CN112168973A - 核酸适配体递送载体，其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了一种核酸适配体递送载体、包含载体的药物组合物、其制备方法和应用，其中核酸适配体递送载体包括以红细胞膜为骨架的纳米囊泡，所述纳米囊泡上负载有胆固醇修饰的核酸适配体。所获载药靶向性纳米囊泡具有对肿瘤细胞的特异性，并能够沉默耐药肿瘤细胞P‑糖蛋白的表达，逆转其耐药性，同时实现在较低阿霉素浓度下对耐药性肿瘤细胞的有效杀伤。

Description

核酸适配体递送载体，其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种核酸适配体，具体涉及一种核酸适配体递送载体，其制备方法及其应用，属于分子生物学领域。
背景技术
核酸适配体，也被称为核酸适体、适配子等，是从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲合性和高特异性地与各种靶标结合的单链寡核苷酸。最早是由Szostak和Gold两个小组几乎同时提出。1990年，Ellington和Szostak报道了能结合小分子有机染料的RNA片段，并将其命名为Aptamer。适配体(aptamer)是指利用指数富集的配基系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)技术，从人工合成的寡核苷酸文库中筛选得到的具有亲和性高、特异性强的能够与靶分子特异性结合的短的单链DNA和RNA分子。
小核酸作为基因调控的功能分子在多种疾病的治疗领域中有着广泛的应用，尤其在肿瘤治疗方面，通过小核酸调控肿瘤相关基因的表达从而达到抑制肿瘤的生长、侵袭、诱导肿瘤凋亡等目的，已成为一种有潜力的治疗方法。然而，如何精准、高效的将小核酸递送至肿瘤等疾病组织，一直是该领域亟待解决的关键问题。
传统的小核酸递送方式如阳离子脂质体、树枝状分子、阳离子聚合物、无机纳米颗粒等方式虽然能够将小核酸成功的递送至细胞，然而这些载体材料却很难满足对生物相容性的要求。近年来，细胞外囊泡尤其是外泌体被认为是有望替代合成纳米材料的下一代药物递送载体。外泌体等胞外囊泡来源于天然细胞，因此具有较低的细胞毒性和良好的生物相容性。此外，由于外泌体在生物系统中发挥着细胞间通讯的功能，因此具有特定细胞的靶向性和极佳的递送能力。然而天然外泌体的产量很低，且分离方式复杂，大规模获得外泌体需要的成本很高。本发明因此而来。
发明内容
本发明提供一种核酸适配体递送载体，包括以红细胞膜为骨架的纳米囊泡，所述纳米囊泡上负载有胆固醇修饰的核酸适配体，用于解决现有技术中存在的技术问题。
优选的技术方案中，所述核酸适配体具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；优选的，所述纳米囊泡的粒径在50～200nm范围内；优选的，所述纳米囊泡膜表面保留红细胞膜功能分子。
优选的技术方案中，所述核酸适配体递送载体通过如下步骤制备：
(1)获取红细胞膜；
(2)将红细胞膜制备成未负载的纳米囊泡；
(3)将胆固醇修饰的适配体通过孵育的方式负载至未负载的纳米囊泡的膜上。
本发明的另一目的在于提供一种核酸适配体递送载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)获取红细胞膜；
(2)将红细胞膜制备成未负载的纳米囊泡；
(3)将胆固醇修饰的核酸适配体通过孵育的方式负载至未负载的纳米囊泡的膜上。
本发明的另一目的在于提供一种基于核酸适配体靶向的药物组合物，其特征在于，所述组合物包括：
1)药学上有效量的活性药物；
2)所述的核酸适配体递送载体；
其中活性药物负载在所述核酸适配体递送载体上。
优选的技术方案中，所述活性药物包括用于沉默耐药肿瘤细胞P-糖蛋白表达的siRNA和抗肿瘤药物的任意混合，其中siRNA通过胆固醇修饰，并介导负载到未负载的纳米囊泡的膜上。优选的，siRNA载药率在2％～4％，包封率在40％～70％。优选的，抗肿瘤药物的载药率在40％～70％，包封率在50％～70％。优选的，所述siRNA具有SEQ ID No.2或3所示的核苷酸序列。
本发明的另一目的在于提供一种基于核酸适配体靶向的药物组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)获取红细胞膜；
(2)将红细胞膜制备成未负载的纳米囊泡；
