CN115337266B - 一种纳米载药胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳米载药胶束及其制备方法和应用，所述纳米递药胶束包括聚精氨酸‑聚塞来昔布(PAC)共聚物载体以及其负载的化学药物和基因药物，所述胶束的制备方法包括以下步骤：1)PAC共聚物的制备：11)聚精氨酸前体的制备；12)聚塞来昔布前体的制备；13)聚精氨酸的制备；14)RAFT聚合；2)PAC胶束的制备：利用溶剂挥发‑静电结合法制备共载化学和基因药物的PAC胶束。即所述纳米递药胶束由聚精氨酸‑聚塞来昔布(PAC)共聚物共载基因药物和化学药物，并采用肿瘤微酸环境响应型亚胺键连接塞来昔布触发变构并发生电荷翻转，来实现异靶点精准释药以发挥高效治疗效果。

Description

一种纳米载药胶束及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于高分子材料及药物制剂新剂型技术领域，具体涉及一种纳米载药胶束及其制备方法和应用。
背景技术
当前癌症已成为危害人类健康的最主要疾病之一。肿瘤细胞为避免被免疫效应细胞识别杀伤而建立的肿瘤免疫抑制微环境一方面可使肿瘤细胞逃避机体免疫系统的识别和杀伤，另一方面可阻止药物进入肿瘤细胞杀伤肿瘤产生抑制肿瘤的治疗效果。因此，基于调控肿瘤免疫抑制微环境联合化疗治疗肿瘤是一种有前景的治疗手段。目前，基因药物可通过激发机体的免疫反应来对抗、抑制、杀灭肿瘤细胞，是一种有前景的免疫治疗手段。因此，将化学药物与基因药物协同递释至肿瘤细胞内，并将免疫调节药物递送至肿瘤微环境以协同调控肿瘤免疫抑制微环境并增强化学药物发挥直接抑瘤作用，进而实现有效治疗肿瘤的目的。
将化学药物、基因药物及免疫调节药物组合后实现异靶点递送，使其分别通过不同作用位点、不同途径发挥药效，进而使各药物达到微观水平上的协同作用，不仅可以提高各自的抗肿瘤疗效，同时还降低药物的毒副作用。然而，基因药物属于核酸类生物大分子，具有较强的亲水性并带有负电荷，与化学药物的物理化学性质截然不同。
成为异靶点化学药物、基因药物及免疫调节药物共输送载体，必须具有两种功能：第一，实现异靶点递释药物，需要响应肿瘤微环境以达到有效释药至不同靶点；第二，作为基因载体，需要具备高效的基因凝聚能力，保护基因药物不被血清和核酸酶降解，同时应具有高的转染效率，即进入靶细胞后可以促进内涵/溶酶体逃逸，从而使基因药物尽快释放到细胞质中发挥作用；第三，作为疏水化学药物载体，需要具有有效的药物装载能力，使负载的化学药物进入靶细胞后再缓慢释放。
因此，为实现化学药物与基因药物及免疫调节药物联合治疗肿瘤的目的，现急需要开发一种新型的纳米载体，使其能够高效共载化学药物、基因药物及免疫调节药物，从而克服单一用药的局限性。
发明内容
有鉴于此，本发明针对协同治疗肿瘤的化学药物和基因药物在体内高效共递送的问题，提供一种肿瘤微环境酸响应型触发变构-异靶点释药化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统，不仅实现化学药物和基因药物的胞内递送，还能实现免疫调节药物于肿瘤微环境释放以调控肿瘤免疫抑制微环境，协同增强抗肿瘤作用，为抗肿瘤的研究提供新思路。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种纳米载药胶束，所述纳米递药胶束包括聚精氨酸-聚塞来昔布(PAC)共聚物载体以及其共载的化学药物和基因药物。
本发明使用PAC共聚物作为化学和基因药物的共输送纳米载体，PAC共聚物作为共载化学和基因药物治疗肿瘤的纳米载体，具有以下优点：(1)PAC共聚物具有良好的稳定性，其内核可以包载疏水小分子化学药物，精氨酸的正电荷可以固定基因；(2)PAC共聚物包载疏水化学药物后，不仅可以提高难溶药物的溶解度，还可以降低其引起的毒副反应；(3)PAC共聚物可以与基因形成稳定的络合物，保护基因药物不被核酸酶降解；(4)PAC共聚物可以通过酸响应变构触发“质子海绵效应”提高其内涵/溶酶体逃逸能力，促进基因转染；(5)共载的化学和基因药物能够有效地在细胞内释放，从而发挥协同抗肿瘤效果；同时，在pH6.5条件下可以实现免疫调节药物塞来昔布(即CXB)在肿瘤胞外释放作用于多种免疫细胞实现免疫治疗的效果。因此，本发明选择PAC共聚物作为共载化学与基因药物的载体，并基于肿瘤微环境酸响应特性，构建具有肿瘤微环境酸响应触发载体变构-电荷翻转的异靶点药物定点递释纳米体系，不仅可以实现肿瘤的低毒、靶向、高效治疗，而且为抗肿瘤研究提供一项基于免疫调节药物、化学药物及基因药物治疗肿瘤的新型多功能纳米载体及制剂应用策略。
