin.Cell Biol.9：608-615)。EphB3序列在不同物种中是高度保守的(＞95％氨基酸同源性)。单拷贝的20.2kb EphB3基因位于人类3号染色体上，具有16个外显子。人类蛋白由998个氨基酸组成(ref.seq.NM004443)。在胚胎发育过程中和成年脑、肠道、胎盘、肌肉、心脏和肺和肾(肺和肾中强度较低)中存在高水平小鼠EphB3转录物(Ciossek et al.，1995Oncogene 11：2085-2095)。在成人脑、肺、胰腺、肝、胎盘、肾、骨骼肌和心脏中存在EphB3转录物(Bohme et al，1993Oncogene 8：2857-2862)。

在鸡中鉴定了EphB3剪接变体，其在近膜结构域中具有15个氨基酸插入(Sajjadi and Pasquale，1993Oncogene 8：1807-1813)。除了主要的4.8kb全长EphB3转录物，在小鼠组织中发现了更小的2.8kb、2.3kb和1.9kb转录物(Ciossek et al.，1995Oncogene 11：2085-2095)。在人类EphB3中仅仅观察到了一种转录物大小(Bohme etal.，Oncogene 1993 8：2857-2862)。但是，鉴定了人类EphB2剪接变体，表明可以发现其它人类Eph受体的其它同工型(Tang et al.，1998Oncogene 17：521-526)。

已经在胚胎发育中进行了相当多的Eph受体表征。Adams等(Genes & Dev.13：295-306)证明了EphB3在卵黄囊中表达，并且发育出小鼠胚胎的动脉和静脉。他们也证明了EphB2/EphB3双突变小鼠表现出卵黄囊血管化的缺陷、心包囊扩大、血管发育缺陷和头、心脏和体节血管发生缺陷。Adams等也确定了ephrin-B配体能够诱导体外测定中的毛细血管出芽。

EphB3缺陷小鼠说明了受体参与脑连合，特别是连接两个大脑半球的胼胝体的形成。此外，EphB2/EphB3双突变体具有颚裂，表明它们也参与面部发育(Orioli et al.，1996EMBO 15：6035-6049)。

在肠上皮中，随着分化，干细胞产生以特定模式迁移的前体。肠上皮细胞中β-连环蛋白/TCF的突变激活导致息肉形成。Batle等人证明了β-连环蛋白/TCF信号传递事件控制结直肠癌细胞中的和沿着隐窝-绒毛轴的EphB3表达。在无EphB3的小鼠中，通常迁移以占据肠隐窝底部的Paneth细胞在隐窝中随机定位，表明分选细胞群中的缺陷。此外，在EphB2/EphB3双突变体中，在肠上皮细胞中混有增殖和分化的细胞(Batle et al.，2002Cell 111：251-263)。

也在成年小鼠耳蜗中发现了EphB3表达，表明其可能在外周听觉系统中起作用。与野生型对照相比，EphB3敲除小鼠表现出显著更低的失真-产物耳听力发射DPOAE水平(Howard et al.，2003Hear.Res.178：118-130)。DPOAE测量值反映了外毛细胞水平上的耳蜗功能。

Willson等证明了成年大鼠损伤部位的受损脊髓中EphB3表达的上调(Willson et al.，2003，Cell Transpl.12：279-290)。EphB3受体的表达共同定位在也具有高水平ephrin B配体的CNS区域中。损伤部位EphB3受体和配体的补充表达可能是由于损伤后抑制轴突再生的环境。

已经在乳腺和上皮来源的肿瘤细胞系中检测了EphB3(Bohme etal.，1993，Oncogene 8：2857-2862)。也在多种肿瘤类型中上调了其它Eph受体的表达水平(综述于Dodelet and Pasquale，Oncogene 200019：5614-5619)。一些证据提示，Eph的上调似乎不驱动增殖(Lhotakand Pawson，1993，Mol.Cell.Biol.13：7071-7079)，但是升高的表达似乎与转移潜能相关(Andres et al.，1994Oncogene 1461-1467；Vogtet al.，1998Clin.Cancer Res.4：791-797)。

组织无序和异常细胞粘附是晚期肿瘤的标志。Eph受体的超量表达可能使肿瘤对ephrin激活高度敏感，促进细胞粘附减少、细胞移动性和侵入性。已经发现Eph受体通过调节整联蛋白活性而影响细胞-基质附着。Maio et al.(2000Nature Cell.Biol.2：62-69)证明了前列腺癌细胞上ephrin A1配体对EphA2的激活，瞬时抑制整联蛋白介导的细胞附着。此外，在早期非洲爪蟾胚胎中，ephrin-Bl的异位表达或激活的EphA4干扰钙粘着蛋白依赖性细胞附着(Jones et al，1998Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：576-581；Winning et al，1996Dev.Biol.，179：309-319)。

已经建立了Eph受体和细胞骨骼改变之间的联系，这是细胞移动性的关键方面。通过ephrin-B2配体激活EphB4，诱导了Eph表达细胞中Rac介导的膜起皱(Marston et al.，2003Nat.Cell Biol.5：879-888)。Wahl等人(2000J.Cell Biol.149：263-270)证明了ephrin-A5以Rho依赖性方式诱导神经生长圆锥的塌陷。Rho和Rac都与参与肿瘤形成的细胞改变相关(综述于Schmitz et al.，2000Exp.Cell Res.261：1-12)。Eph受体导致的这些信号传递途径的激活可以导致肿瘤侵入和转移。

由于Eph受体和它们的配体在胚胎血管发育和血管发生中的作用(综述于Sullivan and Bicknell，2003Br.J.Cancer 89：228-231)，这些分子也可以通过导致肿瘤的血管化而参与肿瘤生长。已经证明了Eph受体配体促进内皮细胞组织和组装为毛细血管结构，并且诱导从存在的血管进行毛细血管出芽(Daniel et al.，1996Kidney Intl.Suppl.57：S73-81；Pandey et al.，1995Science 268：567-569)。分泌的ephrin配体也可以作为内皮细胞的可弥散的化学引诱物；肿瘤细胞上表达的eph受体可以指导从进入的内皮细胞构建新血管(Pandey et al.，1995Science 268：567-569)。

由于在肿瘤细胞中的上调(Bohme et al.，1993Oncogene 8：2857)，以及可能参与肿瘤血管发生和转移，EphB3可以产生癌症诊断或治疗干涉的有吸引力的靶。可溶性EphA-Fc受体抑制皮肤窗测定中以及体内抑制注射了4T1肿瘤细胞的小鼠中的肿瘤血管发生(Brantley et al，2002 Oncogene 21：7011-7026)。

或者，可能存在这样的情况，其中可能需要增强Eph受体的血管发生特性，例如用于治疗冠状血管阻塞。

受损脊髓中EphB3的表达也可以作为CNS损伤的有吸引力的治疗靶。EphB3的细胞排斥作用可以导致受损的脊髓轴突不能再生。研究证明，当用抗体阻断抑制轴突再生的其它分子时，受损脊髓中发生轴突再生(Bregman et al.，1995Nature 378：498-501；GrandPre et al.，2002Nature 417：547-551)。

Eph受体自磷酸化是随后与具有磷酸酪氨酸结合域的SH2的信号传递分子相互作用的关键事件(综述于Bruckner et al，1998Curr.Opion.Neuro.8：375-382)。

Binns等人(Binns，et al.，2000，Mol.Cell.Biol.20：4791-4805)描述了用于研究神经元细胞上EphB2的ephrin-刺激的细胞测定系统。简言之，建立了稳定表达EphB2的NG108-15细胞系(NG-EphB2WT细胞)。NG108-15细胞表现运动神经元的特征，运动神经元是一种在胚胎发育期间表达EphB2的细胞类型。但是，NG108-15细胞不内源表达EphB2或反应于ephrin-B配体。用Fc-ephrin-B 1刺激NG-EphB2WT细胞，导致神经突消退和聚合肌动蛋白结构的解聚。野生型NG108-15细胞和近膜基序中表达酪氨酸至苯丙氨酸取代(关键磷酸化位点)的细胞不表现出反应于配体刺激的细胞骨骼重塑。也用抗-p Tyr抗体监测了wt EphB2与EphB2(Y→F)转化细胞中酪氨酸残基的磷酸化变异。EphB2受体功能减弱也导致eph信号传递级联的一种成分p62^dok的磷酸化减少。

专利US6169167也描述了用细胞-细胞自磷酸化测定来确定对hek4配体对hek4激活的方法。在受体-配体相互作用后，从表达Hek4DNA的CHO细胞的裂解物免疫沉淀Hek4受体。将裂解物用于采用抗磷酸酪氨酸抗体进行的Western印迹。

在另一种优选实施方案中，本发明提供了RAD51作为能够减弱或增强DNA破坏剂的细胞杀伤的基因。在哺乳动物细胞中，可以通过非同源末端连接(NHEJ)或通过同源重组修复双链DNA断裂(DSBs)。NHEJ涉及在没有模板的情况下对断裂的DNA末端再连接，并且可以导致断裂位点的突变或缺失。同源重组需要模板、完整的姐妹双链体，并且导致高保真修复。同源重组也可以修复DNA中停顿或断裂的复制叉。DSBs的修复是重要的，因为如果不对它们进行处理或不准确修复，可能发生功能受损或细胞凋亡。遗传不稳定性是肿瘤细胞的关键特征，它也可以导致不具有高保真度的同源重组修复。同源重组的起始步骤-同源配对和链交换，涉及属于RecA/Rad51重组酶家族的蛋白(综述于Baumann and West，1998，Trends Biochem.Sci.23：247-251；Henning and Sturzbecher，2003，Toxicology 193：91-109)。

大肠杆菌蛋白RecA是作为对DNA破坏的SOS反应的调节剂，并且促进同源配对和链交换(综述于Baumann and West，1998，TrendsBiochem.Sci.23：247-251)。在啤酒糖酵母中鉴定了DSB修复基因rad51，并且与recA同源(Shinohara et al.，1992，Cell 69：457-470)。也从人类和小鼠克隆了rad51基因(Yoshimura et al.，1993，NucleicAcids Res.21：1665；Shinohara et al.，1993，Nature Genet.4：239-243)。单拷贝人类radS1基因位于15号染色体(Shinohara et al，1993，Nature Genet.4：239-243)。rad51基因由10个外显子组成，编码339个氨基酸的蛋白。两种哺乳动物Rad51蛋白的氨基酸序列与酵母Rad1具有83％的同源性，与大肠杆菌RecA蛋白具有56％同源性。RecA和Rad51之间的同源区包括用于重组、UV抗性和寡聚物形成的功能域(RecA的321-260位)(Yoshimura et al.，1993，Nucleic Acids Res.21：1665；Shinohara et al.，1993，Nature Genet.4：239-243)。发现小鼠Rad51转录物在胸腺、脾、睾丸和卵巢中是高水平，在脑中是低水平(Shinohara et al，1993，Nature Genet.4：239-243)。Rad51表达似乎是细胞周期调节的，在S和G2期间有转录上调(Flygare etal.，1996，Biochim.Biophys.Acta 1312：231-236)。此外，鉴定了5种Rad51平行进化同源物(XRCC2，XRCC3，Rad51B-D)，它们与Rad51具有20-30％同一性。这些平行进化同源物可以促进Rad51灶形成(综述于Thompson and Schild，2001，Mutat.Res.477：131-153)。

Rad51作为长螺旋聚合物起作用，它缠绕DNA，以形成核蛋白丝。Rad51结合于通过DSB位点的溶核性重新切割而产生的单链DNA，该相互作用由Rad52增强。重新切割的DSB末端向同源双链体的侵入发生在Rad51核蛋白丝，需要ATP结合但不需要水解。第二个重新切割的末端也被Rad51捕获。侵入的重新切割的末端作为DNA重新合成的引物。Holliday-接合解开和连接使得修复的双链体能够分开(综述于West，2003，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.4：435-445)。Pellegrini等人(2002，Nature 420：287-293)报道了BRCA2中的保守重复序列BRC4模拟Rad51中的基序，并且作为用于Rad51单体的寡聚化的界面。尽管有这种BRC4-Rad51复合物，BRCA2能够控制Rad51核蛋白丝的组装。Rad51活性也受其它机制的调节。发现p53下调由Rad51促进的同源重组(Linke et al.，2003，Cancer Res.63：2596-2605；Yoon et al.，2004，J.Mol.Biol.336：639-654)。发现Rad54使双链DNA(dsDNA)上形成的Rad51核蛋白丝分解，并且可以参与Rad51-dsDNA丝的更新，这在DNA链交换反应中是重要的。在酵母中，发现Srs2通过破坏单链DNA上的Rad51丝形成而抑制重组(Veaute et al.，2003，Nature 423：309-312；Krejci et al.，2003，Nature423：305-309)。

已经鉴定了Rad51的剪接变体。一种转录物(NM_133487)缺乏相应于外显子4、5和外显子6的5’部分的内部片段，得到缺乏97个氨基酸的内部区域的蛋白。由Genbank编号AY425955识别的转录物也表明在睾丸中存在进一步截短的剪接变体。也在其它物种，如秀丽新杆线虫中发现了Rad51剪接变体(Rinaldo et al.，1998，Mol.Gen.Genet.260：289-294)。

一些研究证明了Rad51 135C多态性显著升高了BRCA2(但不是BRCA1)的携带者中乳腺癌的风险(Levy-Lahad et al.，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：3232-3236；Kadouri et al.，2004，Br.J.Cancer 90：2002-2005)。在患有双侧乳腺癌的两名患者中报道了错义突变(Gln150Arg)，但相反，在大多数肿瘤中没有发现Rad51突变(Katoet al.，2000，J.Hum.Genet.45：133-137；Schmutte et al.，1999，CancerRes.59：4564-4569)。Rad51敲除小鼠在胚胎发育早期死亡，但杂合子是存活和可育的，并且不能建立rad51^-/-小鼠细胞，表明该基因的关键作用(Tsuzuki et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：6236-6240)。Sonoda等人(1998，EMBO J.，17：598-608)通过使用可阻遏的启动子控制Rad51转基因而制备了rad51^-/-鸡B淋巴细胞DT40细胞系。DT40细胞中rad51转基因的抑制导致了高水平的染色体断裂、G2/M期的细胞周期停滞和细胞死亡。一些研究也调查了Rad51在细胞系中的超量表达。Vispe等(1998，Nucleic Acids Res.26：2859-2864)发现CHO细胞中的Rad51超量表达增加了两个邻接的同源等位基因之间的同源重组，并且增加了晚S/G₂细胞周期阶段对电离辐射的抗性。Richardson等人(2004，Oncogene 23：546-553)进行的工作提出了肿瘤细胞中Rad51水平增加和与肿瘤进展相关的染色体不稳定性之间的联系。Rad51水平在DSB诱导期间在小鼠ES细胞系中瞬时上调2-4倍，产生了新的重组修复产物并且产生异常核型。

在肿瘤中报道了Rad51水平升高，表明Rad51上调可促进肿瘤进展。Maacke等人(2000，Int.J.Cancer 88：907-913)报道了Rad51超量表达和乳腺肿瘤分期之间的正相关。在多种肿瘤细胞系中也观察到了与非恶性对照细胞系相比Rad51的2-7倍增加(Raderschall etal.，2002，Cancer Res.62：219-225)。也在66％的人类胰腺腺癌组织样品中发现了Rad51超量表达(Maacke et al.，2000，Oncogene19：2791-2795)。推测癌细胞中的Rad51超量表达可以保护细胞免受DNA破坏或导致基因组不稳定性和多样性。也在人类成纤维细胞的永生化中观察到了Rad51的表达升高和重组增加(Xia et al.，1997，Mol.CellBiol.17：7151-7158)。

许多研究提示了Rad51在肿瘤抗性中的功能作用。Hansen等人(2003，Int.J.Cancer 105：472-479)证明了RadS1水平与小细胞肺癌(SCLC)细胞中的依托泊苷抗性正相关。此外，用有义或反义构建体下调或上调Rad51，改变了SCLC细胞中的依托泊苷敏感性。发现苯丁酸氮芥治疗诱导B细胞慢性淋巴细胞白血病细胞中的Rad51表达(Christodoulopoulos et al.，1999，Clin.Cancer Res.5：2178-2184)。反义Rad51寡核苷酸在小鼠胚胎皮肤细胞系和恶性胶质细胞瘤中增强辐射导致的DNA破坏(Taki et al.，1996，Biochem.Biophys.Res.Commun.223：434-438；Ohnishi et al.，1998，Biochem.Biophys.Res.Commun.245：319-324)。用核酶进行的Rad51下调也增加了前列腺癌细胞对辐射的敏感性(Collis et al.，2001，Nucleic Acids Res.29：1534-1538)。通过Rad51与BRCA2上的BRC重复序列的相互作用而破坏其功能，也导致癌细胞中对辐射和甲磺酸甲酯的高敏感性(Chen et al.，1999，J.Biol.Chem.274：32931-32935；Chen et al.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：5287-5292)。Slupianek等人(2001，Mol.Ceu 8：795-806)证明了Rad51表达对髓细胞中的顺铂和丝裂霉素C抗性是重要的。这些研究提示Rad51是改进癌症治疗效力的有吸引力的靶。

5.4.2.DNA破坏剂

可以用任何公知的DNA破坏剂实施本发明，包括，但不限于任何拓扑异构酶抑制剂、DNA结合剂、抗代谢药、电离辐射或两种或多种所述已知DNA破坏剂的组合。

可以与本发明联合使用的拓扑异构酶抑制剂可以是拓扑异构酶I(TopoI)抑制剂、拓扑异构酶II(TopoII)抑制剂、或双重拓扑异构酶I和II抑制剂。topo I抑制剂可以来自以下任何类化合物：喜树碱类似物(如karenitecin、氨基喜树碱、lurtotecan、托泊替堪、irinotecan、BAY 56-3722、rubitecan、GI14721、exatecan mesylate)、rebeccamycin类似物、PNU 166148、rebeccamycin、TAS-103、喜树碱(如聚谷氨酸喜树碱、喜树碱钠)、intoplicine、海鞘素743、J-107088、pibenzimol。优选的topo I抑制剂的例子包括，但不限于，喜树碱、托泊替堪(hycaptamine)、irinotecan(irinotecan hydrochloride)、belotecan，或其类似物或衍生物。

可以与本发明联合使用的拓扑异构酶II抑制剂可以来自以下任何类化合物：蒽环抗生素(如洋红霉素、吡喃阿霉素、脂质体柠檬酸柔红霉素、道诺霉素、4-碘-4-脱氧阿霉素。阿霉素、n，n-二苯基道诺霉素、吗啉代阿霉素、阿克拉霉素抗生素、柔红霉素醇、menogaril、诺加霉素、佐柔比星、表阿霉素、麻西罗霉素、detorubicin、annamycin、7-cyanoquinocarcinol、脱氧阿霉素、去甲氧柔红霉素、GPX-100、MEN-10755、valrubicin、KRN5500)、表鬼臼毒素化合物(如鬼臼树脂、替尼泊苷、依托泊苷、GL331、2-乙基酰肼)、蒽酮化合物(如双氢胺蒽酮、比山群、米托蒽醌、蒽酮)、环丙沙星、氨甲酰吖啶、氨萘非特、蒽吡唑抗生素(如teloxantrone、sedoxantronetrihydrochloride、piroxantrone、蒽吡唑、losoxantrone)、TAS-103、fostriecin、丙亚胺、XK469R、XK469、chloroquinoxaline sulfonamide、merbarone、intoplicine、elsamitrucin、CI-921、吡唑并吖啶、羟哔咔唑、安吖啶。优选的拓扑异构酶II抑制剂包括，但不限于，阿霉素(亚德里亚霉素)、磷酸依托泊苷(etopofos)、替尼泊苷、sobuzoxane，或其类似物或衍生物。

可以与本发明联合使用的DNA结合剂包括但不限于DNA沟结合剂，如DNA小沟结合剂；DNA交联剂；嵌入剂；和DNA加合物形成剂。DNA小沟结合剂可以是蒽环抗生素、丝裂霉素抗生素(如porfiromycin、KW-2149、丝裂霉素B、丝裂霉素A、丝裂霉素C)、色霉素A3、carzelesin、放线菌素抗生素(如cactinomycin、更生霉素、放线菌素F1)、brostallicin、棘霉素、bizelesin、duocarmycin抗生素(如KW 2189)、阿多来辛、橄榄霉素抗生素、plicamycin、新制癌菌素、偏端霉素、MS-247、海鞘素743、安吖啶、蒽霉素和pibenzimol，或其类似物或衍生物。

DNA交联剂包括但不限于抗肿瘤烷化剂、8-甲氧基补骨脂素、丝裂霉素抗生素、补骨脂素。抗肿瘤烷化剂可以是硝基脲化合物(如cystemustine、牛磺莫司汀、甲环亚硝脲、PCNU、链脲霉素、SarCNU、CGP-6809、卡氮芥、福替目丁、甲基硝基脲、尼莫司汀、雷诺氮芥、乙基硝基脲、罗氮芥、chlorozotocin)、氮芥试剂(如氮芥化合物，如螺旋氮芥、氯乙环磷酰胺、苯丁酸氮芥、雌氮芥、2，2，2-三氯三乙胺、松龙苯芥、新氮芥、蛋氨氮芥、glufosfamide、苯丙氨酸芥肽、异环磷酰胺、磷氨氮芥、氮芥、苯芥胆甾醇、甘露醇氮芥、环磷酰胺、马法兰、perfosfamide、盐酸氧氮芥、尿嘧啶氮芥、bestrabucil、DHEA氮芥、tallimustine、mafosfamide、苯基氮芥、萘氮芥；硫氮芥化合物，如双氯乙基硫化物；氮芥前药，如TLK286和ZD2767)、乙烯亚胺化合物(如丝裂霉素抗生素、乙烯亚胺、尿烷亚胺、塞替派、地吖醌、hexamethylene bisacetamide、pentamethylmelamine、六甲密胺、嗜癌霉素、三亚胺醌、四甲尿烷亚胺、苄替派、卡波醌)、磺酸烷酯化合物(如二甲基白消安、Yoshi-864、胺丙磺酯、嗪消安、苏消安、白消安、hepsulfam)、环氧化物化合物(如anaxirone、mitolactol、二去水卫矛醇、环氧三嗪酮)、混杂的烷化剂(如ipomeanol、carzelesin、甲磺酸亚甲酯、二溴甘露醇、bizelesin、阿多来新、哌嗪二酮、VNP40101M、asaley、6-羟基甲基烷基富烯、E09、环氧甘醚、海鞘素743、溴丙哌嗪)、铂化合物(如ZD0473、脂质体-顺铂类似物、satraplatin、BBR 3464、spiroplatin、ormaplatin、顺铂、草酸铂、卡铂、lobaplatin、折尼拉丁、iproplatin)、三烯化合物(如咪唑氮芥、CB 10-277、mitozolomide、temozolomide、甲基苄肼、达卡巴嗪)、picoline化合物(如penclomedine)，或其类似物或衍生物。优选的烷化剂的例子包括但不限于顺铂、二溴卫矛醇、福替目丁、异环磷酰胺、雷诺氮芥、nedaplatin(latoplatin)、bendamustine(bendamustinehydrochloride)、eptaplatin、temozolomide(methazolastone)、卡铂、六甲密胺、松龙苯芥、草酸铂、卡氮芥、塞替派、leusulfon(白消安)、lobaplatin、环磷酰胺、bisulfan、美法兰和苯丁酸氮芥，或其类似物或衍生物。

嵌入剂可以是蒽酮化合物、博莱霉素抗生素、rebeccamycin类似物、吖啶、氨甲酰吖啶、氨萘非特、rebeccamycin、蒽吡唑抗生素、棘霉素、补骨脂素、LU 79553、BW A773U、crisnatol mesylate、苯并芘-7，8-二醇-9，10-环氧化物、acodazole、羟哔咔唑、pixantrone，或其类似物或衍生物。

DNA加合物形成剂包括但不限于enediyne抗肿瘤抗生素(如dynemicin A、esperamicin A1、新制癌菌素、dynemicin、calicheamicingamma II)、铂化合物、卡氮芥、他莫昔芬(如4-羟基-他莫昔芬)、补骨脂素、哌嗪二氮杂氢氧化物、苯并芘-7，8-二醇-9，10-环氧化物，或其类似物或衍生物。

抗代谢药包括但不限于胞嘧啶、阿糖胞苷、氟尿苷、氟尿嘧啶、巯基嘌呤、吉西他滨和氨甲喋呤(MTX)。

电离辐射包括但不限于X射线、γ射线和电子束。

5.4.3.确定与DNA破坏反应基因相互作用的蛋白或其它分子的方法

可以用适于检测蛋白-蛋白相互作用的任何方法鉴定DNA破坏反应蛋白与另一种细胞蛋白之间的相互作用。也可以用本领域公知的方法鉴定DNA破坏反应基因和其它细胞分子之间的相互作用，如DNA破坏反应及其调节剂之间的相互作用。

可以使用的传统方法包括免疫共沉淀、交联和通过梯度或层析柱共纯化。利用诸如这些的程序，使得能够鉴定与DNA破坏反应基因产物相互作用的细胞蛋白。一旦得到分离，所述细胞蛋白可以被鉴定，然后可与标准技术结合使用，用于鉴定与其相互作用的蛋白。例如，可以用本领域公知的技术，如Edman降解技术(参见，例如Creighton，1983，″Proteins：Structures and Molecular Principles″，W.H.Freeman& Co.，N.Y.，pp.34-49)确定与DNA破坏反应基因产物相互作用的细胞蛋白的至少一部分氨基酸序列。可以将获得的氨基酸序列作为产生可以用于筛选编码所述细胞蛋白的基因序列的寡核苷酸混合物的指导。例如，可以通过标准杂交或PCR技术完成筛选。用于制备寡核苷酸混合物和筛选的技术是本领域公知的(参见，例如Ausubel，supra.，and PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，1990，Innis，M.et al.，eds.Academic Press，Inc.，New York)。

此外，可以使用导致同时鉴定编码与DNA破坏反应蛋白相互作用的细胞蛋白的基因。这些方法包括，例如，利用与公知的λgt11文库的抗体探测技术相似的方式利用DNA破坏反应蛋白，用标记的DNA破坏反应蛋白探测表达文库。

简言之，采用这样的系统，构建了编码两种杂合蛋白的质粒：一种由与DNA破坏反应基因产物融合的转录激活蛋白的DNA结合域组成，另一种由与作为cDNA文库的一部分重组到该质粒中的cDNA编码的未知蛋白融合的转录激活蛋白的激活域组成。将DNA结合域融合质粒和cDNA文库转化到含有报道基因(如HBS或lacZ)的啤酒糖酵母株，所述酵母株的调节区含有转录激活物的结合位点。任何单独的杂合蛋白都不能激活报道基因的转录：DNA结合域杂合蛋白不能，因为它不提供激活功能，激活域杂合蛋白不能，因为它不能定位到激活物的结合位点。两种杂合蛋白的相互作用重建了功能性激活蛋白，并且导致报道基因的表达，通过报道基因产物的测定可以对其进行检测。

可以将双杂合系统或相关的方法用于筛选与“诱饵”基因产物相互作用的蛋白的激活域文库。举例说明，但不是限制，DNA破坏反应基因产物可以用作诱饵基因产物。总基因组或cDNA序列与编码激活域的DNA融合。与DNA结合域融合的该文库和编码诱饵DNA破坏反应基因产物的杂合体的质粒被共转染到酵母报道株中，筛选得到的转化体中表达报道基因的那些。例如，但不是限制，诱饵DNA破坏反应基因序列，如DNA破坏反应基因的编码序列，可以克隆到载体中，使得它翻译融合于编码GAL4蛋白的DNA结合域的DNA。纯化这些菌落，分离负责报道基因表达的文库质粒。然后用DNA测序鉴定由文库质粒编码的蛋白。

可以用本领域中常规实施的方法制备细胞系的cDNA文库，来自该文库的与DNA破坏反应基因产物相互作用的蛋白是待检测的。根据此处描述的特定系统，例如，可以将cDNA片段插入载体，使得它们翻译融合于GAL4的转录激活域。该文库可以与诱饵DNA破坏反应基因-GAL4融合质粒共转化到酵母株中，该酵母株含有由包含GAL4激活序列的启动子驱动的lacZ基因。与DNA破坏反应基因产物相互作用的、由cDNA编码的融合于GAL4转录激活域的蛋白，将重构活性GAL4蛋白，并且因此驱动HIS3基因的表达。可以通过在含有基于半固体琼脂的缺乏组氨酸的培养基的陪替氏培养皿上的生长，检测表达HIS3的菌落。然后可以从这些菌株纯化cDNA，并且用本领域常规实施的技术生产和分离诱饵DNA破坏反应基因-相互作用蛋白。

