CN107828887A - Stmn1基因的用途 - Google Patents

Stmn1基因的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了STMN1基因作为标志物在原发性肝癌微血管浸润（MVI）诊断中的应用。本发明还表明通过抑制STMN1的表达能抑制肝癌细胞的增殖和侵袭。本发明还提供了四种用于干扰STMN1基因的小干扰RNA。本发明表明STMN1基因作为标记物即可用于原发性肝癌病人合并MVI的术前预测，也可用于肝癌病理诊断及临床分期的辅助诊断，以及作为治疗靶点开发肝癌靶向治疗的药物，从而为临床上肝癌患者的术前预测、术后复发及预后判断及开展原发性肝癌的靶向治疗提供重要靶点。

Description

STMN1基因的用途
技术领域：
本发明属于生物医学领域，涉及一种诊断试剂盒和药物的用途，具体来说是STMN1基因作为肝癌微血管浸润(MVI)的诊断指标，用于原发性肝癌的术前预测、肿瘤分期、复发及预后判断以及靶向治疗中的用途。
背景技术
原发性肝癌(以下简称肝癌)是我国最常见的恶性肿瘤之一，且恶性度高，治疗效果差，高居癌症相关死亡的第二位。包括肝切除和肝移植在内的手术治疗是肝癌治疗的主要手段，但是由于肝癌起病隐匿，转移率高，我国肝癌手术率不足10％，即使早期(巴塞罗那肝癌分期：BCLC-0/A期)患者有机会接受手术治疗，术后3年内复发率仍高达75％，肝癌的早期浸润、转移成为肝癌临床治疗的最大瓶颈。
血管侵犯与转移是肝癌恶性侵袭和转移的主要表现，也是导致肝癌术后早期复发和远期存活率低的主要原因。可分为临床可见的大血管癌栓和病理显微镜下可见的微血管浸润，后者也称微血管癌栓。按照国际BCLC肝癌分期标准，无论肿瘤大小、数目如何，只要存在临床可见的大血管癌栓就属于肝癌晚期，已经失去手术治疗价值，3年中位存活时间仅11～20月。而对于有机会接受手术治疗的早期肝癌患者(BCLC-0/A)，MVI的发生率也在15-57.1％。作为临床大血管癌栓的早期阶段，MVI主要是指在显微镜下于内皮细胞衬覆的血管腔内见到癌细胞巢团，其引起的肝内播散和隐匿性转移灶是肝切除或肝移植术后肿瘤复发的主要原因。大量研究显示，MVI阳性是早期肝癌术后复发早和远期存活时间短的重要原因，且与MVI分级程度密切相关。新近提出的肝癌肝移植受体选择标准——“up-to-serven”标准也认为：只要无MVI，肿瘤大小可以由以前“米兰标准”的5cm扩展到7cm，数目也可以扩展到7个，而不会显著影响移植后的无瘤存活和总存活时间。2015年我国第一版《原发性肝癌病理诊断指南》正式把MVI纳为肝癌规范病理诊断的必需指标，作为评估肝癌患者复发和转移风险的最直接形态学指标，也是继肝癌大小、数目、肿瘤分化程度之后又一个具有里程碑意义的临床病理学特征。2015版指南根据MVI的数量和分布情况也进行了风险分级：M0为未发现MVI；M1(低危组)为≤5个MVI，且发生于近癌旁肝组织区域(≤1cm)；M2(高危组)为>5个MVI，或MVI发生于远癌旁肝组织区域(>1cm)。以上表明：MVI的发生是肝癌早期浸润转移的重要标志，也是影响临床治疗策略和远期效果的关键指标。
术前对早期肝癌是否合并MVI进行预测有助于更准确地进行临床分期和选择个体化治疗方案，对于以肿瘤大小、数目为基础的BCLC临床分期或TNM分期来说都具有重要的改良价值。然而，目前MVI的诊断主要依赖于术后病理学检查，尚没有特别有效的术前评估手段。肝癌穿刺活检虽然有助于术前肝癌的诊断，但是由于标本量小，无法进行准确判断且有导致肿瘤播散的风险。近年来报道采用术前PET影像下18F-FDG的摄取水平、CT影像上肿瘤边界是否清晰、血清中PIVKA-II、AFP水平以及肿瘤大小、数目等可以协助预测MVI的发生，但是效能不高，争议也较大。
STMN1是一类C端螺旋结构域高度保守的磷酸化蛋白，主要表达在细胞质中，可与微管蛋白二聚体结合，形成复合物阻隔微管的聚合或直接破坏微管结构来调控微管的稳定性，在细胞运动、迁移、细胞周期调控等过程中发挥重要作用。STMN1除了调节微管稳定性外，还可与细胞内多种信号通路发生作用，促进肿瘤细胞增殖和抑制肿瘤细胞凋亡。
发明内容：
针对现有技术中的上述问题，本发明提供了STMN1基因的用途，所述的这种STMN1基因的用途用以解决现有技术中MVI的预测和原发性肝癌复发及预后诊断的技术问题，以及为原发性肝癌的靶向治疗提供新的靶点。
本发明提供了STMN1基因作为标记物在原发性肝癌微血管浸润(MVI)诊断中的用途。
本发明提供了STMN1基因作为标记物在制备检测原发性肝癌的辅助诊断试剂盒中的用途，用于原发性肝癌MVI的术前预测或术后病理诊断，辅助判断肝癌患者的肿瘤分期、肿瘤复发及预后。