优选的，所述的化学药物为阿霉素、紫杉醇、多西他赛、顺铂、奥沙利铂、克唑替尼中的任一种；
和/或，所述基因药物为质粒DNA、siRNA、mRNA、反义寡核苷酸中的任一种。
优选的，所述PAC共聚物中精氨酸集合度为50～150个，塞来昔布的聚合度为10～60个。
优选的，所述纳米载药胶束中化学药物含量为8％～12％，基因药物含量为32％～48％，塞来昔布的含量为10％～35％。
优选的，所述PAC共聚物与化学药物的质量比为(5～10):1，PAC共聚物中有效氮与基因药物中磷的质量比为(10～50):1。
本发明还提供了一种如上述技术方案所述的一种纳米载药胶束的制备方法，具体包括以下步骤：
1)PAC共聚物的制备：
11)聚精氨酸前体的制备
将4-苯乙烯氯溶于有机溶剂A中，再加入催化剂NaI和Boc-精氨酸，在氮气中50～110℃条件下反应8～24h。通过硅胶柱分离化合物，加入1～5mL50wt％的三氟乙酸脱去Boc基团，得到聚精氨酸前体；
12)聚塞来昔布前体的制备
将塞来昔布与对醛基苯甲酸溶于有机溶剂A中，在催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶的催化下于氮气保护25～75℃条件下反应48～96h发生酯化反应，反应结束后用油泵抽干有机溶剂A，加入0.5～20mL浓盐酸除去4-二甲氨基吡啶，另加100～500mL有机溶剂A和等体积的饱和氯化钠进行萃取，收集有机溶剂A层，通过硅胶柱分离化合物得到产物1；
再将98wt％4-苯乙烯氯、97wt％Boc-乙醇胺和NaH溶于有机溶剂A中，在20～45℃的条件下反应12～48h发生取代反应，通过硅胶柱分离化合物得到产物2；
将产物1和产物2溶于有机溶剂B中，在45～105℃条件下回流反应5～24h发生亲核取代反应形成亚胺键，得到聚塞来昔布前体；
13)聚精氨酸的制备
聚精氨酸前体溶于有机溶剂A中，加入4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸和偶氮二异丁腈，经液氮连续冻融-抽真空2～6次后，反应液在氮气保护下于60～110℃油浴聚合，磁力搅拌反应10～40h后，液氮猝冷以停止反应，加入有机溶剂A纯化沉淀反应液2～5次，真空干燥后得到聚精氨酸；
14)RAFT聚合
将聚精氨酸、聚塞来昔布前体和偶氮二异丁腈溶于有机溶剂A中，经液氮连续冻融-抽真空2～6次后，反应液在氮气保护下于60～110℃油浴聚合，磁力搅拌反应8～40h后，液氮猝冷以停止反应，加入有机溶剂A纯化沉淀反应液2～5次，真空干燥后得到聚精氨酸-聚塞来昔布，即PAC共聚物；
2)PAC胶束的制备：
利用溶剂挥发-静电结合法制备共载化学和基因药物的PAC胶束。
本发明通过采用溶剂挥发-静电结合法制备共载化学和基因药物的PAC共聚物胶束，制备肿瘤微环境酸响应型触发变构-异靶点释药化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统，涉及的主要反应为：