(3)将胆固醇修饰的核酸适配体、胆固醇修饰的siRNA和抗肿瘤药物通过孵育的方式负载至未负载的纳米囊泡上，即得基于核酸适配体靶向的药物组合物。
优选的技术方案中，所述方法中红细胞膜是采用低渗处理法处理红细胞后形成的，具体方法包括将红细胞置于PBS溶液中震荡孵育1～3h，12000～14000rpm离心10～20min后收集红细胞膜的步骤。
优选的技术方案中，所述方法中将红细胞膜制备成未负载的纳米囊泡是采用挤压过膜的方式，包括将红细胞膜超声破碎后，挤压过膜10～30次获得纳米级的纳米囊泡。
优选的技术方案中，其中超声破碎使用超声破碎仪，功率为20～60W，频率20～25KHz，超声时间1～5min。
优选的技术方案中，其中挤压过膜采用脂质体挤出器，挤压采用滤膜采用50～200nm孔径聚碳酸酯膜。
本发明的另一目的在于提供一种基于核酸适配体靶向的药物组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
获取红细胞膜；
将胆固醇修饰的核酸适配体、胆固醇修饰的siRNA和抗肿瘤药物通过孵育的方式负载至红细胞膜上；
将红细胞膜制备成纳米囊泡，即得基于核酸适配体靶向的药物组合物。
优选的技术方案中，其中核酸适配体、siRNA、抗肿瘤药物与红细胞膜的质量比为1：(2-10)：(2-10)：150～300。
优选的技术方案中，所述步骤(2)中红细胞膜浓度为5～10μg/mL。
优选的技术方案中，其中核酸适配体和siRNA的孵育时间控制在为1～2h，阿霉素的孵育时间为12～16h。
本发明的另一目的在于提供所述的核酸适配体递送载体在制备抗肿瘤药物方面的应用。
本发明的另一目的在于提供所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物方面的应用。
优选的技术方案中，所述抗肿瘤药物为肿瘤靶向性治疗药物。
本发明利用细胞膜制备纳米囊泡的技术逐渐发展起来。红细胞由于其结构简单，且其细胞膜上具有能够阻止自体免疫细胞吞噬的CD47蛋白分子，因此可应用于构建药物递送体系，并能够延长载体材料在体内的循环时间。
本发明涉及一种基于适配体靶向的小核酸递送载体，具体涉及一种靶向肿瘤的由红细胞膜制备的纳米囊泡载体，包括其制备方法和应用。也属于靶向给药领域。本发明的主要目的在于提供一种基于适配体的具有肿瘤靶向能力的小核酸递送载体，及其制备方法和药物负载方法，以克服现有技术的不足。
具体的，本发明提供了一种基于适配体靶向的小核酸递送载体的制备方法，其包括：
将红细胞在低渗条件下制备成红细胞膜；
将胆固醇连接的适配体修饰在红细胞膜上；
将修饰后的红细胞膜通过过膜挤压的方式制备成纳米囊泡载体。
抗肿瘤药物优选化疗药物，如阿霉素。
本发明实施例还提供了小核酸及化疗药物的负载方法，其包括：
利用胆固醇连接小核酸末端，将胆固醇连接的小核酸与红细胞膜在PBS中孵育，使小核酸通过胆固醇介导负载至红细胞膜表面；
将阿霉素与红细胞膜在PBS中孵育，使阿霉素通过疏水作用负载至红细胞膜内；
将药物负载后的红细胞膜通过过膜挤压的方式制备成载药纳米囊泡。
本发明实施例还提供了前述的基于适配体靶向的小核酸递送载体用于多药耐药性肿瘤细胞治疗的应用。优选的，所述的用途包括：利用肿瘤靶向性的纳米囊泡载体联合负载P-糖蛋白siRNA和阿霉素，对多药耐药性肿瘤细胞进行递送和杀伤。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
1)生物囊泡作为小核酸等药物的递送载体相比传统的化学合成载体具有较大的优势。但是目前较常用的外泌体载体，其获取方式较为困难、成本较高、产量较低。本发明提供的利用过膜挤压制备红细胞膜纳米囊泡的方法，能够实现纳米囊泡载体的大量、低成本制备；
2)本发明所述的制备纳米囊泡方法能够通过更换聚碳酸酯膜孔径，调控载体尺寸，所制备的载体粒径均一。且设备价格低廉、操作简便；
3)本发明所述的纳米囊泡制备方法能够保留细胞膜原有的功能蛋白，使纳米囊泡具备特定的生物学功能；
4)本发明所述的胆固醇介导的小核酸负载方法，相比传统的阳离子介导或电穿孔方法，具有负载效率高、简单快捷、不引入非天然材料、不需要额外仪器设备等优点；
5)本发明所获纳米囊泡具有生物相容性高、递送效率高、靶向性等优势，可有效递送siRNA等小核酸药物、阿霉素等小分子化疗药物，能够实现对耐药性肿瘤的高效治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一典型实施例中肿瘤靶向纳米囊泡的制备示意图；