本发明提供了STMN1基因在制备治疗原发性肝癌靶向药物中的用途。
本发明还提供了一种试剂盒，其特征在于，用于检测STMN1基因。
本发明还提供了一种STMN1基因的拮抗剂在制备治疗原发性肝癌靶向药物中的用途。
本发明还提供了一种用于干扰STMN1基因的小干扰RNA，其特征在于，包括正义链和反义链，其正义链序列为SEQ ID NO.1所示，反义链序列为：SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种用于干扰STMN1基因的小干扰RNA，其特征在于，包括正义链和反义链，其正义链序列为SEQ ID NO.3所示，反义链序列为：SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种用于干扰STMN1基因的小干扰RNA，其特征在于，包括正义链和反义链，其正义链序列为SEQ ID NO.5所示，反义链序列为：SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了一种用于干扰STMN1基因的小干扰RNA，其特征在于，包括正义链和反义链，其正义链序列为SEQ ID NO.7所示，反义链序列为：SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了任一上述的一种用于干扰STMN1基因的小干扰RNA在制备治疗原发性肝癌靶向药物中的用途。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。STMN1作为肝癌MVI特异的标记物，术前能对肝癌是否合并MVI进行有效预测，术后对肝癌是否合并MVI进行有效诊断，对于以肿瘤大小、数目为基础的BCLC临床分期或TNM分期来说都具有重要的改良价值，因此有助于更准确地进行临床分期，以及研究开发靶向治疗的治疗方案。
附图说明
图1显示了早期肝癌组织不同MVI分级下STMN1mRNA水平差异表达，其中，左图为MVI阳性组STMN1转录水平高于MVI阴性组；右图为：MVI阳性高危组STMN1转录水平高于MVI阳性低危组。
图2显示了早期肝癌术前血清中STMN1的含量与MVI呈正相关，MVI组的含量高于无MVI组。
图3显示肝癌组织中STMN1的表达水平明显高于正常肝组织，且靠近边缘的位置表达更显著，尤其微血管癌栓(MVI)中的STMN1表达最为丰富。
图4对STMN1四条干扰靶点序列进行了QPCR验证，结果表明四条干扰序列都符合后续实验的要求。
图5为对照组(NC组)和实验组(STMN1-siRNA1组)接种培养后，经过固定和染色，在显微镜下选取5个不同的视野的照片。
图6显示了肝癌细胞经过STMN1干扰实验后，侵袭能力明显下降。
图7显示了肝癌细胞经过STMN1干扰实验后，增殖能力明显减弱。
具体实施方式
实施例1早期肝癌标本中的初步数据显示STMN1mRNA转录水平与MVI分级程度潜在正相关
对收集的37例MVI阳性(M1：17，M2：8)和12例MVI阴性(M0)早期肝癌标本进行STMN1mRNA的RT-PCR检测。
引物信息：
步骤如下：
选取符合标准的早期肝癌样本100mg，采用Trizol抽提法进行RNA的抽提并进行定量。按照Takara公司反转录试剂盒对抽提的RNA进行反转录和荧光定量QPCR检测，检测结果结合临床资料进行数据统计分析。
图1显示了早期肝癌中标本中STMN1的mRNA表达水平与MVI分级程度呈正相关关系，MVI阳性(M1和M2)肝癌组STMN-1mRNA转录水平明显高于阴性组(M0)，且MVI阳性高危组(M2)较MVI阳性低危组(M1)也有明显差异。
实例例2早期肝癌患者术前血清中STMN1含量的初步数据显示与MVI呈正相关
对收集的48例(MVI阴性：42，MVI阳性：16)早期肝癌患者的血清进行酶联免疫分析(Elisa)实验。步骤如下：
稀释Elisa试剂盒提供的标准品，在96孔板中加入稀释后的标准品和待测血清，加酶37度孵育30分钟，然后显色，在450nm波长测量吸光度值并进行数据分析。
图2显示了早期肝癌术前血清中STMN1的含量与MVI呈正相关，MVI组的含量高于无MVI组。
实施例3免疫组化检测MVI阳性早期肝癌中STMN1的表达和分布
对正常肝脏和MVI阳性早期肝癌中STMN1的表达和分布进行了免疫组化检测，步骤如下：
临床样本进过梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切成2-4um的切片，再经过复水，抗原修复，一抗二抗孵育，DAB显色等步骤进行免疫组化染色。
如图3所示，肝癌组织中STMN1的表达水平明显高于正常肝组织，且靠近边缘的位置表达更显著，尤其微血管癌栓(MVI)中的STMN1表达最为丰富。表明：STMN1的高水平表达与肝癌的MVI密切相关。