其主要制备原理为:利用亲核取代反应将4-苯乙烯氯和Boc-精氨酸制备成Boc修饰的聚精氨酸前体产物，通过三氟乙酸脱Boc后得到聚精氨酸前体产物，利用RAFT聚合合成聚精氨酸(P-Arg)；再通过亲核取代将4-苯乙烯氯和Boc-乙醇胺进行反应，并用盐酸脱Boc处理后得到氨基修饰的苯乙烯氯，另外通过酯化反应将塞来昔布(CXB)与中间体对醛基苯甲酸反应得到醛基修饰的CXB，利用醇回流将氨基修饰的苯乙烯氯和醛基修饰的CXB进行反应得到聚CXB的前体产物，再利用RAFT聚合合成聚精氨酸-聚塞来昔布的共聚物即PAC，形成肿瘤微环境酸响应型触发变构-异靶点释药化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统。即本发明构建的肿瘤微环境酸响应型触发变构-异靶点释药化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统可实现体内长效循环、微环境酸响应型变构塞来昔布药物释放于胞外-触发电荷翻转以实现基因药物和化学药物有效入胞并引发质子海绵效应介导的内涵/溶酶体逃逸以促进化学药物和基因药物有效胞内递送和高效转染，发挥协同治疗肿瘤功效。
优选的，步骤2)所述PAC胶束的制备具体包括：
21)将PAC共聚物与化学药物分别溶于有机溶剂B中，混合后缓慢滴加到盛有浓度为10～50mmol/L、pH7.0～7.5并磁力搅拌的Hepes缓冲溶液中，滴加完后继续磁力搅拌8～12h，使有机溶剂B完全挥发，即得包载化学药物的PAC胶束溶液；
22)将等体积基因药物溶液加入所述包载化学药物的PAC胶束溶液中，采用移液枪头轻轻吹打均匀，静置10～40min，即得共载化学与基因药物的PAC胶束。
优选的，步骤11)所述Boc-精氨酸、4-苯乙烯氯和NaI的摩尔比为1:(0.01～1):(0.5～6)。
和/或，步骤12)所述塞来昔布、对醛基苯甲酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:(1～25):(1～20):(1～20)；
和/或，所述4-苯乙烯氯、Boc-乙醇胺和NaH的摩尔比为1:(0.5～2):(1～50)。
和/或，步骤13)所述聚精氨酸前体、4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸和偶氮二异丁腈的摩尔比为1:(0.005～0.5):(0.01～1)；
和/或，步骤14)所述聚精氨酸、聚塞来昔布前体和所述偶氮二异丁腈的摩尔比为1:(0.005～0.5):(0.01～1)。
优选的，所述有机溶剂为A为N,N二甲基甲酰胺、四氢呋喃、1,4-二氧六环、二甲基亚砜、无水乙醚、石油醚、二氯甲烷、氯仿和乙酸乙酯中的任一种；
所述有机溶剂B为甲醇、二氯甲烷、无水乙醇、四氢呋喃和乙腈中的一种或多种的混合。
一种纳米载药胶束的靶向纳米递药系统，所述系统利用微环境酸响应以亚胺键触发载体变构，使CXB作用于异靶点外，并使电荷翻转使基因药物和化学药物作用于异靶点内。
经由上述的技术方案，与现有技术相比可知，本发明公开了一种纳米载药胶束及其制备方法和应用。具有以下技术效果：
本发明公开了一种双前药共组装纳米靶向给药系统及其制备方法，其中合成了具有胶束自组装特性的PAC前药用于肿瘤微环境酸响应型释放免疫调节药物CXB；此外，该聚合物前药中含有大量的精氨酸可与带有负电荷的核酸形成稳定的复合物进行基因药物的缩合和传递，并且可以触发“质子海绵效应”提高其内涵/溶酶体逃逸能力，从而进行基因转染。由于该聚合物的主链可形成疏水内核，进而可以实现化学药物的包载。因此，本发明开发了一种创新型PAC共聚物前药，将其应用于化学药物、基因药物及免疫调节药物的异靶点高效递送，使理化性质截然不同的药物集成于一个纳米体系，为有效的实现免疫调节药物于肿瘤微环境释放作用于不同免疫抑制细胞，化学药物和基因药物于肿瘤细胞释放保证化学药物有效发挥药效，基因药物实现有效转染。值得注意的是，PAC共聚物胶束为阳离子载体在血液循环过程中更易被网状内皮系统(RES)清除，且易对正常组织产生毒性，但在负载基因药物后正电性显著降低且PAC共聚物前药的磺酰胺基团及其钠盐具有亲水及荷负电特性可使负载药物的PAC避免被RES清除延长血液循环时间；在肿瘤微环境酸响应条件下，免疫调节药物的释放、磺酰胺基团消失，胶束发生变构-电荷转变通过静电作用实现入胞，进而实现化学药物和基因药物在肿瘤胞内发挥作用。