可以通过本领域公知的标准方法确定DNA破坏反应基因及其调节剂之间的相互作用。

5.4.4.筛选试剂的方法

本发明提供了筛选调节DNA破坏反应的表达或调节DNA破坏反应与其它蛋白或分子的相互作用的方法。

5.4.4.1.筛选测定

设计了以下测定，以鉴定一些化合物，其结合于DNA破坏反应基因或基因产物、结合于与DNA破坏反应基因产物相互作用的其它细胞蛋白、结合于受DNA破坏反应基因产物影响的细胞组分，如蛋白、或结合于干扰DNA破坏反应基因或基因产物与其它细胞蛋白的相互作用的化合物以及调节DNA破坏反应基因的活性(即，调节DNA破坏反应基因表达水平和/或调节DNA破坏反应基因产物活性的水平)的化合物。还可以利用鉴定结合于DNA破坏反应基因调节序列(如启动子序列)的化合物的测定，参见，例如Platt，K.A.，1994，J.Biol.Chem.269：28558-28562，在此全文引入作为参考，所述化合物可以调节DNA破坏反应基因的表达水平。所述化合物可以包括，但不限于，能够影响DNA破坏反应基因或一些参与DNA破坏反应途径的其它基因的表达的小有机分子，或其它细胞蛋白。鉴定所述细胞蛋白的方法描述于上文5.4.3节。所述细胞蛋白可以参与DNA破坏剂的生长抑制作用的调节。此外，在这些化合物中，包括了影响DNA破坏反应基因的表达和/或DNA破坏反应基因产物的活性，并且可以用于调节对DNA破坏剂的生长抑制作用的抗性的化合物。

经过如此处描述的测定鉴定的化合物可以用于，例如，调节DNA破坏反应基因产物的生物功能，以及用于改善对DNA破坏剂的生长抑制作用的抗性和/或增强DNA破坏剂的生长抑制作用。用于检测化合物的有效性的测定在下文5.4.4.2.节中讨论。

可以设计体外系统，以鉴定能够结合于本发明的DNA破坏反应基因产物的化合物。鉴定的化合物可以用于，例如，调节野生型和/或突变的DNA破坏反应基因产物的活性，可以用于阐明DNA破坏反应基因产物的生物功能，可以在鉴定破坏正常DNA破坏反应基因产物相互作用，或自身破坏所述相互作用的化合物的筛选中使用。

用于鉴定结合于DNA破坏反应基因产物的化合物的原则包括在足以使DNA破坏反应基因产物和测试化合物相互作用并结合的条件和时间中制备这两种成分的反应混合物，由此形成可以在反应混合物中除去和/或检测的复合物。可以采用多种方式进行所述测定。例如，进行测定的一种方法包括将DNA破坏反应基因产物或测试物质锚定到固相上，并且在反应结束时检测锚定在固相上的DNA破坏反应基因产物/测试化合物复合物。在所述方法的在一种实施方案中，可以将DNA破坏反应基因产物锚定在固体表面，并且可以直接或间接标记未锚定的测试化合物。

或者，可以在液相中进行反应，从未反应的成分分离反应产物，并且检测复合物；例如，用DNA破坏反应基因产物或测试化合物的特异性固定化抗体锚定溶液中形成的任何复合物，用可能的复合物的其它成分的特异性标记抗体检测锚定的复合物。

DNA破坏反应基因或基因产物可以在体内与一种或多种细胞内或细胞外分子，如蛋白相互作用。所述分子可以包括，但不限于，通过如上文5.4.3节描述的方法鉴定的核酸分子和蛋白。为了讨论的目的，在此将所述分子称作“结合配偶体”。破坏DNA破坏反应基因产物的结合的化合物可以用于调节DNA破坏反应基因产物的活性。破坏DNA破坏反应基因产物的结合的化合物可以用于调节DNA破坏反应基因的表达，例如通过调节DNA破坏反应基因的调节剂的结合。所述化合物可以包括，但不限于诸如上文5.4.4.1节描述的肽等，其能够接近DNA破坏反应基因产物。

用于鉴定干扰DNA破坏反应基因产物及其细胞内或细胞外结合配偶体的相互作用的化合物的测定系统的基本原理包括在足以使DNA破坏反应基因产物和结合配偶体相互作用并结合的条件和时间中制备包含这两种成分的反应混合物，由此形成复合物。为了测试化合物的抑制活性，在测试化合物存在和不存在的条件下制备反应混合物。测试化合物最初可以包括在反应混合物中，或可以在加入DNA破坏反应基因产物及其结合配偶体之后的时间加入。在没有测试化合物的条件下或与安慰剂一起温育对照反应混合物。然后检测DNA破坏反应基因蛋白和结合配偶体之间任何复合物的形成。在对照反应中形成复合物，但在含有测试化合物的反应混合物中不形成复合物，表明化合物干扰DNA破坏反应基因蛋白和相互作用的结合配偶体之间的相互作用。此外，在含有测试化合物和正常DNA破坏反应基因蛋白的反应混合物中的复合物形成，也可以与含有测试化合物和突变DNA破坏反应基因蛋白的反应混合物中的复合物形成进行比较。在需要鉴定破坏突变体，但不破坏正常DNA破坏反应基因蛋白的化合物的情况下，该比较是重要的。

可以以非均相或均相形式进行干扰DNA破坏反应基因产物及其结合配偶体的相互作用的化合物。非均相测定包括将DNA破坏反应基因产物或结合配偶体锚定在固相上，并且在反应结束时检测锚定在固相上的复合物。在均相测定中，在液相中进行整个反应。在任一种方法中，可以改变加入反应物的顺序，以获得关于测试的化合物的不同信息。例如，通过例如竞争而干扰DNA破坏反应基因产物和结合配偶体之间的相互作用的测试化合物可以通过以下方法鉴定：在测试物质存在下进行反应，即通过在加入DNA破坏反应蛋白和相互作用的结合配偶体之前或同时将测试物质加入反应混合物。或者，通过在形成复合物之后将测试化合物加入反应混合物，可以检测破坏预先形成的复合物的测试化合物，如置换复合物的成分之一的具有更高结合常数的化合物。下文简要描述了各种形式。

在非均相测定系统中，将DNA破坏反应基因产物或相互作用的结合配偶体锚定在固相上，而直接或间接标记未锚定的物质。在实践中，可以方便地利用微量滴定板。可以通过非共价或共价附着，将锚定的物质固定化。可以简单地通过用DNA破坏反应基因产物或结合配偶体溶液包被固体表面并干燥，完成非共价附着。或者，可以用待固定的物质的特异性固定化抗体，将物质锚定到固体表面。可以提前制备表面并储存。

在本发明的一种替代实施方案中，可以使用均相测定。在该方法中，制备DNA破坏反应基因蛋白和相互作用的结合配偶体的预先形成的复合物，其中标记了DNA破坏反应基因产物或其结合配偶体，但由于复合物形成，该标记产生的信号被淬灭(参见，例如Rubenstein的美国专利No.4,109,496，其利用该方法进行免疫测定)。与预先形成的复合物中的物质之一竞争并且置换该物质的测试物质的添加，将导致产生高于背景的信号。以此方式，可以鉴定破坏DNA破坏反应蛋白/结合配偶体相互作用的测试物质。

在一种具体的实施方案中，可以制备DNA破坏反应基因产物，以采用重组DNA技术进行固定。例如，可以采用融合载体，如pGEX-5X-l，使DNA破坏反应编码区与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因融合，融合方式使得在得到的融合蛋白中保持其结合活性。可以纯化相互作用的结合配偶体，并且用于采用本领域常规实施的方法产生单克隆抗体。例如，可以通过本领域常规实施的方法，用放射性同位素¹²⁵I标记抗体。在非均相测定中，可以将例如GST-DNA破坏反应融合蛋白锚定于谷胱甘肽-琼脂糖珠。然后，可以以允许发生相互作用和结合的方式在测试化合物存在或不存在的条件下加入相互作用的结合配偶体。在反应结束时，可以洗去未结合的物质，可以将标记的单克隆抗体加入系统中，并且使其与复合的成分结合。可以通过测量保持与谷胱甘肽-琼脂糖珠缔合的放射性的量，检测DNA破坏反应基因蛋白和相互作用的结合配偶体之间的相互作用。测试化合物对相互作用的成功抑制，将导致测量的放射性减少。

或者，可以在不存在固体谷胱甘肽-琼脂糖珠的条件下，将GST-DNA破坏反应融合蛋白和相互作用的结合配偶体一起混合在液体中。可以在这些物质相互作用之时或之后加入测试化合物。然后，可以将该混合物加入谷胱甘肽-琼脂糖珠，洗去未结合的物质。同样，可以通过加入标记的抗体并且测量与珠缔合的放射性而检测DNA破坏反应基因产物/结合配偶体相互作用的抑制程度。

在另一种实施方案中，可以采用相应于DNA破坏反应蛋白和/或相互作用的结合配偶体的结合域的肽片段替代这两种全长蛋白中的一种或两种来使用这些技术(在结合配偶体是蛋白的情况下)。可以使用本领域常规实施的任何数目的方法来鉴定和分离结合位点。这些方法包括，但不限于，编码蛋白之一的基因的诱变和筛选共免疫沉淀测定中结合的破坏。然后可以选择编码复合物中第二种物质的基因中的补偿突变。编码各自蛋白的基因的序列分析将揭示相应于参与相互作用的结合中的蛋白的区域。或者，可以用本节中上文所描述的方法将一种蛋白锚定于固体表面，并且使其与其结合配偶体相互作用并结合，所述结合配偶体已经用蛋白水解酶，如胰蛋白酶处理。洗涤后，包含结合域的标记的短肽可以保持与固体材料缔合，其可以通过氨基酸测序分离并鉴定。同样，一旦获得了编码结合配偶体的基因，可以对短基因片段进行工程化以表达蛋白的肽片段，然后可以检测所述片段的结合活性，并且纯化或合成。

例如，但不是限制，可以按照本节中上文的描述，通过制备GST-DNA破坏反应融合蛋白并使其与谷胱甘肽琼脂糖珠结合而将DNA破坏基因产物锚定于固体材料。可以用放射性同位素，如35S标记相互作用的结合配偶体，并且用蛋白水解酶，如胰蛋白酶切割。然后可以将切割产物加入锚定的GST-DNA破坏反应融合蛋白，并且使结合发生。洗去未结合的肽后，可以通过公知方法洗脱代表结合配偶体结合域的标记的结合材料，纯化，并且分析氨基酸序列。可以合成产生如此鉴定的肽，或采用重组DNA技术与合适的易化蛋白融合。

5.4.4.2.筛选调节和/或增强DNA破坏剂的生长抑制作用的化合物

可以进一步筛选调节DNA破坏反应基因的表达和/或DNA破坏反应蛋白与其结合配偶体的相互作用的任何试剂，如5.4.4.1节鉴定的化合物、DNA破坏反应蛋白的抗体等调节和/或增强DNA破坏剂在细胞中的生长抑制作用的能力。可以将本领域公知的任何合适的增殖或生长抑制测定用于该目的。在一种实施方案中，将候选试剂和DNA破坏剂施用于细胞系的细胞，并且确定生长抑制作用的改变。优选地，用不同浓度的候选试剂与不同浓度DNA破坏剂的组合确定生长抑制作用的改变，以便确定导致50％抑制的候选试剂和DNA破坏剂的浓度的一种或多种组合，即，IC₅₀。

在一种优选实施方案中，用MTT增殖测定(参见，例如van deLoosdrechet，et al.，1994，J.Immunol.Methods 174：311-320；Ohnoet al.，1991，J.Immunol.Methods 145：199-203；Ferrari et al.，1990，J.Immunol.Methods 131：165-172；Alley et al.，1988，Cancer Res.48：589-601；Carmichael et al.，1987，Cancer Res.47：936-942；Gerlieret al.，1986，J.Immunol.Methods 65：55-63；Mosmann，1983，J.Immunological Methods 65：55-63)来筛选与DNA破坏剂组合用于抑制细胞生长的候选试剂。用选定浓度的候选试剂和DNA破坏剂处理细胞4-72小时。然后细胞与合适量的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)一起温育1-8小时，使得存活的细胞将MTT转化为不溶的甲的细胞内沉积物。除去上清液中包含的过量MTT后，加入合适的MTT溶剂，如DMSO溶液，以溶解甲然后通过确定570nm处的光密度，测量与存活细胞的数目成比例的MTT浓度。可以测定大量不同浓度的候选试剂，以便确定导致50％抑制的候选试剂和DNA破坏剂的浓度。

在另一种优选实施方案中，使用细胞增殖的alamarBlue^TM测定来筛选可以用于抑制细胞生长的一种或多种候选试剂(参见，例如Page etal.，1993，Int.J.Oncol.3：473-476)。alamarBlue^TM测定测量细胞呼吸，并且将其用作存活细胞数目的量度。增殖细胞的内环境比非增殖细胞的内环境具有更高的还原性。例如，在增殖过程中，NADPH/NADP，FADH/FAD，FMNH/FMN和NADH/NAF的比值增加。这些代谢中间产物可以还原alamarBlue，因此，可以用于监测细胞增殖。通过alamarBlue测量的处理的样品中的细胞数目可以表示为相对于未处理的对照样品中的细胞数目的百分比。

在一种特定实施方案中，进行alamarBlue^TM测定，以确定靶定DNA破坏反应基因的siRNA的转染滴度曲线是否由于选定浓度的DNA破坏剂，如喜树碱的存在而改变。用靶定DNA破坏反应基因的siRNA转染细胞。siRNA转染后4小时，在存在或不存在DNA破坏剂的条件下加入100微升/孔的DMEM/10％胎牛血清，将板在37℃和5％CO2的条件下温育68小时。从孔中除去培养基，并且用含有10％(vol/vol)alamarBlue^TM试剂(Biosource International Inc.，Camarillo，CA)和0.001体积的1M Hepes缓冲液组织培养试剂(Invitrogen)的DMEM/10％胎牛血清(Invitrogen)替换。将板在37℃温育2小时，然后采用Softmax Pro 3.1.2软件(MolecularDevices)在SpectraMax plus读板器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上，在570和600nm波长读数。将存在或不存在DNA破坏剂的条件下用一定滴度的靶定DNA破坏反应的siRNA转染的孔的还原百分比与荧光素酶siRNA转染的孔进行比较。不存在DNA破坏剂时对0nM荧光素酶siRNA转染的孔计算的％还原数值被认为是100％。

5.4.4.3.鉴定的化合物

在该筛选中鉴定的化合物包括证明了选择性调节细胞中DNA破坏反应基因表达和调节和/或增强DNA破坏剂的生长抑制作用的能力的化合物。这些化合物包括，但不限于，siRNA、反义分子、核酶、三螺旋、抗体和多肽分子、aptamrs和小有机或无机分子。

在该筛选中鉴定的化合物也包括调节DNA破坏反应与其它蛋白或分子的相互作用的化合物。在一种实施方案中，在该筛选中鉴定的化合物是调节DNA破坏反应蛋白与其相互作用配偶体的相互作用的化合物。在另一种实施方案中，在该筛选中鉴定的化合物是调节DNA破坏反应基因与转录调节剂的相互作用的化合物。

5.4.5.诊断

可以将多种方法用于诊断和预后性评估由于DNA破坏反应的调节缺陷导致的细胞对DNA破坏剂，如喜树碱的生长抑制作用的抗性，和用于鉴定具有对DNA破坏剂的生长抑制作用具有抗性的倾向的受试者。

在一种实施方案中，该方法包括确定细胞中DNA破坏反应基因表达水平，其中高于预定阈水平的表达水平表明细胞具有DNA破坏剂抗性。优选地，预定阈水平是DNA破坏反应基因的正常表达水平的至少2倍、4倍、8倍或10倍。在另一种实施方案中，本发明提供了评估细胞中的DNA破坏剂抗性的方法，包括确定细胞中由DNA破坏反应基因编码的蛋白的丰度水平，其中高于预定阈水平的丰度水平表明细胞具有DNA破坏剂抗性。在另一种实施方案中，本发明提供了评估细胞中的DNA破坏剂抗性的方法，包括确定哺乳动物细胞中由DNA破坏反应基因编码的蛋白的活性水平，其中高于预定阈水平的活性水平表明细胞具有DNA破坏剂抗性。优选地，丰度或活性的预定阈水平是DNA破坏反应蛋白的正常丰度或活性水平的至少2倍、4倍、8倍或10倍。

所述方法可以，例如，使用试剂如DNA破坏反应基因核苷酸序列和针对相互作用基因产物，包括其肽片段的抗体。具体地，所述试剂可以用于，例如(1)检测DNA破坏反应基因中突变的存在，或检测DNA破坏反应基因的mRNA相对于正常表达水平的超量表达或表达不足；和(2)检测DNA破坏反应基因产物相对于DNA破坏反应蛋白正常水平的超量丰度或丰度不足。

例如，可以通过使用包含此处描述的至少一种特异性DNA破坏反应基因核酸或抗DNA破坏反应抗体试剂的试剂盒进行此处描述的方法，所述方法可以方便地用于例如临床设置中，以诊断具有与DNA破坏反应基因相关的病症或异常的患者。

为了检测DNA破坏反应突变，可以将任何具核的细胞用作基因组核酸的起始来源。为了检测DNA破坏反应基因的表达或DNA破坏反应基因产物，可以使用表达了DNA破坏反应基因的任何细胞类型或组织。

基于核酸的检测技术描述于下文5.4.5.1节。肽检测技术描述于下文5.4.5.2节。

5.4.5.1.DNA破坏反应基因表达的检测

可以利用许多技术检测细胞或组织中DNA破坏反应基因的表达，例如DNA破坏反应基因转录物的细胞水平和/或突变的存在或缺乏。可以将来自任何具核细胞的核酸用作所述测定技术的起始点，并且可以根据本领域技术人员公知的标准核酸制备程序进行分离。例如，可以使用均包含DNA破坏反应基因中的核苷酸序列的一种或多种多核苷酸探针测量DNA破坏反应基因的表达水平，确定DNA破坏反应基因的表达水平。在本发明的特别优选的实施方案中，将该方法用于诊断人类癌症对采用DNA破坏剂的治疗的抗性。

可以将DNA用于生物样品的杂交或扩增测定中，以检测涉及DNA破坏反应基因的结构的异常，包括点突变、插入、缺失和染色体重排。所述测定可以包括，但不限于，Southern分析，单链构象多态性分析(SSCP)、DNA微阵列分析和PCR分析。

用于检测DNA破坏反应基因特异性突变的所述诊断方法可以包括，例如，接触并且温育包括重组DNA分子、克隆的基因或其简并变体的核酸，其获自样品，如衍生自具有一种或多种包括重组DNA分子、克隆的基因或其简并变体的标记的核酸试剂的患者样品或其它合适的细胞来源，接触和温育的条件有利于这些试剂与DNA破坏反应基因中与其互补的序列进行特异性退火。优选地，这些核酸试剂的长度是至少15-30个核苷酸。温育后，将所有未退火的核酸从核酸：DNA破坏反应分子杂交体中除去。然后检测进行了杂交的核酸的存在(如果存在任何所述分子)。采用所述检测方案，可以将来自目的细胞类型或组织的核酸固定在例如膜的固体支持物上，或固定在例如微量滴定板或聚苯乙烯珠的表面的塑料表面。在该情况下，在温育后，可以容易将未退火的标记的核酸试剂除去。用本领域技术人员公知的标准技术，完成了剩余的、退火的、标记的DNA破坏反应核酸试剂的检测。与核酸试剂退火的DNA破坏反应基因可以与从正常DNA破坏反应基因序列预计的退火模式进行比较，以便确定是否存在DNA破坏反应基因突变。

用于检测患者样品或其它合适的细胞来源中的DNA破坏反应基因特异性核酸分子的替代诊断方法可以包括它们的扩增，例如通过PCR扩增(在Mullis，K.B.，1987，美国专利No.4,683,202)，然后用本领域技术人员公知的技术检测扩增的分子。可以将得到的扩增序列与如果核酸扩增时仅仅含有正常拷贝的DNA破坏反应基因的情况下所预期的那些进行比较，以便确定是否存在DNA破坏反应基因突变。

在所述杂交和/或PCR分析优选的DNA破坏反应基因的核酸序列中，包括检测DNA破坏反应基因剪接位点突变存在的那些。

此外，可以进行公知的基因型分析技术，以鉴定携带DNA破坏反应基因突变的个体。所述技术包括，例如，使用限制片段长度多态性(RFLPs)，其包括使用的特异性限制酶的识别位点之一中的序列变异。

此外，已经描述了分析可以用于鉴定DNA破坏反应突变的DNA多态性的方法，所述方法利用限制酶位点之间不同数目的短串连重复DNA序列的存在。例如Weber(美国专利No.5,075,217，在此全文引入该文献作为参考)描述了(dC-dA)n-(dG-dT)n短串连重复序列区块中的基于长度多态性的DNA标记物。估计(dC-dA)n-(dG-dT)n区块的平均分隔是30,000-60,000bp。空间上紧密邻近的标记物表现出高频率共遗传，并且对鉴定诸如DNA破坏反应基因内的突变的基因突变和诊断与DNA破坏反应突变相关的疾病和病症特别有用。

Caskey等(美国专利No.5,364,759，在此全文引入该文献作为参考)描述了用于检测短的三和四核苷酸重复序列的DNA谱分析。该方法包括提取目的DNA，如DNA破坏反应基因，扩增提取的DNA，并且标记重复序列以形成个体DNA的基因型图谱。

也可以测定DNA破坏反应基因的表达水平。例如，可以分离并且利用如上文描述的杂交或PCR技术检验已知或怀疑表达DNA破坏反应基因的细胞类型或组织，如表现DNA破坏剂抗性的癌症细胞类型的RNA。分离的细胞可以衍生自细胞培养物或患者。取自培养物的细胞的分析可以是用作基于细胞的基因治疗技术的部分，或检验化合物对DNA破坏反应基因表达的作用的细胞评估中的必要步骤。所述分析可以揭示DNA破坏反应基因的表达模式的定量和定性方面，包括DNA破坏反应基因表达的激活或灭活。

在所述检测方案的一种实施方案中，从目的RNA分子合成cDNA分子(如，通过将RNA分子逆转录为cDNA)。然后将cDNA内的序列用作核酸扩增反应，如PCR扩增反应等使用的模板。用作该方法的逆转录和核酸扩增步骤中的合成起始试剂(如引物)的核酸试剂选自DNA破坏反应基因核酸试剂。所述核酸试剂的优选长度是至少9-30个核苷酸。为了检测扩增产物，可以用放射性或非放射性标记的核苷酸进行核酸扩增。或者，可以制备足够的扩增产物，使得可以通过使用任何合适的核酸染色方法，如，通过标准溴化乙锭染色显示产物。

此外，可以“原位”进行所述DNA破坏反应基因表达测定，即，直接对从活检物或切除物获得的患者组织的组织切片(固定和/冷冻的)进行测定，从而不必进行核酸纯化。可以将DNA破坏反应基因的核酸用作所述原位程序中的探针和/或引物(参见，例如Nuovo，G.J.，1992，″PCR In Situ Hybridization：Protocols And Applications″，Raven Press，NY)。

或者，如果可以获得足量的合适细胞，可以进行标准Northern分析，以确定DNA破坏反应基因的mRNA表达水平。

也可以用DNA微阵列技术评估细胞或组织中的DNA破坏反应基因表达，如DNA破坏反应转录物的细胞水平和/或突变的存在或缺乏。在所述技术中，可以将均包含DNA破坏反应基因的序列的一种或多种多核苷酸探针用于监测DNA破坏反应基因的表达。因此，本发明提供了包含多核苷酸探针的DNA微阵列，所述探针包含DNA破坏反应基因的序列。

可以将任何形式的DNA微阵列技术与本发明结合使用。在一种实施方案中，通过将DNA破坏反应基因的cDNA片段，如全长cDNA、ESTs等的PCR产物沉积在合适的表面上，制备斑点cDNA微阵列(参见，例如DeRisi et al.，1996，Nature Genetics 14：457-460；Shalon etal.，1996，Genome Res.6：689-645；Schena et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：10539-11286；和Duggan et al.，Nature GeneticsSupplement 21：10-14)。在另一种实施方案中，通过光刻技术在表面上原位合成含有与DNA破坏反应基因的序列互补的寡核苷酸的高密度寡核苷酸阵列(参见，例如，Fodor et al.，1991，Science 251：767-773；Pease et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：5022-5026；Lockhart et al.，1996，Nature Biotechnology 14：1675；McGall et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：13555-13560；美国专利Nos.5,578,832；5,556,752；5,510,270；5,858,659；和6,040,138)。该形式的微阵列技术对检测单核苷酸多态性(SNPs)特别有用(参见，例如Hacia et al.，1999，Nat Genet.22：164-7；Wang et al.，1998，Science280：1077-82)。在另一种实施方案中，通过喷墨技术在表面上原位合成含有与DNA破坏反应基因的序列互补的寡核苷酸的高密度寡核苷酸阵列(参见，例如Blanchard，1998年9月24日公开的国际专利申请公开WO 98/41531；Blanchard et al.，1996，Biosensors andBioelectronics 11：687-690；Blanchard，1998，in Synthetic DNA Arraysin Genetic Engineering，Vol.20，J.K.Setlow，Ed.，Plenum Press，New York at pages 111-123)。在另一种实施方案中，可以将允许进行电子严格性控制的DNA微阵列与包含DNA破坏反应基因的序列的多核苷酸探针结合使用(参见，例如美国专利No.5,849,486)。

5.4.5.2.DNA破坏反应基因产物的检测

可以按照此处的描述，将抗野生型或突变的DNA破坏反应基因产物或其保守变体或肽片段的抗体用作DNA破坏剂抗性的诊断和预后剂。可以将所述诊断方法用于检测DNA破坏反应基因的表达水平的异常，或DNA破坏反应基因产物的结构和/或产物的时间、组织、细胞或亚细胞定位的异常。

由于DNA破坏反应基因产物是细胞内的基因产物，下文描述的抗体和免疫测定方法在评估治疗DNA破坏反应基因的调节缺陷导致的病症，如增殖性疾病的效果的体外应用中具有重要性。如下文所述的抗体或抗体片段可以用于体外筛选可能的治疗化合物，以确定它们对DNA破坏反应基因表达和DNA破坏反应肽生产的作用。可以鉴定对DNA破坏反应的调节缺陷相关的病症具有有益作用的化合物，并且确定治疗有效剂量。

也可以使用例如体外免疫测定方法来评估对DNA破坏反应的调节缺陷相关的病症的基于细胞的基因治疗的效力。可以体外使用抗DNA破坏反应肽的抗体来确定在遗传工程化以产生DNA破坏反应肽的细胞中完成的DNA破坏反应基因表达水平。此处公开的证据表明，DNA破坏反应基因产物是细胞内基因产物，所述测定优选是用细胞裂解物或提取物进行的。所述分析使得能够确定获得体内疗效必须的转化细胞数目，以及优化基因替代方案。

待分析的组织或细胞类型通常包括已知或怀疑表达DNA破坏反应基因的那些，如，DNA破坏剂抗性癌症细胞类型。此处使用的蛋白分离方法可以是，例如，Harlow和Lane中描述的那些(Harlow，E.and Lane，D.，1988，″Antibodies：A Laboratory Manual″，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)，在此全文引入作为参考。分离的细胞可以衍生自细胞培养物或患者。取自培养物的细胞的分析可以用于检验化合物对DNA破坏反应基因表达的作用。

用于检测DNA破坏反应基因产物或其保守变体或肽片段的优选诊断方法可以包括，例如免疫测定，其中通过DNA破坏反应基因产物或其保守变体或肽片段与抗DNA破坏反应基因产物特异性抗体的相互作用对其进行检测。

例如，可以将结合DNA破坏反应蛋白的抗体或抗体片段用于对DNA破坏反应基因产物或其保守变体或肽片段的存在进行定量或定性检测。这可以通过例如使用与光学显微镜、流式细胞术、或荧光检测结合的荧光标记的抗体(参见该节下文)的免疫荧光技术完成。如果所述DNA破坏反应基因产物在细胞表面表达，所述技术是特别优选的。

用于本发明的抗体(或其片段)可以额外进行组织学使用，如用于免疫荧光或免疫电子显微镜，用于DNA破坏反应基因产物或其保守变体或肽片段的原位检测。可以通过从患者除去组织学标本，并且将其施用于本发明的标记的抗体，完成原位检测。优选通过将标记的抗体(或片段)覆盖到生物样品上而施用抗体(或片段)。通过使用所述程序，不仅可以确定DNA破坏反应基因产物或其保守变体或肽片段的存在，也可以确定其在受检组织中的分布。采用本发明，本领域技术人员将很容易认识到，可以改进多种组织学方法(如染色程序)中的任意一种，以完成所述原位检测。

DNA破坏反应基因产物或其保守变体或肽片段的免疫测定通常包括在能够鉴定DNA破坏反应基因产物或其保守变体或肽片段的可检测性标记的抗体存在下温育样品，如生物流体、组织提取物、新收获的细胞、或在细胞培养物中温育过的细胞的裂解物，并且通过本领域公知的任何技术检测结合的抗体。

可以使生物样品接触和固定在固相支持物或载体，如硝酸纤维素或其它能够固定细胞、细胞颗粒或可溶蛋白的固体支持物上。然后可以用合适的缓冲液洗涤支持物，随后用可检测性标记的DNA破坏反应蛋白特异性抗体处理。然后可以第二次用缓冲液洗涤固相支持物以除去未结合的抗体。然后可以通过常规方法检测固体支持物上的结合的标记物的量。