图2是本发明一典型实施例中纳米囊泡的靶向修饰和药物负载示意图；
图3是本发明一典型实施例中，根据所述方法所获得的纳米囊泡载体的粒径和表面电位图；
图4是通过本发明所述方法制备得到的纳米囊泡的膜表面CD47分子的蛋白免疫印迹图；
图5是通过本发明所述方法，改变聚碳酸酯膜孔径制备得到的不同尺寸大小的纳米囊泡的透射电镜图；
图6是本发明一典型实施例中，根据所述方法所获得的纳米囊泡的肿瘤细胞靶向性分析的流式图；
图7是本发明一典型实施例中，根据所述方法所获得的纳米囊泡的肿瘤细胞靶向性分析的共聚焦图；
图8是本发明一典型实施例中，根据所述方法所获得的纳米囊泡的细胞毒性图；
图9是本发明一典型实施例中，根据所述方法对纳米囊泡进行药物负载的包封率和载药率图；
图10是本发明一典型实施例中，所制备的载药纳米囊泡对阿霉素的靶向递送的共聚焦图；
图11是本发明一典型实施例中，所制备的载药纳米囊泡对siRNA的靶向递送的共聚焦图；
图12是本发明一典型实施例中，使用所制备的肿瘤靶向载药纳米囊泡，对耐药性肿瘤细胞进行治疗后其P-糖蛋白的表达图；
图13是本发明一典型实施例中，使用所制备的肿瘤靶向载药纳米囊泡，对耐药性肿瘤细胞进行治疗后其细胞活性图。
具体实施方式
通过应连同所附图式一起阅读的以下具体实施方式将更完整地理解本发明。本文中揭示本发明的详细实施例；然而，应理解，所揭示的实施例仅具本发明的示范性，本发明可以各种形式来体现。因此，本文中所揭示的特定功能细节不应解释为具有限制性，而是仅解释为权利要求书的基础且解释为用于教示所属领域的技术人员在事实上任何适当详细实施例中以不同方式采用本发明的代表性基础。
本发明实施例提供了一种基于适配体靶向的小核酸递送载体，其制备方法及其药物负载方法，包括：
利用低渗处理法将红细胞制备成红细胞膜；
利用挤压过膜的方式将红细胞膜制备成纳米囊泡；
将胆固醇修饰的适配体、胆固醇修饰的小核酸和化疗药物阿霉素，通过孵育的方式负载至纳米囊泡的膜上，制备成靶向的载药纳米囊泡。
其中将红细胞置于PBS溶液中震荡孵育1～3h，12000～14000rpm离心10～20min收集红细胞膜。其中将红细胞膜超声破碎后，挤压过膜10～30次，获得纳米级囊泡。
其中使用超声破碎仪，功率为20～60W，频率20～25KHz，变幅杆型号Φ2，超声时间1～5min。使用Avanti miniextruder脂质体挤出器，50～200nm孔径聚碳酸酯膜。其中更换不同孔径聚碳酸酯膜，可制备得到50～200nm大小的囊泡。
优选的，所述囊泡膜表面可保留红细胞膜功能分子。胆固醇修饰的适配体，胆固醇修饰的siRNA和阿霉素与红细胞膜进行孵育，并挤压过膜制备成载药的纳米囊泡。适配体、siRNA、阿霉素与红细胞膜质量比为1：5：5：150～300。红细胞膜浓度为5～10μg/mL。适配体和siRNA的孵育时间为1～2h，阿霉素为12～16h。
其中所述负载后的红细胞膜的挤压过膜方法同纳米囊泡。其中所述适配体为AS1411，其序列为SEQ ID No.1所示：
5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGAAAAA-cholesterol-3’。
其中所述P-糖蛋白siRNA序列可以为SEQ ID No.2或3所示：
5’-GAAACCAACTGTCAGTGTAdTdT-cholesterol-3’；
5’-TACACTGACAGTTGGTTTCdTdT-3’。
其中，所述囊泡具有肿瘤靶向性。其中，其siRNA载药率可达2％～4％，包封率可达40％～70％；阿霉素载药率可达40％～70％，包封率可达50％～70％。所述载药囊泡可用于靶向递送siRNA和阿霉素药物至肿瘤细胞，并杀伤耐药性肿瘤细胞。利用所述囊泡递送P-糖蛋白siRNA和阿霉素至耐药肿瘤细胞后，细胞P-糖蛋白表达量沉默至原有的20％；耐药指数从44逆转为3.8；阿霉素有效杀伤浓度为5μg/mL。
本发明实施例的一个方面提供了一种基于适配体靶向的小核酸递送载体的制备方法，其包括：
将红细胞通过低渗处理法制备成红细胞膜；
将红细胞膜通过挤压过膜的方式制备成纳米囊泡。
在一些实施例中，所述制备方法包括：将红细胞膜置于0.25×PBS中，冰上震荡孵育1～3h，12000～14000rpm离心10～20min收集红细胞膜。
作为优选方案之一，所述红细胞膜可置于冷冻干燥机中冷冻干燥2～3天。