因此，本发明创新的使三药共载于一个肿瘤微环境酸响应型触发变构-异靶点释药化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统，该系统不仅实现化学药物和基因药物的胞内递送，还能实现免疫调节药物于肿瘤微环境释放以调控肿瘤免疫抑制微环境，协同增强抗肿瘤作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
图1为实施例1中聚精氨酸(图1-A)和聚精氨酸-聚塞来昔布(图1-B)的1H-NMR表征图。
图2为肿瘤微环境酸响应型触发变构-异靶点释药化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统的稳定性图。
图3为实施例3制备的PAC/pIL-12(A)、DOX/PAC/pIL-12(B)在不同N/P下的凝胶阻滞电泳图。
图4为实施例3制备的PAC和DOX/PAC的粒径分布图。
图5为实施例3制备的空白载体、单载药及共载药的靶向纳米递药系统在pH7.4、6.8、6.5和6.0下，酸响应电位变化图。
图6为实施例3制备的游离溶液、单载及共载药的靶向纳米递药系统在pH7.4、6.5、5.0的PBS缓冲液中不同制剂的累积释药率图。
图7为实施例3制备的PEI25K/pEGFP和PAC/pEGFP在不同N/P比和pH下转染4T1细胞后的倒置荧光显微镜图。
图8为制备实施例3制备的游离溶液、单载及共载药的靶向纳米递药系统在荷瘤小鼠体内抗肿瘤药效学结果图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 PArg和PAC共聚物的合成
1.PArg的合成
将200mgBoc-精氨酸、300mgNaI和70μL的98wt％4-苯乙烯氯溶于10mL的DMF中，在油浴100℃加热条件下搅拌反应10h；将反应液中的N,N二甲基甲酰胺(DMF)用油泵抽干，用乙酸乙酯和水进行萃取，收集乙酸乙酯层，并使用硅胶拌样。采用湿法装柱、干法上样的方法分离化合物，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇。向分离出的产物中加入2mL50wt％三氟乙酸脱去Boc基团，得到聚精氨酸前体产物；
将100mg聚精氨酸前体产物溶于10mL无水四氢呋喃中，再加入1mg4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸和1.5mg偶氮二异丁腈，经液氮连续冻融-抽真空3次后，反应液在氮气保护下于90℃油浴聚合，磁力搅拌反应24h后，液氮猝冷以停止反应，加入石油醚纯化沉淀反应液3次，真空干燥后得到聚精氨酸，其1H-NMR表征图如1-A所示。
2、PAC的合成
将300mg塞来昔布、150mg中间体对醛基苯甲酸、300mg4-二甲氨基吡啶和250mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于15mLDMF中，50℃油浴搅拌反应3天。油泵将DMF抽干，加入10mL浓盐酸去除DMAP，加入250mL的二氯甲烷并使用同体积的饱和NaCl进行萃取，收集二氯甲烷层加入无水硫酸钠除水，并采用常压过滤的方法过滤多余的NaCl和硫酸钠；收集滤液，硅胶拌样旋转蒸发溶剂。采用硅胶柱进行分离，洗脱剂为二氯和甲醇，纯化得到产物1。其次，将70μL98wt％4-苯乙烯氯、77μL97wt％Boc-乙醇胺和催化剂80mgNaH溶于DMF中，氮气保护，室温搅拌反应24h；反应结束后，向反应液中加入1mL浓盐酸和3mLH2O，油泵抽干溶剂，用200mL乙酸乙酯和10mL水萃取，收集乙酸乙酯层，采用硅胶柱分离得到产物2，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯。最后，将60mg产物1和25mg产物2溶于8mL乙醇中，回流搅拌反应5h，采用硅胶柱分离得到具有酸敏感性的聚塞来昔布前体产物。
将50mg聚精氨酸前体产物溶于10mL无水四氢呋喃中，再加入30mg聚塞来昔布前体产物和2mg偶氮二异丁腈，经液氮连续冻融-抽真空3次后，反应液在氮气保护下于85℃油浴聚合，磁力搅拌反应10h后，液氮猝冷以停止反应，加入石油醚纯化沉淀反应液3次，真空干燥后得到聚精氨酸-聚塞来昔布，其1H-NMR表征图如图1-B所示。