可以根据公知方法确定给定批次的抗DNA破坏反应基因产物抗体的结合活性。本领域技术人员能够通过常规实验确定每次测定的可操作和最优测定条件。

能够可检测性标记DNA破坏反应基因肽特异性抗体的途径之一是通过将其与酶连接，并且用于酶免疫测定(EIA)(Voller，A.，″TheEnzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)″，1978，DiagnosticHorizons 2：1-7，Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，MD)；Voller，A.et al.，1978，J.Clin.Pathol.31：507-520；Butler，J.E.，1981，Meth.Enzymol.73：482-523；Maggio，E.(ed.)，1980，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，FL，；Ishikawa，E.etal.，(eds.)，1981，Enzyme Immunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo)。与抗体结合的酶将与合适的底物，优选发色底物反应，反应方式使得产生能够通过例如分光光度、荧光法或通过肉眼观察方法检测的化学部分。可以用于检测性标记抗体的酶包括，但不限于，苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-5-甾体类异构酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油酯、脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。可以通过使用酶的发色底物的比色法完成检测。也可以通过肉眼比较与相似制备的标准物的底物的酶促反应程度，完成该检测。

也可以用多种其它免疫测定中的任意一种完成检测。例如，通过放射性标记抗体或抗体片段，可以通过使用放射免疫测定(RIA)检测DNA破坏反应肽(参见，例如Weintraub，B.，Principles ofRadioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques，The Endocrine Society，March 1986，在此引入作为参考)。可以通过诸如使用γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影的方法检测放射性同位素。

5.4.6.调节DNA破坏反应基因表达的方法

可以根据本发明，使用多种治疗方法体内调节DNA破坏反应基因的表达。例如，可以对siRNA分子工程化，并且用于在体内使DNA破坏反应基因沉默。也可以对反义DNA分子进行工程化，并用于体内阻断DNA破坏反应mRNA的翻译。或者，可以设计核酶分子，以体内切割和破坏DNA破坏反应mRNA。在另一种方案中，设计寡核苷酸以便与DNA破坏反应基因的5’区(包括编码序列上游的区)杂交，并且形成可以用于阻断或减少DNA破坏反应基因转录的三螺旋结构。如果需要，也可以设计寡核苷酸以便与负调节剂的结合位点杂交和形成三螺旋结构，以便阻断与负调节剂的结合并且增强DNA破坏反应基因的转录。

在一种优选实施方案中，设计siRNA、反义分子、核酶和三螺旋核苷酸以抑制一种或多种DNA破坏反应同工型的翻译或转录，并且对其它可能与DNA破坏反应基因共有一个或多个基序的其它基因的表达影响最小。为达到该目的，应该基于DNA破坏反应基因特有的相关序列设计所使用的寡核苷酸。

例如，但不是限制，寡核苷酸不应该落在DNA破坏反应基因的核苷酸序列与其基因的核苷酸序列同源性最高的区域。在反义分子的情况下，所述序列优选选自上文的列表。序列的长度优选是至少18个核苷酸，以便实现与靶mRNA序列的足够强的退火，从而阻止序列的翻译。Izant et al.，1984，Cell，36：1007-1015；Rosenberg et al.，1985，Nature，313：703-706。

本发明的核酶也包括RNA内切核酸酶(此后称作“Cech型核酶”)，如在Tetrahymena Thermophila中天然存在(称作IVS或L-19IVS RNA)，并且被Thomas Cech及其合作者充分描述的核酶(Zaug，et al.，1984，Science，224：574-578；Zaug and Cech，1986，Science，231：470-475；Zaug，et al.，1986，Nature，324：429-433；UniversityPatents Inc.的公开的国际专利申请No.WO88/04300；Been et al.，1986，Cell，47：207-216)。Cech内切核酸具有8个与靶RNA序列杂交的碱基对活性位点，在其后发生靶RNA的切割。

对于与DNA破坏反应基因的5’末端杂交并且与其形成三螺旋结构，并且可以用于阻断转录的寡核苷酸，它们优选与表达水平不受影响的其它DNA破坏反应相关基因中不存在的DNA破坏反应基因的5’末端的序列互补。所述序列也优选不包括DNA破坏反应启动子中甚至略微与所述其它基因同源的区域。可以通过本领域公知的多种方法施用前述化合物，包括，但不限于，使用脂质体作为送递载体。当处于抗降解形式时，也可以使用裸DNA或RNA分子，所述抗降解是通过修饰末端，通过形成环状分子，或通过使用更迭键，包括硫代磷酸酯键和硫代磷酰修饰的键。此外，可以通过促进转运而送递核酸，其中将核酸分子缀合于聚赖氨酸或转铁蛋白。也可以通过多种病毒载体，包括，但不限于逆转录病毒、痘苗病毒、AAV和腺病毒中的任意一种，将核酸转运到细胞中。

或者，可以构建编码或作为所述反义分子、核酶、三螺旋或DNA破坏反应基因核酸分子的重组核酸分子。该核酸分子可以是RNA或DNA。如果核酸编码RNA，该序列优选与调节元件可操作性连接，以便产生足够拷贝的需要的RNA产物。调节元件可以允许序列的组成型或调节型转录。可以在体内，即，在生物的细胞中将编码一种或多种RNA的转移载体，如细菌质粒或病毒RNA或DNA转染到细胞中。(如，Llewellyn et al.，1987，J.Mol.Biol.，195：115-123；Hanahanet al.1983，J.Mol.Biol.，166：557-580)。一旦位于细胞内，转移载体可以复制，并且由细胞聚合酶转录，以产生RNA，或者可以将其整合到宿主细胞的基因组。或者，可以通过微量操作技术，如微量注射，将包含编码一种或多种RNA的序列的转移载体转染到细胞中或导入细胞，使得转移载体或其部分整合到宿主细胞的基因组中。

RNAi也可以用于敲除DNA破坏反应基因的表达。在一种实施方案中，与从DNA破坏反应基因转录的mRNA的同源区杂交的21-23个核苷酸的双链RNA分子被用于降解mRNA，从而使DNA破坏反应基因的表达“沉默”。优选地，dsRNA具有杂交区，如，19个核苷酸的双链区，其与DNA破坏反应基因的编码序列的序列互补。可以将任何靶定DNA破坏反应基因，如人类STK6或TPX2基因的合适的编码序列的siRNA用于本发明。作为示例性的实施方案，根据标准选择规则(参见，例如Elbashir et al.，2002，Methods 26：199-213，在此全文引入作为参考)设计靶定DNA破坏反应基因的编码区的21个核苷酸的双链siRNA。

可以使用任何用于导入siRNA的标准方法。在一种实施方案中，通过给细胞呈递靶定DNA破坏反应基因的siRNA而诱导基因沉默(参见，例如，Elbashir et al.，2001，Nature 411，494-498；Elbashir et al.，2001，Genes Dev.15，188-200，在此全文引入所有上述文献作为参考)。siRNA可以化学合成，或者衍生自通过重组切割酶对双链RNA的切割。用于导入使DNA破坏反应基因沉默的双链DNA(dsRNA)的另一种方法是shRNA，即，短发夹RNA(参见，例如Paddison et al.，2002，Genes Dev.16，948-958；Brummelkamp et al.，2002，Science296，550-553；Sui，G.et al.2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，5515-5520，在此全文引入所有上述文献作为参考)。在该方法中，从质粒(或病毒)表达靶定DNA破坏反应基因的siRNA，其作为反向重复序列，具有间插的环序列以形成发夹结构。随后通过切割酶加工得到的含有发夹的RNA转录物，以产生用于沉默的siRNA。可以在细胞中稳定表达基于质粒的shRNA，使得在体外和体内都可以在细胞中进行长期基因沉默(参见，McCaffrey et al.2002，Nature 418，38-39；Xia et al.，2002，Nat.Biotech.20，1006-1010；Lewis et al.，2002，Nat.Genetics 32，107-108；Rubinson et al.，2003，Nat.Genetics 33，401-406；Tiscornia et al.，2003，Proc.AM.Acad.Sci.USA100，1844-1848，在此全文引入所有上述文献作为参考)。也可以将靶定DNA破坏反应基因的siRNA体内送递到哺乳动物，如人类的器官或组织中(参见，例如Song et al.2003，Nat.Medicine 9，347-351；Sorensen etal.，2003，J.Mol.Biol.327，761-766；Lewis et al.，2002，Nat.Genetics32，107-108，在此全文引入所有上述文献作为参考)。在该方法中，将siRNA的溶液静脉内注射到哺乳动物中。然后siRNA可以到达目的器官或组织，并且有效减少哺乳动物器官或组织中靶基因的表达。

5.4.7.调节DNA破坏反应蛋白的活性和/或其途径的方法

可以通过调节DNA破坏反应蛋白与其结合配偶体之间的相互作用而调节DNA破坏反应蛋白的活性。在一种实施方案中，可以用试剂，如抗体、aptamers、小有机或无机分子抑制所述结合配偶体的结合，以便调节DNA破坏剂抗性。在另一种实施方案中，可以用试剂，如抗体、aptamers、小有机或无机分子抑制DNA破坏反应蛋白调节途径中蛋白的活性，以便调节DNA破坏剂抗性。在一种实施方案中，使用激酶抑制剂，如Herbimycin、Gleevec、Genistein、Lavendustin、Iressa来调节DNA破坏反应蛋白激酶的活性。

5.4.8.通过靶定DNA破坏反应基因和/或其产物而进行癌症治疗

可以用上文所述调节DNA破坏反应表达和/或活性的方法和/或组合物与DNA破坏剂联合治疗患有癌症的患者。具体地，可以将所述方法和/或组合物与DNA破坏剂联合使用，用于治疗患有表现出DNA破坏反应介导的DNA破坏剂抗性的癌症的患者。所述疗法可以用于治疗癌症，包括，但不限于，横纹肌肉瘤、成神经细胞瘤和成胶质细胞瘤、小细胞肺癌、骨肉瘤、胰腺癌、乳腺和前列腺癌、鼠黑素瘤和白血病，以及B细胞淋巴瘤。

在优选实施方案中，本发明的方法和/或组合物与DNA破坏剂联合用于治疗患有表现出DNA破坏反应介导的DNA破坏剂抗性的癌症的患者。在所述实施方案中，调节DNA破坏反应表达和/或活性，以赋予癌细胞对DNA破坏剂的敏感性，从而赋予或增强DNA破坏剂治疗的有效性。

在联合治疗中，可以在施用DNA破坏剂之前、同时或之后施用一种或多种本发明的组合物。在一种实施方案中，在施用DNA破坏剂之前施用本发明的组合物。可以通过本领域技术人员熟悉的常规实验确定施用本发明的组合物和DNA破坏剂之间的时间间隔。在一种实施方案中，在DNA破坏反应蛋白水平达到需要的阈值之后给予DNA破坏剂。可以通过采用上文描述的任何技术确定DNA破坏反应蛋白的水平。

在另一种实施方案中，与DNA破坏剂同时施用本发明的组合物。

在另一种实施方案中，也在施用DNA破坏剂之后施用一种或多种本发明的组合物。当DNA破坏剂的半衰期长于治疗中使用的一种或多种本发明的组合物时，所述施用可以是特别有益的。

本领域技术人员可以理解，可以使用本发明的组合物和DNA破坏剂的不同施用时间的任意组合。例如，当DNA破坏剂的半衰期长于本发明的组合物时，优选在施用DNA破坏剂之前或之后施用本发明的组合物。

施用本发明的组合物的频率或间隔取决于需要的DNA破坏反应水平，可以通过上文描述的任何技术确定该水平。当DNA破坏反应蛋白水平改变为高于或低于需要的水平，可以增加或减少本发明的组合物的施用频率。

可以通过本领域公知的任何方法评估单独或与DNA破坏剂联合施用本发明的组合物的效果或益处，例如，通过基于测量存活率、副作用、DNA破坏剂的剂量要求或其任意组合的方法。如果本发明的组合物的施用在患者中实现了任意一种或多种益处，如增加存活率、减少副作用、降低DNA破坏剂的剂量要求，则认为本发明的组合物加强了DNA破坏剂治疗，并且认为该方法是有效的。

5.5.药物制剂和施用途径

可以以治疗有效剂量给患者施用确定影响STK6基因表达或基因产物活性的化合物，以治疗或改善与STK6调节缺陷相关的病症。治疗有效剂量是指足以导致细胞中KSPi抗性改善和/或增强KSP抑制剂的生长抑制作用的化合物的量。

5.5.1.有效剂量

可以通过标准药学方法在细胞培养物或实验动物中确定所述化合物的毒性和疗效，如确定LD₅₀(对群体的50％致死的剂量)和ED₅₀(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和疗效的剂量比是治疗指数，其表示为比值LD₅₀/ED₅₀。优选治疗指数大的化合物。尽管可以使用表现出毒性副作用的化合物，但必须小心设计将所述化合物靶定于受影响组织的位点的送递系统，以使对未受影响的细胞的损伤可能最小，从而减少副作用。

从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于定制用于人类的一定范围的剂量。所述化合物的剂量优选落在包括具有很少或不具有毒性的ED₅₀的循环浓度范围。剂量可以在该范围中改变，取决于使用的剂型和采用的施用途径。对于用于本发明方法的任何化合物，最初可以从细胞培养测定估计治疗有效剂量。可以在动物模型中定制剂量，以实现包括在细胞培养物中确定的IC50(即，实现症状最大抑制的一半的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。所述信息可以用来更准确确定人类中有用的剂量。例如，可以通过高效液相色谱测量血浆中的水平。

5.5.2.制剂和用途

可以根据常规方法，用一种或多种生理学可接受的载体或附形剂对根据本发明使用的药物组合物进行制剂化。

因此，可以对化合物及其生理学可接受的盐和溶剂合物进行制剂化，以便用于吸入或吹入(通过口或鼻)施用或通过口服、颊或直肠施用。

对于口服施用，药物组合物可以采用的形式是例如，通过常规方法，用药学可接受的附形剂，如粘合剂(如预凝胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(如马铃薯淀粉或乙醇酸淀粉钠)；或润湿剂(如十二烷基硫酸钠)制备的片剂或胶囊。可以用本领域公知的方法包被片剂。用于口服施用的液体制剂可以是以下形式，例如，溶液、糖浆或悬浮液，或它们可以作为干产品存在，在使用前用水或其它合适的附形剂配制。可以通过常规方法，采用药学可接受的添加剂制备所述液体制剂，所述添加剂如悬浮剂(如山梨糖醇浆、纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)；乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水附形剂(如杏仁油、油酯、乙醇或分级分离的植物油)；和防腐剂(如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。所述制剂也可以含有合适的缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。

用于口服施用的制剂可以适当制剂化，以得到活性化合物的受控释放。

对于经颊施用，组合物可以采取按照常规方式制剂化的片剂或锭剂形式。

对于吸入施用，根据本发明使用的化合物常规地以气溶胶喷雾形式，由加压包装或喷雾器送递，其中使用合适的推进剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压气溶胶的情况下，可以通过提供阀门而确定剂量单位，以送递计量的量。可以配制含有化合物和合适的粉基，如乳糖或淀粉的粉末混合物的用于吸入器或吹入器中的例如明胶的胶囊和药筒。

可以对化合物进行制剂化，用于通过注射，例如通过快速浓注或连续输注而肠胃外施用。用于注射的制剂可以存在于单位剂型，例如，在安瓿或多剂容器中，其中添加防腐剂。组合物可以是诸如油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳状液形式，并且可以含有制剂化试剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前用合适的载体，如无菌无热原的水配制。

也可以在直肠组合物，如栓剂或保留灌肠剂中对化合物进行制剂化，所述栓剂或保留灌肠剂例如可以含有常规的栓剂基，如可可酯或其它甘油酯。

除了前面描述的制剂，也可以将化合物制剂化为储存制剂。所述长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射而施用。因此，例如，可以用合适的聚合或疏水材料(例如作为可接受油中的乳状液)或离子交换树脂，或作为微溶衍生物，例如作为微溶盐对化合物制剂化。

如果需要，所述组合物可以存在于包装或分配装置中，所述装置可以包含含有活性成分的一个或多个单位剂型。包装可以例如包含金属或塑料箔，例如气泡包装。包装或分配装置中可以附有施用说明。

5.5.3.施用途径

合适的施用途径可以包括，例如口服、直肠、经粘膜、经皮、或肠道施用；肠胃外送递，包括肌内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。

或者，可以在局部施用化合物而不是以系统方式施用，例如，将化合物直接注射到受影响部位，通常以储存或持续释放制剂。

此外，可以在靶定的药物送递系统中，例如，在包被了受影响细胞的特异性抗体的脂质体中施用药物。将脂质体靶定于细胞，并且被细胞选择性摄取。

5.5.4.包装

如果需要，组合物可以存在于可以包含含有活性成分的一个或多个单位剂型的包装或分配装置中。包装可以例如包含金属或塑料箔，例如气泡包装。包装或分配装置中可以附有施用说明。也可以制备包含制剂化在相容的药学载体中的包含本发明化合物的组合物，将其置于合适的容器中，并且贴上用于治疗指出的适应症的标签。标签上指出的合适状况可以包括治疗疾病，如特征在于异常或过量STK6或DNA破坏反应基因表达或活性的那些。

6.实施例

以下实施例是为了说明本发明，不意欲以任何方式限制本发明。

6.1.实施例1：STK6和TPX2与KSP相互作用

该实施例说明了筛选siRNA文库中与KSP基因抑制剂相互作用的基因。CIN8是KSP的啤酒糖酵母同源物。CIN8的缺失突变体是可存活的，并且已经鉴定了CIN8不存在的条件下必须的(CIN8存在下则并非如此)许多基因(Geiser et al.，1997，Mol Biol Cell.8：1035-1050)。类似地，推断这些基因的人类同源物的破坏可能在亚最佳浓度的KSPi存在下比其不存在条件下对肿瘤细胞生长更具有破坏性。筛选含有据报道与CIN8协同致死的11种基因：CDC20、ROCK2、TTK、FZR1、BUB1、BUB3、BUB1B、MAD1L1、MAD2L1、DNCH1和STK6的同源物的siRNA的siRNA文库中的调节KSP抑制剂(1S)-1-{[(2S)-4-(2，5-二氟苯基)-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基]羰基}-2-甲基丙胺(EC₅₀约80nM)的作用的基因。靶定这11种基因的siRNA的序列列于表I。在存在或不存在＜EC10浓度(25nM)的(1S)-1-{[(2S)-4-(2，5-二氟苯基)-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基]羰基}-2-甲基丙胺的条件下将这些siRNA转染到HeLa细胞中。表I也列出了分别靶定荧光素酶、PTEN和KSP的siRNA的序列。

按如下进行siRNA转染：在转染前一天，将100微升选定的细胞，如在DMEM/10％胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)中生长至约90％汇合的宫颈癌HeLa细胞(ATCC，Cat.No.CCL-2)以1500细胞/孔种植在96孔组织培养板上(Corning，Coming，NY)。对于每次转染，将85微升OptiMEM(Invitrogen)与来自20微摩尔储液的5微升系列稀释的siRNA(Dharmacon，Denver)混合。对于每次转染，将5微升OptiMEM与5微升Oligofectamine试剂(Invitrogen)混合，并且在室温下温育5分钟。然后将10微升OptiMEM/Oligofectamine混合物与OptiMEM/siRNA混合物分配到每个试管中，混合，并且在室温下温育15-20分钟。将10微升转染混合物等分到96孔板的每个孔中，并且在37C和5％CO2的条件下温育4小时。

4小时后，加入100微升/孔的含有或不含有25nM(1S)-1-{[(2S)-4-(2，5-二氟苯基)-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基]羰基}-2-甲基丙胺的DMEM/10％胎牛血清，将板在37℃和5％CO2的条件下再温育68小时。用Alamar Blue测定法测量细胞生长(参见5.2节)。alamarBlue测定测量细胞呼吸，并且将测量值用作存活细胞数目的量度。增殖细胞的内环境比非增殖细胞的内环境具有更高的还原性。具体地，在增殖过程中，NADPH/NADP，FADH/FAD，FMNH/FMN和NADH/NAF的比值增加。这些代谢中间产物可以还原alamarBlue，因此，可以用于监测细胞增殖。在本实施例中，按照下文进行alamarBlue测定，以确定25nM KSP抑制剂(1S)-1-{[(2S)-4-(2，5-二氟苯基)-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基]羰基}-2-甲基丙胺的存在是否改变了STK6siRNA转染滴定曲线：转染后72小时，从孔中除去培养基，并且用含有10％(vol/vol)alamarBlue试剂(Biosource InternationalInc.，Camarillo，CA)和0.001体积的1M Hepes缓冲液组织培养试剂(Invitrogen)的DMEM/10％胎牛血清(Invitrogen)替换。将板在37℃温育2小时，然后采用Softmax Pro 3.1.2软件(MolecularDevices)在SpectraMax plus读板器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上，在570和600nm波长读数。含有样品的孔的％还原根据公式1确定。从含有样品的孔的％还原减去不含细胞的孔的％还原，以确定高于背景的％还原。将存在或不存在25nM(1S)-1-{[(2S)-4-(2，5-二氟苯基)-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基]羰基}-2-甲基丙胺的条件下用一定滴度的STK6siRNA转染的孔的还原百分比与靶定荧光素酶的siRNA转染的孔进行比较。不存在(1S)-1-{[(2S)-4-(2，5-二氟苯基)-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基]羰基}-2-甲基丙胺时对0nM荧光素酶siRNA转染的孔计算的％还原数值被认为是100％。

在(1S)-1-{[(2S)-4-(2，5-二氟苯基)-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基]羰基}-2-甲基丙胺存在下，靶定STK6(STK6-1、STK6-2和STK6-3)的三种siRNA表现出抑制肿瘤细胞生长。在三者中，STK6-1在最初的筛选中表现出最强的生长抑制活性。为了研究该生长抑制活性是由于siRNA的中靶还是脱靶活性，使用靶定STK6的三种额外的siRNA，并且评估所有6种siRNA诱导STK6沉默和生长抑制的能力。在STK6沉默水平和生长抑制之间存在良好的相关性(图1)。该相关性表明生长抑制是由于中靶活性(即，STK6破坏)。然后在(1S)-1-{[(2S)-4-(2，5-二氟苯基)-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基]羰基}-2-甲基丙胺存在或不存在的条件下，滴定STK6-1和荧光素酶的对照siRNA(阴性对照)(图2)。KSPi的添加将STK6-1剂量反应曲线向左移动了约5-10倍。KSPi的该浓度没有增强由荧光素酶siRNA导致的对细胞生长的作用。相反，对靶定PTEN的siRNA的剂量反应曲线没有被KSPi移动，所述PTEN与STK-6对细胞生长具有相似的作用。其它STK6的siRNA也增强KSPi对细胞生长的作用。由此，KSP的破坏增强了STK6siRNA对细胞生长的作用。通过采用STK6和KSP的siRNA的组合的研究，获得了对此的进一步支持，所述组合表现出比任一单独的siRNA更强的生长抑制活性。由于用于这些实验中的KSPi浓度自身不影响细胞生长，KSPi对STK6siRNA活性的作用表现为协同的，而不是叠加的。

人类STK6和KSP之间的相互作用与这些基因在非洲爪蟾中的生理学相互作用的证据一致(Giet et al.，1999，J Biol Chem.274：15005-5013)。具体地，STK6和KSP的非洲爪蟾同源物共同定位在有丝分裂纺锤体极，并且通过免疫沉淀，蛋白表现出分子缔合。此外，KSP是STK6的底物。

STK6siRNA的生长抑制表明该基因对肿瘤细胞生长是必须的，并且支持STK6是抗肿瘤靶的研究。表明STK6抑制剂和KSPi之间的协同致死相互作用的数据表明，用这些化合物进行联合治疗，可能比用任何单独的化合物进行治疗更有效。STK6通常在人类肿瘤中超量表达，包括预后不良的乳腺癌(van′t Veer et al.，2002，Nature.2002415：530-536)。STK6的扩增与对紫杉醇的抗性有关(Anand et al.，2003，Cancer Cell.3：51-62)。由于KSPi和紫杉醇影响相同的靶(有丝分裂纺锤体)，STK6的超量表达同样可以降低KSPi的有效性。该可能性与表明KSPi和STK6的抑制剂之间的相互作用的结果一致，并且应该在KSPi的临床开发过程中进行研究。例如，KSPi可能在预后不良的乳腺癌患者中没有最佳效果，因为这些肿瘤倾向于超量表达STK6。

图17示出了对KSPi敏感的基因的筛选结果。结果表明TPX2也与KSP相互作用。用于使TPX2沉默的siRNA序列也列于表I。

表I siRNA的列表

STK6-1	GCACAAAAGCUUGUCUCCATT(SEQ ID NO：1)
STK6-1	GCACAAAAGCUUGUCUCCATT(SEQ ID NO：1)	STK6-2	UUGCAGAUUUUGGGUGGUCTT(SEQ ID NO：2)
STK6-3	ACAGUCUUAGGAAUCGUGCTT(SEQ ID NO：3)	STK6-2	UUGCAGAUUUUGGGUGGUCTT(SEQ ID NO：2)
STK6-3	ACAGUCUUAGGAAUCGUGCTT(SEQ ID NO：3)	STK6-4	CCUCCCUAUUCAGAAAGCUTT(SEQ ID NO：4)
STK6-5	GACUUUGAAAUUGGUCGCCTT(SEQ ID NO：5)	STK6-4	CCUCCCUAUUCAGAAAGCUTT(SEQ ID NO：4)
STK6-5	GACUUUGAAAUUGGUCGCCTT(SEQ ID NO：5)	STK6-6	CACCCAAAAGAGCAAGCAGTT(SEQ ID NO：6)
ROCK2-1	AACCAGUCUAUUAGACGGCTT(SEQ ID NO：7)	STK6-6	CACCCAAAAGAGCAAGCAGTT(SEQ ID NO：6)
ROCK2-1	AACCAGUCUAUUAGACGGCTT(SEQ ID NO：7)	ROCK2-2	GUGACUCUCCAUCUUGUAGTT(SEQ ID NO：8)
ROCK2-3	GUGGCCUCAAAGGCACUUATT(SEQ ID NO：9)	ROCK2-2	GUGACUCUCCAUCUUGUAGTT(SEQ ID NO：8)
ROCK2-3	GUGGCCUCAAAGGCACUUATT(SEQ ID NO：9)	CDC20-1	CCCAUCACCUCAGUUGUUUTT(SEQ ID NO：10)
CDC20-2	GACCUGCCGUUACAUUCCUTT(SEQ ID NO：11)	CDC20-1	CCCAUCACCUCAGUUGUUUTT(SEQ ID NO：10)
CDC20-2	GACCUGCCGUUACAUUCCUTT(SEQ ID NO：11)	CDC20-3	GGAGAACCAGUCUGAAAACTT(SEQ ID NO：12)
TTK-1	AUGCUGGAAAUUGCCCUGCTT(SEQ ID NO：13)	CDC20-3	GGAGAACCAGUCUGAAAACTT(SEQ ID NO：12)
TTK-1	AUGCUGGAAAUUGCCCUGCTT(SEQ ID NO：13)	TTK-2	ACAACCCAGAGGACUGGUUTT(SEQ ID NO：14)
TTK-3	UAUGUUCUGGGCCAACUUGTT(SEQ ID NO：15)	TTK-2	ACAACCCAGAGGACUGGUUTT(SEQ ID NO：14)
TTK-3	UAUGUUCUGGGCCAACUUGTT(SEQ ID NO：15)	FZR1-1	CCAGAUCCUUGUCUGGAAGTT(SEQ ID NO：16)
FZR1-2	CGACAACAAGCUGCUGGUCTT(SEQ ID NO：17)	FZR1-1	CCAGAUCCUUGUCUGGAAGTT(SEQ ID NO：16)
FZR1-2	CGACAACAAGCUGCUGGUCTT(SEQ ID NO：17)	FZR1-3	GAAGCUGUCCAUGUUGGAGTT(SEQ ID NO：18)
BUB1-1	CUGUAUGGGGUAUUCGCUGTT(SEQ ID NO：19)	FZR1-3	GAAGCUGUCCAUGUUGGAGTT(SEQ ID NO：18)
BUB1-1	CUGUAUGGGGUAUUCGCUGTT(SEQ ID NO：19)	BUB1-2	ACCCAUUUGCCAGCUCAAGTT(SEQ ID NO：20)
BUB1-3	CAGACUCCAUGUUUGCAGUTT(SEQ ID NO：21)	BUB1-2	ACCCAUUUGCCAGCUCAAGTT(SEQ ID NO：20)
BUB1-3	CAGACUCCAUGUUUGCAGUTT(SEQ ID NO：21)	BUB3-1	UACAUUUGCCACAGGUGGUTT(SEQ ID NO：22)
BUB3-2	CAAUUCGUACUCCCCAAUGTT(SEQ ID NO：23)	BUB3-1	UACAUUUGCCACAGGUGGUTT(SEQ ID NO：22)
BUB3-2	CAAUUCGUACUCCCCAAUGTT(SEQ ID NO：23)	BUB3-3	AGCUGCUUCAGACUGCUUCTT(SEQ ID NO：24)
MAD1L1-1	GACCUUUCCAGAUUCGUGGTT(SEQ ID NO：25)	BUB3-3	AGCUGCUUCAGACUGCUUCTT(SEQ ID NO：24)
MAD1L1-1	GACCUUUCCAGAUUCGUGGTT(SEQ ID NO：25)	MAD1L1-2	AGAGCAGAGCAGAUCCGUUTT(SEQ ID NO：26)
MAD1L1-3	CCAGCGGCUCAAGGAGGUUTT(SEQ ID NO：27)	MAD1L1-2	AGAGCAGAGCAGAUCCGUUTT(SEQ ID NO：26)
MAD1L1-3	CCAGCGGCUCAAGGAGGUUTT(SEQ ID NO：27)	MAD2L2-1	CCAUGACGUCGGACAUUUUTT(SEQ ID NO：28)
MAD2L2-2	GUGCUCUUAUCGCCUCUGUTT(SEQ ID NO：29)	MAD2L2-1	CCAUGACGUCGGACAUUUUTT(SEQ ID NO：28)
MAD2L2-2	GUGCUCUUAUCGCCUCUGUTT(SEQ ID NO：29)	MAD2L2-3	ACGCAAGAAGUACAACGUGTT(SEQ ID NO：30)
DNCH1-1	GCAAGUUGAGCUCUACCGCTT(SEQ ID NO：31)	MAD2L2-3	ACGCAAGAAGUACAACGUGTT(SEQ ID NO：30)
DNCH1-1	GCAAGUUGAGCUCUACCGCTT(SEQ ID NO：31)	DNCH1-2	UGGCCAGCGCUUACUGGAATT(SEQ ID NO：32)
DNCH1-3	GGCCAAGGAGGCGCUGGAATT(SEQ ID NO：33)	DNCH1-2	UGGCCAGCGCUUACUGGAATT(SEQ ID NO：32)
DNCH1-3	GGCCAAGGAGGCGCUGGAATT(SEQ ID NO：33)	BUB1B-1	AUGACCCUCUGGAUGUUUGTT(SEQ ID NO：34)
BUB1B-2	UGCCAAUGAUGAGGCCACATT(SEQ ID NO：35)	BUB1B-1	AUGACCCUCUGGAUGUUUGTT(SEQ ID NO：34)
BUB1B-2	UGCCAAUGAUGAGGCCACATT(SEQ ID NO：35)	BUB1B-3	GAAAGAACAGGUGAUCAGCTT(SEQ ID NO：36)
荧光素酶	CGUACGCGGAAUACUUCGATT(SEQ ID NO：37)	BUB1B-3	GAAAGAACAGGUGAUCAGCTT(SEQ ID NO：36)
荧光素酶	CGUACGCGGAAUACUUCGATT(SEQ ID NO：37)	KSP-1	CUGGAUCGUAAGAAGGCAGTT(SEQ ID NO：38)
KSP-2	GGACAACUGCAGCUACUCUTT(SEQ ID NO：39)	KSP-1	CUGGAUCGUAAGAAGGCAGTT(SEQ ID NO：38)
KSP-2	GGACAACUGCAGCUACUCUTT(SEQ ID NO：39)	PTEN-1	UGGAGGGGAAUGCUCAGAATT(SEQ ID NO：40)
PTEN-2	UAAAGAUGGCACUUUCCCGTT(SEQ ID NO：41)	PTEN-1	UGGAGGGGAAUGCUCAGAATT(SEQ ID NO：40)
PTEN-2	UAAAGAUGGCACUUUCCCGTT(SEQ ID NO：41)	PTEN-3	AAGGCAGCUAAAGGAAGUGTT(SEQ ID NO：42)
TPX2	UACUUGAAGGUGGGCCCAUTT(SEQ ID NO：1237)	PTEN-3	AAGGCAGCUAAAGGAAGUGTT(SEQ ID NO：42)
TPX2	UACUUGAAGGUGGGCCCAUTT(SEQ ID NO：1237)	TPX2	GAAAUCAGUUGCUGAGGGCTT(SEQ ID NO：1238)
TPX2	ACCUAGGACCGUCUUGCUUTT(SEQ ID NO：1239)	TPX2	GAAAUCAGUUGCUGAGGGCTT(SEQ ID NO：1238)

