CN111729086A - 核酸纳米器件及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种核酸纳米器件，所述核酸纳米器件为负载有化疗药物且杂交有小干扰RNA的DNA折纸结构，所述DNA折纸结构上杂交有细胞穿透肽和/或核酸适配体，且可以通过特定DNA序列修饰实现响应性开闭。本发明还提供了其制备方法与应用。本发明提供的核酸纳米器件利用小干扰RNA的基因沉默作用敲除多药耐药肿瘤细胞的相关耐药基因，再结合化疗药物阿霉素杀伤肿瘤细胞，并杂交穿膜多肽TAT提高该纳米器件穿透肿瘤细胞膜的效率。在基因治疗和化疗的共同作用下，该核酸纳米器件在细胞和活体水平上显著地降低了耐药基因的表达并抑制了肿瘤细胞的生长，且没有明显的免疫原性和组织毒性。

Description

核酸纳米器件及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米药物领域，具体地说，涉及一种核酸纳米器件及其制备方法与应用。
背景技术
目前，癌症每年在全世界范围的患病率正逐步提高，而且，癌症的死亡率也呈逐年上升趋势。据美国癌症协会统计，90％以上肿瘤患者在化疗过程中都会产生自发或获得性耐药，这也是导致化疗失败的重要原因。多药耐药性(multidrug-resistance,MDR)是指肿瘤细胞对接触的一种化疗药物产生耐药的同时，对其它未接触过的、结构和作用机制各不相同的药物也产生交叉耐药的现象。MDR在肿瘤细胞中的形成机制十分复杂，肿瘤细胞可通过不同途径产生多药耐药性。肿瘤的多药耐药性是攻克癌症问题所要面临的重要挑战。
在单独化疗无法解决的多药耐药肿瘤的环境下，发展基因治疗是一种有力的辅助手段，可以从根源下调肿瘤细胞的耐药基因，从而减轻化疗的压力。基因治疗常用的是RNA干扰的方法，RNA干扰(RNAi)是用双链RNA诱发宿主细胞同源mRNA降解而导致基因沉默的基因治疗技术。这种现象发生于转录后水平，又称为转录后沉默。RNA干扰可以高效、特异地阻断体内同源基因的表达，促使细胞表现出特定基因缺失。目前常用的基因治疗介质有小干扰RNA和小发卡RNA。针对不同的肿瘤MDR基因设计小干扰RNA，转染细胞后逆转肿瘤的MDR已得到了广泛的研究。研究已经证实小干扰RNA介导的MDR1和MDR3基因沉默可以提高乳腺癌细胞系MCF-7/ADR细胞内阿霉素的聚集，提高该细胞对阿霉素的敏感性。
纳米材料的诞生为抗癌药物带来了新的契机，纳米材料具有表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应，特定的纳米药物载体为阿霉素等抗癌药物以及小干扰RNA等提供了靶向性、可控性等性能。DNA纳米技术的出现为纳米材料的制备提供了一个新的出路，尤其是DNA折纸结构，具有形貌可控性、可寻址性、可修饰性等优势。所谓DNA折纸技术，即是利用长的噬菌体单链核苷酸序列与若干条短的寡核苷酸序列通过碱基互补配对进行杂交形成预先设计的结构，通过这项技术，可以简单方便的制备结构复杂的二维或三维DNA纳米结构。值得一提的是，作为生物大分子，DNA具有其他材料不可比拟的生物安全性，这为DNA折纸结构作为载体提供了强有力的支持。另外，DNA的双螺旋结构也为阿霉素一类的化疗药物提供了嵌入位点，而经过单链DNA修饰的小干扰RNA或多肽等分子，也可以通过分子杂交的方式连接到DNA折纸结构上。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种核酸纳米器件及其制备方法与应用。
在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：
术语“TAT”是指：细胞穿透肽TAT，一种源自人免疫缺陷病毒的转录反式激活因子。
术语“NLS”是指：核定位信号肽。
术语“RGD”是指：RGD肽，一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg―Gly―Asp)的短肽。
术语“Pep-1”是指：细胞穿透肽Pep-1。
术语“ATP”是指：三磷酸腺苷。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种核酸纳米器件，所述核酸纳米器件为负载有化疗药物且杂交有小干扰RNA的DNA折纸结构，所述DNA折纸结构上杂交有细胞穿透肽和/或核酸适配体，并含有修饰了刺激响应性元件的订书钉链；
其中，所述细胞穿透肽和/或核酸适配体与单链DNA形成复合物后杂交到DNA折纸结构上。
根据本发明第一方面的核酸纳米器件，其中，所述DNA折纸结构为二维DNA折纸结构或三维DNA折纸结构；
优选地，所述DNA折纸结构是通过环状长序列的M13噬菌体基因组DNA单链和短序列的书钉链及捕获书钉链按照碱基互补配对原则杂交组装成的三维DNA折纸结构；
更优选地，所述DNA折纸结构为三维管状结构。
根据本发明第一方面的核酸纳米器件，其中，所述小干扰RNA选自以下一种或多种：P-糖蛋白小干扰RNA、B细胞淋巴瘤/白血病-2小干扰RNA、生存素小干扰RNA；优选为P-糖蛋白小干扰RNA和/或B细胞淋巴瘤/白血病-2小干扰RNA。
根据本发明第一方面的核酸纳米器件，其中，所述化疗药物选自以下一种或多种：紫杉醇、顺铂、环磷酰胺、羟基喜树碱、盐酸阿霉素；优选为盐酸阿霉素。
根据本发明第一方面的核酸纳米器件，其中，所述细胞穿透肽选自以下一种或多种：TAT、NLS、RGD、Pep-1；和/或
所述核酸适配体选自以下一种或多种：MUC-1核酸适配体、AS1411核酸适配体、EGFR核酸适配体、A10核酸适配体。
根据本发明第一方面的核酸纳米器件，其中，所述刺激响应性元件选自二硫键、二硒键、琥珀酰亚胺-硫醚键和/或ATP响应核酸适配体、sgc8c核酸适配体，优选为二硫键。
本发明的第二方面提供了第一方面所述的核酸纳米器件的制备方法，该制备方法可以包括以下步骤：
(1)利用点击化学反应，制备单链DNA与细胞穿透肽和/或核酸适配体的共轭复合物；
(2)利用DNA折纸技术，制备成二维/三维的DNA折纸结构；
(3)在所述DNA折纸结构上组装化疗药物，制备得到化疗药物复合DNA纳米结构；
(4)通过分子杂交的方式在步骤(3)所述化疗药物复合DNA折纸结构上杂交小干扰RNA；