实施例4STMN1干扰靶点的设计、验证与筛选
STMN1基因干扰靶点序列由上海吉玛制药技术有限公司设计与合成，转染试剂为INTERFERin，按照说明书的转染操作步骤，即先在无血清培养基加入1nMsiRNA，再加入7ul的转染试剂INTERFERin，震荡混匀，孵育10分钟，转染6孔板，48h后收集细胞，进行RNA的抽提、反转以及QPCR的检测。
具体靶点序列信息如下：
序列编号 sense(5'-3') antisense(5'-3')
STMN1-Homo-300 GGACUUUCCUUAUCCCAGUTT(SEQ ID NO.1) ACUGGGAUAAGGAAAGUCCTT(SEQ ID NO.2)
STMN1-Homo-682 CUAAUAAAGAGAACCGAGATT(SEQ ID NO.3) UCUCGGUUCUCUUUAUUAGTT(SEQ ID NO.4)
STMN1-Homo-759 GUGCGGAAGAACAAAGAAUTT(SEQ ID NO.5) AUUCUUUGUUCUUCCGCACTT(SEQ ID NO.6)
STMN1-Homo-922 GUAGGACUGUAUAGGUAGATT(SEQ ID NO.7) UCUACCUAUACAGUCCUACTT(SEQ ID NO.8)
如图4所示，设计的四条干扰靶点效果较好，符合实验的要求。
实施例5体外实验显示STMN1沉默表达后肝癌细胞侵袭能力下降
选择其中一条(STMN1-Homo-759)经过QPCR验证的靶点序列(STMN1-siRNA1)进行细胞的转染，24h后，收集细胞并计数，对照组(NC组)和实验组(STMN1-siRNA1组)以相同数目的细胞接种Transwell板的小室中，继续培养24h，经过固定和染色，在显微镜下选取5个不同的视野进行拍照(如图5)和计数，并算出平均值。
名称 NC STMN1-siRNA1
视野1 18 9
视野2 27 14
视野3 22 13
视野4 21 12
视野5 14 11
平均值 20.4 11.8
由图6可知，STMN1-siRNA1组中肝癌细胞侵袭能力明显下降。
实施例6体外实验显示STMN1沉默表达后肝癌细胞增殖能力下降
选择其中一条(STMN1-Homo-759)经过QPCR验证的靶点序列(STMN1-siRNA1)进行细胞的转染，24h后收集细胞计数，接种96孔板，在37度，5％CO2条件下培养，每隔24h取出一个96孔培养板加入10ulCCK8试剂，孵育后，在酶标仪上检测OD值。
如图7所示，STMN1-siRNA1组中肝癌细胞增殖能力明显下降。
实施例7临床肝癌样本
从东方肝胆医院生物样本库中选取2013年1月-2014年1月符合纳入标准的200例早期肝癌患者，纳入标准为：
a.本研究中所有病例均为中国汉族人种且获得签署知情同意；
b.肿瘤分期符合BCLC-0或A期，术后均经病理学确诊为肝细胞肝癌，且符合外科根治原则(完整切除肿瘤，切缘阴性，术后1月无复发)；
c.在术前或者随访过程中临床病理学资料和随访数据完整(包括完整的术前血清样本、术后病理诊断有MVI分级)；
d.术前均未接受诸如肝动脉插管化疗、无水酒精注射、射频消融等抗肿瘤治疗。
2.早期肝癌标本中STMN1的mRNA转录水平与MVI分级程度的验证
选取符合标准的早期肝癌样本100mg，采用Trizol抽提法进行RNA的抽提并进行定量。按照Takara公司反转录试剂盒对抽提的RNA进行反转录和荧光定量QPCR检测，检测结果结合临床资料进行数据统计分析。
3.临床样本的STMN1免疫组化染色
临床样本进过梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切成2-4um的切片，再经过复水，抗原修复，一抗二抗孵育，DAB显色等步骤进行免疫组化染色。抗体信息如下表：
货号 名称 公司 稀释比
3352# STMN1 Cell Signaling Technology 1:50
4.STMN1干扰靶点的设计与验证
STMN1感染靶点的设计由上海吉玛制药技术有限公司设计与合成，具体靶点序列信息如下：
序列编号 sense(5'-3') antisense(5'-3')
STMN1-Homo-300 GGACUUUCCUUAUCCCAGUTT ACUGGGAUAAGGAAAGUCCTT
STMN1-Homo-682 CUAAUAAAGAGAACCGAGATT UCUCGGUUCUCUUUAUUAGTT
STMN1-Homo-759 GUGCGGAAGAACAAAGAAUTT AUUCUUUGUUCUUCCGCACTT
STMN1-Homo-922 GUAGGACUGUAUAGGUAGATT UCUACCUAUACAGUCCUACTT