6.2实施例2：用shRNA和siRNA进行协同致死筛选

本实施例说明，同时使CHEK1和TP53进行RNAi介导的沉默，导致了人类肿瘤细胞中的协同致死作用。

两个问题限制了用RNAi方法进行协同致死筛选的潜能。首先，协同致死作用的证明需要在倾向于第一命中基因缺失或突变的细胞中观察到确定的基因破坏诱导的致死表型，而在仅仅含有野生型等位基因或蛋白的细胞中则观察不到。因此，对于高度对照的实验，需要用除了第一命中基因破坏之外同基因的匹配的细胞系对测定协同致死作用。对于大多数可获得的肿瘤细胞系，所述匹配的细胞系对无法获得。其次，通过使用双重siRNA转染在细胞中产生两个基因破坏的尝试受到了靶定不同mRNA的siRNA彼此竞争的观察结果的阻碍，有效降低了使用的一种或两种siRNA的效力。本实施例中表明，可以通过使用破坏第一命中基因的shRNA的稳定体内送递和靶定第二基因的siRNA的超转染，实现双重RNAi筛选。该方法提供了匹配的(同基因的)细胞系对(加或减shRNA)，并且不导致shRNA和siRNA之间的竞争。在本实施例中，建立了克隆细胞系，其中初级基因靶被短发夹RNA(shRNA)的稳定表达沉默。用靶定其它基因的siRNA对这些克隆的瞬时转染(超转染)没有明显影响shRNA导致的初级靶沉默，shRNA也没有影响siRNA导致的靶沉默。用该方法证明了低浓度DNA破坏剂阿霉素存在下TP53(p53)和关卡激酶CHEK1之间的协同致死作用。

可以通过瞬时转染送递合成的双链小干扰RNA(siRNA)或从瞬时导入或稳定整合到基因组中的重组载体在细胞内表达短发夹RNA(shRNA)，从而实现RNA干扰(参见，例如Paddison et al.，2002，Genes Dev 16：948-958；Sui et al.，2002，Proc Natl Acad Sci USA 99：5515-5520；Yu et al.，2002，Proc Natl Acad Sci U S A 99：6047-6052；Miyagishi et al.，2002，Nat Biotechnol 20：497-500；Paul et al.，2002，Nat Biotechnol 20：505-508；Kwak et al.，2003，J Phannacol Sci 93：214-217；Brummelkamp et al.，2002，Science 296：550-553；Bodenetal.，2003，Nucleic Acids Res 31：5033-5038；Kawasaki et al.，2003，Nucleic Acids Res 31：700-707)。使用编码嘌呤霉素抗性标记物并且驱动从H1(RNA Pol III)启动子表达shRNA的pRETRO-SUPER(pRS)载体。pRS-TP531026shRNA质粒从NKI文库质粒集合解卷积，这是通过用该集合转化细菌，并且寻找仅仅含有感兴趣的质粒的克隆。所使用的序列如下：pRS-p53 1026 19聚体序列：GACTCCAGTGGTAATCTAC(SEQ ID NO：43)；序列特异性PCR的引物：正向：GTAGATTACCACTGGAGTC(SEQ ID NO：44)，反向：CCCTTGAACCTCCTCGTTCGACC(SEQ ID NO：45)。通过序列特异性PCR鉴定质粒，并且通过测序进行证实。通过用带有pRS-TP53 1026质粒的FuGENE 6(Roche)转染HCT116细胞，制备稳定的p53克隆。48小时后将细胞分配到加有1ug/ml嘌呤霉素的10cm培养皿中，维持直到集落明显(5-7天)。将克隆挑选到96孔板，在1ug/ml嘌呤霉素中维持，并且使用TP53和hGUS Pre-Developed测定试剂(AppliedBiosystems)，通过TaqMan检验敲除。为了通过pRS-TP53 1026质粒测量瞬时敲除，用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染HCT116细胞，在24小时后收获RNA。通过TaqMan评估TP53水平。

来源于结肠肿瘤细胞系HCT116的多个嘌呤霉素抗性TP53shRNA克隆(pRS-p53)的分析表明不同水平的靶沉默(50％-96％)。图3表明克隆A5和A11中的TP53表达水平，所述克隆表现出最高水平的沉默。这些克隆中的TP53沉默超过了通过瞬时转染将pRS-p53送递到HCT116细胞后24小时观察到的沉默(图3)。转染效率可能限制TP53shRNA在瞬时转染中的有效性。或者，具有更高TP53沉默水平的细胞在克隆生长过程中获得了生长优势。采用靶定STK6的shRNA(pRS-STK6：pRS-STK6 2178 19聚体序列：CATTGGAGTCATAGCATGT(SEQ ID NO：46))，也观察到了稳定克隆中的一定范围的沉默。但是，这些克隆没有达到与TP53细胞系中观察到的一样高程度的沉默，其沉默也不超过在瞬时测定中获得的沉默。这可能表示抗高水平STK6沉默的选择，因为STK6是培养物中的肿瘤细胞生长的必须基因。

为了检验HCT116克隆中的TP53沉默是否与siRNA竞争，用CHEK1特异性siRNA的集合超转染该克隆的细胞。CHK1集合含有以下三种siRNA：CUGAAGAAGCAGUCGCAGUTT(SEQ ID NO：99)；AUCGAUUCUGCUCCUCUAGTT(SEQID NO：98)；和UGCCUGAAAGAGACUUGUGTT(SEQ ID NO：100)。发现该siRNA集合竞争性降低TP53靶定的siRNA的沉默活性。示出了用10nM或100nM Oligofectamine(Invitrogen)转染的siRNA。对于CHK1集合，以33.3nM同时转染三种siRNA，总共送递100nM。在转染后24小时收获RNA，并且使用CHK1或TP53和hGUS Pre-Developed测定试剂(AppliedBiosystems)，通过TaqMan分析评估敲除。如图4A所示，shRNA和siRNA集合不竞争性抑制每种其它靶的沉默。然后测定由相同序列的瞬时转染的siRNA或稳定表达的shRNA的已知竞争性siRNA导致的抑制。如图4B所示，三种单独的靶定KNSL1(KNSLI210：GACCUGUGCCUUUUAGAGATT(SEQ ID NO：47)；KNSLI211：GACUUCAUUGACAGUGGCCTT(SEQ ID NO：48)；KNSLI212：AAAGGACAACUGCAGCUACTT(SEQ ID N0：49))的siRNA竞争性抑制由靶定STK6的共转染的siRNA达到的沉默(左边的柱)。相反，稳定转染的细胞系中同源STK6shRNA导致的沉默不受KNSL1siRNA的超转染的影响，即使以高10倍的浓度加入竞争剂siRNA时也是如此(中间和右边的柱)。这些实验表明，在稳定表达的shRNA和瞬时转染的siRNA之间几乎没有竞争。这与一起转染彼此竞争的、靶定不同mRNA的两种不同siRNA时的观察结果相反，其中有效降低了使用的一种或两种siRNA的效率。用大约800种基因的siRNA集合瞬时转染pRS和pRS-p53HCT116细胞(参见下文实施例3)，并且通过Alamar Blue测定法测量对细胞生长的作用。观察到了对pRS细胞和pRS-p53细胞中所述大约800种siRNA的集合的几乎相同的反应，没有显示沉默的竞争性抑制。

随后，评估CHEK1siRNA集合在稳定表达TP53shRNA的细胞中的超转染，以确定是否可以将其用于研究这些分子之间的遗传相互作用(SL)。以前已经推测了这种相互作用，但是由于缺乏对推断脱靶作用具有足够特异性的试剂或基因敲除，阻碍了其确切的证明。通过选择含有空pRS载体或pRS-p53的A549肺癌细胞系而制备匹配的细胞系+/-TP53表达。后一种细胞表现出＞90％的TP53mRNA沉默。然后用对照荧光素酶siRNA(luc，100nM)或CHEK1siRNA集合(总共100nM；3种siRNA的每一种33nM)超转染两种细胞系，在暴露或不暴露于DNA破坏剂阿霉素(Dox，图5)的情况下检验它们的细胞周期谱。在缺乏Dox的情况下，pRS-p53细胞的细胞周期谱没有明显不同于pRS细胞的细胞周期谱。CHEK1siRNA的瞬时转染也没有影响不存在Dox情况下的细胞周期谱。但是，在Dox存在的情况下，如对表达功能性TP53的细胞所预期的，pRS转染的细胞表现出了G1和G2/M停滞。CHEK1siRNA的超转染导致了越过G2关卡，并且在G1阻断的细胞数目增加。因为细胞保留TP53功能，它们在G1期停滞并且不回到S期。

相反，pRS-p53细胞失去了在G1停滞的能力，并且主要反应于Dox处理而在G2期停滞，这与TP53在G1关卡的作用一致。通过lucsiRNA超转染发现pRS-p53细胞的细胞周期谱没有改变(图5)。lucsiRNA甚至没有导致TP53反应的部分恢复(以及G1峰的相应增加)，表明该siRNA几乎没有产生对TP53沉默和表型的竞争性抑制。因此，预计不存在CHEK1siRNA集合导致的TP53沉默的竞争性抑制。实际上，反应于Dox处理，用CHEK1瞬时转染的pRS-p53细胞在它们的细胞周期谱表现出了显著改变，在S期的细胞比例显著增加，并且具有亚G1(死细胞)量的DNA。在pRS和pRS-p53稳定转染的HCT116细胞种也观察到了相似的发现。因此，由TP53介导的G1关卡和CHEK1介导的G2关卡的同时破坏，对TP53-肿瘤细胞是致死的，但对TP53+肿瘤细胞不是致死的。

转染的siRNA不竞争性抑制稳定表达的shRNA导致的沉默，这一发现是出乎意料的。目前还不清楚为什么siRNA竞争性交叉抑制沉默，而shRNA和siRNA则并非如此。这可能提示，这两种类型的RNA在生物化学上不同的步骤进入RNAi途径。

6.3.实施例3：增强或减弱DNA破坏剂导致的细胞杀伤的基因

本实施例说明了一种用于鉴定增强或减弱DNA破坏剂导致的细胞杀伤的基因的半自动化siRNA筛选。半自动化平台使得能够用小干扰RNA(siRNA′s)进行丧失功能的(loss-of-function)RNAi筛选。将靶定大约800种人类基因的siRNA的文库用于鉴定DNA破坏剂阿霉素(Dox)、喜树碱(Campto)和顺铂(Cis)的增强剂。在每次筛选中，鉴定了许多基因(“命中物”)，其破坏使细胞对化疗剂的细胞杀伤敏感。(参见表IIIA-C)。这些命中物中的一些(如WEE1)提示增强常用化疗剂活性的新靶；其它命中物(BRCA1，BRCA2)提示用于遗传确定这些基因的突变导致的癌症的新疗法。

为了在人类细胞中进行基因筛选，组建了siRNA双链体的文库。该文库的一种形式靶定大约800种基因，每种基因采用三种siRNA。该文库扩展至靶定大约2,000种基因，进一步扩展至靶定＞7,000种基因(2-3种siRNA/基因)。该文库包含靶定来自“可作为药物的(druggable)基因组”的基因(即以前用小分子小分子作为药物的基因或基因家族)的siRNA。该文库也包含靶定来自“膜组”(膜蛋白)的基因的siRNA，以促进鉴定治疗抗体的潜在靶。表IIIA-C列出了该实施例中使用的siRNA的部分的序列。为了促进用该文库进行大规模siRNA筛选，开发了半自动化平台。在转染前合并靶定相同基因的三种不同siRNA(总siRNA浓度为100nM)。可以由一个人在小于4小时的时间内将双份的完整文库转染到细胞中。每个siRNA集合通常在单个实验中检验2-4次，每次实验通常由不同个体重复至少2次。在不同日或由不同人进行的筛选达到了实现的可重复性。

筛选的目的是鉴定使细胞对常用的癌症化疗剂Dox、Campto和Cis敏感的靶。Dox(亚德里亚霉素)抑制拓扑异构酶II(TopoII)的活性。TopoII主要在细胞周期的G2和M期起作用，并且对解开DNA结构以便进行染色体的正确包装和分离很重要。Campto抑制拓扑异构酶I(TopoI)。TopoI在S期起作用，以释放前进中的DNA聚合酶复合物的扭应力。将Campto加入复制中的细胞，导致复制叉停顿和DNA链断裂。Cis导致DNA加合物和链交联。Cis和Campto处理都导致复制叉停滞和可能的复制叉断裂，导致dsDNA断裂和细胞死亡。

用每一种试剂进行的初级筛选是在TP53缺陷的HeLa细胞中进行的。用siRNA集合转染HeLa细胞，4小时后加入药物。进行初步实验以确定使用的每种药物的浓度；通常这是导致10％-20％生长抑制所需要的量(EC10或EC20)。在转染后72小时评估+/-药物的细胞的生长。

用Cis进行筛选的结构示于图6中。表IIA示出了通过平均超过400ng/ml和500ng/ml的cis浓度的顺铂导致的敏化倍数。该图表示了不存在药物的情况下用siRNA集合转染的细胞的生长百分比(log换算)(X轴)与存在药物的情况下的生长百分比(Y轴)。某些基因的敲除使得对药物治疗敏化，其在对角线以下，而某些基因的敲除介导对药物的抗性，其在对角线以上。靶定BRCA2的siRNA集合导致＞10倍的对Cis的敏化。BRCA1的siRNA集合导致＞3倍的敏化。靶定激酶WEE1和EPHB3的siRNA也导致对Cis的＞3倍的敏化。总共15种基因导致＞2倍的敏化。在相似的筛选中，在每次Dox和Campto筛选中鉴定了约50种导致对药物的＞2倍的敏化的基因(参见表IIb-C)。不同基因的组间的重叠在下文中讨论。

重要的是指出该筛选的设计是为了发现药物活性的增强剂。由于使用的药物浓度对细胞生长产生非常少的作用，药物的阻抑剂将也对细胞生长产生非常少的作用。这样，如所预期的，我们观察到了非常少的基因，所述基因的破坏阻抑了药物活性。一个显著的例外是靶定马球样激酶PLK的siRNA，其在Cis存在下活性较低。这可能反映了DNA破坏和PLK破坏都导致细胞周期停滞的事实。当前一种治疗诱导了细胞周期停滞时，后一种治疗的疗效较低。

为了显示导致对不同药物敏化的基因之间的重叠，我们比较了不同试剂的细胞生长-/+药物(敏化倍数)的比(图7)。比较导致对Dox敏化和对Cis敏化的基因(图7，左侧)，发现某些基因如WEE1激酶的siRNA，使细胞对两种试剂的杀伤敏感。相反，仅仅用靶定乳腺癌易感基因BRCA2的siRNA观察到了细胞对Cis杀伤的强敏化(＞10倍)。比较导致对Campto敏化和对Cis敏化的基因(图2，右侧)，发现用两种治疗时相同的评分最高的基因(BRCA2、BRCA1、EPHB3、WEE1和ELK1)。

WEE1破坏导致对所有三种试剂敏化的观察结果提示，该激酶调节对所有试剂共有的DNA破坏反应。生物化学中，人类WEE1通过保护细胞核免受细胞质激活的CDC2激酶破坏，协调DNA复制和有丝分裂之间的转变(Heald et al.，1993，Cell 74：463-474)。其它研究提示WEE1是在细胞周期的G2期起作用的DNA修复关卡的成分。由于大多数人类肿瘤是TP53缺陷的，它们缺乏主要在G1期起作用的TP53调节的关卡，因此比表达TP53的正常组织更依赖于其它关卡(即，它们具有正常的关卡冗余)。一起考虑可获得数据，表明WEE1提供用于治疗TP53缺陷肿瘤的治疗靶，所述肿瘤的存活依赖于G2关卡完整性。实际上，报道了WEE1的小分子抑制剂作为TP53缺陷细胞的放射致敏剂(即，使细胞对放射诱导的细胞死亡敏感)，但该化合物导致的敏化程度是中度的(Wang et al.，2001，Cancer Res.61：8211-7)。检验了来自这些在肿瘤细胞关卡功能中的筛选的“命中物”在其它范围中敏化细胞杀伤的能力：例如，通过在其它肿瘤类型和匹配的细胞+/-TP53功能中使用其它DNA破坏剂。

对Cis和Campto敏化的基因中的重叠与这些药物的作用机制一致。它们都靶定S期，并且最终使复制叉的进展停顿，导致dsRNA断裂物的形成。相反，Dox主要在细胞周期的G2/M期起作用。这样，通过BRCA1和BRCA2对Campto和Cis的敏化可能代表基于S期特异性机制的敏化。这些结果与对DNA破坏途径中BRCA1和BRCA2的作用的研究得到的数据一致(D′Andrea et al.，2003，Nat Rev Cancer3：23-34)。实际上，现在已知这两种基因都在与先天性全血细胞减少症相关的基因介导的DNA修复途径中起作用；BRCA2与这些基因之一的FANCD1相同。携带BRCA途径中的缺陷的细胞对Cis具有增加的敏感性(Taniguchi et al.，2003，Nat Med.9：568-74)。目前，具有BRCA突变的癌症患者不接受靶定他们的遗传缺陷的治疗，但正在进行努力以在这些患者中检测铂药物(Couzin，2003，Science 302：592)。

一起考虑，这些数据提示siRNA筛选鉴定了某些DNA破坏剂的潜在“反应者”群体(即，BRCA途径缺陷的肿瘤)。直到最近，仍然认为仅仅一小部分乳腺和卵巢肿瘤由BRCA基因中的种系突变导致，因为散发的肿瘤通常不表现出这些基因中的改变。但是，最近的数据表明，BRCA途径的其它成员的基因灭活可能在散发的肿瘤中比BRCA基因自身的改变更广泛(Marsit et al.，2004，Oncogene 23：1000-4)。未来使用更大文库的siRNA筛选可能有助于鉴定其它基因，所述基因的破坏能够诊断对DNA破坏剂的敏感性。实际上，在扩充的siRNA文库中代表了很多已知和预测的DNA修复基因(如，包括BRCA途径中的其它先天性全血细胞减少症基因)。合适设计的筛选也可以鉴定对特定患者有益的其它分子靶，所述特定患者的肿瘤中具有BRCA途径基因破坏。

初级筛选如下进行：筛选含有大约800种基因的siRNA的siRNA文库，得到调节顺铂(顺式-二胺二氯铂)的基因。用100nM(每种siRNA33nM)的siRNA的集合(每种基因3种siRNA的集合)筛选文库。在存在或不存在＜EC25浓度(400ng/ml)的顺铂的条件下将这些siRNA转染到HeLa细胞中。

在转染前一天，将50微升选定的细胞，如在DMEM/10％胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)中生长至约90％汇合的宫颈癌HeLa细胞(ATCC，Cat.No.CCL-2)以450细胞/孔种植在384孔组织培养板上(Corning，Coming，NY)。对于每次转染，将20微升OptiMEM(Invitrogen)与来自10微摩尔储液的2微升siRNA(Dharmacon，Lafayette，CO)混合。对于每次转染，将20微升OptiMEM与1微升Oligofectamine试剂(Invitrogen)混合，并且在室温下温育5分钟。然后将20微升OptiMEM/Oligofectamine混合物与OptiMEM/siRNA混合物分配到96孔板的每个孔中，混合，并且在室温下温育15-20分钟。将5微升转染混合物等分到384孔板的每个孔中，并且在37℃和5％CO2的条件下温育4小时。将含有不同siRNA集合的4个不同96孔板分配在384孔板上，每个占384孔板的四分之一。所有的液体转移都是用具有96孔分配头的BioMek FX液体处理器进行的。

4小时后，加入5微升/孔的含有或不含有2400ng/ml顺铂的DMEM/10％胎牛血清，将板在37℃和5％CO2的条件下温育68小时。用Alamar Blue测定法测量细胞生长(参见5.4.2.2节)。alamarBlue测定测量细胞呼吸，并且将测量值用作存活细胞数目的量度。增殖细胞的内环境比非增殖细胞的内环境具有更高的还原性。具体地，在增殖过程中，NADPH/NADP，FADH/FAD，FMNH/FMN和NADH/NAF的比值增加。这些代谢中间产物可以还原alamarBlue，因此，可以用于监测细胞增殖。转染后72小时，从孔中除去培养基，并且用含有10％(vol/vol)alamarBlue试剂(Biosource International Inc.，Camarillo，CA)和0.001体积的1M Hepes缓冲液组织培养试剂(Invitrogen)的DMEM/10％胎牛血清(Invitrogen)替换。将板在37℃温育2小时，然后采用Softmax Pro 3.1.2软件(Molecular Devices)在GeminiEM微量滴定板读数器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上，通过545nm激发和590nm发射的荧光读板。从不同siRNA集合转染的孔的相对荧光单位减去不含细胞的孔的相对荧光单位，以确定高于背景水平的相对荧光单位。将存在或不存在顺铂时siRNA集合转染的孔的相对荧光单位与靶定荧光素酶的siRNA转染的孔的相对荧光单位进行比较。存在或不存在顺铂时荧光素酶siRNA转染的细胞的相对荧光单位被认为是100％。通过将不存在药物时相对于荧光素酶的％生长作图于X轴，将存在药物时相对于荧光素酶的％生长作图于Y轴，制作了比较图。

用HeLa细胞、A549-pRS细胞和A549-C7细胞进行了次级筛选。用100nM(每种siRNA 33nM)的siRNA的集合(每种基因3种siRNA的集合)，或用100nM的单一siRNA转染细胞。在存在或不存在各种浓度DNA破坏剂的条件下将这些siRNA转染到HeLa细胞中。每种试剂的浓度如下：对于HeLa细胞，阿霉素(10nM)、喜树碱(6nM)、顺铂(500ng/ml)；对于其它细胞系，阿霉素(200nM)、喜树碱(200nM)、顺铂(4ug/ml)。

使用了以下siRNA：WEE1集合、EPHB3集合、CHUK集合、BRCA1集合、BRCA2集合和STK6。使用的siRNA的序列列于表IIIA。

按如下进行siRNA转染：在转染前一天，将2000微升选定的细胞系，如在DMEM/10％胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)中生长至约90％汇合的宫颈癌HeLa细胞(ATCC，Cat.No.CCL-2)以45,000细胞/孔种植在6孔组织培养板上。对于每次转染，将70微升OptiMEM(Invitrogen)与来自20微摩尔储液的5微升siRNA(Dharmacon，Lafayette，CO)混合。对于每次转染，将20微升OptiMEM与5微升Oligofectamine试剂(Invitrogen)混合，并且在室温下温育5分钟。然后将25微升OptiMEM/Oligofectamine混合物与75微升OptiMEM/siRNA混合物混合，并且在室温下温育15-20分钟。将100微升转染混合物等分到6孔板的每个孔中，并且在37℃和5％CO2的条件下温育4小时。

4小时后，将100微升/孔的含有或不含有DNA破坏剂的DMEM/10％胎牛血清加入每个孔，以达到上文所述的每种试剂的终浓度。将板在37℃和5％CO2的条件下再温育44或68小时。然后分析来自两个时间点(转染后48小时或72小时)的样品的细胞周期谱。

对于细胞周期分析，将来自每个孔的上清液与通过胰蛋白酶消化而收获的细胞混合。然后以1200rpm将混合物离心5分钟。用冰冷的70％乙醇将细胞固定约30分钟。用PBS将固定的细胞洗涤一次，重新悬浮在0.5ml含有碘化丙锭(10微克/ml)和RNA酶A(1mg/ml)的PBS中，并且在37℃下温育30分钟。用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson)进行流式细胞分析，并且用FlowJo软件(TreeStar，Inc)分析数据。用亚G1细胞群测量细胞死亡。如果(siRNA+DMSO)样品和(Luc+药物)样品的亚G1细胞群的总和大于(siRNA+药物)样品的亚G1细胞群，认为siRNA沉默使细胞对DNA破坏敏化。

图9-14示出了次级筛选的结果。图9A-9C表示WEE1的沉默使HeLa细胞对Dox、Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感。图9D-9I表明WEE1的沉默使p53-A549细胞对Dox、Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感，但不使p53+A549细胞对所述DNA破坏敏感。图10A-10C表明EPHB3的沉默使HeLa细胞和p53-A549C7对Dox、Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感，使p53+A549pRS细胞对Dox、Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感的程度较低。图11A-11C表明STK6沉默使HeLa细胞和p53-A549C7对Dox、Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感，使p53+A549pRS细胞对Dox、Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感的程度较低。图12A-12C表明BRCA1的沉默使HeLa细胞和p53-A549C7细胞对Dox、Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感。BRCA的沉默也以较低的程度使p53+A549pRS细胞对Cis诱导的DNA破坏敏感，但不使p53+A549pRS细胞对Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感。图13A-13B表明BRCA2的沉默使HeLa细胞和p53-A549C7细胞对Dox、Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感。图13C表明BRCA的沉默以较低的程度使p53+A549pRS细胞对Cis诱导的DNA破坏敏感，但不使p53+A549pRS细胞对Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感。图14A-14B表明CHUK的沉默使HeLa细胞对Dox、Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感。图14C表明CHUK的沉默使p53-A549pRS细胞对Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感。图14D表明CHUK的沉默不使53+A549pRS细胞对Campto和Cis诱导的DNA破坏敏感。