(5)通过分子杂交的方式在步骤(4)所述化疗药物复合DNA折纸结构上杂交步骤(1)所得的共轭复合物，组装得到所述核酸纳米器件。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，步骤(1)中，所述单链DNA以及所述细胞穿透肽和/或核酸适配体分别通过叠氮或炔基修饰；
优选地，单链DNA的5’端通过叠氮修饰，所述细胞穿透肽和/或核酸适配体的末端通过炔基修饰。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，步骤(3)中所述DNA纳米结构与所述化疗药物的摩尔比为1:2×103～1:9×107，优选为1:104；
优选地，步骤(3)所述组装方式为化疗药物通过嵌入碱基对或吸附方式组装到DNA折纸结构中。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，步骤(4)中所述DNA折纸结构复合化疗药物与小干扰RNA的摩尔比为1：10～1：100，优选为1：48；和/或
步骤(5)中所述化疗药物复合DNA折纸结构与步骤(1)所得的共轭复合物的摩尔比为1：10～1：50，优选为1：28。
本发明的第三方面提供了第一方面所述的核酸纳米器件或根据第二方面所述方法制得的核酸纳米器件在制备用于基因治疗和/或化疗的药物或医疗产品中的应用。
本发明提供了一种基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件及其制备方法与应用。所述核酸纳米器件由DNA折纸纳米结构、化疗药物阿霉素、小干扰RNA以及细胞穿透肽TAT制备得到。本发明提供的核酸纳米器件利用小干扰RNA的基因沉默作用敲除多药耐药肿瘤细胞的相关耐药基因，再结合化疗药物阿霉素杀伤肿瘤细胞，并杂交细胞穿透肽TAT提高该纳米器件穿透肿瘤细胞膜的效率。在基因治疗和化疗的共同作用下，该核酸纳米器件在细胞和活体水平上显著地降低了耐药基因的表达并抑制了肿瘤细胞的生长，且没有明显的免疫原性和组织毒性。
为了实现本发明目的，一方面，本发明提供一种基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件，所述核酸纳米器件由DNA折纸纳米结构、化疗药物阿霉素、小干扰RNA以及细胞穿透肽TAT制备得到。
本发明提供的核酸纳米器件利用小干扰RNA的基因沉默作用敲除多药耐药肿瘤细胞的相关耐药基因，再结合化疗药物阿霉素杀伤肿瘤细胞，并杂交细胞穿透肽TAT提高该纳米器件穿透肿瘤细胞膜的效率。在基因治疗和化疗的共同作用下，该核酸纳米器件在细胞和活体水平上显著地降低了耐药基因的表达并抑制了肿瘤细胞的生长，且没有明显的免疫原性和组织毒性。
在本发明的基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件中，所述核酸纳米器件为利用DNA折纸技术制备的DNA二维/三维纳米结构。优选地，所述DNA纳米结构是通过环状长序列的M13噬菌体基因组DNA单链和短序列的书钉链及捕获书钉链按照碱基互补配对原则杂交组装成的三维DNA折纸结构。优选地，为了达到响应性开闭的纳米器件的功效，其中12条含有二硫键的短序列书钉链在组装时可将整个DNA折纸结构折叠成管状，而在进入肿瘤细胞后，由于和细胞质内谷胱甘肽发生氧化还原反应而被切断，从而响应性打开。该响应性元件除二硫键外，还可通过核酸适配体实现。
在本发明的基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件中，所述化疗药物选自紫杉醇、顺铂、环磷酰胺、羟基喜树碱、盐酸阿霉素或所述药物的药学上可接受的药物中的任意一种或至少两种的组合，优选为盐酸阿霉素。
在本发明的基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件中，所述小干扰RNA选自相应的肿瘤耐药相关基因，即P-糖蛋白小干扰RNA、B细胞淋巴瘤/白血病-2小干扰RNA和生存素小干扰RNA中的两种组合，优选为P-糖蛋白小干扰RNA和B细胞淋巴瘤/白血病-2小干扰RNA。
在本发明的基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件中，所述穿膜多肽TAT可替换为任一种细胞穿透肽和/或核酸适配体。
另一方面，本发明提供了所述基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)将所有DNA单链在去离子水或PBS缓冲溶液中溶解得到200μM的溶液，小干扰RNA在DEPC水中溶解得到50μM的溶液；
2)将用于点击化学反应的单链DNA与TAT多肽以1：2-1：3的比例混合于DMSO中，并加入相对于单链DNA摩尔数50-100倍过量的的抗坏血酸和二价铜催化剂。室温过夜孵育后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化，得到单链DNA与TAT多肽的共轭复合物。
3)将M13噬菌体基因组DNA和订书钉链及捕获订书钉链混合在1×TAE/Mg2+缓冲溶液(pH＝8.3)中，最终获得混合溶液的体积为100μL，控制上述混合溶液的温度从95℃逐步降至20℃，整个降温过程控制在12小时以上，从而获得所述三维DNA折纸结构；
4)在步骤3)获得的DNA折纸结构溶液中加入盐酸阿霉素，使得DNA纳米结构与盐酸阿霉素的摩尔比为1:104。室温摇床孵育过夜后，利用截留分子量为100kDa的超滤柱进行分离纯化，以4700rpm的离心方式过滤掉未参与组装的订书钉链、捕获订书钉链以及未负载至DNA折纸结构的盐酸阿霉素分子，得到负载阿霉素的化疗药物复合DNA纳米结构；
5)在步骤4)获得的负载阿霉素的化疗药物复合DNA纳米结构溶液中加入≥2倍摩尔数过量的50μM P-糖蛋白小干扰RNA和B细胞淋巴瘤/白血病-2小干扰RNA，升温至45℃，而后降温至25℃，每摄氏度保持5分钟，重复4-6个循环，完成杂交；
6)在步骤5)获得的杂交产物溶液中加入≥2倍摩尔数过量的200μM DNA-TAT共轭复合物，升温至45℃，而后降温至25℃，每摄氏度保持5分钟，重复4-6个循环，完成杂交，除去多余的小干扰RNA和DNA-TAT共轭复合物，得到基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件。