实施例2 PArg和PAC共聚物的合成
1、PArg的合成
将1.0gBoc-精氨酸、1.5gNaI和3.5mL的4-苯乙烯氯溶于25mL的DMF中，在油浴100℃加热条件下搅拌反应10h；将反应液中的DMF用油泵抽干，用乙酸乙酯和水进行萃取，收集乙酸乙酯层，并使用硅胶拌样。采用湿法装柱、干法上样的方法分离化合物，洗脱剂为二氯和甲醇。将分离出的产物用三氟乙酸脱去Boc基团，得到聚精氨酸前体产物；
将1g聚精氨酸前体产物溶于10mL无水四氢呋喃中，再加入10mg4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸和15mg偶氮二异丁腈，经液氮连续冻融-抽真空3次后，反应液在氮气保护下于90℃油浴聚合，磁力搅拌反应24h后，液氮猝冷以停止反应，加入石油醚纯化沉淀反应液3次，真空干燥后得到聚精氨酸，通过1H-NMR表征结构。
2、PAC的合成
将1g塞来昔布、500mg中间体对醛基苯甲酸、1g4-二甲氨基吡啶和800mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于25mLDMF中，50℃油浴搅拌反应3天。油泵将DMF抽干，加入15mL浓盐酸去除4-二甲氨基吡啶，加入500mL的二氯甲烷并使用同体积的饱和NaCl进行萃取，收集二氯甲烷层加入无水硫酸钠除水，并采用常压过滤的方法过滤多余的NaCl和硫酸钠；收集滤液，硅胶拌样旋转蒸发溶剂。采用硅胶柱进行分离，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，纯化得到产物1。其次，将700μL4-苯乙烯氯、770μLBoc-乙醇胺和催化剂800mgNaH溶于DMF中，氮气保护，室温搅拌反应24h；反应结束后，向反应液中加入10mLHCl和30mLH2O，油泵抽干溶剂，用500mL乙酸乙酯和20mL水萃取，收集乙酸乙酯层，采用硅胶柱分离得到产物2，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯。最后，将600mg产物1和250mg产物2溶于25mL乙醇中，回流搅拌反应5h，采用硅胶柱分离得到具有酸敏感性的聚塞来昔布前体产物。
将500mg聚精氨酸前体产物溶于20mL无水四氢呋喃中，再加入300mg聚塞来昔布前体产物和20mg偶氮二异丁腈，经液氮连续冻融-抽真空3次后，反应液在氮气保护下于85℃油浴聚合，磁力搅拌反应10h后，液氮猝冷以停止反应，加入石油醚纯化沉淀反应液3次，真空干燥后得到聚精氨酸-聚塞来昔布共聚物，通过1H-NMR表征结构。
实施例3
肿瘤微环境酸响应型触发变构-异靶点释药化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统的制备
本实施例结合实施例1，联合使用免疫治疗基因白介素-12质粒DNA(pIL-12)和细胞毒性药物阿霉素(DOX)，利用DOX诱导肿瘤细胞的免疫原性死亡，调节免疫抑制微环境，协助pIL-12发挥作用，共同对抗肿瘤。共载DOX/pIL-12的靶向纳米制剂的制备方法如下：
将10mgPAC共聚物(实施例1)与1mgDOX分别溶于甲醇中，二者混合后，缓慢滴加到1mL浓度为10mmol/LpH7.4并磁力搅拌的Hepes缓冲溶液中，滴加完后继续使用磁力搅拌10h，使有机溶剂完全挥发，即得DOX浓度为1mg/mL的DOX/PAC胶束溶液。PAC胶束溶液的制备方法与上述一致但在制备过程中不加DOX甲醇溶液。
将1mL浓度为0.5mg/mL的pIL-12溶液加入上述PAC和DOX/PAC胶束溶液中，采用移液枪头轻轻吹打均匀，静置30min，即得PAC/pIL-12和共载化学和基因药物的DOX/PAC/pIL-12纳米制剂。
对比例1
纳米递药系统的制备