表IIA顺铂导致的平均敏化倍数

基因ID		基因名称	平均敏化倍数	标准差
基因ID		基因名称	平均敏化倍数	标准差	1	2514	PLK	0.302987553	0.122442
2	3099	PLK	0.344442634	0.157221	1	2514	PLK	0.302987553	0.122442
2	3099	PLK	0.344442634	0.157221	3	3433	PLK	0.415618617	0.142888
4	3266	PLK	0.471258534	0.273419	3	3433	PLK	0.415618617	0.142888
4	3266	PLK	0.471258534	0.273419	5	3006	PLK	0.573026377	0.295022
6	3534	PLK	0.580135373	0.403069	5	3006	PLK	0.573026377	0.295022
6	3534	PLK	0.580135373	0.403069	7	3806	C10orf3	0.581678284	0.122098
8	3322	CCNA2	0.603615299	0.027899	7	3806	C10orf3	0.581678284	0.122098
8	3322	CCNA2	0.603615299	0.027899	9	3805	C20orf1	0.618083836	0.081029
10	3423	NM_006101	0.640054878	0.131981	9	3805	C20orf1	0.618083836	0.081029
10	3423	NM_006101	0.640054878	0.131981	11	3464	INSR	0.67184541	0.043498
12	3722	TLK2	0.680201667	0.164793	11	3464	INSR	0.67184541	0.043498
12	3722	TLK2	0.680201667	0.164793	13	3731	CSNK1E	0.70971928	0.169767
14	3261	ERBB2	0.721804997	0.095466	13	3731	CSNK1E	0.70971928	0.169767
14	3261	ERBB2	0.721804997	0.095466	15	3093	PIK3CG	0.730517635	0.16341
16	3391	PLK	0.73566872	0.438713	15	3093	PIK3CG	0.730517635	0.16341
16	3391	PLK	0.73566872	0.438713	17	3813	ANLN	0.742286686	0.076826
18	3687	CAMK4	0.763785182	0.078326	17	3813	ANLN	0.742286686	0.076826
18	3687	CAMK4	0.763785182	0.078326	19	3838	PRKAA2	0.768128477	0.098461
20	2702	2702	0.77422078	0.032982	19	3838	PRKAA2	0.768128477	0.098461

21	3435	FLT3	0.786069641	0.033061
21	3435	FLT3	0.786069641	0.033061	22	3740	STK35	0.786251834	0.241352
23	3826	NM_015694	0.78668619	0.158833	22	3740	STK35	0.786251834	0.241352
23	3826	NM_015694	0.78668619	0.158833	24	3113	CNK	0.789751097	0.074976
25	3648	CLK1	0.795962486	0.119858	24	3113	CNK	0.789751097	0.074976
25	3648	CLK1	0.795962486	0.119858	26	3397	BUB3	0.798897309	0.041819
27	2982	CDC2L2	0.803290264	0.28261	26	3397	BUB3	0.798897309	0.041819
27	2982	CDC2L2	0.803290264	0.28261	28	2975	NEK4	0.804972926	0.092313
29	3003	FER	0.806761229	0.283308	28	2975	NEK4	0.804972926	0.092313
29	3003	FER	0.806761229	0.283308	30	3776	NOTCH2	0.807626974	0.090463
31	3600	RRM2B	0.807791139	0.116058	30	3776	NOTCH2	0.807626974	0.090463
31	3600	RRM2B	0.807791139	0.116058	32	3303	CDKN2D	0.808236038	0.106543
33	3536	PIK3C3	0.811623871	0.072924	32	3303	CDKN2D	0.808236038	0.106543
33	3536	PIK3C3	0.811623871	0.072924	34	3491	PRKCE	0.818554314	0.081903
35	3181	ST5	0.820227877	0.105561	34	3491	PRKCE	0.818554314	0.081903
35	3181	ST5	0.820227877	0.105561	36	3812	CDCA8	0.825194175	0.149709
37	3525	NOTCH4	0.826075824	0.135465	36	3812	CDCA8	0.825194175	0.149709
37	3525	NOTCH4	0.826075824	0.135465	38	3182	MYCN	0.826997754	0.074996
39	2992	PRKR	0.83026411	0.107682	38	3182	MYCN	0.826997754	0.074996
39	2992	PRKR	0.83026411	0.107682	40	2972	KSR	0.840737073	0.220722
41	3359	TUBA1	0.841656288	0.176344	40	2972	KSR	0.840737073	0.220722
41	3359	TUBA1	0.841656288	0.176344	42	3183	NM_005200	0.843755002	0.126232
43	2961	PIM1	0.846814316	0.1791	42	3183	NM_005200	0.843755002	0.126232
43	2961	PIM1	0.846814316	0.1791	44	3814	HMMR	0.848584565	0.089675
45	3326	CCT7	0.850805908	0.139648	44	3814	HMMR	0.848584565	0.089675
45	3326	CCT7	0.850805908	0.139648	46	3819	TACC3	0.851051224	0.151449
47	3495	FGFR2	0.851658058	0.169414	46	3819	TACC3	0.851051224	0.151449
47	3495	FGFR2	0.851658058	0.169414	48	2952	PRKG1	0.853083744	0.103483
49	3680	CLK3	0.853111421	0.029348	48	2952	PRKG1	0.853083744	0.103483
49	3680	CLK3	0.853111421	0.029348	50	3650	NM_025195	0.855769333	0.097938
51	3635	STAT1	0.856732819	0.045221	50	3650	NM_025195	0.855769333	0.097938
51	3635	STAT1	0.856732819	0.045221	52	3487	MAP2K3	0.858609643	0.046727
53	3831	CLSPN	0.865300447	0.043122	52	3487	MAP2K3	0.858609643	0.046727
53	3831	CLSPN	0.865300447	0.043122	54	3416	IKBKE	0.868770694	0.033925
55	3693	NEK9	0.871865115	0.272749	54	3416	IKBKE	0.868770694	0.033925
55	3693	NEK9	0.871865115	0.272749	56	3686	MAP3K8	0.872321606	0.276021
57	3677	HCK	0.874242862	0.099478	56	3686	MAP3K8	0.872321606	0.276021
57	3677	HCK	0.874242862	0.099478	58	3509	KIF21A	0.876152348	0.070276
59	3666	PAK6	0.877347139	0.070142	58	3509	KIF21A	0.876152348	0.070276
59	3666	PAK6	0.877347139	0.070142	60	3563	RAB3A	0.877392452	0.07511
61	2993	SRMS	0.877914429	0.052743	60	3563	RAB3A	0.877392452	0.07511
61	2993	SRMS	0.877914429	0.052743	62	3658	STK18	0.884409716	0.022945
63	3153	RB1	0.884802012	0.066909	62	3658	STK18	0.884409716	0.022945
63	3153	RB1	0.884802012	0.066909	64	3000	BMX	0.88790935	0.05788
65	3784	MAPK8	0.888444434	0.124134	64	3000	BMX	0.88790935	0.05788
65	3784	MAPK8	0.888444434	0.124134	66	3503	EGR1	0.8888158	0.172111
67	3578	RREB1	0.889406356	0.126074	66	3503	EGR1	0.8888158	0.172111
67	3578	RREB1	0.889406356	0.126074	68	3085	KIF5C	0.889747874	0.062749
69	3431	NM_018454	0.893082893	0.124062	68	3085	KIF5C	0.889747874	0.062749
69	3431	NM_018454	0.893082893	0.124062	70	2954	ROCK2	0.893933798	0.055935
71	2922	NM_004783	0.89487587	0.052019	70	2954	ROCK2	0.893933798	0.055935
71	2922	NM_004783	0.89487587	0.052019	72	3631	WISP2	0.895799222	0.04132

73	3752	CCNB3	0.895903064	0.014712
73	3752	CCNB3	0.895903064	0.014712	74	3808	CKAP2	0.897429532	0.077036
75	3399	HSPCB	0.898588123	0.283379	74	3808	CKAP2	0.897429532	0.077036
75	3399	HSPCB	0.898588123	0.283379	76	3251	ABL1	0.899747173	0.09061
77	3695	PRKAA1	0.899926191	0.099839	76	3251	ABL1	0.899747173	0.09061
77	3695	PRKAA1	0.899926191	0.099839	78	3319	CCND1	0.901342596	0.14162
79	3786	FRAP1	0.901481586	0.064389	78	3319	CCND1	0.901342596	0.14162
79	3786	FRAP1	0.901481586	0.064389	80	2964	RIPK2	0.901658094	0.057156
81	3179	PDGFB	0.902358454	0.054703	80	2964	RIPK2	0.901658094	0.057156
81	3179	PDGFB	0.902358454	0.054703	82	2987	RNASEL	0.90485908	0.109916
83	3086	KIF11	0.905925473	0.044166	82	2987	RNASEL	0.90485908	0.109916
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775	2929	CHUK	1.646057679	0.111716	774	3787	FZD4	1.621497881	0.053639
775	2929	CHUK	1.646057679	0.111716	776	3468	ABL2	1.652007602	0.180802
777	2988	FRK	1.653152871	0.298882	776	3468	ABL2	1.652007602	0.180802
777	2988	FRK	1.653152871	0.298882	778	3758	RAD51L1	1.662423293	0.135675
779	3531	NM_021170	1.666989154	0.094206	778	3758	RAD51L1	1.662423293	0.135675
779	3531	NM_021170	1.666989154	0.094206	780	3155	ATR	1.680571715	0.388687
781	3747	GSK3A	1.688637713	0.38953	780	3155	ATR	1.680571715	0.388687
781	3747	GSK3A	1.688637713	0.38953	782	3144	KIF4B	1.695873891	0.467258
783	3235	CHEK1	1.697910825	0.356224	782	3144	KIF4B	1.695873891	0.467258
783	3235	CHEK1	1.697910825	0.356224	784	3313	CCNG2	1.703651114	0.216266
785	3004	MAP3K1	1.721492222	0.376438	784	3313	CCNG2	1.703651114	0.216266
785	3004	MAP3K1	1.721492222	0.376438	786	3619	FRAT1	1.761446915	0.292031
787	3192	WNT1	1.765037748	0.394063	786	3619	FRAT1	1.761446915	0.292031
787	3192	WNT1	1.765037748	0.394063	788	3673	DDR1	1.770053978	0.2338
789	3358	top2B	1.800293702	0.195754	788	3673	DDR1	1.770053978	0.2338
789	3358	top2B	1.800293702	0.195754	790	2981	ALK	1.84348901	0.208338
791	2958	PRKACA	1.889142934	0.494773	790	2981	ALK	1.84348901	0.208338
791	2958	PRKACA	1.889142934	0.494773	792	3152	APC	1.894694006	0.191358
793	3712	RPS6KA6	1.957145081	0.421292	792	3152	APC	1.894694006	0.191358
793	3712	RPS6KA6	1.957145081	0.421292	794	3436	BRAF	1.999825737	1.173208
795	3727	GPRK6	2.044605743	0.256806	794	3436	BRAF	1.999825737	1.173208
795	3727	GPRK6	2.044605743	0.256806	796	3780	MCM3	2.062893191	0.187038
797	3329	CDC42	2.131693629	0.483392	796	3780	MCM3	2.062893191	0.187038
797	3329	CDC42	2.131693629	0.483392	798	3095	KIF2C	2.163834467	0.289685
799	3098	CENPE	2.170456559	0.120025	798	3095	KIF2C	2.163834467	0.289685
799	3098	CENPE	2.170456559	0.120025	800	3331	CDC25B	2.199340751	0.484716

801	3706	C20orf97	2.377822809	0.678329
801	3706	C20orf97	2.377822809	0.678329	802	3580	ELK1	2.456195789	0.434043
803	3241	WEE1	2.66755235	0.625231	802	3580	ELK1	2.456195789	0.434043
803	3241	WEE1	2.66755235	0.625231	804	3642	EPHB3	2.758093154	0.565256
805	3158	BRCA1	2.878071685	0.418358	804	3642	EPHB3	2.758093154	0.565256
805	3158	BRCA1	2.878071685	0.418358	806	3150	BRCA2	11.61633698	1.101248

表IIB喜树碱导致的平均敏化倍数

基因ID	BIOID	基因	敏化倍数
基因ID	BIOID	基因	敏化倍数	1	63	M15077	1
2	2514	PLK	0.029197	1	63	M15077	1
2	2514	PLK	0.029197	3	2540	2540	#DIV/01
4	2541	2541	0.860453	3	2540	2540	#DIV/01
4	2541	2541	0.860453	5	2701	2701	0.034091
6	2702	2702	0.432441	5	2701	2701	0.034091
6	2702	2702	0.432441	7	3391	PLK	0.052632
8	3534	PLK	0.083815	7	3391	PLK	0.052632
8	3534	PLK	0.083815	9	3099	PLK	0.090142
10	3006	PLK	0.09146	9	3099	PLK	0.090142
10	3006	PLK	0.09146	11	3266	PLK	0.096774
12	3433	PLK	0.13	11	3266	PLK	0.096774
12	3433	PLK	0.13	13	3322	CCNA2	0.264029
14	3154	MADH4	0.361653	13	3322	CCNA2	0.264029
14	3154	MADH4	0.361653	15	3518	NFKB1	0.372726
16	3600	RRM2B	0.381056	15	3518	NFKB1	0.372726
16	3600	RRM2B	0.381056	17	3184	TSG101	0.432287
18	3348	DCK	0.446467	17	3184	TSG101	0.432287
18	3348	DCK	0.446467	19	3332	CDC5L	0.451264
20	3812	CDCA8	0.453177	19	3332	CDC5L	0.451264
20	3812	CDCA8	0.453177	21	3423	NM_006101	0.478261
22	3464	INSR	0.480578	21	3423	NM_006101	0.478261
22	3464	INSR	0.480578	23	2961	PIM1	0.51581
24	3661	FGR	0.517647	23	2961	PIM1	0.51581
24	3661	FGR	0.517647	25	3171	VHL	0.524194
26	3809	CDCA3	0.529046	25	3171	VHL	0.524194
26	3809	CDCA3	0.529046	27	3525	NOTCH4	0.534058
28	3093	PIK3CG	0.557692	27	3525	NOTCH4	0.534058
28	3093	PIK3CG	0.557692	29	3740	STK35	0.55782
30	3435	FLT3	0.56	29	3740	STK35	0.55782
30	3435	FLT3	0.56	31	3805	C20orf1	0.564035
32	3219	CENPC1	0.575465	31	3805	C20orf1	0.564035
32	3219	CENPC1	0.575465	33	3003	FER	0.579832
34	3183	NM_005200	0.580153	33	3003	FER	0.579832
34	3183	NM_005200	0.580153	35	3374	POLR2A	0.583796
36	3601	POLE	0.588331	35	3374	POLR2A	0.583796
36	3601	POLE	0.588331	37	3112	KNSL7	0.597685
38	3489	SRC	0.606833	37	3112	KNSL7	0.597685
38	3489	SRC	0.606833	39	3478	EPHA2	0.608258
40	3422	SMC4L1	0.608696	39	3478	EPHA2	0.608258
40	3422	SMC4L1	0.608696	41	3357	PRIM2A	0.611218
42	3262	LATS1	0.613321	41	3357	PRIM2A	0.611218
42	3262	LATS1	0.613321	43	2987	RNASEL	0.617089
44	3123	AKT3	0.618574	43	2987	RNASEL	0.617089
44	3123	AKT3	0.618574	45	3687	CAMK4	0.61913
46	3303	CDKN2D	0.625741	45	3687	CAMK4	0.61913
46	3303	CDKN2D	0.625741	47	2966	NM_033266	0.627321
48	3226	RBX1	0.632166	47	2966	NM_033266	0.627321

49	3509	KIF21A	0.634426
49	3509	KIF21A	0.634426	50	2999	FES	0.634596
51	3517	MYC	0.637624	50	2999	FES	0.634596
51	3517	MYC	0.637624	52	3592	SOS2	0.640343
53	3139	XM_095827	0.642535	52	3592	SOS2	0.640343
53	3139	XM_095827	0.642535	54	3105	BUB1	0.643861
55	3397	BUB3	0.644077	54	3105	BUB1	0.643861
55	3397	BUB3	0.644077	56	3267	CCNH	0.64503
57	2975	NEK4	0.645485	56	3267	CCNH	0.64503
57	2975	NEK4	0.645485	58	3766	S100A2	0.646739
59	2936	SGKL	0.64695	58	3766	S100A2	0.646739
59	2936	SGKL	0.64695	60	3524	NOTCH3	0.647109
61	3806	C10orf3	0.64878	60	3524	NOTCH3	0.647109
61	3806	C10orf3	0.64878	62	3448	NM_016231	0.654135
63	3461	KIT	0.662033	62	3448	NM_016231	0.654135
63	3461	KIT	0.662033	64	3501	RPS6KA2	0.667039
65	3494	MAPK4	0.668898	64	3501	RPS6KA2	0.667039
65	3494	MAPK4	0.668898	66	3251	ABL1	0.675159
67	3103	PIK3CA	0.679543	66	3251	ABL1	0.675159
67	3103	PIK3CA	0.679543	68	3572	RASA3	0.681105
69	3246	RPS6KB1	0.681548	68	3572	RASA3	0.681105
69	3246	RPS6KB1	0.681548	70	3230	MAP2K1	0.683985
71	3733	MYLK2	0.684534	70	3230	MAP2K1	0.683985
71	3733	MYLK2	0.684534	72	3491	PRKCE	0.685882
73	2982	CDC2L2	0.687831	72	3491	PRKCE	0.685882
73	2982	CDC2L2	0.687831	74	3542	PPP2CA	0.690237
75	3350	ADA	0.692046	74	3542	PPP2CA	0.690237
75	3350	ADA	0.692046	76	3651	VRK1	0.692308
77	2937	NM_025052	0.693089	76	3651	VRK1	0.692308
77	2937	NM_025052	0.693089	78	3007	MAP3K14	0.694169
79	3751	BCR	0.694278	78	3007	MAP3K14	0.694169
79	3751	BCR	0.694278	80	3410	RPS27	0.695238
81	3240	MAPK12	0.696498	80	3410	RPS27	0.695238
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83	3413	KIF23	0.701413	84	3773	WNT2	0.702997
85	3762	MCC	0.706533	84	3773	WNT2	0.702997
85	3762	MCC	0.706533	86	3731	CSNK1E	0.707275
87	3778	VHL	0.707386	86	3731	CSNK1E	0.707275
87	3778	VHL	0.707386	88	3476	PRKCD	0.708251
89	3754	CDKL2	0.712665	88	3476	PRKCD	0.708251
89	3754	CDKL2	0.712665	90	3741	RPS6KB2	0.715261
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91	3744	PRKWNK4	0.716089	92	3148	LIG1	0.71816
93	2964	RIPK2	0.71873	92	3148	LIG1	0.71816
93	2964	RIPK2	0.71873	94	3486	RPS6KA3	0.71875
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97	3363	GART	0.723732	96	3193	FGF3	0.723179
97	3363	GART	0.723732	98	3438	DTR	0.725061
99	3351	ESR1	0.725395	98	3438	DTR	0.725061
99	3351	ESR1	0.725395	100	3416	IKBKE	0.726044

101	2972	KSR	0.727171
101	2972	KSR	0.727171	102	3326	CCT7	0.727769
103	3648	CLK1	0.728232	102	3326	CCT7	0.727769
103	3648	CLK1	0.728232	104	3401	HDAC1	0.728268
105	3498	CSNK1A1	0.728714	104	3401	HDAC1	0.728268
105	3498	CSNK1A1	0.728714	106	2976	NEK7	0.729805
107	3347	top1	0.731826	106	2976	NEK7	0.729805
107	3347	top1	0.731826	108	3236	PTK2B	0.736339
109	3256	CDC2L1	0.738272	108	3236	PTK2B	0.736339
109	3256	CDC2L1	0.738272	110	3606	CREBBP	0.738487
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111	3657	PCTK1	0.739866	112	3452	JAK1	0.745847
113	3250	CHEK2	0.745919	112	3452	JAK1	0.745847
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123	3460	CSK	0.759454	124	3722	TLK2	0.761568
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725	3137	KIF26A	1.782366
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741	3467	MAP2K7	1.894459	742	2986	ACVR2	1.896882
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745	3804	NM_024322	1.920139	746	3558	RALA	1.92029
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749	3205	NM_139286	1.997054	750	3221	top3B	1.997534
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755	3223	NM_016263	2.045139	756	3358	top2B	2.050562
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759	3742	RHOK	2.075949	760	2946	NM_017719	2.078131
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761	3406	TERT	2.10274	762	3206	ANAPC5	2.159615
763	3531	NM_021170	2.163086	762	3206	ANAPC5	2.159615
763	3531	NM_021170	2.163086	764	3008	SGK2	2.1766
765	3706	C20orf97	2.1875	764	3008	SGK2	2.1766
765	3706	C20orf97	2.1875	766	3254	CSF1R	2.196822
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767	3439	EGR2	2.213333	768	2970	AATK	2.235211
769	3528	TCF3	2.273649	768	2970	AATK	2.235211
769	3528	TCF3	2.273649	770	3327	CDC45L	2.288265
771	3551	STAT3	2.29125	770	3327	CDC45L	2.288265
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773	3734	BMPR1B	2.330839	772	3001	PRKY	2.313131
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775	3222	PTTGI	2.347826	776	3532	NM_019089	2.352437

777	3547	FOXO1A	2.352444
777	3547	FOXO1A	2.352444	778	3671	STK4	2.362408
779	3781	SRC	2.37859	778	3671	STK4	2.362408
779	3781	SRC	2.37859	780	3789	ELKI	2.394828
781	3247	NM_018492	2.480851	780	3789	ELKI	2.394828
781	3247	NM_018492	2.480851	782	3586	RASA2	2.506796
783	3727	GPRK6	2.553987	782	3586	RASA2	2.506796
783	3727	GPRK6	2.553987	784	3689	BLK	2.584588
785	3777	ABL1	2.615226	784	3689	BLK	2.584588
785	3777	ABL1	2.615226	786	3399	HSPCB	2.632207
787	2958	PRKACA	2.635514	786	3399	HSPCB	2.632207
787	2958	PRKACA	2.635514	788	3304	CCNE2	2.677656
789	3617	CTNNBIP1	2.698292	788	3304	CCNE2	2.677656
789	3617	CTNNBIP1	2.698292	790	3225	NM_013367	2.714286
791	3619	FRAT1	2.728111	790	3225	NM_013367	2.714286
791	3619	FRAT1	2.728111	792	3121	PIK3C2A	2.828125
793	3816	NM_017769	2.847273	792	3121	PIK3C2A	2.828125
793	3816	NM_017769	2.847273	794	3134	XM_170783	2.923286
795	3737	NM_016457	2.940451	794	3134	XM_170783	2.923286
795	3737	NM_016457	2.940451	796	3135	XM_064050	3.063002
797	3129	STK6	3.146434	796	3135	XM_064050	3.063002
797	3129	STK6	3.146434	798	3564	RALBP1	3.170605
799	3580	ELK1	3.356401	798	3564	RALBP1	3.170605
799	3580	ELK1	3.356401	800	3157	NF1	3.402273
801	3638	STAT5A	3.754386	800	3157	NF1	3.402273
801	3638	STAT5A	3.754386	802	3241	WEE1	3.801887
803	3718	PTK6	4.317857	802	3241	WEE1	3.801887
803	3718	PTK6	4.317857	804	3712	RPS6KA6	5.356624
805	3158	BRCA1	5.821429	804	3712	RPS6KA6	5.356624
805	3158	BRCA1	5.821429	806	3642	EPHB3	6.43
807	3150	BRCA2	14.13136	806	3642	EPHB3	6.43

表IIC阿霉素导致的平均敏化倍数

基因ID	BiolD	基因	三次筛选的平均值
基因ID	BiolD	基因	三次筛选的平均值	1	2514	PLK	0.094489
2	3099	PLK	0.195626	1	2514	PLK	0.094489
2	3099	PLK	0.195626	3	3099	PLK	0.211482
4	3099	PLK	0.211747	3	3099	PLK	0.211482
4	3099	PLK	0.211747	5	3099	PLK	0.219626
6	3099	PLK	0.227603	5	3099	PLK	0.219626
6	3099	PLK	0.227603	7	3099	PLK	0.235482
8	3099	PLK	0.235683	7	3099	PLK	0.235482
8	3099	PLK	0.235683	9	3099	PLK	0.235747
10	3099	PLK	0.251539	9	3099	PLK	0.235747
10	3099	PLK	0.251539	11	3099	PLK	0.251603
12	3099	PLK	0.259683	11	3099	PLK	0.251603
12	3099	PLK	0.259683	13	3099	PLK	0.275539
14	3099	PLK	0.282503	13	3099	PLK	0.275539

15	3099	PLK	0.298359
15	3099	PLK	0.298359	16	3099	PLK	0.298624
17	3099	PLK	0.31448	16	3099	PLK	0.298624
17	3099	PLK	0.31448	18	3099	PLK	0.32256
19	3534	PLK	0.330807	18	3099	PLK	0.32256
19	3534	PLK	0.330807	20	3099	PLK	0.338416
21	3099	PLK	0.395491	20	3099	PLK	0.338416
21	3099	PLK	0.395491	22	3099	PLK	0.411612
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751	3531		1.800094	750	3430	STMN1	1.798292
751	3531		1.800094	752	3515	PDGFRB	1.80459
753	3324	CUL5	1.820969	752	3515	PDGFRB	1.80459
753	3324	CUL5	1.820969	754	3511		1.832738
755	3472	MAP3K5	1.834487	754	3511		1.832738
755	3472	MAP3K5	1.834487	756	3428	ECT2	1.84097
757	3642	EPHB3	1.84828	756	3428	ECT2	1.84097
757	3642	EPHB3	1.84828	758	3208	ZW10	1.858453
759	3820		1.861643	758	3208	ZW10	1.858453
759	3820		1.861643	760	3225		1.868827
761	3834	CHEK1	1.869085	760	3225		1.868827
761	3834	CHEK1	1.869085	762	3510	CDK4	1.869212
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763	3795	NR4A2	1.870845	764	3247		1.875796
765	3521	MET	1.887521	764	3247		1.875796
765	3521	MET	1.887521	766	3538	NFKB2	1.892227
767	3818		1.900799	766	3538	NFKB2	1.892227
767	3818		1.900799	768	3719	BMPR2	1.919267
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769	3144	KIF4B	1.924148	770	3355	GUK1	1.925235
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773	3361	IMPDH2	1.938577	774	3672	SYK	1.945812
775	3697	CAMK2G	1.946161	774	3672	SYK	1.945812
775	3697	CAMK2G	1.946161	776	3415	HSPCA	1.94686
777	3505	STK6	1.949702	776	3415	HSPCA	1.94686
777	3505	STK6	1.949702	778	3368	top3A	1.959095
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779	3681	SRPK1	1.963919	780	3613	DVL1	1.984151
781	3720		1.996699	780	3613	DVL1	1.984151
781	3720		1.996699	782	2995	PTK2	2.015836
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783	3522	KRAS2	2.026984	784	3436	BRAF	2.036457
785	3787	FZD4	2.049799	784	3436	BRAF	2.036457
785	3787	FZD4	2.049799	786	3584	RASAL2	2.089191
787	3098	CENPE	2.090255	786	3584	RASAL2	2.089191
787	3098	CENPE	2.090255	788	3267	CCNH	2.096356
789	2931	MAP4K3	2.11675	788	3267	CCNH	2.096356
789	2931	MAP4K3	2.11675	790	2962	MAP4K2	2.12521
791	3790	ERBB3	2.13688	790	2962	MAP4K2	2.12521
791	3790	ERBB3	2.13688	792	3742	RHOK	2.142917
793	2948	MYO3A	2.173575	792	3742	RHOK	2.142917
793	2948	MYO3A	2.173575	794	3629	AXIN1	2.184253

795	3546	INPP5D	2.197591
795	3546	INPP5D	2.197591	796	3723		2.212338
797	2973	NEK1	2.222767	796	3723		2.212338
797	2973	NEK1	2.222767	798	3512	TGFBR1	2.223853
799	3135		2.223901	798	3512	TGFBR1	2.223853
799	3135		2.223901	800	3637	STAT4	2.227212
801	3004	MAP3K1	2.235803	800	3637	STAT4	2.227212
801	3004	MAP3K1	2.235803	802	3304	CCNE2	2.239326
803	3129	STK6	2.248154	802	3304	CCNE2	2.239326
803	3129	STK6	2.248154	804	3402	HDAC4	2.253527
805	3627	CTNNA1	2.28197	804	3402	HDAC4	2.253527
805	3627	CTNNA1	2.28197	806	3537	EIF4EBP1	2.322458
807	3704	ACVR2B	2.322634	806	3537	EIF4EBP1	2.322458
807	3704	ACVR2B	2.322634	808	3329	CDC42	2.333632
809	3259	MAPK8	2.334959	808	3329	CDC42	2.333632
809	3259	MAPK8	2.334959	810	3689	BLK	2.340679
811	3241	WEE1	2.35419	810	3689	BLK	2.340679
811	3241	WEE1	2.35419	812	3137	KIF26A	2.359341
813	3612	TCF1	2.413867	812	3137	KIF26A	2.359341
813	3612	TCF1	2.413867	814	3532		2.468626
815	3764	NOTCH4	2.482525	814	3532		2.468626
815	3764	NOTCH4	2.482525	816	3417	HDAC3	2.485246
817	3120	PIK3CB	2.528659	816	3417	HDAC3	2.485246
817	3120	PIK3CB	2.528659	818	3313	CCNG2	2.568855
819	3722	TLK2	2.571781	818	3313	CCNG2	2.568855
819	3722	TLK2	2.571781	820	3136		2.916125
821	3780	MCM3	2.988111	820	3136		2.916125
821	3780	MCM3	2.988111	822	3580	ELK1	3.0307
823	3718	PTK6	3.090027	822	3580	ELK1	3.0307
823	3718	PTK6	3.090027	824	3777	ABL1	3.099871
825	3605	FZD4	3.155698	824	3777	ABL1	3.099871
825	3605	FZD4	3.155698	826	3134		3.263194
827	2929	CHUK	3.298485	826	3134		3.263194
827	2929	CHUK	3.298485	828	3781	SRC	3.433423
829	3223		3.587036	828	3781	SRC	3.433423
829	3223		3.587036	830	3706	C20orf97	4.288466