在本发明所述的基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件的制备方法中，步骤2)的目的是利用点击化学反应来制备单链DNA与TAT多肽的共轭复合物，再通过捕获链连接到DNA折纸结构上。其中单链DNA的3’或5’端修饰有叠氮基，而TAT多肽末端带有炔基修饰。或单链DNA带炔基修饰，TAT多肽带叠氮修饰。优选地，单链DNA 5’端带叠氮修饰，TAT多肽带炔基修饰。反应过程中，为使单链DNA连接效率提高，加入2-3倍过量的TAT多肽，优选为2倍过量。抗坏血酸将二价铜还原为一价亚铜粒子发挥催化作用，其中抗坏血酸的摩尔数为单链DNA的50-100倍,可以为50、60、70、80、90或100倍，优选为50倍。例如，反应体积及比例为，单链DNA(200μM，25μL)，TAT多肽(200μM，50μL)，抗坏血酸(10mM，25μL)，Cu2+-TBTA 25μL，DMSO 25μL。反应产物可通过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离提纯。
在本发明所述的基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件的制备方法中，步骤3)所述DNA折纸结构通过现有技术制备。例如，在1×TAE/Mg2+缓冲溶液(pH＝8.3)中制备10nM，100μL的DNA折纸结构，最终获得混合溶液的体积为100μL，其中M13噬菌体基因组DNA的浓度为10nM，订书钉链及捕获订书钉链的浓度均为100nM。
在本发明所述的基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件的制备方法中，步骤4)所述DNA折纸结构与盐酸阿霉素的摩尔比为1:2×103-1:9×107，优选为1:104；例如，摩尔比可以为1:2×103、1:3×103、1:5×103、1:8×103、1:104、1:3×104、1:5×104、1:8×104、1:9×104、1:105、1:3×105、1:5×105、1:8×105、1:106、1:3×106、1:5×106、1:8×106、1:107、1:3×107、1:5×107或1:9×107。
优选地，步骤4)所述方法为向DNA折纸结构中加入盐酸阿霉素，盐酸阿霉素通过嵌入氢键和吸附两种方式组装到DNA折纸结构中。
步骤4)所述分离纯化采用现有技术实现，例如可以采用超滤、离心分离等技术。
在本发明所述的基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件的制备方法中，步骤5)、6)所述杂交中，小干扰RNA或DNA-TAT共轭复合物与DNA折纸结构的摩尔比≥2，例如可以为2、3、4、5、6、8、10、20、30、40、50、100、200或500等，优选为3。所述杂交步骤为：将步骤4)得到的负载阿霉素的化疗药物复合DNA纳米结构溶液与小干扰RNA和DNA-TAT共轭复合物依次混合，升温至40-50℃，而后降温至20-25℃，每摄氏度保持2-10分钟，重复4-6个循环。例如可将温度升高至40℃、41℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃；而后降温至20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃；每摄氏度保持2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟；如此重复4-6个循环，例如重复4个循环、5个循环或6个循环。
优选地，步骤5)、6)所述杂交步骤为，将步骤4)得到的负载阿霉素的化疗药物复合DNA纳米结构溶液与小干扰RNA和DNA-TAT共轭复合物依次混合，升温至45℃，而后降温至25℃，每摄氏度保持5分钟，重复5个循环，完成杂交。
步骤5)、6)所述的除去方法采用现有技术实现，例如采用100kDa的超滤柱，以4700rpm的离心方式过滤掉分子量较小的小干扰RNA和DNA-TAT共轭复合物，得到提纯后的核酸纳米器件。
作为优选技术方案，本发明提供的基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件的制备方法，具体包括以下步骤：
1)将所有DNA单链在去离子水或PBS缓冲溶液中溶解得到200μM的溶液，小干扰RNA在DEPC水中溶解得到50μM的溶液；
2)将用于点击化学反应的单链DNA与TAT多肽(单链DNA 5’端带叠氮修饰，TAT多肽带炔基修饰)以1：2的比例混合于DMSO中，并加入相对于单链DNA摩尔数50倍过量的的抗坏血酸和二价铜催化剂。室温过夜孵育后用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化，得到单链DNA与TAT多肽的共轭复合物。
3)将M13噬菌体基因组DNA和订书钉链及捕获订书钉链混合在1×TAE/Mg2+缓冲溶液(pH＝8.3)中，最终获得混合溶液的体积为100μL，控制上述混合溶液的温度从95℃逐步降至20℃，整个降温过程控制在12小时以上，从而获得所述三维DNA折纸结构；
4)在步骤3)获得的DNA折纸结构溶液中加入盐酸阿霉素，使得DNA纳米结构与盐酸阿霉素的摩尔比为1:104。室温摇床孵育过夜后，利用截留分子量为100kDa的超滤柱进行分离纯化，以4700rpm的离心方式过滤掉未参与组装的订书钉链、捕获订书钉链以及未负载至DNA折纸结构的盐酸阿霉素分子，得到负载阿霉素的化疗药物复合DNA纳米结构；
5)在步骤4)获得的负载阿霉素的化疗药物复合DNA纳米结构溶液中加入3倍摩尔数过量的50μM P-糖蛋白小干扰RNA和B细胞淋巴瘤/白血病-2小干扰RNA，升温至45℃，而后降温至25℃，每摄氏度保持5分钟，重复5个循环，完成杂交；
6)在步骤5)获得的杂交产物溶液中加入3倍摩尔数过量的200μM DNA-TAT共轭复合物，升温至45℃，而后降温至25℃，每摄氏度保持5分钟，重复5个循环，完成杂交，通过100kDa的超滤柱除去多余的小干扰RNA和DNA-TAT共轭复合物，得到基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件。