将10mgPAC共聚物(实施例2)溶于1mL甲醇中，制成浓度为10mg/mL的PAC的甲醇溶液，有机溶剂经氮气吹干，并真空干燥除去残余有机溶剂，形成聚合物薄膜，加入pH7.2浓度为10mmol/LHepes缓冲溶液10mL，使其完全溶解并均匀分散，制得浓度为1mg/mL的PAC前药胶束纳米递药系统。
对比例2
纳米递药系统的制备
将10mgPAC共聚物(实施例2)溶于二甲基亚砜。置于截留分子量为3500Da的透析袋内，浸入蒸馏水中，透析24h除去有机溶剂和游离药物，收集透析袋内溶液，制得浓度为1mg/mL的PAC前药胶束纳米递药系统。
测试数据1
肿瘤微环境酸响应型触发变构-异靶点释药化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统的稳定性
将实施例3制备的共载化学/基因药物的靶向纳米制剂与对比例1、对比例2中的双前药共组装靶向纳米制剂分别置于4℃，以是否析出沉淀为标准观察稳定性情况。
结果如图2所示，相比于对比例1、对比例2中制备的PAC胶束溶液，采用本发明制备方法制备出的PAC胶束稳定性更高，可达23天，并且包载DOX不影响其稳定性。共载化学/基因药物的纳米制剂DOX/PAC/pIL-12可稳定12天，稳定性优于DOX/PAC，表明本发明制备方法制备出的纳米制剂具有更好的稳定性，这可能归因于带有负电荷的基因药物与PAC阳离子聚合物形成更稳定的复合物有助于提高纳米制剂的稳定性。
测试数据2
肿瘤微环境酸响应型触发变构-异靶点释药化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统对基因的负载能力
通过凝胶阻滞试验评价实施例3制备的纳米递药系统负载基因药物的能力。按照PAC/pIL-12的N/P比为10到70，制备凝聚1μgpIL-12的PAC/pIL-12(A)、DOX/PAC/pIL-12(B)胶束复合物。将新鲜制备的各胶束复合物与上样缓冲液混合均匀，每孔20μL加到0.8％琼脂糖凝胶中，用TAE缓冲液作为电解质，80mV下跑45min，电泳结束后置于凝胶成像系统进行分析。
结果如图3A-B所示，当N/P比为30及以上时，基因被成功阻滞，表明基因可以有效地凝聚在阳离子胶束上。
测试数据3
肿瘤微环境酸响应型触发变构-异靶点释药化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统的表征
采用动态光散射法对实施例3制备的纳米递药系统的粒径及表面电位进行表征，结果如图4所示。PAC共聚物胶束的粒径主要分布在235nm左右；DOX/PAC在摇胶束的粒径主要分布在225nm左右。这表明PAC空白载体和载药胶束具有较小的粒径，可通过EPR效应聚积至肿瘤部位，进而达到有效的递药效果。
测试数据4
肿瘤微环境酸响应型触发变构-异靶点释药化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统的酸响应性评价
通过检测体外模拟生理条件(pH7.4)肿瘤细胞外环境(pH6.8、6.5、6.0)下纳米递药系统的Zeta电位变化，考察PAC和DOX/PAC的粒径的变化情况及PAC/pIL-12和DOX/PAC/pIL-12在肿瘤细胞外微环境中的电荷翻转特性，结果如图5所示。随着pH的降低，PAC/pIL-12和DOX/PAC/pIL-12胶束表面电荷逐渐逆转至正电荷，有助于载药胶束进入肿瘤细胞，发挥治疗效果。结果表明，共载化学/基因药物的纳米递药系统在肿瘤细胞外微酸环境中，酸敏感键断裂实现电荷翻转，进而有效入胞，有利于化学和基因药物的释放。
测试数据5
肿瘤微环境酸响应型触发变构-异靶点释药化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统的体外释放评价