表IIIA用于DNA破坏剂的筛选中的siRNA序列：顺铂筛选

基因名称	序列ID	有义序列	SEQ ID NO
基因名称	序列ID	有义序列	SEQ ID NO	CHUK	NM_001278	AAAGGCUGCUCACAAGUUCTT	50
CHUK	NM_001278	AGCUGCUCAACAAACCAGATT	51	CHUK	NM_001278	AAAGGCUGCUCACAAGUUCTT	50
CHUK	NM_001278	AGCUGCUCAACAAACCAGATT	51	CHUK	NM_001278	AUGAGGAACAGGGCAAUAGTT	52
PRKACA	NM_002730	GAAUGGGGUCAACGAUAUCTT	53	CHUK	NM_001278	AUGAGGAACAGGGCAAUAGTT	52
PRKACA	NM_002730	GAAUGGGGUCAACGAUAUCTT	53	PRKACA	NM_002730	GGACGAGACUUCCUCUUGATT	54
PRKACA	NM_002730	GUGUGGCAAGGAGUUUUCUTT	55	PRKACA	NM_002730	GGACGAGACUUCCUCUUGATT	54
PRKACA	NM_002730	GUGUGGCAAGGAGUUUUCUTT	55	MAP4K2	NM_004579	GAAUCCUAAGAAGAGGCCGTT	56
MAP4K2	NM_004579	GAGGAGGUCUUUCAUUGGGTT	57	MAP4K2	NM_004579	GAAUCCUAAGAAGAGGCCGTT	56
MAP4K2	NM_004579	GAGGAGGUCUUUCAUUGGGTT	57	MAP4K2	NM_004579	GAUAGUCAAGCUAGACCCATT	58
STK17B	NM_004226	AUCCUCCUGUAAUGGAACCTT	59	MAP4K2	NM_004579	GAUAGUCAAGCUAGACCCATT	58

STK17B	NM_004226	GAAGAGGACAGGAUUGUCGTT	60
STK17B	NM_004226	GAAGAGGACAGGAUUGUCGTT	60	STK17B	NM_004226	GACCAACAGCAGAGAUAUGTT	61
ALK	NM_004304	ACCAGAGACCAAAUGUCACTT	62	STK17B	NM_004226	GACCAACAGCAGAGAUAUGTT	61
ALK	NM_004304	ACCAGAGACCAAAUGUCACTT	62	ALK	NM_004304	AUAAGCCCACCAGCUUGUGTT	63
ALK	NM_004304	UCAACACCGCUUUGCCGAUTT	64	ALK	NM_004304	AUAAGCCCACCAGCUUGUGTT	63
ALK	NM_004304	UCAACACCGCUUUGCCGAUTT	64	FRK	NM_002031	ACUAUAGACUUCCGCAACCTT	65
FRK	NM_002031	CAGUAGAUUGCUGUGGCCUTT	66	FRK	NM_002031	ACUAUAGACUUCCGCAACCTT	65
FRK	NM_002031	CAGUAGAUUGCUGUGGCCUTT	66	FRK	NM_002031	CUCCAUACAGCUUCUGAAGTT	67
MAP3K1	AF042838	UCACUUAGCAGCUGAGUCUTT	68	FRK	NM_002031	CUCCAUACAGCUUCUGAAGTT	67
MAP3K1	AF042838	UCACUUAGCAGCUGAGUCUTT	68	MAP3K1	AF042838	UUGACAGCACUGGUCAGAGTT	69
MAP3K1	AF042838	UUGGCAAGAACUUCUUGGCTT	70	MAP3K1	AF042838	UUGACAGCACUGGUCAGAGTT	69
MAP3K1	AF042838	UUGGCAAGAACUUCUUGGCTT	70	KIF2C	NM_006845	ACAAAAACGGAGAUCCGUCTT	71
KIF2C	NM_006845	AUAAGCAGCAAGAAACGGCTT	72	KIF2C	NM_006845	ACAAAAACGGAGAUCCGUCTT	71
KIF2C	NM_006845	AUAAGCAGCAAGAAACGGCTT	72	KIF2C	NM_006845	GAAUUUCGGGCUACUUUGGTT	73
CENPE	NM_001813	GAAAAUGAAGCUUUGCGGGTT	74	KIF2C	NM_006845	GAAUUUCGGGCUACUUUGGTT	73
CENPE	NM_001813	GAAAAUGAAGCUUUGCGGGTT	74	CENPE	NM_001813	GAAGAGAUCCCAGUGCUUCTT	75
CENPE	NM_001813	UCUGAAAGUGACCAGCUCATT	76	CENPE	NM_001813	GAAGAGAUCCCAGUGCUUCTT	75
CENPE	NM_001813	UCUGAAAGUGACCAGCUCATT	76	STK6	NM_003600	ACAGUCUUAGGAAUCGUGCTT	3
STK6	NM_003600	GCACAAAAGCUUGUCUCCATT	1	STK6	NM_003600	ACAGUCUUAGGAAUCGUGCTT	3
STK6	NM_003600	GCACAAAAGCUUGUCUCCATT	1	STK6	NM_003600	UUGCAGAUUUUGGGUGGUCTT	2
KIF4B	AF241316	CCUGCAGCAACUGAUUACCTT	77	STK6	NM_003600	UUGCAGAUUUUGGGUGGUCTT	2
KIF4B	AF241316	CCUGCAGCAACUGAUUACCTT	77	KIF4B	AF241316	GAACUUGAGAAGAUGCGAGTT	78
KIF4B	AF241316	GAAGAGGCCCACUGAAGUUTT	79	KIF4B	AF241316	GAACUUGAGAAGAUGCGAGTT	78
KIF4B	AF241316	GAAGAGGCCCACUGAAGUUTT	79	BRCA2	NM_000059	CAAAUGGGCAGGACUCUUATT	80
BRCA2	NM_000059	CUGUUCAGCCCAGUUUGAATT	81	BRCA2	NM_000059	CAAAUGGGCAGGACUCUUATT	80
BRCA2	NM_000059	CUGUUCAGCCCAGUUUGAATT	81	BRCA2	NM_000059	UCUCCAAGGAAGUUGUACCTT	82
APC	NM_000038	ACCAAGUAUCCGCAAAAGGTT	83	BRCA2	NM_000059	UCUCCAAGGAAGUUGUACCTT	82
APC	NM_000038	ACCAAGUAUCCGCAAAAGGTT	83	APC	NM_000038	AGACCUGUAUUAGUACGCCTT	84
APC	NM_000038	CAAGCUUUACCCAGCCUGUTT	85	APC	NM_000038	AGACCUGUAUUAGUACGCCTT	84
APC	NM_000038	CAAGCUUUACCCAGCCUGUTT	85	ATR	NM_001184	GAAACUGCAGCUAUCUUCCTT	86
ATR	NM_001184	GUUACAAUGAGGCUGAUGCTT	87	ATR	NM_001184	GAAACUGCAGCUAUCUUCCTT	86
ATR	NM_001184	GUUACAAUGAGGCUGAUGCTT	87	ATR	NM_001184	UCACGACUCGCUGAACUGUTT	88
BRCA1	NM_007296	ACUUAGGUGAAGCAGCAUCTT	89	ATR	NM_001184	UCACGACUCGCUGAACUGUTT	88
BRCA1	NM_007296	ACUUAGGUGAAGCAGCAUCTT	89	BRCA1	NM_007296	GGGCAGUGAAGACUUGAUUTT	90
BRCA1	NM_007296	UGAAGUGGGCUCCAGUAUUTT	91	BRCA1	NM_007296	GGGCAGUGAAGACUUGAUUTT	90
BRCA1	NM_007296	UGAAGUGGGCUCCAGUAUUTT	91	DCC	NM_005215	ACAUCGUGGUGCGAGGUUATT	92
DCC	NM_005215	AUGAGCCGCCAAUUGGACATT	93	DCC	NM_005215	ACAUCGUGGUGCGAGGUUATT	92
DCC	NM_005215	AUGAGCCGCCAAUUGGACATT	93	DCC	NM_005215	AUGGCAAGUUUGGAAGGACTT	94
WNT1	NM_005430	ACGGCGUUUAUCUUCGCUATT	95	DCC	NM_005215	AUGGCAAGUUUGGAAGGACTT	94
WNT1	NM_005430	ACGGCGUUUAUCUUCGCUATT	95	WNT1	NM_005430	CCCUCUUGCCAUCCUGAUGTT	96
WNT1	NM_005430	CUAUUUAUUGUGCUGGGUCTT	97	WNT1	NM_005430	CCCUCUUGCCAUCCUGAUGTT	96
WNT1	NM_005430	CUAUUUAUUGUGCUGGGUCTT	97	CHEK1	NM_001274	AUCGAUUCUGCUCCUCUAGTT	98
CHEK1	NM_001274	CUGAAGAAGCAGUCGCAGUTT	99	CHEK1	NM_001274	AUCGAUUCUGCUCCUCUAGTT	98
CHEK1	NM_001274	CUGAAGAAGCAGUCGCAGUTT	99	CHEK1	NM_001274	UGCCUGAAAGAGACUUGUGTT	100
WEE1	NM_003390	AUCGGCUCUGGAGAAUUUGTT	101	CHEK1	NM_001274	UGCCUGAAAGAGACUUGUGTT	100
WEE1	NM_003390	AUCGGCUCUGGAGAAUUUGTT	101	WEE1	NM_003390	CAAGGAUCUCCAGUCCACATT	102
WEE1	NM_003390	UGUACCUGUGUGUCCAUCUTT	103	WEE1	NM_003390	CAAGGAUCUCCAGUCCACATT	102
WEE1	NM_003390	UGUACCUGUGUGUCCAUCUTT	103		NM_018492	AGGACACUUUGGGUACCAGTT	104
	NM_018492	GACCCUAAAGAUCGUCCUUTT	105		NM_018492	AGGACACUUUGGGUACCAGTT	104
	NM_018492	GACCCUAAAGAUCGUCCUUTT	105		NM_018492	GCUGAGGAGAAUAUGCCUCTT	106
MAPK8	NM_139049	CACCCGUACAUCAAUGUCUTT	107		NM_018492	GCUGAGGAGAAUAUGCCUCTT	106
MAPK8	NM_139049	CACCCGUACAUCAAUGUCUTT	107	MAPK8	NM_139049	GGAAUAGUAUGCGCAGCUUTT	108

MAPK8	NM_139049	GUGAUUCAGAUGGAGCUAGTT	109
MAPK8	NM_139049	GUGAUUCAGAUGGAGCUAGTT	109	CUL1	NM_003592	GACCGCAAACUACUGAUUCTT	110
CUL1	NM_003592	GCCAGCAUGAUCUCCAAGUTT	111	CUL1	NM_003592	GACCGCAAACUACUGAUUCTT	110
CUL1	NM_003592	GCCAGCAUGAUCUCCAAGUTT	111	CUL1	NM_003592	UAGACAUUGGGUUCGCCGUTT	112
CCNG2	NM_004354	CCUCGAGAAAAAGGGCUGATT	113	CUL1	NM_003592	UAGACAUUGGGUUCGCCGUTT	112
CCNG2	NM_004354	CCUCGAGAAAAAGGGCUGATT	113	CCNG2	NM_004354	GCUCAGCUGAAAGCUUGCATT	114
CCNG2	NM_004354	UGCCUAGCCGAGUAUUCUUTT	115	CCNG2	NM_004354	GCUCAGCUGAAAGCUUGCATT	114
CCNG2	NM_004354	UGCCUAGCCGAGUAUUCUUTT	115	CDC42	NM_044472	ACCUUAUGGAAAAGGGGUGTT	116
CDC42	NM_044472	CCAUCCUGUUUGAAAGCCUTT	117	CDC42	NM_044472	ACCUUAUGGAAAAGGGGUGTT	116
CDC42	NM_044472	CCAUCCUGUUUGAAAGCCUTT	117	CDC42	NM_044472	CCCAAAAGGAAGUGCUGUATT	118
CDC25B	NM_021874	AGGAUGAUGAUGCAGUUCCTT	119	CDC42	NM_044472	CCCAAAAGGAAGUGCUGUATT	118
CDC25B	NM_021874	AGGAUGAUGAUGCAGUUCCTT	119	CDC25B	NM_021874	GACAAGGAGAAUGUGCGCUTT	120
CDC25B	NM_021874	GAGCCCAGUCUGUUGAGUUTT	121	CDC25B	NM_021874	GACAAGGAGAAUGUGCGCUTT	120
CDC25B	NM_021874	GAGCCCAGUCUGUUGAGUUTT	121	top2B	NM_001068	ACAUUCCCUGGAGUGUACATT	122
top2B	NM_001068	GAGGAUUUAGCGGCAUUUGTT	123	top2B	NM_001068	ACAUUCCCUGGAGUGUACATT	122
top2B	NM_001068	GAGGAUUUAGCGGCAUUUGTT	123	top2B	NM_001068	GCUGCUGGACUGCAUAAAGTT	124
IMPDH2	NM_000884	AGAGGGAAGACUUGGUGGUTT	125	top2B	NM_001068	GCUGCUGGACUGCAUAAAGTT	124
IMPDH2	NM_000884	AGAGGGAAGACUUGGUGGUTT	125	IMPDH2	NM_000884	CACUCAUGCCAGGACAUUGTT	126
IMPDH2	NM_000884	GAAGAAUCGGGACUACCCATT	127	IMPDH2	NM_000884	CACUCAUGCCAGGACAUUGTT	126
IMPDH2	NM_000884	GAAGAAUCGGGACUACCCATT	127		NM_007027	ACUCACAGAAAAACCGUCGTT	128
	NM_007027	AUGAUGGGCGGACGAGUAUTT	129		NM_007027	ACUCACAGAAAAACCGUCGTT	128
	NM_007027	AUGAUGGGCGGACGAGUAUTT	129		NM_007027	GAGUCAGCACCAUCAAAUGTT	130
HDAC4	NM_006037	AGAGGACGUUUUCUACGGCTT	131		NM_007027	GAGUCAGCACCAUCAAAUGTT	130
HDAC4	NM_006037	AGAGGACGUUUUCUACGGCTT	131	HDAC4	NM_006037	AUCUGUUUGCAAGGGGAAGTT	132
HDAC4	NM_006037	CAAGAUCAUCCCCAAGCCATT	133	HDAC4	NM_006037	AUCUGUUUGCAAGGGGAAGTT	132
HDAC4	NM_006037	CAAGAUCAUCCCCAAGCCATT	133	TERT	NM_003219	CACCAAGAAGUUCAUCUCCTT	134
TERT	NM_003219	GAGUGUCUGGAGCAAGUUGTT	135	TERT	NM_003219	CACCAAGAAGUUCAUCUCCTT	134
TERT	NM_003219	GAGUGUCUGGAGCAAGUUGTT	135	TERT	NM_003219	GUUUGGAAGAACCCCACAUTT	136
BRAF	NM_004333	ACACUUGGUAGACGGGACUTT	137	TERT	NM_003219	GUUUGGAAGAACCCCACAUTT	136
BRAF	NM_004333	ACACUUGGUAGACGGGACUTT	137	BRAF	NM_004333	GUCAAUCAUCCACAGAGACTT	138
BRAF	NM_004333	UUGCAUGUGGAAGUGUUGGTT	139	BRAF	NM_004333	GUCAAUCAUCCACAGAGACTT	138
BRAF	NM_004333	UUGCAUGUGGAAGUGUUGGTT	139	ERBB4	NM_005235	GAGUACUCUAUAGUGGCCUTT	140
ERBB4	NM_005235	GCUUCCCAGUCCAAAUGACTT	141	ERBB4	NM_005235	GAGUACUCUAUAGUGGCCUTT	140
ERBB4	NM_005235	GCUUCCCAGUCCAAAUGACTT	141	ERBB4	NM_005235	UGACAGUGGAGCAUGUGUUTT	142
ABL2	NM_007314	AUCAGUGAUGUGGUGCAGATT	143	ERBB4	NM_005235	UGACAGUGGAGCAUGUGUUTT	142
ABL2	NM_007314	AUCAGUGAUGUGGUGCAGATT	143	ABL2	NM_007314	GACUCGGACACUGAAGAAATT	144
ABL2	NM_007314	UGGCACAGCAGGUACUAAATT	145	ABL2	NM_007314	GACUCGGACACUGAAGAAATT	144
ABL2	NM_007314	UGGCACAGCAGGUACUAAATT	145	KRAS2	NM_033360	GAAAAGACUCCUGGCUGUGTT	146
KRAS2	NM_033360	GGACUCUGAAGAUGUACCUTT	147	KRAS2	NM_033360	GAAAAGACUCCUGGCUGUGTT	146
KRAS2	NM_033360	GGACUCUGAAGAUGUACCUTT	147	KRAS2	NM_033360	GGCAUACUAGUACAAGUGGTT	148
	NM_021170	AUCCUGGAGAUGACCGUGATT	149	KRAS2	NM_033360	GGCAUACUAGUACAAGUGGTT	148
	NM_021170	AUCCUGGAGAUGACCGUGATT	149		NM_021170	GCCGGUCAUGGAGAAGCGGTT	150
	NM_021170	UGGCCCUGAGACUGCAUCGTT	151		NM_021170	GCCGGUCAUGGAGAAGCGGTT	150
	NM_021170	UGGCCCUGAGACUGCAUCGTT	151	ELK1	NM_005229	GCCAUUCCUUUGUCUGCCATT	152
ELK1	NM_005229	GUGAAAGUAGAAGGGCCCATT	153	ELK1	NM_005229	GCCAUUCCUUUGUCUGCCATT	152
ELK1	NM_005229	GUGAAAGUAGAAGGGCCCATT	153	ELK1	NM_005229	UUCAAGCUGGUGGAUGCAGTT	154
RASAL2	NM_004841	AGUACCAGGAUUCUUCAGCTT	155	ELK1	NM_005229	UUCAAGCUGGUGGAUGCAGTT	154
RASAL2	NM_004841	AGUACCAGGAUUCUUCAGCTT	155	RASAL2	NM_004841	CUUAGUUCUGGGCCAUGUATT	156
RASAL2	NM_004841	GACGCCACUGACAGUGAUUTT	157	RASAL2	NM_004841	CUUAGUUCUGGGCCAUGUATT	156
RASAL2	NM_004841	GACGCCACUGACAGUGAUUTT	157	ARHGEF2	NM_004723	AGCUACACCACAGAUGCCATT	158
ARHGEF2	NM_004723	GGACUUUGCAGCUGACUCUTT	159	ARHGEF2	NM_004723	AGCUACACCACAGAUGCCATT	158
ARHGEF2	NM_004723	GGACUUUGCAGCUGACUCUTT	159	ARHGEF2	NM_004723	UAAAGGUUGGGGUGGCCAUTT	160

FRAT1	NM_005479	AAGCUAAUGACGAGGAACCTT	161
FRAT1	NM_005479	AAGCUAAUGACGAGGAACCTT	161	FRAT1	NM_005479	CCAUGGUGAAGUGCUUGGATT	162
FRAT1	NM_005479	UAACAGCUGCAAUUCCCUGTT	163	FRAT1	NM_005479	CCAUGGUGAAGUGCUUGGATT	162
FRAT1	NM_005479	UAACAGCUGCAAUUCCCUGTT	163	CTNNA2	NM_004389	CCUGAUGAAUGCUGUUGUCTT	164
CTNNA2	NM_004389	GCACAAUACGGUGACCAAUTT	165	CTNNA2	NM_004389	CCUGAUGAAUGCUGUUGUCTT	164
CTNNA2	NM_004389	GCACAAUACGGUGACCAAUTT	165	CTNNA2	NM_004389	UCACAUCUUGGAGGAUGUGTT	166
AXIN1	AF009674	GAAAGUGAGCGACGAGUUUTT	167	CTNNA2	NM_004389	UCACAUCUUGGAGGAUGUGTT	166
AXIN1	AF009674	GAAAGUGAGCGACGAGUUUTT	167	AXIN1	AF009674	GUGCCUUCAACACAGCUUGTT	168
AXIN1	AF009674	UGAAUAUCCAAGAGCAGGGTT	169	AXIN1	AF009674	GUGCCUUCAACACAGCUUGTT	168
AXIN1	AF009674	UGAAUAUCCAAGAGCAGGGTT	169	EPHB3	NM_004443	GAAGAUCCUGAGCAGUAUCTT	170
EPHB3	NM_004443	GCUGCAGCAGUACAUUGCUTT	171	EPHB3	NM_004443	GAAGAUCCUGAGCAGUAUCTT	170
EPHB3	NM_004443	GCUGCAGCAGUACAUUGCUTT	171	EPHB3	NM_004443	UACCCUGGACAAGCUCAUCTT	172
DDR1	NM_013994	AACAAGAGGACACAAUGGCTT	173	EPHB3	NM_004443	UACCCUGGACAAGCUCAUCTT	172
DDR1	NM_013994	AACAAGAGGACACAAUGGCTT	173	DDR1	NM_013994	AGAGGUGAAGAUCAUGUCGTT	174
DDR1	NM_013994	UCGCAGACUUUGGCAUGAGTT	175	DDR1	NM_013994	AGAGGUGAAGAUCAUGUCGTT	174
DDR1	NM_013994	UCGCAGACUUUGGCAUGAGTT	175	CLK2	NM_003993	AUCGUUAGCACCUUAGGAGTT	176
CLK2	NM_003993	CCCCUGCCUUGUACAUAAUTT	177	CLK2	NM_003993	AUCGUUAGCACCUUAGGAGTT	176
CLK2	NM_003993	CCCCUGCCUUGUACAUAAUTT	177	CLK2	NM_003993	GUACAAGGAAGCAGCUCGATT	178
C20orf97	NM_021158	AGUCCCAGGUGGGACUCUUTT	179	CLK2	NM_003993	GUACAAGGAAGCAGCUCGATT	178
C20orf97	NM_021158	AGUCCCAGGUGGGACUCUUTT	179	C20orf97	NM_021158	CUGGCAUCCUUGAGCUGACTT	180
C20orf97	NM_021158	GACUGUUCUGGAAUGAGGGTT	181	C20orf97	NM_021158	CUGGCAUCCUUGAGCUGACTT	180
C20orf97	NM_021158	GACUGUUCUGGAAUGAGGGTT	181		X95425	ACUGCCAGGAGUAAGAACUTT	182
	X95425	CUAUUACUGCAGAGGGCUUTT	183		X95425	ACUGCCAGGAGUAAGAACUTT	182
	X95425	CUAUUACUGCAGAGGGCUUTT	183		X95425	UGCAUCCUGCAGAGUAUCUTT	184
RPS6KA6	NM_014496	CCUCCUUUCAAACCUGCUUTT	185		X95425	UGCAUCCUGCAGAGUAUCUTT	184
RPS6KA6	NM_014496	CCUCCUUUCAAACCUGCUUTT	185	RPS6KA6	NM_014496	GAGGUUCUGUUUACAGAGGTT	186
RPS6KA6	NM_014496	UCAGCCAGUGCAGAUUCAATT	187	RPS6KA6	NM_014496	GAGGUUCUGUUUACAGAGGTT	186
RPS6KA6	NM_014496	UCAGCCAGUGCAGAUUCAATT	187		AB002301	AGACAAAGAGGGGACCUUCTT	188
	AB002301	GAAAGUCUAUCCGAAGGCUTT	189		AB002301	AGACAAAGAGGGGACCUUCTT	188
	AB002301	GAAAGUCUAUCCGAAGGCUTT	189		AB002301	UGCCUCCCUGAAACUUCGATT	190
GPRK6	NM_002082	AAGCAAGAAAUGGCGGCAGTT	191		AB002301	UGCCUCCCUGAAACUUCGATT	190
GPRK6	NM_002082	AAGCAAGAAAUGGCGGCAGTT	191	GPRK6	NM_002082	GAGCUGAAUGUCUUUGGGCTT	192
GPRK6	NM_002082	UGUAUAUAGCGACCAGAGCTT	193	GPRK6	NM_002082	GAGCUGAAUGUCUUUGGGCTT	192
GPRK6	NM_002082	UGUAUAUAGCGACCAGAGCTT	193	GSK3A	NM_019884	CUUCAGUGCUGGUGAACUCTT	194
GSK3A	NM_019884	GCUGGACCACUGCAAUAUUTT	195	GSK3A	NM_019884	CUUCAGUGCUGGUGAACUCTT	194
GSK3A	NM_019884	GCUGGACCACUGCAAUAUUTT	195	GSK3A	NM_019884	GUGGCUUACACGGACAUCATT	196
RAD51L1	NM_133510	AACAGGACCGUACUGCUUGTT	197	GSK3A	NM_019884	GUGGCUUACACGGACAUCATT	196
RAD51L1	NM_133510	AACAGGACCGUACUGCUUGTT	197	RAD51L1	NM_133510	GAAGCCUUUGUUCAGGUCUTT	198
RAD51L1	NM_133510	GAGAGGCAUCCUCCUUGAATT	199	RAD51L1	NM_133510	GAAGCCUUUGUUCAGGUCUTT	198
RAD51L1	NM_133510	GAGAGGCAUCCUCCUUGAATT	199	NOTCH4	NM_004557	CCAGCACUGACUACUGUGUTT	200
NOTCH4	NM_004557	GGAACUCGAUGCUUGUCAGTT	201	NOTCH4	NM_004557	CCAGCACUGACUACUGUGUTT	200
NOTCH4	NM_004557	GGAACUCGAUGCUUGUCAGTT	201	NOTCH4	NM_004557	UGCGAGGAAGAUACGGAGUTT	202
MCM3	NM_002388	GCAGAUGAGCAAGGAUGCUTT	203	NOTCH4	NM_004557	UGCGAGGAAGAUACGGAGUTT	202
MCM3	NM_002388	GCAGAUGAGCAAGGAUGCUTT	203	MCM3	NM_002388	GUACAUCCAUGUGGCCAAATT	204
MCM3	NM_002388	UGGGUCAUGAAAGCUGCCATT	205	MCM3	NM_002388	GUACAUCCAUGUGGCCAAATT	204
MCM3	NM_002388	UGGGUCAUGAAAGCUGCCATT	205	FZD4	NM_012193	AGAACCUCGGCUACAACGUTT	206
PZD4	NM_012193	UCCGCAUCUCCAUGUGCCATT	207	FZD4	NM_012193	AGAACCUCGGCUACAACGUTT	206
PZD4	NM_012193	UCCGCAUCUCCAUGUGCCATT	207	FZD4	NM_012193	UCGGCUACAACGUGACCAATT	208