进一步地，所述冷冻干燥后红细胞膜可于-80℃长期储存。
在一些实施例中，所述制备方法包括：使用Avanti miniextruder脂质体挤出器将红细胞膜挤压通过聚碳酸酯膜10～30次，制备得到纳米囊泡。
作为优选方案之一，挤压前红细胞膜应置于超声波中处理5～30min。
进一步地，所述超声处理包括超声波浴和超声破碎仪，但不限于此。
进一步地，所述聚碳酸酯膜孔径包括50～200nm，但不限于此。
作为优选方案之一，所述基于适配体靶向的小核酸递送载体具有均一粒径，且大小可控，包含100～400nm大小。优选的，所述纳米囊泡保留红细胞膜上一些蛋白分子,如CD47分子。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述基于适配体靶向的小核酸递送载体，其药物负载的方法，其包括：
将胆固醇修饰于小核酸药物和适配体末端；
将红细胞膜与胆固醇修饰的小核酸、胆固醇修饰的适配体和阿霉素孵育；
将负载药物的红细胞膜通过挤压过膜的方式制备成载药的纳米囊泡。
在一些实施例中，所述制备方法包括：将红细胞膜加入PBS中，浓度为5～10μg/mL，加入5～100μg阿霉素并孵育12～16h。12000～14000rpm离心10～20min，去除未结合的阿霉素。然后加入1～9μg胆固醇修饰的siRNA和0.2～1.8μg胆固醇修饰的适配体并孵育1～2h。离心去除游离的siRNA和适配体。
作为优选方案之一，siRNA的胆固醇修饰应修饰于正义链的5’端，以降低对其生物学效应的影响，但不限于此。
进一步地，所述载药方式其孵育温度为25～37℃。
进一步地，加入siRNA后应加入1～4μM的RNA酶抑制剂，以防止siRNA降解。
在一些实施例中，所述制备方法包括：使用Avanti miniextruder脂质体挤出器将载药红细胞膜挤压通过聚碳酸酯膜10～30次，制备得到靶向修饰和载药的纳米囊泡。
作为优选方案之一，挤压前载药红细胞膜应置于超声波中处理5～30min。
进一步地，所述超声处理包括超声波浴和超声破碎仪，但不限于此。
进一步地，所述聚碳酸酯膜孔径包括50～200nm，但不限于此。
作为优选方案之一，所述肿瘤靶向性纳米囊泡的载药方法，其siRNA载药率可达2％～4％，包封率可达40％～70％；阿霉素载药率可达40％～70％，包封率可达50％～70％。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述基于适配体靶向的小核酸递送载体在多药耐药性肿瘤细胞治疗领域中的应用。
优选的，所述的用途包括：靶向递送所述的纳米囊泡至耐药性肿瘤细胞，验证其靶向性和对耐药肿瘤细胞P-糖蛋白表达的调控能力，并实现耐药肿瘤细胞耐药性的逆转和在较低阿霉素浓度下对耐药性肿瘤细胞的有效杀伤。
优选的，载药纳米囊泡治疗时的浓度为100～300μg/mL。
藉由上述技术方案，本发明利用天然生物材料红细胞膜，采用简便、快捷的挤压过膜方法，大量、低成本的制备粒径均一、可控的纳米囊泡载体。所述方法制备的纳米囊泡生物相容性好，同时保留有红细胞上功能膜蛋白CD47，能够有效逃逸体内循环系统清除，延长血液循环时间。利用胆固醇介导的方式对纳米囊泡进行适配体的修饰和小核酸药物的负载，使其具备肿瘤靶向性和小核酸药物的高效负载能力。该方式简便、快捷、高效，利于工艺放大。所获载药靶向性纳米囊泡具有对肿瘤细胞的特异性，并能够沉默耐药肿瘤细胞P-糖蛋白的表达，逆转其耐药性，同时实现在较低阿霉素浓度下对耐药性肿瘤细胞的有效杀伤。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
除非另外具体陈述，否则术语“包含(include、includes、including)”、“具有(have、has或having)”的使用通常应理解为开放式的且不具限制性。
除非另外具体陈述，否则本文中单数的使用包含复数(且反之亦然)。此外，除非上下文另外清楚地规定，否则单数形式“一(a、an)”及“所述(the)”包含复数形式。另外，在术语“约”的使用在量值之前之处，除非另外具体陈述，否则本发明教示还包括特定量值本身。
应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
实施例1
步骤一：将红细胞加入1×PBS中，800g，4℃离心5min，收集红细胞，重复两次。然后将红细胞加入0.25×PBS中，冰上震荡孵育1h，14000rpm，4℃离心10min，收集红细胞膜。再加入0.25×PBS，冰上震荡孵育1h，14000rpm，4℃离心10min，收集红细胞膜。