另一方面，本发明提供了所述的基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件在肿瘤治疗中的应用。本发明的基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件可利用DNA纳米结构同时负载化疗药物和小干扰RNA，可以起到基因治疗和化疗的双重效果，对于肿瘤的治疗更加有效。
本发明的纳米器件可以具有但不限于以下有益效果：
本发明通过DNA折纸技术构建了一种三维管状的DNA折纸结构，其作为载体，可同时负载化疗药物和小干扰RNA，在肿瘤的EPR效应下富集在肿瘤区域，并通过杂交TAT多肽来提高该器件穿透肿瘤细胞的效率，从而减少了结构由于非特异性而存在的免疫原性和组织毒性。另外，由于小干扰RNA的杂交位点在该管状DNA折纸结构的内部，可以有效防止其受到核酸酶的降解。同时，由于该管状DNA折纸结构由含二硫键的寡核苷酸链控制打开与关闭，具有在肿瘤细胞内响应性打开，暴露并释放小干扰RNA的功能。
对于耐药型肿瘤细胞，该器件在进入细胞后会通过释放小干扰RNA来下调相应多药耐药基因的表达，如P-糖蛋白基因和B细胞淋巴瘤/白血病-2基因，从而减少化疗药物的外排并加速细胞的凋亡，为同时释放的化疗药物杀伤肿瘤细胞提供了有力的辅助。在细胞水平上，可使癌细胞的活力下降至30％左右，在活体水平上，在对荷瘤小鼠治疗24天后可有效抑制实体瘤的增殖，对癌细胞的杀伤作用明显优于DNA纳米结构单独负载化疗药物的杀伤作用，因此能更高效地治疗肿瘤疾病。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了本发明所述基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件的示意图，负载有阿霉素，小干扰RNA和TAT多肽。
图2示出了实施例1中本发明所述基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件的原子力显微镜表征，图中标尺为100nm。
图3示出了试验例1中利用流式细胞仪对本发明所述基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件及各对照组被MCF-7/ADR细胞摄取的流式定量分析结果。
图4示出了试验例2中利用MTT比色实验对本发明所述基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件及各对照组对MCF-7/ADR细胞杀伤作用的效果分析。
图5示出了试验例3中利用小动物光学活体成像系统对基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件及各对照组在荷瘤小鼠体内动态分布的成像结果。
图6示出了试验例4中对各组荷瘤小鼠进行相应药物治疗过程中得到的肿瘤生长曲线。
图7示出了试验例5中利用琼脂糖凝胶电泳验证核酸纳米器件在谷胱甘肽还原作用下响应性打开的结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
原料：
短序列DNA链、小干扰RNA链(PAGE纯化、HPLC纯化)购于北京擎科生物技术有限公司；M13噬菌体基因组DNA购自New England Biolabs公司；TAT多肽购于紫域生物有限公司；盐酸阿霉素等化疗药物购自北京华奉有限公司；细胞培养基购于维森特生物技术有限公司，其他试剂购于美国Sigma-Aldrich公司。
试剂：
实验中所用的缓冲溶液有TAE/Mg2+缓冲溶液(pH 8.3)和PBS缓冲溶液(pH 7.4)。其中，1×TAE/Mg2+缓冲溶液(pH 8.3)的组分为：4×10-2mol·L-1Tris，2×10-2mol·L-1乙酸，2.0×10-3mol·L-1EDTA和1.25×10-2mol·L-1醋酸镁；1×PBS缓冲溶液(pH 7.4)的组成为：136.9×10-3mol·L-1(8.00g·L-1)NaCl，2.68×10-3mol·L-1(0.20g L-1)KCl，9.75×10- 3mol·L-1(1.56g L-1)Na2HPO4·H2O和1.47×10-3mol·L-1(0.20g L-1)KH2PO4；这些缓冲溶液所用的试剂均为分析纯，购自Sigma-Aldrich公司。
细胞：
MCF-7/ADR耐阿霉素人乳腺癌细胞系，购自中国协和医科大学基础医学研究所。
培养基：
RPMI 1640培养基，添加10％胎牛血清，细胞接种于100mm2培养皿中，置于5％CO2培养箱，37℃培养，当细胞生长至融合度80％左右时传代；所用培养基和胎牛血清购自维森特生物技术有限公司。
实验动物：
BALB/c裸鼠(SPF级，雌性，5-6周龄)及饲料购于北京维通利华实验动物技术有限公司。所有动物实验均依照北京大学动物管理与使用规章进行。
仪器：
Mastercycler Pro梯度PCR仪(Eppendorf，德国)，荧光分光光度计(Perkinelmer，美国)，原子力显微镜(Bruker，德国)，HT7700透射电子显微镜(Hitachi，日本)，激光共聚焦扫描显微镜(Zeiss，德国)，流式细胞仪(Bioscience)，小动物荧光活体成像系统(Perkinelmer，美国)。
实施例1基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件的制备
在本实施例中，通过以下方法制备基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件，具体包括以下步骤：
1)DNA-TAT共轭复合物的制备：
该共轭复合物由点击化学反应合成，其中单链DNA 5’端带叠氮修饰N3-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，TAT多肽末端带炔基修饰YGRKKRRQRRRPPQ-propargylglycine，由抗坏血酸和二价铜催化反应。具体步骤如下：5’端带叠氮修饰的单链DNA和末端带炔基修饰的TAT溶于PBS缓冲溶液中，调整浓度为200μM。取1.5mL离心管，依次加入25μL单链DNA，两倍过量的TAT(50μL)，抗坏血酸(10mM)25μL，Cu2+-TBTA 25μL，DMSO 25μL。混匀后避光，室温下过夜反应。反应产物通过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离提纯，再使用紫外分光光度计进行定量。