表IIIB用于DNA破坏剂的筛选中的siRNA序列：阿霉素筛选

基因符号	序列ID	有义序列	SEQ ID NO
基因符号	序列ID	有义序列	SEQ ID NO	AATK	AB014541	CGCAAGAAGAAGGCCGUGUTT	209
AATK	AB014541	CGCUGGUGCAAUGUUUUCUTT	210	AATK	AB014541	CGCAAGAAGAAGGCCGUGUTT	209
AATK	AB014541	CGCUGGUGCAAUGUUUUCUTT	210	AATK	AB014541	GAAUCCCUACCGAGACUCUTT	211
ABL1	NM_007313	AAACCUCUACACGUUCUGCTT	212	AATK	AB014541	GAAUCCCUACCGAGACUCUTT	211
ABL1	NM_007313	AAACCUCUACACGUUCUGCTT	212	ABL1	NM_007313	CUAAAGGUGAAAAGCUCCGTT	213
ABL1	NM_007313	UCCUGGCAAGAAAGCUUGATT	214	ABL1	NM_007313	CUAAAGGUGAAAAGCUCCGTT	213
ABL1	NM_007313	UCCUGGCAAGAAAGCUUGATT	214	ACVR2	NM_001616	AAGAUGGCCACAAACCUGCTT	215
ACVR2	NM_001616	AGAUAAACGGCGGCAUUGUTT	216	ACVR2	NM_001616	AAGAUGGCCACAAACCUGCTT	215
ACVR2	NM_001616	AGAUAAACGGCGGCAUUGUTT	216	ACVR2	NM_001616	GACAUGCAGGAAGUUGUUGTT	217
ACVR2B	NM_001106	CGGGAGAUCUUCAGCACACTT	218	ACVR2	NM_001616	GACAUGCAGGAAGUUGUUGTT	217
ACVR2B	NM_001106	CGGGAGAUCUUCAGCACACTT	218	ACVR2B	NM_001106	GAGAUUGGCCAGCACCCUUTT	219
ACVR2B	NM_001106	GCCCAGGACAUGAGUGUCUTT	220	ACVR2B	NM_001106	GAGAUUGGCCAGCACCCUUTT	219
ACVR2B	NM_001106	GCCCAGGACAUGAGUGUCUTT	220	ADRBK2	NM_005160	CGAGGAUGAGGCAUCUGAUTT	221
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ADRBK2	NM_005160	CUGAAGUCCCUUUUGGAGGTT	222	ADRBK2	NM_005160	GAACUUCCCUUUGGUCAUCTT	223
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AKT1	NM_005163	CGCACCUUCCAUGUGGAGATT	226	AKT1	NM_005163	AGACGUUUUUGUGCUGUGGTT	225
AKT1	NM_005163	CGCACCUUCCAUGUGGAGATT	226	AKT2	NM_001626	AGAUGGCCACAUCAAGAUCTT	227
AKT2	NM_001626	GUCAUCAUUGCCAAGGAUGTT	228	AKT2	NM_001626	AGAUGGCCACAUCAAGAUCTT	227
AKT2	NM_001626	GUCAUCAUUGCCAAGGAUGTT	228	AKT2	NM_001626	UGCCAGCUGAUGAAGACCGTT	229
ALK	NM_004304	ACCAGAGACCAAAUGUCACTT	230	AKT2	NM_001626	UGCCAGCUGAUGAAGACCGTT	229
ALK	NM_004304	ACCAGAGACCAAAUGUCACTT	230	ALK	NM_004304	AUAAGCCCACCAGCUUGUGTT	231
ALK	NM_004304	UCAACACCGCUUUGCCGAUTT	232	ALK	NM_004304	AUAAGCCCACCAGCUUGUGTT	231
ALK	NM_004304	UCAACACCGCUUUGCCGAUTT	232	ALS2CR7	NM_139158	CUGGCUGAUUUUGGUCUUGTT	233
ALS2CR7	NM_139158	GCCUUCAUGUUGUCUGGAATT	234	ALS2CR7	NM_139158	CUGGCUGAUUUUGGUCUUGTT	233
ALS2CR7	NM_139158	GCCUUCAUGUUGUCUGGAATT	234	ALS2CR7	NM_139158	UCCACACCAAAGAGACACUTT	235
AXIN1	AF009674	GAAAGUGAGCGACGAGUUUTT	236	ALS2CR7	NM_139158	UCCACACCAAAGAGACACUTT	235
AXIN1	AF009674	GAAAGUGAGCGACGAGUUUTT	236	AXIN1	AF009674	GUGCCUUCAACACAGCUUGTT	237
AXIN1	AF009674	UGAAUAUCCAAGAGCAGGGTT	238	AXIN1	AF009674	GUGCCUUCAACACAGCUUGTT	237
AXIN1	AF009674	UGAAUAUCCAAGAGCAGGGTT	238	BLK	NM_001715	AGUCACGAGCGUUCGAAAATT	239
BLK	NM_001715	CAACAUGAAGGUGGCCAUUTT	240	BLK	NM_001715	AGUCACGAGCGUUCGAAAATT	239
BLK	NM_001715	CAACAUGAAGGUGGCCAUUTT	240	BLK	NM_001715	GCACUAUAAGAUCCGCUGCTT	241
BMPR2	NM_001204	CAAAUCUGUGAGCCCAACATT	242	BLK	NM_001715	GCACUAUAAGAUCCGCUGCTT	241
BMPR2	NM_001204	CAAAUCUGUGAGCCCAACATT	242	BMPR2	NM_001204	CAAGAUGUUCUUGCACAGGTT	243
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BMPR2	NM_001204	GAACGGCUAUGUGCGUUUATT	244	BRAF	NM_004333	ACACUUGGUAGACGGGACUTT	245
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C20orf97	NM_021158	AGUCCCAGGUGGGACUCUUTT	248	BRAF	NM_004333	UUGCAUGUGGAAGUGUUGGTT	247
C20orf97	NM_021158	AGUCCCAGGUGGGACUCUUTT	248	C20orf97	NM_021158	CUGGCAUCCUUGAGCUGACTT	249
C20orf97	NM_021158	GACUGUUCUGGAAUGAGGGTT	250	C20orf97	NM_021158	CUGGCAUCCUUGAGCUGACTT	249
C20orf97	NM_021158	GACUGUUCUGGAAUGAGGGTT	250	CAMK2G	BC021269	GACAUUGUGGCCAGAGAGUTT	251
CAMK2G	BC021269	GAUGAGGACCUCAAAGUGCTT	252	CAMK2G	BC021269	GACAUUGUGGCCAGAGAGUTT	251
CAMK2G	BC021269	GAUGAGGACCUCAAAGUGCTT	252	CAMK2G	BC021269	GGCUGGAGCCUAUGAUUUCTT	253
CCND3	NM_001760	AAAGCAUGCCCAGACCUUUTT	254	CAMK2G	BC021269	GGCUGGAGCCUAUGAUUUCTT	253
CCND3	NM_001760	AAAGCAUGCCCAGACCUUUTT	254	CCND3	NM_001760	AAGGAUCUUUGUGGCCAAGTT	255
CCND3	NM_001760	CUACCUGGAUCGCUACCUGTT	256	CCND3	NM_001760	AAGGAUCUUUGUGGCCAAGTT	255
CCND3	NM_001760	CUACCUGGAUCGCUACCUGTT	256	CCNE2	NM_057749	CCACAGAUGAGGUCCAUACTT	257
CCNE2	NM_057749	CUGGGGCUUUCUUGACAUGTT	258	CCNE2	NM_057749	CCACAGAUGAGGUCCAUACTT	257
CCNE2	NM_057749	CUGGGGCUUUCUUGACAUGTT	258	CCNE2	NM_057749	GUGGUUAAGAAAGCCUCAGTT	259

CCNG1	NM_004060	AUGGAUUGUUUCUGGGCGUTT	260
CCNG1	NM_004060	AUGGAUUGUUUCUGGGCGUTT	260	CCNG1	NM_004060	CUAUCAGUCUUCCCACAGCTT	261
CCNG1	NM_004060	CUUGCCACUUGAAAGGAGATT	262	CCNG1	NM_004060	CUAUCAGUCUUCCCACAGCTT	261
CCNG1	NM_004060	CUUGCCACUUGAAAGGAGATT	262	CCNG2	NM_004354	CCUCGAGAAAAAGGGCUGATT	263
CCNG2	NM_004354	GCUCAGCUGAAAGCUUGCATT	264	CCNG2	NM_004354	CCUCGAGAAAAAGGGCUGATT	263
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CCNH	NM_001239	GACCCGCUAUCCCAUAUUGTT	266	CCNG2	NM_004354	UGCCUAGCCGAGUAUUCUUTT	265
CCNH	NM_001239	GACCCGCUAUCCCAUAUUGTT	266	CCNH	NM_001239	GCCAGCAAUGCCAAGAUCUTT	267
CCNH	NM_001239	UUGCCCUGACUGCCAUUUUTT	268	CCNH	NM_001239	GCCAGCAAUGCCAAGAUCUTT	267
CCNH	NM_001239	UUGCCCUGACUGCCAUUUUTT	268	CCNT2	NM_058241	AGCGCCAGUAAAGAAGAACTT	269
CCNT2	NM_058241	AGGGCAGCCAGUUGUCAUUTT	270	CCNT2	NM_058241	AGCGCCAGUAAAGAAGAACTT	269
CCNT2	NM_058241	AGGGCAGCCAGUUGUCAUUTT	270	CCNT2	NM_058241	CCACCACUCCAAAAUGAGCTT	271
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表IIIC用于DNA破坏剂的筛选中的siRNA序列：喜树碱筛选

基因符号	序列ID	有义序列	SEQ ID NO
基因符号	序列ID	有义序列	SEQ ID NO	AATK	AB014541	CGCAAGAAGAAGGCCGUGUTT	724
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6.4.实施例4：作为抗癌药物靶的BRCA1/BARD1E3遍在蛋白连接酶

实施例2和3描述了鉴定增强DNA破坏剂导致的细胞杀伤的基因的siRNA筛选。在本实施例中，用或不用顺铂处理HeLa细胞，并且研究了通过BRCC复合物的一个成员导致的敏化(图19)。BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51是特定基因中最明显的，所述特定基因的破坏使细胞对DNA破坏敏感，BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51都是增强DNA破坏后细胞存活的BRCC复合物的成员(Dong et al.，Mol Cell.2003Nov；12(5)：1087-99)。BRCA1、BRCA2和BARD1导致的敏化针对顺铂浓度都是剂量依赖性的，但仅仅在低顺铂浓度时观察到了RAD51导致的敏化(图1)。在其它实验中，发现BRCA1和BRCA2的破坏使得顺铂对HeLa细胞生长的抑制的IC50浓度减少了＞大约4倍(数据未示出)。BRCA1、BRCA2和BARD1siRNA集合导致的沉默是大约85％-98％(数据未示出)。表IV列出了本实施例中使用的BARD1和RAD51的siRNA序列。

这些发现的显著之处在于BRCA1、BRCA2、BARD21和RAD51基因的产物与增强DNA破坏后的细胞存活的全酶复合物(BRCC)缔合(Dong et al.，Mol Cell.2003Nov；12(5)：1087-99)。该复合物具有E3Ub连接酶活性，其中的大多数可以作为BRCAl/BARD1异二聚体回收(Dong et al.，Mol Cell.2003Nov；12(5)：1087-99；Brzovicet al.，Nat Struct Biol.2001Oct；8(10)：833-7)。这些发现强烈表明BRCC在我们的siRNA筛选中参与介导对顺铂的敏感性。出乎意料地，另一种多亚基复合物-FANC复合物的成员(FANCA、FANCC、FANCE和FANCF)的siRNA集合参与决定对顺铂的抗性(Taniguchiet al.，Nat Med.2003May；9(5)：568-74)，其在我们的测定中不增加敏感性(数据未示出)。

为了确定BRCA1或BRCA2破坏导致的对顺铂的敏化是否受到靶细胞中TP53表达存在或缺乏的影响，使用了通过稳定表达靶定TP53的短发夹RNA(shRNA)产生的匹配的TP53阳性和阴性细胞对(参见实施例2)。用BRCA1或BRCA2的siRNA集合超转染TP53阳性或阴性细胞，用顺铂处理，并且用Alamar Blue分析细胞生长(图20)。当用BRCA1或BRCA2siRNAs(IC50约0.1nM)转染时，TP53阴性细胞对顺铂比用对照siRNA(荧光素酶，IC50约1nM)转染时敏感约10倍。在更低的顺铂浓度，BRCA1或BRCA2破坏后对顺铂的敏化作用甚至更显著。BRCA1或BRCA2破坏后，TP53阳性细胞对顺铂较不敏感(IC50约0.4nM)。在该分析中，BRCA1或BRCA2破坏后对顺铂的敏化作用在数量级上与在CHEK1破坏后的敏化作用相似(数据未示出)。也可以用细胞周期分析，研究BRCA1和BRCA2破坏后对DNA破坏剂的敏化作用。用BRCA1或BRCA2的siRNA集合超转染TP53阳性和阴性细胞，用一些DNA破坏剂(顺铂、喜树碱、阿霉素和博莱霉素)中的一种处理，并且通过流式细胞术分析细胞周期破坏。在所有情况下，TP53阴性细胞在BRCA1和BRCA2破坏后比在荧光素酶转染的细胞中对DNA破坏剂更敏感(数据未示出)。BRCA1破坏后这些细胞对博莱霉素的反应示于图21。BRCA1破坏在用博莱霉素处理TP53阴性细胞后，比处理TP53阳性细胞导致了更多的亚G1细胞(死亡细胞)。所述结果表明，缺乏TP53的细胞在BRCA1破坏后对DNA破坏更敏感。图22表示证明RAD51/阿霉素协同作用在TP53-细胞中更强的结果。

本实施例中使用的细胞系是HeLa细胞、TP53阳性A549细胞和TP53阴性A549细胞。通过稳定转染靶定TP53的短发夹RNA(shRNA)，制备了匹配的TP53阳性和阴性细胞对(monthly highlthighlight，Nov.2003)。用100nM(每种siRNA 33nM)的siRNA集合(每个基因三种siRNA的集合)转染细胞，或用100nM的单一siRNA转染细胞。我们的研究中使用了以下siRNA：Luc对照、BRCA1、BRCA2和BARD1集合。然后用各种浓度的DNA破坏剂处理转染的细胞。细胞周期分析中使用的每种试剂的浓度如下：对于HeLa细胞，使用阿霉素(10nM)、喜树碱(6nM)、顺铂(400ng/ml)、丝裂霉素C(40nM)、博莱霉素(100ng/ml)；对于其它细胞系，使用阿霉素(200nM)、喜树碱(200nM)、顺铂(2ug/ml)丝裂霉素C(400nM)、博莱霉素(5ug/ml)。

按如下进行siRNA转染：在转染前一天，将2000(或100)微升选定的细胞系，如在DMEM/10％胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)中生长至约90％汇合的宫颈癌HeLa细胞(ATCC，Cat.No.CCL-2)以45,000(或2000)细胞/孔种植在6孔(或96孔)组织培养板上。对于每次转染，将70微升OptiMEM(Invitrogen)与来自20微摩尔储液的5微升siRNA(Dharmacon，Lafayette，CO)混合。对于每次转染，将20微升OptiMEM与5微升Oligofectamine试剂(Invitrogen)混合，并且在室温下温育5分钟。然后将25微升OptiMEM/Oligofectamine混合物与75微升OptiMEM/siRNA混合物混合，并且在室温下温育15-20分钟。将100(或10)微升转染混合物等分到6孔(或96孔)板的每个孔中，并且在37℃和5％CO2的条件下温育4小时。

BRCA1有很多功能，但唯一已知的酶功能是E3Ub连接酶活性。该活性通过BARD1与BRCA1的缔合而增强，并且导致BRCA1/BARD1复合物通过非常规的遍在蛋白K6键而自身遍在蛋白化(Wu-Baer et al.，J Biol Chem.2003Sep 12；278(37)：34743-6；Chen et al.，J Biol Chem.2002Jun 14；277(24)：22085-92)。可获得的证据表明，BRCA1 E3 Ub连接酶活性是其DNA修复功能所必须的。BRCA1 RING结构域中的倾向于癌症的突变消除了其Ub连接酶活性，并且这些突变不能逆转无BRCA1的人类乳腺癌细胞对γ射线的高敏感性(Ruffner et al.，Proc Natl Acad SciU S A.2001Apr 24；98(9)：5134-9)。此外，siRNA介导的BRCA1破坏，阻断了细胞核中作为接受γ射线辐射的细胞中DNA修复和关卡激活位点的细胞核部位中多遍在蛋白结构的沉积(Morris et al.，Hum Mol Genet.2004Apr15；13(8)：807-17)。重要的是指出BRCA1介导的遍在蛋白键(K6)不同于使蛋白受到蛋白酶体降解的遍在蛋白键(K48)(Wu-Baer etal.，J Biol Chem.2003Sep 12；278(37)：34743-6；Morris et al.，HumMol Genet.2004Apr 15；13(8)：807-17)。目前还不知道K6键的功能，但已知它可以具有信号传递功能。

综上所述，这些发现和文献中的发现提示，BRCA1 E3 Ub连接酶活性的抑制剂可能是有效的抗癌剂，因为相对于正常细胞(TP53阳性)，它可以增强DNA破坏剂对肿瘤细胞(大多数是TP53阴性)的治疗窗。进行了BRCA1水平对顺铂敏感性增强的剂量依赖性与多遍在蛋白在细胞核部位中的沉积研究，以观察这些事件是否具有因果关系。也研究了BRCA1 E3 Ub连接酶的化学抑制剂，以确立多遍在蛋白化在DNA破坏的修复中的作用。

提示存在其它在DNA破坏修复中起作用的E3 Ub连接酶的证据来自酵母研究(Spence et al.，Mol Cell Biol.1995Mar；15(3)：1265-73)，表明DNA破坏修复需要具有非蛋白水解特异性的Ub连接酶(K63键)。为了促进参与DNA破坏修复的连接酶的鉴定，我们在我们的siRNA文库中添加了与BRCA1具有相似结构域结构(无名指结构域连接酶)的多个E3连接酶的siRNA，希望通过我们的文库筛选发现使细胞对DNA破坏敏感的那些。

表IVBARD1和RAD51的siRNA序列

	有义序列	序列ID	基因名称	SEQ ID NO
	有义序列	序列ID	基因名称	SEQ ID NO	5093	CAGUAAUUCUUAAGGCUAATT	NM_000465	BARD1	1237
5094	CUCCUGAGAAGGUCUGCAATT	NM_000465	BARD1	1238	5093	CAGUAAUUCUUAAGGCUAATT	NM_000465	BARD1	1237
5094	CUCCUGAGAAGGUCUGCAATT	NM_000465	BARD1	1238	5095	CGCAGAAGCAGGCUCAACATT	NM_000465	BARD1	1239
6920	GUUAGAGCAGUGUGGCAUATT	NM_002875	RAD51	1240	5095	CGCAGAAGCAGGCUCAACATT	NM_000465	BARD1	1239
6920	GUUAGAGCAGUGUGGCAUATT	NM_002875	RAD51	1240	6921	GGUAUGCACUGCUUAUUGUTT	NM_002875	RAD51	1241
6922	CAGAUUGUAUCUGAGGAAATT	NM_002875	RAD51	1242	6921	GGUAUGCACUGCUUAUUGUTT	NM_002875	RAD51	1241

7.引用的参考文献

在此为所有目的而全文引入本文中引用的所有参考文献，其程度如同特定并单独指出引入为所有目的而全文引入每个单独的公开文献或专利或专利申请。

可以对本发明进行很多修改和变化，而不离开其精神和范围，这对本领域技术人员是显而易见的。此处描述的具体实施方式仅仅是为了举例说明，本发明仅仅受到所附权利要求以及所述权利要求的全部等同范围的限定。

Claims

1.鉴定基因的方法，所述基因的产物调节一种试剂对一种细胞类型的细胞的作用，所述方法包括

(a)使所述细胞类型的一种或多种细胞的大量的组与所述试剂接触，其中每个所述的一种或多种细胞的组包含来自大量的不同siRNA的一种或多种不同的小干扰RNA(siRNA)，所述一种或多种不同的siRNA靶定相同的基因，并且所述大量的不同siRNA包含分别靶定所述细胞类型的细胞中的不同基因的siRNA；

(b)将所述试剂对每个所述的一种或多种细胞的组的作用与所述试剂对不包含靶定任一所述不同基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用进行比较；和

(c)如果所述试剂对包含靶定所述基因的所述一种或多种不同siRNA的所述一种或多种细胞的组的作用与所述试剂对不包含靶定任一所述不同基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用不同，则鉴定基因为所述的其产物调节所述试剂对所述细胞类型的细胞的作用的基因。

2.权利要求1的方法，其中包含所述大量siRNA中的一种或多种的每个所述的细胞组是通过在所述接触步骤之前用所述一种或多种siRNA转染而获得的。

3.鉴定基因的方法，所述基因的产物调节一种试剂对一种细胞类型的细胞的作用，所述方法包括

(a)用包含来自大量的不同siRNA的一种或多种不同的小干扰RNA(siRNA)的组合物转染所述细胞类型的一种或多种细胞的大量的组中的每一个，所述一种或多种不同的siRNA靶定相同的基因，并且所述大量的不同siRNA包含分别靶定所述细胞类型的细胞中的不同基因的siRNA；

(b)使一种或多种细胞的所述大量的组与所述试剂接触；

(c)将所述试剂对每个所述的一种或多种细胞的组的作用与所述试剂对没有用靶定任一所述不同基因的siRNA转染的所述细胞类型的细胞的作用进行比较；和

(d)如果所述试剂对包含靶定所述基因的所述一种或多种不同siRNA的所述一种或多种细胞的组的作用与所述试剂对不包含靶定任一所述不同基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用不同，则鉴定基因为所述的其产物调节所述试剂对所述细胞类型的细胞的作用的基因。

4.权利要求1-3的任意一项的方法，其中与所述试剂对不包含靶定任一所述不同基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用相比，所述试剂对包含所述siRNA的每个所述一种或多种细胞的组的作用增强。

5.权利要求1-3的任意一项的方法，其中与所述试剂对不包含靶定任一所述不同基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用相比，所述试剂对包含所述siRNA的每个所述一种或多种细胞的组的作用减弱。

6.权利要求1-3的任意一项的方法，其中所述试剂作用于由所述大量siRNA靶定的任一所述不同基因以外的基因或其编码的蛋白。

7.权利要求3的方法，其中所述大量siRNA包含靶定所述不同基因中至少一种基因的至少k种不同的siRNA，其中所述k选自2、3、4、5、6和10。

8.权利要求7的方法，其中靶定所述至少一种基因的所述一种或多种不同的siRNA包含2、3、4、5、6或10种不同的siRNA。

9.权利要求7的方法，其中所述大量siRNA包含靶定所述不同基因中的至少两种不同基因中的每一种的至少k种不同的siRNA，其中所述k选自2、3、4、5、6和10。

10.权利要求9的方法，其中靶定所述至少两种不同基因中的每一种的所述一种或多种不同的siRNA包含2、3、4、5、6或10种不同的siRNA。

11.权利要求9的方法，其中所述大量siRNA包含靶定所述不同基因中的每一种的至少k种不同的siRNA，其中所述k选自2、3、4、5、6和10。

12.权利要求11的方法，其中靶定所述不同基因中的每一种的所述一种或多种不同的siRNA包含2、3、4、5、6或10种不同的siRNA。

13.权利要求5的方法，其中所述细胞类型是癌细胞类型。

14.权利要求13的方法，其中所述细胞类型是癌细胞类型，并且其中所述作用是生长抑制作用。

15.权利要求12的方法，其中所述试剂是KSP抑制剂。

16.权利要求7-15的任意一项的方法，其中所述多种不同的基因包含至少N种不同的基因，其中N选自5、10、100、1000和5000种不同的基因。

17.权利要求1-3的任意一项的方法，其中所述不同的基因是不同的内源基因。

18.鉴定与一种细胞类型的细胞中的初级靶基因相互作用的基因的方法，所述方法包括

(a)使所述细胞类型的一种或多种细胞的大量的组与一种试剂接触，其中所述试剂调节所述初级靶基因的表达和/或由所述初级靶基因编码的蛋白的活性，并且其中所述细胞的组包含大量的不同siRNA中的一种或多种不同的siRNA，所述一种或多种不同的siRNA靶定相同的基因，并且所述大量的不同siRNA包含分别靶定所述细胞中的不同次级基因的siRNA；

(b)将所述试剂对每个所述的一种或多种细胞的组的作用与所述试剂对不包含靶定任一所述不同次级基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用进行比较；和

(c)如果所述试剂对包含靶定所述基因的一种或多种siRNA的所述一种或多种细胞的组的作用与所述试剂对不包含靶定任一所述不同次级基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用不同，则鉴定基因为所述与所述细胞类型的细胞中的所述初级靶基因相互作用的基因。

19.权利要求18的方法，其中包含所述大量siRNA中的一种或多种的每个所述的细胞组是通过在所述接触步骤之前用所述一种或多种siRNA转染而获得的。

20.鉴定与一种细胞类型的细胞中的初级靶基因相互作用的基因的方法，所述方法包括

(b)使所述细胞类型的一种或多种细胞的所述大量的组与一种试剂接触，其中所述试剂调节所述初级靶基因的表达和/或由所述初级靶基因编码的蛋白的活性；

(c)将所述试剂对每个所述的一种或多种细胞的组的作用与所述试剂对不包含靶定任一所述不同次级基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用进行比较；和

(d)如果所述试剂对包含靶定所述基因的一种或多种siRNA的所述一种或多种细胞的组的作用与所述试剂对不包含靶定任一所述不同次级基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用不同，则鉴定基因为所述与所述细胞类型的细胞中的所述初级靶基因相互作用的基因。

21.权利要求18-20的任意一项的方法，其中所述试剂是靶定所述初级靶基因并使其沉默的siRNA。

22.权利要求18-20的任意一项的方法，所述试剂是所述初级靶基因的抑制剂。

23.权利要求18-20的任意一项的方法，其中与所述试剂对不包含靶定任一所述不同次级基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用相比，所述试剂对包含所述一种或多种siRNA的所述一种或多种细胞的组的作用增强。

24.权利要求18-20的任意一项的方法，其中与所述试剂对不包含靶定任一所述不同次级基因的siRNA的所述细胞类型的细胞的作用相比，所述试剂对包含所述一种或多种siRNA的所述一种或多种细胞的组的作用减弱。

25.权利要求20的方法，其中所述大量siRNA包含靶定至少一种所述不同次级基因的至少k种不同的siRNA，其中所述k选自2、3、4、5、6和10。

26.权利要求25的方法，其中靶定所述至少一种基因的所述一种或多种不同的siRNA包含2、3、4、5、6或10种不同的siRNA。

27.权利要求18的方法，其中所述大量siRNA包含靶定所述不同次级基因中的至少两种不同基因中的每一种的至少k种不同的siRNA，其中所述k选自2、3、4、5、6和10。

28.权利要求27的方法，其中靶定所述至少两种不同基因中的每一种的所述一种或多种不同的siRNA包含2、3、4、5、6或10种不同的siRNA。

29.权利要求27的方法，其中所述大量siRNA包含靶定所述不同次级基因中的每一种的至少k种不同的siRNA，其中所述k选自2、3、4、5、6和10。

30.权利要求29的方法，其中靶定所述不同基因中的每一种的所述一种或多种不同的siRNA包含2、3、4、5、6或10种不同的siRNA。

31.权利要求22的方法，其中所述初级靶基因是KSP。

32.权利要求18的方法，其中所述多种不同的基因包含至少N种不同的基因，其中N选自5、10、100、1000和5000种不同的基因。

33.权利要求18-20的任意一项的方法，其中所述不同的次级基因是不同的内源基因。

34.权利要求18-20的任意一项的方法，其中所述细胞类型是癌细胞类型。

35.权利要求8或26的方法，其中所述组合物中所述一种或多种siRNA的总siRNA浓度是用于使所述靶基因沉默的最优浓度，其中所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，基本不增加沉默的水平。

36.权利要求35的方法，其中所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，沉默水平的增加不超过20％、不超过10％、或不超过5％。

37.权利要求35的方法，其中所述一种或多种siRNA的每一种的浓度大约相同。

38.权利要求35的方法，其中所述一种或多种siRNA各自的浓度彼此之间的差别小于50％、小于20％、或小于10％。

39.权利要求35的方法，其中所述组合物中没有一种siRNA的浓度占所述一种或多种siRNA的总siRNA浓度的80％以上、50％以上、或20％以上。

40.权利要求35的方法，其中所述组合物中至少一种siRNA的浓度占所述一种或多种siRNA的总siRNA浓度的20％以上或50％以上。

41.权利要求8或26的方法，其中选择不同siRNA的数目和所述组合物中每一种siRNA的浓度，使得所述组合物导致任何不作为靶的基因的沉默小于10％、小于1％、小于0.1％或小于0.01％。

42.治疗患有癌症的哺乳动物的方法，包括给所述哺乳动物施用治疗足够量的一种试剂，所述试剂调节STK6或TPX2基因的表达和/或由所述STK6或TPX2基因编码的蛋白的活性，其中所述哺乳动物进行一种治疗，所述治疗包括给所述哺乳动物施用治疗足够量的KSP抑制剂。

43.治疗患有癌症的哺乳动物的方法，包括给所述哺乳动物施用i)治疗足够量的一种试剂，所述试剂调节STK6或TPX2基因的表达和/或由所述STK6或TPX2基因编码的蛋白的活性，和ii)治疗足够量的KSP抑制剂。

44.权利要求42或43的方法，其中所述试剂减少所述癌症的细胞中所述STK6或TPX2基因的表达。

45.权利要求42或43的方法，其中所述试剂包括靶定所述STK6或TPX2基因的siRNA。

46.权利要求45的方法，其中所述试剂包含2、3、4、5、6或10种靶定所述STK6或TPX2基因的不同siRNA。

47.权利要求46的方法，其中所述试剂中所述不同siRNA的总siRNA浓度是用于使所述STK6或TPX2基因沉默的最优浓度，其中所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，基本不增加沉默的水平。

48.权利要求47的方法，其中所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，沉默水平的增加不超过20％、不超过10％、或不超过5％。

49.权利要求47的方法，其中每一种所述不同siRNA的浓度大约相同。

50.权利要求47的方法，其中所述不同siRNA各自的浓度彼此之间的差别小于50％、小于20％、或小于10％。

51.权利要求47的方法，其中所述试剂中没有一种siRNA的浓度占所述不同siRNA的所述总siRNA浓度的80％以上、50％以上、或20％以上。

52.权利要求47的方法，其中所述试剂中至少一种siRNA的浓度占所述不同siRNA的所述总siRNA浓度的20％以上或50％以上。

53.权利要求47的方法，其中选择不同siRNA的数目和所述试剂中每一种siRNA的浓度，使得所述试剂导致任何不作为靶的基因的沉默小于10％、小于1％、小于0.1％或小于0.01％。

54.权利要求45的方法，其中所述哺乳动物是人，并且其中所述siRNA选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的siRNA。

55.治疗患有癌症的哺乳动物的方法，包括给所述哺乳动物施用i)治疗足够量的第一种试剂，所述第一种试剂调节STK6或TPX2基因的表达和/或由所述STK6或TPX2基因编码的蛋白的活性，和ii)治疗足够量的第二种试剂，所述第二种试剂调节KSP基因的表达和/或由所述KSP基因编码的蛋白的活性。