其中，红细胞和0.25×PBS的体积比为1：9。
步骤二：将收集的红细胞膜置于超声波破碎仪中超声破碎，条件为60W功率，25KHz频率，变幅杆型号Φ2，超声1min。然后使用Avanti miniextruder脂质体挤出器，装备200nm孔径聚碳酸酯膜，将超声后的红细胞膜过膜挤压30次，获得纳米囊泡。
上述步骤一至二可通过图1表示。
本实施例所获纳米囊泡可用于药物负载及靶向修饰等。
实施例2
步骤一：将红细胞加入1×PBS中，800g，4℃离心5min，收集红细胞，重复两次。然后将红细胞加入0.25×PBS中，冰上震荡孵育3h，14000rpm，4℃离心10min，收集红细胞膜。再加入0.25×PBS，冰上震荡孵育1h，12000rpm，4℃离心20min，收集红细胞膜。
其中，红细胞和0.25×PBS的体积比为1：9。
步骤二：将收集的红细胞膜置于超声波破碎仪中超声破碎，条件为20W功率，20KHz频率，变幅杆型号Φ2，超声5min。然后使用Avanti miniextruder脂质体挤出器，装备100nm孔径聚碳酸酯膜，将超声后的红细胞膜过膜挤压10次，获得纳米囊泡。
上述步骤一至二可通过图1表示。
本实施例所获纳米囊泡可用于药物负载及靶向修饰等。
实施例3
步骤一：将收集的红细胞膜加入1×PBS中，使红细胞膜终浓度为5μg/mL。加入阿霉素并37℃孵育16h。然后14000rpm，4℃离心10min，收集红细胞膜并弃去上清。加入1×PBS重悬红细胞膜，使红细胞膜终浓度为5μg/mL，加入胆固醇修饰的适配体和胆固醇修饰的siRNA并37℃孵育2h，然后14000rpm，4℃离心10min，收集红细胞膜并弃去上清。
其中，适配体、siRNA、阿霉素与红细胞膜质量比为1：5：5：150。
步骤二：将收集的载药红细胞膜置于超声波破碎仪中超声破碎，条件为20W功率，20KHz频率，变幅杆型号Φ2，超声5min。然后使用Avanti miniextruder脂质体挤出器，装备100nm孔径聚碳酸酯膜，将超声后的载药红细胞膜过膜挤压30次，获得载药的肿瘤靶向的纳米囊泡。
上述步骤一至二可通过图1表示。
本实施例所获载药的肿瘤靶向纳米囊泡可用于多药耐药性肿瘤细胞治疗。
实施例4
步骤一：将收集的红细胞膜加入1×PBS中，使红细胞膜终浓度为10μg/mL。加入阿霉素并37℃孵育12h。然后14000rpm，4℃离心10min，收集红细胞膜并弃去上清。加入1×PBS重悬红细胞膜，使红细胞膜终浓度为10μg/mL，加入胆固醇修饰的适配体和胆固醇修饰的siRNA并37℃孵育1h，然后14000rpm，4℃离心10min，收集红细胞膜并弃去上清。
其中，适配体、siRNA、阿霉素与红细胞膜质量比为1：5：5：300。
步骤二：将收集的载药红细胞膜置于超声波破碎仪中超声破碎，条件为60W功率，25KHz频率，变幅杆型号Φ2，超声1min。然后使用Avanti miniextruder脂质体挤出器，装备200nm孔径聚碳酸酯膜，将超声后的载药红细胞膜过膜挤压10次，获得载药的肿瘤靶向的纳米囊泡。
上述步骤一至二可通过图1表示。
本实施例所获载药的肿瘤靶向的纳米囊泡可用于多药耐药性肿瘤细胞治疗。
实施例5
步骤一：将所获载药的肿瘤靶向纳米囊泡与耐药性肿瘤细胞孵育4h，对细胞进行药物递送。然后替换为完全培养基继续培养48h。
其中，载药纳米囊泡的浓度为100μg/mL。
步骤二：收集细胞，利用TRIzol法提取细胞总RNA，对P-糖蛋白基因表达量进行实时定量PCR分析。
其中，具体方法为，将细胞用1mL TRIzol总RNA提取试剂于冰上消化，并吸入离心管中。静置5分钟后，加入200μL三氯甲烷并立刻涡旋15秒。然后室温静置10分钟，使液面充分分层。将样品放入离心机，4℃，12000转/分钟，离心15分钟。小心吸取上层清液约400μL，再加入500μL预冷的异丙醇，充分混合后放于-20℃沉淀20分钟。然后将样品放入离心机，4℃，12000转/分钟，离心15分钟。小心倒去上清液，再加入1mL DEPC配置的75％乙醇，充分混合后放入离心机，4℃，7500转/分钟，离心5分钟。小心倒去上清液，并吸干管壁和管底部的液体保留沉淀，随后放入烘箱烘干。最后向烘干的沉淀中加入40μL DEPC处理水，反复吹打使沉淀完全溶解，并于紫外分光光度计260nm处测量总RNA浓度。