2)DNA折纸结构的合成：
在组装前，将普通订书钉链/捕获订书钉链(177条，管状DNA折纸结构的订书钉链序列如表1所示，P糖蛋白小干扰RNA的捕获订书钉链序列如表2所示，B细胞淋巴瘤/白血病-2小干扰RNA的捕获订书钉链序列如表3所示，TAT多肽的捕获订书钉链序列如表4所示)和含有二硫键的订书钉链(12条，如表5所示)的浓度均调整为100μM，在试管中等体积混匀。以组装10nM，100μL DNA折纸结构为例，将M13噬菌体基因组DNA与事先混匀的订书钉链以1：8的化学计量比混合。补充10×TAE/Mg2+缓冲溶液和去离子水使M13 DNA终浓度为10nM，体系终体积为100μL且处于1×TAE/Mg2+缓冲溶液(pH＝8.3)环境中。控制上述混合溶液的温度从95℃逐步降至20℃，整个降温过程控制在12小时以上，从而获得管状DNA折纸结构。
表1 管状DNA折纸结构的普通订书钉链序列
Figure BDA0002464871380000111
Figure BDA0002464871380000121
Figure BDA0002464871380000131
Figure BDA0002464871380000141
Figure BDA0002464871380000151
表2 P糖蛋白小干扰RNA的捕获订书钉链序列
Figure BDA0002464871380000152
Figure BDA0002464871380000161
表3 B细胞淋巴瘤/白血病-2小干扰RNA的捕获订书钉链序列
Figure BDA0002464871380000162
Figure BDA0002464871380000171
表4 TAT多肽的捕获订书钉链序列
Figure BDA0002464871380000172
Figure BDA0002464871380000181
Figure BDA0002464871380000191
表5修饰二硫键的订书钉链序列
Figure BDA0002464871380000192
3)DNA折纸结构负载盐酸阿霉素：
在步骤2)获得的DNA折纸结构溶液中加入盐酸阿霉素，使得盐酸阿霉素的浓度为100μM(即溶液中DNA折纸结构与盐酸阿霉素的摩尔比为1:104)，盐酸阿霉素将会嵌入到DNA双链的碱基对中。室温摇床孵育过夜后，利用截留分子量为100kDa的超滤柱，以4700rpm，5min的离心方式离心四次，过滤掉未参与组装的订书钉链、捕获订书钉链以及未负载至DNA折纸结构的盐酸阿霉素分子，得到负载阿霉素的DNA折纸纳米结构。
4)负载阿霉素的DNA折纸纳米结构与小干扰RNA、DNA-TAT多肽共轭复合物的组装：
在步骤3)获得的负载阿霉素的DNA折纸结构溶液中加入3倍摩尔数过量的50μM P-糖蛋白小干扰RNA和B细胞淋巴瘤/白血病-2小干扰RNA，小干扰RNA序列如表6所示，升温至45℃，而后降温至25℃，每摄氏度保持5分钟，重复5个循环，完成杂交；在上一步获得的杂交产物溶液中加入3倍摩尔数过量的200μM DNA-TAT共轭复合物，升温至45℃，而后降温至25℃，每摄氏度保持5分钟，重复5个循环，完成杂交，通过100kDa的超滤柱，以4700rpm，5min的离心方式离心四次，除去多余的小干扰RNA和DNA-TAT共轭复合物，完成杂交。
表6小干扰RNA序列
Figure BDA0002464871380000201
以30mL 1×TBE缓冲溶液在加热条件下溶解1％的琼脂糖，加入2μL溴化乙锭对其预先染色，以所获得的琼脂糖凝胶对上述产物进行电泳分离，电泳所需要的电压为85V，所需要的离子环境为0.5×TBE缓冲溶液，电泳时间为30分钟。在自然光和紫外光下分别确定组合产物在琼脂糖凝胶中位置，取干净的刀片切下该区域的凝胶，利用凝胶纯化柱在4℃以离心的方法得到纯净浓缩的产物进行后续表征。
图2是对实施例1制备的核酸纳米器件进行的原子力显微镜表征，方法如下：取粘有云母的铁片，滴加1nM，20μL的上述纯化产物，沉积十分钟。用滤纸吸去云母表面液体后，用洗耳球将云母表面吹干，静置2小时后，利用原子力显微镜进行表征分析。该核酸纳米器件尺寸约为50nm。
实施例2
本实施例用于说明本发明纳米器件的制备方法。
本实施例方法与实施例1方法基本相同，不同之处仅在于，在合成负载有阿霉素的DNA折纸结构的过程中将DNA折纸结构与盐酸阿霉素的摩尔比设定为1:2000，步骤4)中将P-糖蛋白小干扰RNA、B细胞淋巴瘤/白血病-2小干扰RNA和DNA-TAT共轭复合物与DNA折纸结构的摩尔比调整为2，反应条件调整为将混合溶液升温至45℃，而后降温至20℃，每摄氏度保持6分钟，重复4个循环，完成组装。其余原料选用以及制备方法和反应条件均与实施例1相同，同样制备得到了基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件。
实施例3
本实施例用于说明本发明纳米器件的制备方法。
本实施例方法与实施例1方法基本相同，不同之处仅在于，在合成负载有阿霉素的DNA折纸结构的过程中将DNA折纸结构与盐酸阿霉素的摩尔比设定为1:105，步骤4)中将P-糖蛋白小干扰RNA、B细胞淋巴瘤/白血病-2小干扰RNA和DNA-TAT共轭复合物与DNA折纸结构的摩尔比调整为10，反应条件调整为将混合溶液升温至40℃，而后降温至20℃，每摄氏度保持10分钟，重复6个循环，完成组装。其余原料选用以及制备方法和反应条件均与实施例1相同，同样制备得到了基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件。
实施例4
本实施例用于说明本发明纳米器件的制备方法。
本实施例方法与实施例1方法基本相同，不同之处仅在于，在合成该核酸纳米器件过程中选用的化疗药物为紫杉醇，除此之外，其余原料选择以及制备方法和反应条件均与实施例1相同，从而制备得到基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件。
实施例5
本实施例用于说明本发明纳米器件的制备方法。