采用达科为公司提供的转染试剂INTERFERin，按照说明书的转染操作步骤，转染6孔板，48h后收集细胞，进行RNA的抽提、反转以及QPCR的检测，验证四条干扰靶点的有效性。
5.侵袭实验
选取人肝癌细胞株HepG2接种6孔板，培养24后，按照转染试剂操作说明书进行转染，48h后，收集细胞并计数，处理组和对照组以相同数目的细胞接种于Transwell板的column中，培养24h后，用PBS清洗column 2次，经过4％多聚甲醛固定、结晶紫染色和自来水漂洗后，用棉签将column膜内侧未侵袭细胞轻轻擦去，在显微镜下选取5个不同的视野进行拍照和计数，并算出平均值。(数据见实施例4)
如图4所示，设计的四条干扰靶点效果较好，符合实验的要求。
6.增殖实验
选取人肝癌细胞株HepG2接种6孔板，培养24后，按照转染试剂操作说明书进行转染，48h后，收集细胞并计数，接种于96孔板，每隔24h取出一个96孔培养板加入10ulCCK8试剂，孵育后，在酶标仪上检测OD值。(数据见实施例5)
由图6可知，STMN1-siRNA1组中肝癌细胞侵袭能力明显下降。
序列表
<110> 上海市东方医院
<120> STMN1基因的用途
<141> 2017-10-12
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggacuuuccu uaucccagut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acugggauaa ggaaagucct t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cuaauaaaga gaaccgagat t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ucucgguucu cuuuauuagt t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gugcggaaga acaaagaaut t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
auucuuuguu cuuccgcact t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
guaggacugu auagguagat t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ucuaccuaua caguccuact t 21
<210> 9
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gattgtgcag aatacactgc ctgt 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttgcgtcttt cttctgcagc ttct 24

Claims (10)

1.STMN1基因作为标记物在原发性肝癌微血管浸润诊断中的用途。
2.一种试剂盒，其特征在于，用于检测STMN1基因。
3.STMN1基因作为标记物在制备检测原发性肝癌的辅助诊断试剂盒中的用途。
4.STMN1基因在制备治疗原发性肝癌靶向药物中的用途。
5.一种STMN1基因的拮抗剂在制备治疗原发性肝癌靶向药物中的用途。
6.一种用于干扰STMN1基因的小干扰RNA，其特征在于，包括正义链和反义链，其正义链序列为SEQ ID NO.1所示，反义链序列为：SEQ ID NO.2所示。
7.一种用于干扰STMN1基因的小干扰RNA，其特征在于，包括正义链和反义链，其正义链序列为SEQ ID NO.3所示，反义链序列为：SEQ ID NO.4所示。
8.一种用于干扰STMN1基因的小干扰RNA，其特征在于，包括正义链和反义链，其正义链序列为SEQ ID NO.5所示，反义链序列为：SEQ ID NO.6所示。
9.一种用于干扰STMN1基因的小干扰RNA，其特征在于，包括正义链和反义链，其正义链序列为SEQ ID NO.7所示，反义链序列为：SEQ ID NO.8所示。
10.权利要求6‐9中任一所述的一种用于干扰STMN1基因的小干扰RNA在制备治疗原发性肝癌靶向药物中的用途。
CN201711021992.6A 2017-10-12 2017-10-27 Stmn1基因的用途 Pending CN107828887A (zh)

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