下一步，利用反转录试剂盒，将提取的总RNA反转录成cDNA。取总RNA 500ng，按照反转录试剂盒说明加入各种试剂，混合均匀后于PCR仪上进行反转录PCR，程序为37℃，15分钟；86℃，6秒钟；4℃保存。
最后，进行qPCR。将上一步的反转录产物用去离子水稀释5倍。将每组反转录产物分为p21基因组和β-actin内参组。按照qPCR试剂盒说明，加入各种试剂。再分别向各组体系中加入对应的p21基因和β-actin基因的上、下游引物，最后加入2μL反转录产物作为PCR模板。混匀后放入qPCR仪进行qPCR。程序为95℃，10分钟Hold阶段；95℃，1分钟变性，60℃，1分钟退火延申，这两步作为一个循环共进行40循环；最后进入溶解曲线阶段。
采用ΔΔCt法计算p21基因的相对表达量。
步骤三：收集细胞，利用蛋白免疫印迹法，对细胞P-糖蛋白蛋白表达量进行分析。
其中，具体方法为：细胞分别加入50μL细胞裂解液进行裂解。裂解后的细胞碎片通过14000g，10分钟离心去除。上清液加入BCA蛋白试剂盒进行蛋白浓度测定，通过酶标仪读取标准蛋白和样本蛋白吸收，并计算得出样本蛋白浓度。各组取50μg蛋白，加入LoadingBuffer后煮沸10分钟以充分变性待用。配制10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel，PAGE)和5％的浓缩胶，先将10％的PAGE灌入制胶槽，加入去离子水液封。待PAGE胶凝固后，吸干液封的去离子水，再加入5％的浓缩胶。
然后进行跑胶和转膜。PAGE胶制备完成后，放入电泳槽，上样后先在80V电压下将样品跑至浓缩胶分界面，再调100V电压，电泳1.5小时。电泳结束后，取出PAGE胶待转膜。取PVDF膜，甲醇活化15秒后，将PVDF膜，PAGE胶叠放在转膜夹板中。用滤纸夹紧并放入转膜槽中进行转膜。由于转膜中温度过高，因此使用乙醇循环冷却装置为转膜过程降温。转膜电压为100V，时间1.5小时。
接下来进行封闭和一抗的孵育。转膜结束后，用TBS轻轻清洗PVDF膜，然后加入丽春红染色。通过染色并根据标准蛋白Ladder的定位，剪出目的蛋白p21和内参β-actin条带的大概位置。将条带放入5％的脱脂奶粉中封闭1小时，然后用TBST清洗未结合的脱脂奶粉。将清洗后的条带放入对应的p21一抗和β-actin一抗中，4℃孵育过夜。
最后进行二抗的孵育和显影。用TBST清洗一抗孵育后的条带，洗去未结合的一抗。将条带与二抗在室温孵育2小时后洗去未结合的二抗。清洗后的条带滴入ECL显影液后用凝胶成像系统成像。
步骤四：将负载相同量siRNA，不同量阿霉素(0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10、50μg/mL)的靶向纳米囊泡与相同量耐药性肿瘤细胞孵育，以对其进行递送。孵育4h后，更换完全培养基继续培养48h。然后，吸去培养基并用PBS清洗三遍，加入工作浓度WST-1试剂，在37℃的二氧化碳培养箱中孵育2小时，最后吸取上清液在450nm处用酶标仪读数。并计算IC50和细胞活性，以计算细胞的耐药性变化以及对耐药细胞的杀伤能力。
其中，为消除系统误差，只含有WST-1的孔(无细胞)作为空白孔被减去，细胞毒性和细胞活性用下述公式进行计算：
Figure BDA0002119917940000151
A实验指加入材料的各实验组吸光度数值，A对照指未加材料只含细胞的对照组数值，A空白指只有WST-1试剂(无材料，无细胞)的空白组的数值。
上述步骤二至三可通过图12表示，步骤四可通过图13表示。
本实施例所介绍的为基于适配体靶向的纳米囊泡载体负载阿霉素和小核酸在耐药性肿瘤细胞治疗中的应用。
下面，通过7项性能测试展示上述各实施例所获基于适配体靶向的纳米囊泡的应用优势。
(1)利用马尔文粒径仪测试上述实施例所获纳米囊泡的水动力学粒径和表面电位，结果可通过图3表示。通过结果可以看出，纳米囊泡粒径均一，在100nm左右，表面电荷为负。
(2)利用蛋白免疫印迹法测试上述实施例所获纳米囊泡的膜蛋白CD47的保留情况。结果可由图4表示。通过结果可知，纳米囊泡能够保留红细胞膜表面的CD47分子。
(3)利用透射电镜测试上述实施例所获纳米囊泡的形貌。其结果可通过图5表示。按上述实施例中制备方法描述，更改不同孔径的聚碳酸酯膜挤压过膜制备纳米囊泡，能够制得粒径均一的100、200和400nm直径的纳米囊泡。