本实施例方法与实施例1方法基本相同，不同之处仅在于，在合成该核酸纳米器件过程中选用的小干扰RNA为P-糖蛋白小干扰RNA和生存素小干扰RNA，除此之外，其余原料选择以及制备方法和反应条件均与实施例1相同，从而制备得到基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件。
实施例6
本实施例用于说明本发明纳米器件的制备方法。
本实施例方法与实施例1方法基本相同，不同之处仅在于，在合成该核酸纳米器件过程中选用MUC-1核酸适配体替换TAT多肽，除此之外，其余原料选择以及制备方法和反应条件均与实施例1相同，从而制备得到基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件。
实施例7
本实施例用于说明本发明纳米器件的制备方法。
本实施例方法与实施例1方法基本相同，不同之处仅在于，在步骤2)合成DNA折纸结构过程中选用ATP响应核酸适配体替换含有二硫键的订书钉链，除此之外其余原料选择以及制备方法和反应条件均与实施例1相同，从而制备得到基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件。
试验例1基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件的活细胞摄入
在本试验例中，通过以下方法考察基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件的活细胞摄入情况，所述方法如下：
将对阿霉素具有抗性的人乳腺癌细胞系MCF-7/ADR细胞培养在含有10％胎牛血清和1％双抗(双抗为一种含有青霉素(10,000IU)和链霉素(10,000μg/mL)的100倍工作浓度的混合液)的1640完全培养基中，培养环境为37℃和5％CO2。当细胞生长至融合度为80％左右，将细胞消化，重新接种于12孔板中，培养24小时，将其培养基依次替换为添加了1×TAE/Mg2+缓冲溶液的1640完全培养基、含有游离的Cy5荧光标记的寡核苷酸链的培养基、含有Cy5荧光标记的核酸纳米器件(无TAT修饰，按照实施例1方法制备，其区别仅在于步骤1)中不加入TAT)的培养基、含有Cy5荧光标记的该核酸纳米器件(有TAT修饰，按照实施例1方法制备)的培养基，孵育12小时。
将上述各组孵育12小时后的细胞依次用PBS清洗三次，再加入500μL PBS缓冲溶液，利用流式细胞仪观察该核酸纳米器件进入细胞的情况并定量分析。图3结果显示，本发明制备的修饰有TAT多肽的核酸纳米器件被MCF-7/ADR细胞摄入效率最高，无TAT修饰的核酸纳米器件的内化效率略低，而单独的Cy5荧光标记的寡核苷酸链内化效率更低。这说明该核酸纳米器件相对于游离寡核苷酸链能够增强自身作为载体被细胞的摄入，且穿膜多肽TAT的修饰能够进一步提高该核酸纳米器件被细胞内化的能力。
试验例2基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件对肿瘤细胞的杀伤作用
在本试验例中，通过以下方法考察基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件对肿瘤细胞的杀伤作用，所述方法如下：
将对阿霉素具有抗性的人乳腺癌细胞系MCF-7/ADR细胞培养在含有10％胎牛血清和1％双抗的1640完全培养基中，培养环境为37℃和5％CO2。当细胞生长至融合度为80％左右，将细胞消化，重新接种于96孔板中，培养24小时。分别加入游离阿霉素(30μM)、按照实施例1方法的步骤1)～3)制备的DNA折纸结构-阿霉素(4nM,阿霉素30μM)、按照实施例1方法制备的核酸纳米器件(4nM,阿霉素30μM)和新鲜的完全培养基(空白对照)，孵育24h。通过MTT比色实验(0.5mg/mL)测定细胞的生存率。结果如图4显示，在此给药浓度下，核酸纳米器件对MCF-7/ADR细胞活力的抑制率为70％，而游离的阿霉素以及DNA折纸结构-阿霉素的抑制率分别为20％和30％。因此，由于小干扰RNA的基因沉默作用，与阿霉素协同杀伤肿瘤细胞，所述核酸纳米器件可有效抑制多药耐药肿瘤细胞的活性。
试验例3裸鼠成瘤模型的构建及基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件的 体内分布
在本试验例中，通过以下方法考察基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件在活体水平的动力学分布，所述方法如下：
裸鼠成瘤模型的构建：裸鼠(雌性，5-6周龄，16-17g)购于北京维通利华实验动物技术有限公司。每只小鼠在左侧腋下接种约1×106个MCF-7/ADR细胞。成瘤后(瘤体尺寸约100mm3)的小鼠随机分为三组，每组三只。给每组小鼠分别尾静脉注射Cy5.5荧光标记的寡核苷酸链(0.96μM，100μL)、Cy5.5荧光标记的该核酸纳米器件(无TAT修饰，按照实施例1方法制备，其区别仅在于步骤1)中不加入TAT)(20nM,Cy5.5 0.96μM，100μL)、含有Cy5荧光标记的该核酸纳米器件(有TAT修饰，按照实施例1方法制备)(20nM,Cy5.5 0.96μM，100μL)。选取1h、6h、12h、24h四个时间点，在小动物活体荧光成像系统中进行成像分析。24h后，处死小鼠并解剖，取肿瘤及主要器官进行荧光成像。
结果如图5所示，与游离的Cy5.5荧光标记的寡核苷酸链相比，DNA折纸结构在小鼠体内的代谢较慢，且在肿瘤部位的富集较多。由于穿膜多肽TAT的辅助穿膜作用，带有TAT修饰的核酸纳米器件相比于无TAT修饰的核酸纳米器件更容易滞留在肿瘤部位，因此在24h后荧光信号最强。
试验例4基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件对实体瘤生长的抑制作用
在本试验例中，通过以下方法考察基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件对实体瘤生长的抑制作用，所述方法如下：
