CN109620969A - 一种针对耐药肿瘤细胞的靶向抗肿瘤药物体系及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种针对耐药肿瘤细胞的磁靶向抗肿瘤药物体系及其构建方法，该药物体系包括小干扰RNA‑核酸适配体载体、该载体固载的抗肿瘤药物、以及聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性四氧化铁纳米颗粒。本发明利用小干扰RNA来下调相应蛋白的表达，具有高度特异性、高效性；磁靶向抗肿瘤药物体系将单一的化疗药道诺霉素与核酸适配体结合后，增加了药物的生物相容性，并赋予其靶向性，为减少化疗药物对正常细胞杀伤作用提供一种可能；同时又负载光敏剂卟啉，实现化学疗法和光动力疗法的双重杀灭肿瘤的目的。PEI修饰的超顺磁四氧化三铁纳米粒子用于协同增强治疗效率的抗癌药物/基因载体，还作为体外肿瘤成像的有效超声造影剂。

Description

一种针对耐药肿瘤细胞的靶向抗肿瘤药物体系及其构建方法
技术领域
本发明属于基因治疗技术领域，具体涉及一种针对耐药肿瘤细胞的靶向抗肿瘤药物体系及其构建方法。
背景技术
肿瘤的发病是一个多因素、多阶段的复杂病变过程。单机制抗肿瘤药物不足以对肿瘤细胞产生充分的抑制作用，且容易使机体产生耐药性。利用多重机制联合作用于肿瘤疾病相关的多个靶点，有助于提高疗效和降低耐药性，相对于单一机制的抗肿瘤治疗方案，尤其是已经对单肿瘤抑制剂产生耐药性的癌症患者的治疗十分有优势。将化学抗肿瘤药物和光动力学光敏剂集中在同一药物载体内，形成“单方多药”体系，联合运用化学疗法(Chemothrapy)和光动力学疗法(PDT)进行抗肿瘤治疗，近年来受到广大研究者的青睐，但是，如下两点因素制约了这一方案的推广：一是化学抗肿瘤药物和光敏剂极易对肿瘤边界的正常细胞造成伤害，在肿瘤部位的聚集位点要求十分精准；二是耐药性的问题，对于已产生耐药的肿瘤细胞来说，此方案并没有太多的优势。
纳米颗粒独具的在肿瘤部位聚集的EPR效应(enhanced permeation andretention effect)给予了大家克服上述问题的灵感。其中，以超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPION)为代表的磁靶向纳米载药体系能够在外磁场作用下，实现药物在体内定向移动和浓集，引起了人们的广泛关注。随着近年来对核酸的深入科学研究，作为生物材料，核酸已展现了诸多优势，具体包括核酸的生物可降解性、生物相容性好、高稳定性、易修饰性和便于分子工程等等。具体对于核酸适配体来说，其生物安全性已经随着2004年美国FDA对第一个核酸适配体类药物的审批而得到了广泛认可。核酸适配体是一段寡聚核苷酸，通过配体指数富集的系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment，SELEX)筛选得到。核酸适配体具有易筛选、易合成、易储存、易修饰、高亲和力、高生物相容性和生物可降解性等优点，并能高效、特异性地与靶分子结合。
涉及肿瘤多药耐药作用的其中一个重要机制即为P-糖蛋白(P-glycoprotein)的过表达。P-糖蛋白属于ATP结合盒(ATP-binding cassette)转运载体蛋白家族中一员，ATP结合盒转运载体蛋白具有一个共同的膜内结合域，它被叫做核苷酸结合域，这个结构域可以整合并利用水解ATP的能量主动从细胞内将药物泵出至胞外从而降低细胞内药物浓度。具有抑制P-糖蛋白功能的药物毒性作用大且影响化疗药物在体内的正常代谢，从而导致严重的副作用。RNA干扰(RNAi)技术是指小干扰RNA能够选择性的沉默特定基因的表达，可以将其抗癌作用最大化而不带来细胞毒性。
而P-gp siRNA能够通过沉默MDR基因表达从而降低肿瘤细胞耐药蛋白的表达，起到降低肿瘤耐药性或者加速肿瘤细胞的凋亡的作用，与递释药物实现基因疗法、光动力疗法和化学疗法三位一体抑制肿瘤细胞的增生，提高药物疗效。
发明内容
本发明所要解决的技术问题，就是提出一种针对耐药肿瘤细胞的磁靶向抗肿瘤药物体系。该药物体系基于RNA干扰技术抗癌作用最大化而不带来细胞毒性；核酸适配体的导向作用和高选择性作用；靶向负载双重抗肿瘤药物，实现运用基因疗法、化学疗法和光动力疗法联合使用，达到三重重抑制耐药肿瘤增殖的目的。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种针对耐药肿瘤细胞的磁靶向抗肿瘤药物体系，包括小干扰RNA-核酸适配体载体、该载体固载的抗肿瘤药物、以及聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性四氧化铁纳米颗粒；所述小干扰RNA与核酸适配体之间自组装结合，固载了抗肿瘤药物的小干扰RNA-核酸适配体载体与聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性四氧化铁纳米颗粒之间通过静电力作用结合。