(4)通过流式细胞术和共聚焦荧光显微镜对适配体修饰后的纳米囊泡其肿瘤细胞特异性进行分析。其结果可通过图6和7表示。如图所示，经过DiO荧光修饰后的纳米囊泡，对其分别进行靶向性和无靶向修饰，并递送肿瘤细胞。无靶向组细胞的荧光强度低于靶向组，说明靶向性修饰能够使纳米囊泡具有肿瘤特异性。
(5)通过WST试剂对纳米囊泡的细胞毒性进行测试。其结果可通过图8表示。如图所示，纳米囊泡载体具有良好的生物相容性，较低的细胞毒性。当纳米囊泡浓度达800μg/mL时，仍几乎无细胞毒性，而纳米囊泡载体在上述实施例中治疗的浓度为100～300μg/mL，因此能够满足要求。
(6)通过测试和计算获得纳米囊泡对阿霉素和siRNA的包封率和载药率。其结果可通过图9表示。如图所示，利用上述胆固醇介导的药物负载方法和孵育的方式，其siRNA载药率可达2％～4％，包封率可达40％～70％；阿霉素载药率可达40％～70％，包封率可达50％～70％。说明该方法具有较高的装载效率。
(7)通过共聚焦荧光显微镜对阿霉素和siRNA负载后的肿瘤靶向性纳米囊泡其肿瘤细胞特异性的药物递送能力进行分析。其结果可通过图10和11表示。适配体修饰后的载药纳米囊泡展现出了较良好的靶向递送能力。
对照例1
一般情况下，常规方法获得囊泡类载体如外泌体等，需要大量培养细胞，收集大量细胞上清液，并需要超高速离心机长时间(16h左右)离心分离。且分离得到的外泌体大小不均。整个过程费时，费力，成本极高。因此限制了囊泡类载体在临床中的应用。
与对照例1相比，本发明实施例1和2所述纳米囊泡的制备方式简便快捷，所需设备小巧，价格低廉，同时能够大量、低成本制备得到。所制备纳米囊泡的粒径均一，大小可调控，且本身保留有红细胞膜功能蛋白，能够有效降低囊泡类载体的获取成本，提高质量，并易于大规模标准化、自动化生产。
对照例2
一般情况下，常规方法对囊泡类载体进行靶向修饰多采用化学偶联或静电吸附的方式。例如利用活性基团形成化学键修饰靶向分子；或利用阳离子介导吸附靶向分子。这些方法需要引入非天然的高分子聚合物、无机物、有机试剂等杂质。因此生物相容性难以保证。
与对照例2相比，本发明实施例3和4所述胆固醇介导的适配体修饰,实施简便快捷，不引入非天然化学试剂，保证纳米囊泡载体具有较高的生物相容性。
对照例3
一般情况下，常规方法对囊泡类载体进行小核酸等生物大分子的负载，往往利用电转染的方法。该方法需要较昂贵的电转染设备和耗材，且转染效率不高、单次样品处理量少。因此难以实现大规模生产。
与对照例3相比，本发明实施例3和4所述胆固醇介导的小核酸负载方法，不需要额外设备，且成本低、简便快捷、效率高。同时易于工艺放大，实现标准化、自动化生产。
综上所述，藉由本发明的上述技术方案，所发明的一种基于适配体靶向的小核酸递送载体，其制备方法及其药物负载方法具有生物相容性好、方法简便快捷、不需额外大型仪器、产量高、成本低、易于放大生产等优势，且能够用于耐药性肿瘤等疾病的治疗。
此外，本案发明人还参照实施例1-5的方式，以本说明书中列出的其它原料和条件等进行了试验，并同样制得了具有肿瘤靶向性、药物负载率高的载药纳米囊泡。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。此外，除非具体陈述，否则术语第一、第二等的任何使用不表示任何次序或重要性，而是使用术语第一、第二等来区分一个元素与另一元素。
Figure BDA0002119917940000181
序列表
<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
<120> 核酸适配体递送载体，其制备方法及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtggaaaa a 31
<210> 2
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
gaaaccaact gtcagtgta 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
tacactgaca gttggtttc 19

Claims (18)

1.一种核酸适配体递送载体，其特征在于，包括以红细胞膜为骨架的纳米囊泡，所述纳米囊泡上负载有胆固醇修饰的核酸适配体。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体递送载体，其特征在于，所述核酸适配体具有SEQID No.1所示的核苷酸序列；优选的，所述纳米囊泡的粒径在50～200nm范围内；优选的，所述纳米囊泡膜表面保留红细胞膜功能分子。