采用透析法考察纳米递药系统的体外释放行为。将实例3中制备的不同载药胶束复合物置于截留量为3500的透析袋内和释放介质中。释放介质为不同pH值(7.4、6.5、5.0)的PBS缓冲液，37℃恒温摇床摇动。在规定的时间间隔内，采集透析袋外的2mL溶液并补充相同体积的缓冲液。采用荧光分光光度计测定制剂中药物的释放量，结果如图6所示。模拟血液循环过程中的生理环境下，DOX/PAC和DOX/PAC/pIL-12胶束中药物的释放非常缓慢，说明载药胶束在血液循环中稳定，有利于肿瘤组织的高效积累。在pH6.5的条件下，载药胶束在响应微酸环境后仍保持稳定结构，使得药物释放较少。载药胶束在模拟肿瘤胞内微环境药物的释放行为，释放量最多，该释放行为有利于载药胶束发挥化学-基因协同抗肿瘤功效。
测试数据6
肿瘤微环境酸响应型触发变构-异靶点释药化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统的细胞转染性能
选取生长良好的4T1细胞接种到12孔培养板中，孵育过夜。吸出培养基并用PBS将细胞表面清洗干净，用不含酚红与血清的培养基稀释pH7.4和pH6.5条件下的PEI25K/pEGFP和PAC/pEGFP(N/P比值为10、20、30、40)并加入到培养孔中，于37℃、5％CO2培养箱中孵育。4h后吸出培养基并加入新鲜培养基继续培养。48h后，置于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的分布与强度。结果如图7所示，随着N/P比升高，PEI25K能够高效转染细胞，但PEI25K/pEGFP多聚物在N/P比为20及以上时，会引起严重的细胞形态改变和明显的细胞毒性。PAC/pEGFP处理4T1细胞的EGFP蛋白表达也随着N/P比值的增加而显著增强。但也注意到4T1细胞有细胞毒性和形态缺陷，可能导致N/P比为40时基因转染效率下降。上述基因转染结果表明，PAC可作为基因传递和转染的有效载体。
测试数据7
肿瘤微环境酸响应性触发变构-异靶点释药化学/基因药物共载的靶向纳米递药系统的体内药物作用效果
42只雌性BABL/c(6-8周)，皮下注射4T1细胞(2×106个细胞/鼠)。待肿瘤体积至50mm3，随机分为七组，即生理盐水组，CXB溶液组，DOX溶液组，PAC胶束组，DOX/PAC胶束组，PAC/pIL-12胶束组和DOX/PAC/pIL-12胶束组。于0、2、4、6、8天给药，并记录小鼠肿瘤体积和体重。于21天处死小鼠，取出肿瘤进行拍照并称重，研究共载药胶束体内抗肿瘤作用。结果如图8A所示，与其他治疗组相比，DOX/PAC/pIL-12胶束治疗组的肿瘤体积最小，这表明PAC具有共载化疗药物和基因药物的能力，可实现化学药物DOX与基因药物pIL-12的体内同步共递送；通过肿瘤微环境酸响应CXB释放至肿瘤胞外再以静电作用内吞入胞共释放DOX和pIL-12于肿瘤细胞内，发挥免疫化疗联合抗肿瘤作用。图8B和D为不同治疗组的肿瘤大小拍照图和肿瘤重量变化图，结果同图8A。图8C为不同治疗组20天内的体重变化图，结果表明各治疗组相较于对照组来说体重未发生显著性差异，证明PAC载体具有较好的安全性，进入体内后不会引起异常的体重变化。通过体内药效结果实验证明了共载药胶束DOX/PAC/pIL-12组的肿瘤明显被抑制，这进一步证实了PAC载体可实现DOX和pIL-12的有效递送，提高了两药在肿瘤组织的蓄积量，达到了最佳的抗肿瘤治疗效果。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (5)

1.一种纳米载药胶束，其特征在于，所述纳米递药胶束包括聚精氨酸-聚塞来昔布共聚物载体以及共载的化学药物和基因药物；
所述聚精氨酸-聚塞来昔布共聚物化学结构式如下：
;
其中，m为50～150，n为10～60；
所述化学药物为阿霉素、紫杉醇、多西他赛、顺铂、奥沙利铂、克唑替尼中的任一种；
所述基因药物为质粒DNA、siRNA、mRNA、反义寡核苷酸中的任一种。
2.根据权利要求1所述的一种纳米载药胶束，其特征在于，所述纳米载药胶束中化学药物含量为8％～12％，基因药物含量为32％～48％，塞来昔布的含量为10％～35％。