进一步地，所述抗肿瘤药物为蒽环类抗生素和卟啉。
进一步地，所述蒽环类抗生素为阿霉素或者道诺霉素或者伊达比星或者米托蒽醌或者表阿霉素。
进一步地，所述卟啉为光敏剂TMPyP或者原卟啉或者血卟啉或者血卟啉单甲醚。
进一步地，所述小干扰RNA为P-gp siRNA。
进一步地，所述核酸适配体为AS1411。
进一步地，所述核酸适配体在小干扰RNA-核酸适配体载体中表现为具有空间构型的G-四连体结构。
进一步地，所述双链P-gp siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述AS1411的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步地，所述小干扰RNA-核酸适配体载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
所用核酸序列(5’-3’)
备注：斜体部分为连接部分。
本发明是通过小干扰RNA(P-gp siRNA)与核酸适配体(AS1411)通过自组装技术结合(AP-PSA)，并运载化疗药道诺霉素(DNM)和光敏剂TMPyP(DNM&TMPyP&AP-PSA)，利用静电力作用将DNM&TMPyP&AP-PSA与聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性四氧化铁纳米颗粒(PEI@SPION)结合制备DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION纳米载药体系。
此外，本发明还提出了该针对耐药肿瘤细胞的磁靶向抗肿瘤药物体系的构建方法，具体包括如下步骤：
S1、核酸适配体-小干扰RNA杂交链制备：
分别将核酸适配体用无核酸酶水溶解，siRNA用DEPC水溶解，按照摩尔比1:1的比例加入核酸适配体和siRNA；然后用等体积的退火液进行退火处理，降至室温后形成核酸适配体-小干扰RNA杂交链，同时核酸适配体形成具有空间构型的G-四连体结构；
S2、蒽环类抗生素固载：
取S1所得的核酸适配体-小干扰RNA杂交链载体溶液，加入蒽环类抗生素混匀后进行固载；
S3、卟啉固载：
取S2所得的混合物溶液，加入卟啉混匀后进行固载；
S4、制得抗肿瘤药物体系：
取S3所得的混合物溶液，加入聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性四氧化铁纳米颗粒(PEI@SPION)后得到磁靶向抗肿瘤药物体系。
进一步地，所述步骤S1中退火液的制备方法，包括如下步骤：取200mM的KCl、4mM的MgCl2、28mM的Tris-HCl于容器中，加水溶解，定量至1L即得。
进一步地，所述步骤S1中退火处理的温度为90℃，处理时间为10min，缓慢降至室温。
进一步地，所述S2中固载在冰浴条件下进行，固载时间为2h。
进一步地，所述S3中固载在常温条件下进行，固载时间为2h。所述常温是指室温，具体可以是20～40℃。
进一步地，所述S4中混合后的溶液缓慢震摇1h，得到的磁靶向抗肿瘤药物体系在冰箱中4℃条件下保存备用。
本发明还提出了该针对耐药肿瘤细胞的磁靶向抗肿瘤药物体系在制备抗肿瘤药物产品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明利用小干扰RNA来下调相应蛋白的表达，具有高度特异性、高效性；磁靶向抗肿瘤药物体系将单一的化疗药道诺霉素与核酸适配体结合后，增加了药物的生物相容性，并赋予其靶向性，为减少化疗药物对正常细胞杀伤作用提供一种可能；同时又负载光敏剂卟啉，实现化学疗法和光动力疗法的双重杀灭肿瘤的目的。PEI修饰的超顺磁四氧化三铁纳米粒子用于协同增强治疗效率的抗癌药物/基因载体，还作为体外肿瘤成像的有效超声造影剂。体系运用基因疗法、化学疗法和光动力疗法联合使用，达到三重抑制耐药肿瘤增殖的作用的目的。
附图说明
图1为本发明的琼脂糖凝胶电泳中不同AS1411-siRNA与SPION固载质量比下荧光检测琼脂糖凝胶结果图；
图2为本发明的DNM&TMPyP&AP-PSA、DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION的电镜粒径图、Zeta电位图、DLS图；
图3为本发明的AS1411-siRNA与DNM(a)和TMPYP(b)在不同固载比下的荧光强度变化曲线图；
图4a、4b为本发明的ABTS反应结果图；图4c为本发明的CD光谱；
图5为本发明的细胞经普鲁士蓝染色实验结果图，其中：a，b为MCF-7/ADR细胞普鲁士蓝染色结果图，c，d为MCF-7细胞普鲁士蓝染色结果图；
图6为本发明的细胞增殖毒性mtt实验结果图：其中，a、b分别为DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION在光照和避光条件下，对MCF-7及MCF-7/ADR细胞的毒性检测图；