每只裸鼠(雌性，5-6周龄，16-17g)在左侧腋下接种约1×106个MCF-7/ADR细胞。成瘤后(瘤体尺寸约100mm3)的小鼠随机分为4组，每组5只。4组小鼠分别尾静脉注射以下药物治疗：生理盐水、游离阿霉素(2.1mg/kg)、按照实施例1方法的步骤1)～3)制备的DNA折纸结构-阿霉素(DNA折纸结构1mg/kg，阿霉素2.1mg/kg)、按照实施例1方法制备的核酸纳米器件(DNA折纸结构1mg/kg、阿霉素2.1mg/kg、小干扰RNA0.44mg/kg)。注射周期为6天，共注射3次，期间记录小鼠的体重和瘤体尺寸变化。持续观察记录24天后，解剖小鼠，将肿瘤及主要脏器(心肝脾肺肾)拍照留存。
小鼠瘤体尺寸变化曲线如图6所示，与其他对照组相比，利用所述核酸纳米器件治疗的小鼠肿瘤生长得到了明显抑制。将各组小鼠的主要脏器进行包埋切片，用苏木素伊红染色，证明本发明所述基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件不会引发明显的组织毒性。
试验例5管状核酸纳米器件的氧化还原响应性验证
在本试验例中，通过以下方法考察基因治疗-化疗协同抑制肿瘤的核酸纳米器件的氧化还原响应性，所述方法如下：
将按照实施例1方法制备的制备好的管状核酸纳米器件在梯度浓度(2.5～10mM)的谷胱甘肽溶液中孵育12h，温度设置为37℃，以模拟细胞内谷胱甘肽的浓度。孵育结束后，将样品加入1％的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。
凝胶电泳结果如图7所示。与完全闭合的核酸纳米器件相比，其余浓度孵育的样品条带均有不同程度的滞后，并且随浓度升高，逐渐接近完全打开的核酸纳米器件对照组条带，证明在谷胱甘肽的还原作用下，修饰二硫键的订书钉链被切断，管状核酸纳米器件从而被打开。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种核酸纳米器件，其特征在于，所述核酸纳米器件为负载有化疗药物且杂交有小干扰RNA的DNA折纸结构，所述DNA折纸结构上杂交有细胞穿透肽和/或核酸适配体，并且所述DNA折纸结构中含有修饰了刺激响应性元件的订书钉链，所述刺激响应性元件选自以下一种或多种：二硫键、二硒键、琥珀酰亚胺-硫醚键和/或ATP响应核酸适配体、sgc8c核酸适配体，优选为二硫键；
其中，所述细胞穿透肽和/或核酸适配体与单链DNA形成共轭复合物后杂交到DNA折纸结构上。
2.根据权利要求1所述的核酸纳米器件，其特征在于，所述DNA折纸结构为二维DNA折纸结构或三维DNA折纸结构；
优选地，所述DNA折纸结构是通过环状长序列的M13噬菌体基因组DNA单链和短序列的书钉链及捕获书钉链按照碱基互补配对原则杂交组装成的三维DNA折纸结构；
更优选地，所述DNA折纸结构为三维管状结构。
3.根据权利要求1或2所述的核酸纳米器件，其特征在于，所述小干扰RNA选自以下一种或多种：P-糖蛋白小干扰RNA、B细胞淋巴瘤/白血病-2小干扰RNA、生存素小干扰RNA；优选为P-糖蛋白小干扰RNA和/或B细胞淋巴瘤/白血病-2小干扰RNA。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸纳米器件，其特征在于，所述化疗药物选自以下一种或多种：紫杉醇、顺铂、环磷酰胺、羟基喜树碱、盐酸阿霉素；优选为盐酸阿霉素。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸纳米器件，其特征在于，所述细胞穿透肽选自以下一种或多种：TAT、NLS、RGD、Pep-1；和/或
所述核酸适配体选自以下一种或多种：MUC-1核酸适配体、AS1411核酸适配体、EGFR核酸适配体、A10核酸适配体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸纳米器件的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)利用点击化学反应，制备单链DNA与细胞穿透肽和/或核酸适配体的共轭复合物；
(2)利用DNA折纸技术，制备成二维/三维的DNA折纸结构；
(3)在所述DNA折纸结构上组装化疗药物，制备得到化疗药物复合DNA纳米结构；
(4)通过分子杂交的方式在步骤(3)所述化疗药物复合DNA折纸结构上杂交小干扰RNA；
(5)通过分子杂交的方式在步骤(4)所述化疗药物复合DNA折纸结构上杂交步骤(1)所得的共轭复合物，组装得到所述核酸纳米器件。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述单链DNA以及所述细胞穿透肽和/或核酸适配体分别通过叠氮或炔基修饰；
优选地，单链DNA的5’端通过叠氮修饰，所述细胞穿透肽和/或核酸适配体的末端通过炔基修饰。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述DNA纳米结构与所述化疗药物的摩尔比为1:2×103～1:9×107，优选为1:104；
优选地，步骤(3)所述所述组装方式为化疗药物通过嵌入氢键或吸附方式组装到DNA折纸结构中。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述DNA折纸结构复合化疗药物与小干扰RNA的摩尔比为1：10～1：100，优选为1：48；和/或
步骤(5)中所述化疗药物复合DNA折纸结构与步骤(1)所得的共轭复合物的摩尔比为1：10～1：50，优选为1：28。
10.权利要求1至5中任一项所述的核酸纳米器件或根据权利要求6至9中任一项所述方法制得的核酸纳米器件在制备用于基因治疗和/或化疗的药物或医疗产品中的应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113332444A (zh) * 2021-05-12 2021-09-03 上海交通大学 一种基于DNA折纸与aC5a适配体的DNA纳米器件及其制备方法以及应用
CN114177312A (zh) * 2021-12-14 2022-03-15 国家纳米科学中心 一种核酸纳米药物载体及其制备方法和应用
CN114773418A (zh) * 2022-03-29 2022-07-22 国家纳米科学中心 一种核酸适配体簇修饰的纳米结构及其制备方法和应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104840966A (zh) * 2015-05-05 2015-08-19 国家纳米科学中心 一种核酸纳米结构抗癌复合药物及其制备方法和应用