3.根据权利要求1所述的核酸适配体递送载体，其特征在于，所述核酸适配体递送载体通过如下步骤制备：
(1)获取红细胞膜；
(2)将红细胞膜制备成未负载的纳米囊泡；
(3)将胆固醇修饰的适配体通过孵育的方式负载至未负载的纳米囊泡的膜上。
4.一种核酸适配体递送载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)获取红细胞膜；
(2)将红细胞膜制备成未负载的纳米囊泡；
(3)将胆固醇修饰的核酸适配体通过孵育的方式负载至未负载的纳米囊泡的膜上。
5.一种基于核酸适配体靶向的药物组合物，其特征在于，所述组合物包括：
1)药学上有效量的活性药物；
2)权利要求1或者2所述的核酸适配体递送载体；
其中活性药物负载在所述核酸适配体递送载体上。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述活性药物包括用于沉默耐药肿瘤细胞P-糖蛋白表达的siRNA和抗肿瘤药物的任意混合，其中siRNA通过胆固醇修饰，并介导负载到未负载的纳米囊泡的膜上；优选的，所述siRNA具有SEQ ID No.2或3所示的核苷酸序列；优选的，siRNA载药率在2％～4％，包封率在40％～70％；优选的，抗肿瘤药物的载药率在40％～70％，包封率在50％～70％。
7.一种基于核酸适配体靶向的药物组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)获取红细胞膜；
(2)将红细胞膜制备成未负载的纳米囊泡；
(3)将胆固醇修饰的核酸适配体、胆固醇修饰的siRNA和抗肿瘤药物通过孵育的方式负载至未负载的纳米囊泡上，即得基于核酸适配体靶向的药物组合物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述方法中红细胞膜是采用低渗处理法处理红细胞后形成的，具体方法包括将红细胞置于PBS溶液中震荡孵育1～3h，12000～14000rpm离心10～20min后收集红细胞膜的步骤。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述方法中将红细胞膜制备成未负载的纳米囊泡是采用挤压过膜的方式，包括将红细胞膜超声破碎后，挤压过膜10～30次获得纳米级的纳米囊泡。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，其中超声破碎使用超声破碎仪，功率为20～60W，频率20～25KHz，超声时间1～5min。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，其中挤压过膜采用脂质体挤出器，挤压采用滤膜采用50～200nm孔径聚碳酸酯膜。
12.一种基于核酸适配体靶向的药物组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)获取红细胞膜；
(2)将胆固醇修饰的核酸适配体、胆固醇修饰的siRNA和抗肿瘤药物通过孵育的方式负载至红细胞膜上；
(3)将红细胞膜制备成纳米囊泡，即得基于核酸适配体靶向的药物组合物。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，其中核酸适配体、siRNA、抗肿瘤药物与红细胞膜的质量比为1：(2-10)：(2-10)：150～300。
14.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中红细胞膜浓度为5～10μg/mL。
15.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，其中核酸适配体和siRNA的孵育时间控制在为1～2h，阿霉素的孵育时间为12～16h。
16.权利要求1至3中任一所述的核酸适配体递送载体在制备抗肿瘤药物方面的应用。
17.权利要求5或6所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物方面的应用。
18.根据权利要求17的应用，其特征在于所述抗肿瘤药物为肿瘤靶向性治疗药物。
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