图7为本发明的荧光显微镜拍照结果图；
图8为磁靶向实验结果图，其中，a为MCF-7细胞中DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION在无磁场和有磁场条件下，细胞形态的变化；b为MCF-7/ADR细胞中DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION在无磁场和有磁场条件下，细胞形态的变化；
图9为本发明的细胞划痕实验结果图；
图10为本发明的细胞凋亡实验结果图。
具体实施方式
为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。
简写词
药物 简称
道诺霉素 DNM
5,10,15,20-四(1-甲基-4-吡啶)卟吩对甲苯磺酸盐 TMPYP
胎牛血清 FBS
三羟甲基氨基甲烷 Tris Base
乙二胺四乙酸 EDTA
3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐 MTT
二甲基亚砜 DMSO
聚乙烯亚胺修饰超顺磁四氧化三铁 PEI@SPION
所用核酸序列(5’-3’)
备注：斜体部分为连接部分。
实施例1
DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION纳米体系的制备和表征
1.AP-PSA和PEI@SPION结合能力考察-琼脂糖凝胶试验
琼脂糖凝胶阻滞测定用于确定PEI@SPION和AP-PSA的结合能力。将AP-PSA与PEI@SPION混合以获得比率(wt/wt)为1:30，1:45，1:90的混合物。将混合物在室温下孵育1h以形成复合物。通过2％琼脂糖凝胶，TBE缓冲液在110V下电泳30分钟来确认纳米复合物的形成，凝胶成像系统观察并拍照。
2.DNM、TMPYP与杂交链(AP-PSA)固载比例的确定
DNM、TMPYP自身都有一定的荧光性，当与DNA结合后，其荧光被淬灭。利用这种特性来测定AP-PSA对DNM、TMPYP这两种药的固载情况。
取10μl浓度为189.566μmol/l的DNM溶于2.5ml的超纯水中，荧光分光光度计测其荧光，依次加入1μl浓度为50μmol/l的退火后的AP-PSA，待充分混匀反应5min后，测其荧光改变情况，荧光检测结果如图3所示。DNM的荧光条件设置为激发波长Ex＝480nm，发射波长扫描Em＝450-750nm。
取5μl浓度为733.35μmol/l的TMPYP溶于2.5ml的超纯水中，荧光分光光度计测其荧光，依次加入1μl浓度为50μmol/l的退火后的AP-PSA，待充分混匀反应5min后，测其荧光改变情况，荧光检测结果如图3所示。TMPYP的荧光条件设置为激发波长Ex＝420nm，发射波长扫描Em＝450-750nm。
3.DNM&TMPyP&AP-PSA制备
按照AS1411：siRNA：DNM：TMPYP＝1:1:3:1的摩尔比固载。
固载DNM：取浓度均为400μmol/l的单链AS1411和siRNA溶液各6.25μl，加入26.6μl的退火液混匀，于PCR仪上设置90℃退火10min，缓慢降至室温形成杂交链(以下简称AP-PSA)。取出退火后的AP-PSA溶液，加入7.5μl DNM(1000μmol/l)，混匀器混匀，冰浴中固载2h，得到DNM&AP-PSA；
固载TMPYP：取出已固载DNM的AP-PSA(DNM&AP-PSA)溶液，加入3.4μl的TMPYP溶液(733.35μmol/l)，于常温固载2h，得到靶向抗耐药肿瘤药物体系DNM&TMPyP&AP-PSA，其中靶向抗耐药肿瘤药物系统中DNM终浓度为150μmol/l，TMPYP终浓度为50μmol/l。
退火液的制备过程如下：取200mM的KCl、4mM的MgCl2、28mM的Tris-HCl于容器中，加水溶解，定量至1L制得。
磁性修饰：将DNM&TMPyP&AP-PSA和聚乙烯亚胺修饰的超顺磁四氧化三铁纳米粒子按照1：45的质量比混匀，摇床缓慢震摇1h，得到DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION磁性纳米载药体系4℃备用。
4.表征：
对DNM&TMPyP&AP-PSA、DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION的结构、表面形态和大小进行了研究。
扫描电子显微镜(TEM)，ZetaPlus粒径和zeta电位分析仪获得它们的尺寸分布和表面电荷。