CN106893722A (zh) * 2017-02-20 2017-06-27 国家纳米科学中心 一种刺激响应型核酸纳米结构载体手性贵金属纳米复合物及其制备方法和应用
CN107469088A (zh) * 2017-06-27 2017-12-15 郑州大学 一种基于dna折纸术的精确识别靶向纳米载体的构建方法及其应用
EP3448997A1 (en) * 2016-04-27 2019-03-06 Massachusetts Institute of Technology Stable nanoscale nucleic acid assemblies and methods thereof
CN109620969A (zh) * 2019-01-30 2019-04-16 广东药科大学 一种针对耐药肿瘤细胞的靶向抗肿瘤药物体系及其构建方法
US20190240340A1 (en) * 2016-07-20 2019-08-08 Guild Biosciences Functionalized nucleic acid nanostructures for rna delivery
KR20190141368A (ko) * 2018-06-14 2019-12-24 한국과학기술연구원 베타-디펜신 이합체를 포함하는 신규 세포투과성 펩타이드 및 이의 용도
US20200102574A1 (en) * 2017-07-10 2020-04-02 Shanghai Jiao Tong University Functional Nucleic Acid Protective Vector Based On DNA Hydrogel, Preparation Method and Application Thereof

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104840966A (zh) * 2015-05-05 2015-08-19 国家纳米科学中心 一种核酸纳米结构抗癌复合药物及其制备方法和应用
EP3448997A1 (en) * 2016-04-27 2019-03-06 Massachusetts Institute of Technology Stable nanoscale nucleic acid assemblies and methods thereof
US20190240340A1 (en) * 2016-07-20 2019-08-08 Guild Biosciences Functionalized nucleic acid nanostructures for rna delivery
CN106893722A (zh) * 2017-02-20 2017-06-27 国家纳米科学中心 一种刺激响应型核酸纳米结构载体手性贵金属纳米复合物及其制备方法和应用
CN107469088A (zh) * 2017-06-27 2017-12-15 郑州大学 一种基于dna折纸术的精确识别靶向纳米载体的构建方法及其应用
US20200102574A1 (en) * 2017-07-10 2020-04-02 Shanghai Jiao Tong University Functional Nucleic Acid Protective Vector Based On DNA Hydrogel, Preparation Method and Application Thereof
KR20190141368A (ko) * 2018-06-14 2019-12-24 한국과학기술연구원 베타-디펜신 이합체를 포함하는 신규 세포투과성 펩타이드 및 이의 용도
CN109620969A (zh) * 2019-01-30 2019-04-16 广东药科大学 一种针对耐药肿瘤细胞的靶向抗肿瘤药物体系及其构建方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIANBING LIU ET AL.: ""A Tailored DNA Nanoplatform for Synergistic RNAi-/Chemotherapy of Multidrug-Resistant Tumors"", 《ANGEWANDTE INTERNATIONAL EDITION》 *
QIAO JIANG ET AL.: ""Rationally Designed DNA-Origami Nanomaterials for Drug Delivery In Vivo"", 《ADVANCED SCIENCE NEWS》 *
ZHAORAN WANG ET AL.: ""A Tubular DNA Nanodevice as a siRNA/Chemo-Drug Co-delivery Vehicle for Combined Cancer Therapy"", 《ANGEWANDTE INTERNATIONAL EDITION》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113332444A (zh) * 2021-05-12 2021-09-03 上海交通大学 一种基于DNA折纸与aC5a适配体的DNA纳米器件及其制备方法以及应用
CN114177312A (zh) * 2021-12-14 2022-03-15 国家纳米科学中心 一种核酸纳米药物载体及其制备方法和应用
CN114177312B (zh) * 2021-12-14 2024-02-13 国家纳米科学中心 一种核酸纳米药物载体及其制备方法和应用
CN114773418A (zh) * 2022-03-29 2022-07-22 国家纳米科学中心 一种核酸适配体簇修饰的纳米结构及其制备方法和应用
CN114773418B (zh) * 2022-03-29 2023-10-31 国家纳米科学中心 一种核酸适配体簇修饰的纳米结构及其制备方法和应用

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