3.根据权利要求1-2任一项所述的一种纳米载药胶束，其特征在于，所述聚精氨酸-聚塞来昔布共聚物与化学药物的质量比为(5～10):1，聚精氨酸-聚塞来昔布共聚物中有效氮与基因药物中磷的质量比为(10～50):1。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种纳米载药胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）聚精氨酸的合成
将200mgBoc-精氨酸、300mgNaI和70μL的98wt％4-氯甲基苯乙烯溶于10mL的N,N二甲基甲酰胺中，在油浴100℃下搅拌反应10h；将反应液中的N,N二甲基甲酰胺用油泵抽干，用乙酸乙酯和水进行萃取，收集乙酸乙酯层，并使用硅胶拌样；采用湿法装柱、干法上样的方法分离化合物，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇；向分离出的化合物中加入2mL50wt％三氟乙酸脱去Boc基团，得到聚精氨酸前体产物；
将100mg所述聚精氨酸前体产物溶于10mL无水四氢呋喃中，再加入1mg4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸和1.5mg偶氮二异丁腈，经液氮连续冻融-抽真空3次后，反应液在氮气保护下于90℃油浴聚合，搅拌反应24h后，液氮猝冷以停止反应，加入石油醚纯化沉淀反应液3次，真空干燥后得到聚精氨酸；
（2）聚精氨酸-聚塞来昔布共聚物的合成
先将300mg塞来昔布、150mg对醛基苯甲酸、300mg4-二甲氨基吡啶和250mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于15mLN,N二甲基甲酰胺中，50℃油浴搅拌反应3天；油泵将N,N二甲基甲酰胺抽干，加入10mL浓盐酸去除4-二甲氨基吡啶，加入250mL的二氯甲烷并使用同体积的饱和NaCl进行萃取，收集二氯甲烷层加入无水硫酸钠除水，常压过滤出NaCl和硫酸钠；收集滤液，硅胶拌样旋转蒸发溶剂；采用硅胶柱进行分离，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，纯化得到产物1；
其次，将70μL98wt％4-氯甲基苯乙烯、77μL97wt％Boc-乙醇胺和80mgNaH溶于N,N二甲基甲酰胺中，氮气保护，室温搅拌反应24h；反应结束后，向反应液中加入1mL浓盐酸和3mLH2O，油泵抽干溶剂，用200mL乙酸乙酯和10mL水萃取，收集乙酸乙酯层，采用硅胶柱分离得到产物2，其中洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯；
最后，将60mg所述产物1和25mg所述产物2溶于8mL乙醇中，回流搅拌反应5h，采用硅胶柱分离得到聚塞来昔布前体产物；将50mg所述聚精氨酸溶于10mL无水四氢呋喃中，再加入30mg所述聚塞来昔布前体产物和2mg偶氮二异丁腈，经液氮连续冻融-抽真空3次后，反应液在氮气保护下于85℃油浴聚合，磁力搅拌反应10h后，液氮猝冷以停止反应，加入石油醚纯化沉淀反应液3次，真空干燥后得到聚精氨酸-聚塞来昔布共聚物；
（3）纳米载药胶束的制备
将10mg所述聚精氨酸-聚塞来昔布共聚物与1mg阿霉素分别溶于甲醇中，混合均匀，缓慢滴加到1mL浓度为10mmol/L、pH为7.4并磁力搅拌的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液中，滴加完后继续磁力搅拌10h，即得阿霉素浓度为1mg/mL的阿霉素/聚精氨酸-聚塞来昔布胶束溶液；
将1mL浓度为0.5mg/mL的pIL-12溶液加入所述阿霉素/聚精氨酸-聚塞来昔布胶束溶液中，吹打均匀，静置30min，即得共载化学和基因药物的阿霉素/聚精氨酸-聚塞来昔布/pIL-12的纳米载药胶束。
5.根据权利要求1-3任一项所述的一种纳米载药胶束或根据权利要求4所述的制备方法获得的纳米载药胶束，其特征在于，所述纳米载药胶束利用微环境酸响应以亚胺键触发载体变构，使塞来昔布作用于异靶点外，并使电荷翻转使基因药物和化学药物作用于异靶点内。
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