结果显示如图1AP-PSA与PEI@SPION最佳固载比例(质量比)为1:45。图2中Zeta电位与DLS的变化都表明AP-PSA成功的与PEI@SPION结合在一起。图3结果显示：图3a中随着AP-PSA溶液逐渐加入到DNM溶液中，DNM的荧光强度变弱，经测得DNM的最大固载比为DNM：DNA＝3.4:1(摩尔比)；图3b中TMPYP溶液中逐渐加入定量的AP-PSA溶液，TMPYP的荧光强度变弱，经测得TMPYP的最大固载比为TMPYP：DNA＝8.1:1(摩尔比)。
实施例2杂交链AP-PSA的ABTS实验及圆二色谱实验
为了验证核酸适配体在钾离子存在下90℃退火后形成G四链体结构，利用ABTS法进行测试。ABTS即2,2'-连氮-双(3-乙基苯并噻唑6-磺酸)是过氧化物酶的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成绿色可溶性产物。在405nm和650nm波长上有吸收峰，具有灵敏度高，背景低等优点。是HRP结合物最常用的底物。将未退火的AP-PSA、退火后的AP-PSA杂交链分别与氯化血红素(Hemin)孵育120h后，在阴暗处，分别向微孔中各加入100ul混合反应液，避光显色30min左右，分别向微孔中各加反应终止液50μl终止反应，酶标仪405nm波长检测。结果如图4a、4b所示退火后的AP-PSA杂交链与氯化血红素(Hemin)孵育120h这组的颜色为深绿色，证明了G-四链体结构的存在。
圆二色光谱(CD光谱)常用于生物大分子如蛋白质、核酸等的二级和三级结构变化及对手性药物进行定量分析。在一般情况下，CD光谱能用于区分G-四链体DNA平行和反平行结构。当小分子化合物与G-四链体DNA形成复合物后，G-四链体DNA的特征CD光谱在吸收强度和形状上发生一定的改变。
按照上述方法固载药物，DNA浓度终浓度为5μmol/l，溶于pH＝7.4的1xTE(购于生工)溶液中。圆二色光谱仪设置条件为扫描范围220～320nm；光径为1nm，狭缝宽度：2nm；体积：200μl；累积次数：3次，进行测试。测试结果如图4c所示。图4c显示结果如下：在265nm附近处出现了一个正峰，而在245nm附近处出现了一个负峰，这些都是平行结构的典型特征；并且固载了TMPYP的体系CD信号明显增强。
实验例3
细胞培养
细胞系MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)、阿霉素抗性MCF-7/ADR获自广东药科大学基础学院。对于MCF-7/ADR细胞，首先在含有500ng/ml DOX的培养基中培养MCF-7/ADR细胞以逐渐适应其耐药性，然后在传代培养基中将DOX浓度增加至1000ng/ml。以含有10％FBS、1％青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基作为生长环境，于37℃、5％CO2，最适湿度条件下在细胞培养箱中培养，2-3天更换培养基并传代一次，最后选择状况良好的处于对数生长期细胞用于实验。
普鲁士蓝染色
磁性纳米粒子在细胞中的摄取可以通过普鲁士蓝染色实验来验证，将MCF-7和MCF-7/ADR细胞分别接种于6孔板中，培养24h待细胞贴壁后空白对照组加入正常培养基，实验组加入含有浓度为30μg/ml的AP-PSA/PEI@SPION的培养基培养12h。除上清，用PBS清洗三次，用4％多聚甲醛溶液在4℃条件下固定30min，再次用PBS洗去固定液。然后按照1:1比例加入5％亚铁氰化钾(II)三水合物溶液和5％HCl加入到每个孔里，37℃孵育1h，然后用中性红染液进行复染30s，最后用PBS洗三次，光学显微镜拍照记录。如图5结果显示，实验组细胞中有非常多的蓝色颗粒。这证明了AP-PSA/PEI@SPION能够很好地进入细胞中。
细胞活力测定-MTT实验
使用MTT测定法测定MCF-7和MCF-7/ADR细胞在游离DNM、DNM&AP-PSA/PEI@SPION或DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION存在下的细胞活力。取对数期生长状况良好的MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞，分别用0.25％胰酶消化成单细胞悬液，血球计数板进行细胞计数后，用完全培养基调节细胞密度为2×104cell/ml，分别接种于96孔板中，每孔200μl，于37℃、5％CO2培养箱中培养24h；细胞贴壁后，除培养基，每组每孔加入含有DNM、DNM&AP-PSA/PEI@SPION或DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION样品的培养基100μl，设置5个浓度，每个浓度设置5个复孔，培养箱中培养。设置光照组即在加药6h后取出培养板450nm光照5min，继续培养48h；在培养结束前4h，吸出板中含药物的培养基，加入含有10％MTT的培养基100μl，继续培养4h，结束后弃上清，每孔再加入150μl DMSO，轻微震荡反应10min，使结晶颗粒充分溶解，置酶标仪上于490nm波长处测定OD值。