56.权利要求55的方法，其中所述第一种试剂包括靶定所述TPX2或TPX2基因的siRNA，并且所述第二种试剂包括靶定所述KSP基因的siRNA。

57.权利要求56的方法，其中所述第一种试剂包含2、3、4、5、6或10种靶定所述STK6或TPX2基因的不同siRNA。

58.权利要求57的方法，其中所述第一种试剂中所述不同siRNA的总siRNA浓度是用于使所述STK6或TPX2基因沉默的最优浓度，其中所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，基本不增加沉默的水平。

59.权利要求58的方法，其中所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，沉默水平的增加不超过20％、不超过10％、或不超过5％。

60.权利要求58的方法，其中每一种所述不同siRNA的浓度大约相同。

61.权利要求58的方法，其中所述不同siRNA各自的浓度彼此之间的差别小于50％、小于20％、或小于10％。

62.权利要求58的方法，其中所述第一种试剂中没有一种siRNA的浓度占所述不同siRNA的所述总siRNA浓度的80％以上、50％以上、或20％以上。

63.权利要求58的方法，其中所述第一种试剂中至少一种siRNA的浓度占所述不同siRNA的所述总siRNA浓度的20％以上或50％以上。

64.权利要求58的方法，其中选择不同siRNA的数目和所述第一种试剂中每一种siRNA的浓度，使得所述第一种试剂导致任何不作为靶的基因的沉默小于10％、小于1％、小于0.1％或小于0.01％。

65.权利要求56的方法，其中所述哺乳动物是人，并且其中靶定所述STK6基因的所述siRNA选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的siRNA。

66.权利要求45或56的方法，其中所述哺乳动物是人，并且其中靶定所述TPX2基因的所述siRNA选自SEQ ID NO：1237、SEQ IDNO：1238和SEQ ID NO：1239所示的siRNA。

67.评估细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性的方法，所述方法包括确定所述细胞中的STK6或TPX2基因的表达水平，其中高于预定阈值水平的所述表达水平，表明所述细胞对所述KSP抑制剂的生长抑制作用具有抗性。

68.权利要求67的方法，其中通过包括用一种或多种核苷酸探针测量所述STK6或TPX2基因的表达水平的方法，确定所述STK6或TPX2基因的表达水平，所述一种或多种多核苷酸探针中的每一种都包含所述STK6或TPX2基因中的核苷酸序列。

69.权利要求67或68的方法，其中所述一种或多种多核苷酸探针是在微阵列上的多核苷酸探针。

70.评估细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性的方法，所述方法包括确定所述细胞中由STK6或TPX2基因编码的蛋白的丰度水平，其中高于预定阈值水平的所述蛋白的所述丰度水平，表明所述细胞对所述KSP抑制剂的生长抑制作用具有抗性。

71.评估细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性的方法，所述方法包括确定所述细胞中由STK6或TPX2基因编码的蛋白的活性水平，其中高于预定阈值水平的所述活性水平，表明所述细胞对所述KSP抑制剂的生长抑制作用具有抗性。

72.权利要求70或71的方法，其中所述细胞是人细胞。

73.调节细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性的方法，包括使所述细胞接触足够量的一种试剂，所述试剂调节STK6或TPX2基因的表达和/或由所述STK6或TPX2基因编码的蛋白的活性。

74.调节哺乳动物中细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性的方法，包括给所述哺乳动物施用治疗足够量的一种试剂，所述试剂调节STK6或TPX2基因的表达和/或由所述STK6或TPX2基因编码的蛋白的活性。

75.调节细胞生长的方法，包括使所述细胞接触i)足够量的一种试剂，所述试剂调节STK6或TPX2基因的表达和/或由所述STK6或TPX2基因编码的蛋白的活性，和ii)足够量的KSP抑制剂。

76.权利要求73、74或75的方法，其中所述试剂减少所述细胞中所述STK6或TPX2基因的表达。

77.权利要求73、74或75的方法，其中所述试剂包括靶定所述STK6基因的siRNA。

78.权利要求77的方法，其中所述试剂包含2、3、4、5、6或10种靶定所述STK6或TPX2基因的不同siRNA。

79.权利要求78的方法，其中所述试剂中所述不同siRNA的总siRNA浓度是用于使所述STK6或TPX2基因沉默的最优浓度，其中所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，基本不增加沉默的水平。

80.权利要求79的方法，其中所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，沉默水平的增加不超过20％、不超过10％、或不超过5％。

81.权利要求79的方法，其中每一种所述不同siRNA的浓度大约相同。

82.权利要求79的方法，其中所述不同siRNA各自的浓度彼此之间的差别小于50％、小于20％、或小于10％。

83.权利要求79的方法，其中所述试剂中没有一种siRNA的浓度占所述不同siRNA的所述总siRNA浓度的80％以上、50％以上、或20％以上。

84.权利要求79的方法，其中所述试剂中至少一种siRNA的浓度占所述不同siRNA的所述总siRNA浓度的20％以上或50％以上。

85.权利要求79的方法，其中选择不同siRNA的数目和所述试剂中每一种siRNA的浓度，使得所述试剂导致任何不作为靶的基因的沉默小于10％、小于1％、小于0.1％或小于0.01％。

86.权利要求77的方法，其中所述细胞是人细胞，并且其中所述siRNA选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的siRNA。

87.权利要求77的方法，其中所述细胞是人细胞，并且其中所述siRNA选自SEQ ID NO：1237、SEQ ID NO：1238和SEQ ID NO：1239所示的siRNA。

88.鉴定能够调节细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性的试剂的方法，其中所述试剂能够调节STK6或TPX2基因的表达和/或由所述STK6或TPX2基因编码的蛋白的活性，所述方法包括比较存在所述试剂时所述KSP抑制剂对表达所述STK6或TPX2基因的细胞的抑制作用与不存在所述试剂时所述KSP抑制剂对表达所述STK6或TPX2基因的细胞的抑制作用，其中所述KSP抑制剂的所述抑制作用的差异，鉴定所述试剂能够调节所述细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性。

89.鉴定能够调节细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性的试剂的方法，其中所述试剂能够调节STK6或TPX2基因的表达和/或由所述STK6或TPX2基因编码的蛋白的活性，所述方法包括：

(a)在存在所述试剂的条件下使第一种表达所述STK6或TPX2基因的细胞与所述KSP抑制剂接触，并且测量第一种生长抑制作用；

(b)在不存在所述试剂的条件下使第二种表达所述STK6或TPX2基因的细胞与所述KSP抑制剂接触，并且测量第二种生长抑制作用；和

(c)比较在所述步骤(a)和(b)中测量的所述第一种和第二种抑制作用，

其中所述第一种和第二种抑制作用之间的差异，鉴定所述试剂能够调节细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性。

90.权利要求88或89的方法，其中所述试剂包括减少所述STK6或TPX2基因表达的分子。

91.权利要求88或89的方法，其中所述试剂是靶定所述STK6或TPX2基因的siRNA。

92.权利要求91的方法，其中所述细胞是人细胞，并且其中所述siRNA选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的siRNA。

93.权利要求91的方法，其中所述细胞是人细胞，并且其中所述siRNA选自SEQ ID NO：1237、SEQ ID NO：1238和SEQ ID NO：1239所示的siRNA。

94.包含一种或多种不同的小干扰RNA(siRNA)的细胞，所述siRNA靶定所述细胞中的STK6或TPX2基因。

95.权利要求94的细胞，其中所述一种或多种不同的siRNA包括2、3、4、5、6或10种不同的siRNA。

96.权利要求95的细胞，其中所述细胞是通过用所述一种或多种不同的siRNA的组合物转染而产生的，其中所述组合物的总siRNA浓度是用于使所述STK6或TPX2基因沉默的最优浓度，其中所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，基本不增加沉默的水平。

97.权利要求96的细胞，其中所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，沉默水平的增加不超过20％、不超过10％、或不超过5％。

98.权利要求96的细胞，其中每一种所述不同的siRNA的浓度大约相同。

99.权利要求96的细胞，其中所述不同的siRNA各自的浓度彼此之间的差别小于50％、小于20％、或小于10％。

100.权利要求96的细胞，其中所述组合物中没有一种siRNA的浓度占所述不同的siRNA的总siRNA浓度的80％以上、50％以上、或20％以上。

101.权利要求96的细胞，其中所述组合物中至少一种siRNA的浓度占所述不同的siRNA的所述总siRNA浓度的20％以上或50％以上。

102.权利要求96的细胞，其中选择不同的siRNA的数目和所述组合物中每一种siRNA的浓度，使得所述组合物导致任何不作为靶的基因的沉默小于10％、小于1％、小于0.1％或小于0.01％。

103.权利要求94的细胞，其中所述细胞是人细胞。

104.权利要求103的细胞，其中所述细胞是人细胞，并且其中所述一种或多种不同的siRNA的每一种选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6所示的siRNA。

105.权利要求103的细胞，其中所述细胞是人细胞，并且其中所述siRNA选自SEQ ID NO：1237、SEQ ID NO：1238和SEQ ID NO：1239所示的siRNA。

106.权利要求94的细胞，其中所述细胞是鼠细胞。

107.用于诊断细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性的微阵列，所述微阵列包含一种或多种多核苷酸探针，其中每一种所述的多核苷酸探针包含STK6或TPX2基因中的核苷酸序列。

108.用于诊断细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性的试剂盒，所述试剂盒包含置于一个或多个容器中的一种或多种多核苷酸探针，其中每一种所述的多核苷酸探针包含STK6或TPX2基因中的核苷酸序列。

109.用于筛选一种试剂的试剂盒，所述试剂调节细胞对KSP抑制剂的生长抑制作用的抗性，所述试剂盒包含置于一个或多个容器中的(i)权利要求94的细胞；和(ii)KSP抑制剂。

110.用于治疗患有癌症的哺乳动物的试剂盒，该试剂盒包含置于一个或多个容器中的(i)足够量的调节STK6或TPX2基因的表达和/或由所述STK6或TPX2基因编码的蛋白的活性的试剂；和(ii)KSP抑制剂。

111.权利要求42-43、67、70-71、74-75和88-89的任意一项的方法，其中所述KSP抑制剂是(1S)-1-{[(2S)-4-(2，5-二氟苯基)-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基]羰基}-2-甲基丙胺。

112.权利要求1、2或3的方法，其中对每个所述的一种或多种细胞的组分开进行接触步骤(a)。

113.权利要求18、19或20的方法，其中对每个所述的一种或多种细胞的组分开进行接触步骤(a)。

114.权利要求109或110的试剂盒，其中所述KSP抑制剂是(1S)-1-{[(2S)-4-(2，5-二氟苯基)-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基]羰基}-2-甲基丙胺。

115.鉴定与一种细胞类型的细胞中的初级靶基因相互作用的基因的方法，所述方法包括

(a)使所述细胞类型的一种或多种细胞接触一种试剂，其中所述试剂调节次级靶基因的表达和/或由所述次级靶基因编码的蛋白的活性，并且其中所述一种或多种细胞表达靶定所述初级靶基因的第一小干扰RNA(siRNA)；

(b)比较所述试剂对所述克隆的所述一种或多种细胞的作用与所述试剂对不表达所述第一siRNA的所述细胞类型的细胞的作用；和

(c)如果所述试剂对表达所述第一siRNA的所述一种或多种细胞的作用与所述试剂对不表达所述第一siRNA的所述细胞类型的细胞的作用不同，则鉴定所述次级靶基因为与所述细胞类型的细胞中的初级靶基因相互作用的基因。

116.鉴定与一种细胞类型的细胞中的初级靶基因相互作用的基因的方法，所述方法包括

(a)产生表达靶定所述初级靶基因的第一小干扰RNA(siRNA)的所述细胞类型的细胞的克隆；

(b)使所述克隆的一种或多种细胞接触一种试剂，其中所述试剂调节次级靶基因的表达和/或由所述次级靶基因编码的蛋白的活性；

(c)比较所述试剂对所述克隆的所述一种或多种细胞的作用与所述试剂对不表达所述第一siRNA的所述细胞类型的细胞的作用；和

(d)如果所述试剂对表达所述第一siRNA的所述一种或多种细胞的作用与所述试剂对不表达所述第一siRNA的所述细胞类型的细胞的作用不同，则鉴定所述次级靶基因为与所述细胞类型的细胞中的初级靶基因相互作用的基因。

117.权利要求116的方法，其中所述第一siRNA由整合到所述细胞基因组中的核苷酸序列表达。

118.权利要求116的方法，其中所述试剂包括靶定所述次级靶基因并使其沉默的一种或多种第二siRNA。

119.权利要求116的方法，其中所述试剂是所述次级靶基因的抑制剂。

120.权利要求118的方法，其中与所述试剂对不表达所述第一siRNA的所述细胞类型的细胞的作用相比，所述试剂对表达所述第一siRNA的所述一种或多种细胞的作用增强。

121.权利要求118的方法，其中与所述试剂对不表达所述第一siRNA的所述细胞类型的细胞的作用相比，所述试剂对表达所述第一siRNA的所述一种或多种细胞的作用减弱。

122.权利要求120的方法，其中所述一种或多种第二siRNA包括至少k种不同的siRNA，其中所述k选自2、3、4、5、6和10。

123.权利要求122的方法，其中所述试剂中所述至少k种不同的siRNA的总siRNA浓度是用于使所述次级靶基因沉默的最优浓度，其中所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，基本不增加沉默的水平。

124.权利要求123的方法，其中所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，沉默水平的增加不超过20％、不超过10％、或不超过5％。

125.权利要求123的方法，其中所述至少k种不同的siRNA的每一种的浓度大约相同。

126.权利要求123的方法，其中所述至少k种不同的siRNA各自的浓度彼此之间的差别小于50％、小于20％、或小于10％。

127.权利要求123的方法，其中所述试剂中没有一种siRNA的浓度占所述不同siRNA的所述总siRNA浓度的80％以上、50％以上、或20％以上。

128.权利要求123的方法，其中所述试剂中至少一种siRNA的浓度占所述至少k种不同的siRNA的所述总siRNA浓度的20％以上或50％以上。

129.权利要求123的方法，其中选择不同siRNA的数目和所述试剂中每一种siRNA的浓度，使得所述试剂导致任何不作为靶的基因的沉默小于10％、小于1％、小于0.1％或小于0.01％。

130.权利要求122的方法，其中所述细胞类型是癌细胞类型，并且其中所述初级靶基因是p53。

131.权利要求130的方法，进一步包括步骤

(e)对大量不同的次级靶基因中的每一种，重复步骤(b)-(d)。

132.权利要求131的方法，其中所述大量的次级靶基因至少包含选自下组的数目的不同基因：5、10、100、1000和5000种不同的基因。

133.权利要求132的方法，其中所述作用是所述细胞类型的细胞对药物的敏感性的改变。

134.权利要求133的方法，其中所述药物是DNA破坏剂。

135.权利要求134的方法，其中所述DNA破坏剂选自拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、DNA结合剂和电离辐射。

136.权利要求135的方法，其中所述DNA破坏剂选自阿霉素、喜树碱和顺铂。

137.评估一种细胞类型的细胞对药物治疗的反应性的方法，包括

(a)使所述细胞类型的一种或多种细胞接触所述药物，其中所述一种或多种细胞表达靶定初级靶基因的第一小干扰RNA(siRNA)，并且其中所述一种或多种细胞接受一种组合物的处理，所述组合物调节一种或多种次级靶基因的表达和/或分别由所述一种或多种次级靶基因编码的蛋白的活性；

(b)使所述细胞类型的一种或多种细胞接触所述药物，其中所述一种或多种细胞不表达靶定所述初级靶基因的小干扰RNA(siRNA)，并且其中所述一种或多种细胞接受调节级靶基因的表达和/或由所述次级靶基因编码的蛋白的活性的所述试剂的处理；和

(c)比较在步骤(a)中测量的所述药物对所述一种或多种细胞的作用与在步骤(b)中测量的所述药物对所述一种或多种细胞的作用，从而评估所述细胞对所述药物治疗的反应性。

138.评估一种细胞类型的细胞对药物治疗的反应性的方法，所述方法包括

(a)制备表达靶定初级靶基因的第一小干扰RNA(siRNA)的所述细类型的细胞的克隆；

(b)使表达所述第一siRNA的所述克隆的一种或多种细胞接触所述药物，其中所述一种或多种细胞接受调节级靶基因的表达和/或由所述次级靶基因编码的蛋白的活性的试剂的处理；

(c)使不表达靶定所述初级靶基因的小干扰RNA(siRNA)的所述细胞类型的一种或多种细胞接触所述药物，其中所述一种或多种细胞接受调节级靶基因的表达和/或由所述次级靶基因编码的蛋白的活性的所述试剂的处理；和

(d)比较在步骤(b)中测量的所述药物对所述一种或多种细胞的作用与在步骤(c)中测量的所述药物对所述一种或多种细胞的作用，从而评估所述细胞对所述药物治疗的反应性。

139.权利要求137或138的方法，其中与所述药物对不表达所述第一siRNA的所述细胞类型的细胞的作用相比，所述药物对表达所述第一siRNA的一种或多种细胞的作用增强。

140.权利要求137或138的方法，其中与所述药物对不表达所述第一siRNA的所述细胞类型的细胞的作用相比，所述药物对表达所述第一siRNA的一种或多种细胞的作用减弱。

141.权利要求137或138的方法，其中所述组合物包含所述一种或多种次级靶基因的一种或多种抑制剂。

142.权利要求137或138的方法，其中所述组合物包含靶定所述一种或多种第二靶基因并使其沉默的一种或多种第二siRNA。

143.权利要求142的方法，其中所述一种或多种第二siRNA包括至少k种不同的siRNA，其中所述k选自2、3、4、5、6和10。

144.权利要求143的方法，其中所述试剂中所述至少k种不同的siRNA的总siRNA浓度是用于使所述次级靶基因沉默的最优浓度，其中所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，基本不增加沉默的水平。

145.权利要求144的方法，其中所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，沉默水平的增加不超过20％、不超过10％、或不超过5％。

146.权利要求144的方法，其中所述至少k种不同的siRNA的每一种的浓度大约相同。

147.权利要求144的方法，其中所述至少k种不同的siRNA各自的浓度彼此之间的差别小于50％、小于20％、或小于10％。

148.权利要求144的方法，其中所述试剂中没有一种siRNA的浓度占所述不同siRNA的所述总siRNA浓度的80％以上、50％以上、或20％以上。

149.权利要求144的方法，其中所述试剂中至少一种siRNA的浓度占所述至少k种不同的siRNA的所述总siRNA浓度的20％以上或50％以上。

150.权利要求144的方法，其中选择不同siRNA的数目和所述试剂中每一种siRNA的浓度，使得所述试剂导致任何不作为靶的基因的沉默小于10％、小于1％、小于0.1％或小于0.01％。

151.权利要求137或138的方法，其中所述细胞类型是癌细胞类型，并且其中所述初级靶基因是p53。

152.权利要求138的方法，进一步包括步骤

(e)对大量不同的次级靶基因中的每一种，重复步骤(b)-(d)。

153.权利要求137的方法，进一步包括步骤

(e)对大量不同的次级靶基因中的每一种，重复步骤(a)-(b)。

154.权利要求152或153的方法，其中所述大量的次级靶基因至少包含选自下组的数目的不同基因：5、10、100、1000和5000种不同的基因。

155.权利要求154的方法，其中所述药物是DNA破坏剂。

156.权利要求155的方法，其中所述DNA破坏剂选自拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、DNA结合剂和电离辐射。

157.权利要求156的方法，其中所述DNA破坏剂选自阿霉素、喜树碱和顺铂。

158.治疗患有癌症的哺乳动物的方法，包括给所述哺乳动物施用治疗足够量的一种试剂，所述试剂调节一种基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白的活性，其中所述哺乳动物进行一种治疗，所述治疗包括给所述哺乳动物施用治疗足够量的包含一种或多种DNA破坏剂的组合物。

159.治疗患有癌症的哺乳动物的方法，包括给所述哺乳动物施用i)治疗足够量的一种试剂，所述试剂调节一种基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白的活性，和ii)治疗足够量的包含一种或多种DNA破坏剂的组合物。

160.权利要求158或159的方法，其中所述试剂使所述基因在所述癌症的细胞中的表达减少。

161.权利要求158或159的方法，其中所述试剂增强所述基因在所述癌症的细胞中的表达。

162.权利要求161的方法，其中所述一种或多种DNA破坏剂选自拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、DNA结合剂和电离辐射，并且其中所述基因选自EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51。

163.权利要求161的方法，其中所述一种或多种DNA破坏剂选自阿霉素、喜树碱和顺铂，并且其中所述基因选自EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51。

164.权利要求163的方法，其中所述试剂包括靶定所述基因的siRNA。

165.评估细胞对一种试剂的生长抑制作用的敏感性的方法，所述方法包括确定所述细胞中的一种或多种基因的每一种的转录水平，其中低于预定阈值水平的各个基因的每一所述转录水平，表明所述细胞对所述DNA破坏剂的生长抑制作用具有敏感性。

166.权利要求165的方法，其中所述试剂是DNA破坏剂，其选自拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、DNA结合剂和电离辐射，并且其中所述基因选自EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51。

167.权利要求165的方法，其中所述DNA破坏剂选自阿霉素、喜树碱和顺铂，并且其中所述基因选自EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51。

168.权利要求166-167的任意一项的方法，其中所述一种或多种基因包括至少大约5到大约50种不同的基因。

169.权利要求168的方法，其中每一所述转录水平比所述阈水平低1.5倍、2倍或3倍。

170.权利要求166-167的任意一项的方法，其中通过包括用一种或多种核苷酸探针测量所述基因的转录水平的方法，确定所述基因的转录水平，所述一种或多种多核苷酸探针中的每一种都包含所述基因中的核苷酸序列。

171.权利要求170的方法，其中所述一种或多种多核苷酸探针是在微阵列上的多核苷酸探针。

172.用于评估细胞对DNA破坏剂的生长抑制作用的敏感性的方法，所述方法包括确定所述细胞中由一种基因编码的蛋白的丰度水平，其中低于预定阈值水平的所述蛋白的所述丰度水平，表明所述细胞对所述DNA破坏剂的生长抑制作用具有敏感性。

173.评估细胞对DNA破坏剂的生长抑制作用的敏感性的方法，所述方法包括确定所述细胞中由所述基因编码的蛋白的活性水平，其中高于预定阈值水平的所述活性水平，表明所述细胞对所述DNA破坏剂的生长抑制作用具有敏感性。

174.权利要求172或173的方法，其中所述DNA破坏剂选自拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、DNA结合剂和电离辐射，并且其中所述基因选自EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51。

175.权利要求174的方法，其中所述DNA破坏剂选自阿霉素、喜树碱和顺铂，并且其中所述基因选自EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51。

176.权利要求172或173的方法，其中所述细胞是人细胞。

177.调节细胞对DNA破坏的敏感性的方法，所述方法包括使所述细胞与足够量的一种试剂接触，所述试剂调节选自EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51的基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白的活性。

178.权利要求177的方法，其中所述DNA破坏是由DNA破坏剂导致的。

179.权利要求178的方法，其中所述DNA破坏剂选自拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、DNA结合剂和电离辐射。

180.权利要求179的方法，其中所述DNA破坏剂选自阿霉素、喜树碱和顺铂。

181.调节细胞生长的方法，包括使所述细胞接触i)足够量的一种试剂，所述试剂调节选自EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51的基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白的活性；和ii)足够量的DNA破坏剂。

182.权利要求177或181的方法，其中所述试剂减少所述细胞中所述基因的表达。

183.权利要求177或181的方法，其中所述试剂包括靶定所述基因的siRNA。

184.权利要求183的方法，其中所述试剂包括靶定所述基因的2、3、4、5、6或10种不同的siRNA。

185.权利要求184的方法，其中所述试剂中所述不同的siRNA的总siRNA浓度是用于使所述基因沉默的最优浓度，其中所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，基本不增加沉默的水平。

186.权利要求185的方法，其中所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，沉默水平的增加不超过20％、不超过10％、或不超过5％。

187.权利要求185的方法，其中每一种所述不同的siRNA的浓度大约相同。

188.权利要求185的方法，其中所述不同的siRNA各自的浓度彼此之间的差别小于50％、小于20％、或小于10％。

189.权利要求185的方法，其中所述试剂中没有一种siRNA的浓度占所述不同siRNA的所述总siRNA浓度的80％以上、50％以上、或20％以上。

190.权利要求185的方法，其中所述试剂中至少一种siRNA的浓度占所述不同的siRNA的所述总siRNA浓度的20％以上或50％以上。

191.权利要求185的方法，其中选择不同siRNA的数目和所述试剂中每一种siRNA的浓度，使得所述试剂导致任何不作为靶的基因的沉默小于10％、小于1％、小于0.1％或小于0.01％。

192.鉴定能够调节细胞对DNA破坏剂的生长抑制作用的敏感性的试剂的方法，其中所述试剂能够调节选自EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51的基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白的活性，该方法包括比较存在所述试剂时所述DNA破坏剂对表达所述基因的细胞的抑制作用与不存在所述试剂时所述DNA破坏剂对表达所述基因的细胞的抑制作用，其中所述DNA破坏剂的所述抑制作用的差异，鉴定所述试剂能够调节所述细胞对DNA破坏剂的生长抑制作用的敏感性。

193.鉴定能够调节细胞对DNA破坏剂的生长抑制作用的敏感性的试剂的方法，其中所述试剂能够调节选自EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51的基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白的活性，所述方法包括

(a)在存在所述试剂的条件下使第一种表达所述基因的细胞与所述DNA破坏剂接触，并且测量第一种生长抑制作用；

(b)在不存在所述试剂的条件下使第二种表达所述基因的细胞与所述DNA破坏剂接触，并且测量第二种生长抑制作用；

其中所述第一种和第二种抑制作用之间的差异，鉴定所述试剂能够调节所述细胞对所述DNA破坏剂的生长抑制作用的敏感性。

194.权利要求192或193的方法，其中所述细胞表达靶定初级靶基因的siRNA。

195.权利要求194的方法，其中所述初级靶基因是p53。

196.权利要求192或193的方法，其中所述试剂包括减少所述基因表达的分子。

197.权利要求196的方法，其中所述试剂包括靶定所述基因的siRNA。

198.权利要求197的方法，其中所述试剂包括靶定所述基因的2、3、4、5、6或10种不同的siRNA。

199.权利要求198的方法，其中所述试剂中所述不同的siRNA的总siRNA浓度是用于使所述基因沉默的最优浓度，其中所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，基本不增加沉默的水平。

200.权利要求199的方法，其中所述最优浓度是这样的浓度，当进一步增加该浓度时，沉默水平的增加不超过20％、不超过10％、或不超过5％。

201.权利要求199的方法，其中每一种所述不同的siRNA的浓度大约相同。

202.权利要求199的方法，其中所述不同的siRNA各自的浓度彼此之间的差别小于50％、小于20％、或小于10％。

203.权利要求199的方法，其中所述试剂中没有一种siRNA的浓度占所述不同siRNA的所述总siRNA浓度的80％以上、50％以上、或20％以上。

204.权利要求199的方法，其中所述试剂中至少一种siRNA的浓度占所述不同的siRNA的所述总siRNA浓度的20％以上或50％以上。

205.权利要求199的方法，其中选择不同siRNA的数目和所述试剂中每一种siRNA的浓度，使得所述试剂导致任何不作为靶的基因的沉默小于10％、小于1％、小于0.1％或小于0.01％。

206.包含一种或多种不同的小干扰RNA(siRNA)的细胞，所述siRNA靶定所述细胞中的选自EPHB3、WEE1、ELK1、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51的基因。

207.权利要求206的方法，其中所述一种或多种siRNA包括2、3、4、5、6或10种不同的siRNA。

208.权利要求206的方法，其中所述细胞是人细胞。

209.权利要求208的方法，其中所述细胞是鼠细胞。

210.用于诊断细胞对DNA破坏剂的生长抑制作用的敏感性的微阵列，所述微阵列包含一种或多种多核苷酸探针，其中每一种所述的多核苷酸探针包含选自EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51的一种或多种基因中的核苷酸序列。

211.用于诊断细胞对DNA破坏剂的生长抑制作用的敏感性的试剂盒，所述试剂盒包含置于一个或多个容器中的一种或多种多核苷酸探针，其中每一种所述的多核苷酸探针包含选自EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51的基因中的核苷酸序列。

212.用于筛选调节细胞对DNA破坏剂的生长抑制作用的敏感性的试剂的试剂盒，所述试剂盒包含置于一个或多个容器中的(i)权利要求206-211的任意一项的细胞；和(ii)所述DNA破坏剂。

213.用于治疗患有癌症的哺乳动物的试剂盒，所述试剂盒包含置于一个或多个容器中的(i)足够量一种试剂，所述试剂调节选自EPHB3、WEE1、ELK1、STK6、BRCA1、BRCA2、BARD1和RAD51的基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白的活性；和(ii)DNA破坏剂。

214.权利要求192-193的任意一项的方法，其中所述DNA破坏剂选自拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、DNA结合剂和电离辐射。

215.权利要求214的方法，其中所述DNA破坏剂选自阿霉素、喜树碱和顺铂。

216.权利要求212的试剂盒，其中所述DNA破坏剂选自拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、DNA结合剂和电离辐射。

217.权利要求216的试剂盒，其中所述DNA破坏剂选自阿霉素、喜树碱和顺铂。

218.权利要求21、117、137或138的方法，其中控制所述初级靶基因的沉默水平。