计算细胞增殖抑制率，存活率＝(OD实验-OD对照)/(OD对照-OD空白)×100％。将存活率与药物浓度作图，得出剂量反应曲线，计算出相应细胞株的IC50值，即半数抑制有效浓度。具体结果如图6a和图6b。
MCF-7细胞：DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION光照组IC50：
DNM为0.838μmol/l，TMPYP为0.279μmol/l。
DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION避光组IC50：
DNM为2.390μmol/l，TMPYP为0.796μmol/l。
MCF-7/ADR细胞：DNM组IC50：DNM为；52.25μmol/l。
DNM&AP-PSA/PEI@SPION组IC50：
DNM为12.283μmol/l。
DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION光照组IC50：
DNM为10.643μmol/l，TMPYP为3.548μmol/l。
DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION避光组IC50：
DNM为4.397μmol/l，TMPYP为1.466μmol/l。
上述数据说明了DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION载药体系MCF-7/ADR肿瘤细胞有很好的抑制作用。
荧光显微镜拍照-细胞摄取与活性氧检测
为了进一步研究DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION纳米载药体系在细胞内的分布情况及在细胞内释放DNM与TMPYP产生的ROS。我们通过荧光显微镜进行验证。细胞培养如上所述，将MCF-7和MCF-7/ADR细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后，分别加入含有DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION的培养基，设置光照组(450nm照射3min)和避光组，培养箱中孵育6h，先用hoechst 33342进行细胞核染色20min，然后PBS洗三次。再按照碧云天试剂盒说明装载荧光探针并孵育20min。用预冷的PBS洗三次，然后向每孔中加适量PBS，荧光显微镜拍照结果如图7所示。
图7中显示，蓝色荧光表示hoechst 33342细胞核染色结果，绿色荧光是TMPYP活性氧产生的；红色荧光是DNM自身的荧光。从图中可以看出避光组中TMPYP基本没有活性氧，而光照组有很强的绿色荧光。说明TMPYP经450nm照射产生了可以杀灭肿瘤的活性氧，避光组的活性氧相对少很多。
磁靶向性研究
将将MCF-7和MCF-7/ADR细胞接种于60mm培养皿中培养贴壁后，加入DNM浓度为2.5μM的DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION。为了进行磁靶向研究，将一块磁铁(约4T)放在培养皿的一侧下面。孵育24h后，对培养皿中有磁场区域及对侧无磁场区域进行拍照记录。图8为磁靶向实验结果图，其中，a为MCF-7细胞中DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION在无磁场和有磁场条件下，细胞形态的变化；b为MCF-7/ADR细胞中DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION在无磁场和有磁场条件下，细胞形态的变化结果，图8显示，与空白对照组相比，两种细胞中磁靶向区的细胞形态均有变化，并且能看到明显的磁性纳米微球聚集，这说明在外部磁场作用下DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION磁性纳米体系可以局部富集，达到可控被动靶向治疗的目的。
细胞划痕实验-细胞迁移
将MCF-7和MCF-7/ADR细胞以每孔5×105个细胞的密度接种在6孔板中的培养基中，过夜培养24h后，除去上清。在6孔板底部的单层细胞上用10μl无菌白色枪头进行划线，用PBS洗去划痕过程中脱落的细胞。分别用具有相同DNM浓度的游离TMPYP&DNM或DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION的培养基培养48小时，用光学显微镜记录0h、24h、48h同一位置划痕的变化。结果如图9所示，随着时间的推移，与对照组相比，DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION在两种细胞中都表现出了对细胞迁移的抑制作用。
流式细胞仪-测细胞凋亡
将MCF-7和MCF-7/ADR细胞以每孔5×104个细胞的密度接种在12孔板中的培养基中。孵育24小时后，用具有相同DNM(2.5μΜ)浓度的DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION处理细胞，孵育48小时后，将培养基收集备用并用PBS洗一次，加入适量胰酶消化，除去胰酶，并加入上述收集的培养基，吹打细胞并收集细胞悬液；离心除上清后用冷的PBS洗一遍，离心除上清，加入预冷的70％的乙醇固定24小时。固定好细胞后用PBS洗一次，加入碧云天凋亡试剂盒中的凋亡探针，37℃孵育20min，流式细胞仪测定。如图10所示，图a、b分别为MCF-7/ADR细胞未加药的空白组和加药组；图c、d分别为MCF-7细胞未加药的空白组和加药组数据。从数据中可以很好的看出MCF-7/ADR细胞空白组的细胞凋亡为3.58％，加药组的细胞凋亡为46.5％，大部分集中于凋亡早期；而在MCF-7细胞中，空白组的细胞凋亡为7.34％，加药组的细胞凋亡为43.8％，大部分集中于凋亡晚期。由此可见DNM&TMPyP&AP-PSA/PEI@SPION组能更好的诱导MCF-7/ADR细胞凋亡。
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种针对耐药肿瘤细胞的磁靶向抗肿瘤药物体系，其特征在于，包括小干扰RNA-核酸适配体载体、该载体固载的抗肿瘤药物、以及聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性四氧化铁纳米颗粒；所述抗肿瘤药物为蒽环类抗生素和卟啉。
2.根据权利要求1所述的针对耐药肿瘤细胞的磁靶向抗肿瘤药物体系，其特征在于，所述蒽环类抗生素为阿霉素或者道诺霉素或者伊达比星或者米托蒽醌或者表阿霉素；所述卟啉为光敏剂TMPyP或者原卟啉或者血卟啉或者血卟啉单甲醚。
3.根据权利要求1所述的针对耐药肿瘤细胞的磁靶向抗肿瘤药物体系，其特征在于，所述小干扰RNA为双链P-gp siRNA，所述核酸适配体为AS1411，核酸适配体在小干扰RNA-核酸适配体载体中表现为具有空间构型的G-四连体结构。
4.根据权利要求3所述的针对耐药肿瘤细胞的磁靶向抗肿瘤药物体系，其特征在于，所述双链P-gp siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述AS1411的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
5.根据权利要求1所述的针对耐药肿瘤细胞的磁靶向抗肿瘤药物体系，其特征在于，所述小干扰RNA-核酸适配体载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
6.根据权利要求1-5任一项所述的针对耐药肿瘤细胞的磁靶向抗肿瘤药物体系的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1、核酸适配体-小干扰RNA杂交链制备：
分别将核酸适配体用无核酸酶水溶解，siRNA用DEPC水溶解，按照摩尔比1:1的比例加入核酸适配体和siRNA；然后用等体积的退火液进行退火处理，降至室温后形成核酸适配体-小干扰RNA杂交链，同时AS1411或核酸适配体形成具有空间构型的G-四连体结构；
S2、蒽环类抗生素固载：
取S1所得的适配体-小干扰RNA杂交链载体溶液，加入蒽环类抗生素混匀后进行固载；
S3、卟啉固载：
取S2所得的混合物溶液，加入卟啉混匀后进行固载；
S4、制得抗肿瘤药物体系：
取S3所得的混合物溶液，加入聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性四氧化铁纳米颗粒后得到磁靶向抗肿瘤药物体系。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中退火液的制备方法，包括如下步骤：取200mM的KCl、4mM的MgCl2、28mM的Tris-HCl于容器中，加水溶解，定量至1L即得；所述步骤S1中退火处理的温度为90℃，处理时间为10min，缓慢降至室温。
8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述S2中固载在冰浴条件下进行，固载时间为2h。
9.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述S3中固载在20～40℃条件下进行，固载时间为2h。
10.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述S4中混合后的溶液缓慢震摇1h，得到的磁靶向抗肿瘤药物体系在冰箱中4℃条件下保存备用。
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