CN107109406A - 一种新的前体miRNA及其在肿瘤治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
提供了一种新的前体miRNA及其在肿瘤治疗中的应用。该前体miRNA的5'至3'端具有式I所示的结构:
Description
本发明涉及肿瘤治疗领域,具体地,涉及一种新的前体miRNA,以及该前体miRNA用于抑制肿瘤生长中的方法及应用。
microRNA来源于长度约1000bp的长链RNA初始转录产物(Pri-miRNA),Pri-miRNA分子在细胞核中经Drosha酶剪切形成长度约60-80nt的具有茎环结构的miRNA前体。前体miRNA转运至胞质后,被进一步切割成长约18-26nt的双链miRNA。双链miRNA解开后,成熟的miRNA进入RNA诱导基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC),与互补mRNA完全或不完全配对,降解靶mRNA或阻遏其表达。
尽管microRNA在细胞总RNA中所占的比重很小,但由于miRNA参与生命过程中一系列的重要进程,包括早期胚胎发育、细胞增殖和细胞死亡、细胞凋亡与脂肪代谢、细胞分化以及在基因表达调控中的作用。而细胞增殖及凋亡等常在肿瘤中发生异常,因此推测miRNA的异常缺失、突变或过表达将导致人类疾病的发生。
近来,越来越多证据显示miRNA在抑制肿瘤生长、繁殖、分化中扮演者及其重要的角色。本领域迫切需要了解在肿瘤治疗领域,各种不同miRNA的作用,以开发新的肿瘤治疗药物。
发明内容
本发明提供了一种新的表达anti-miRNA-214的前体miRNA,及其在治疗肿瘤中的应用。
本发明第一方面,提供一种药物制剂,所述的制剂含有:
(a)用于表达anti-miRNA和/或siRNA的表达载体;以及
(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中,所述的表达载体所表达的式I-1所示的前体,
式I,
B1为所需要的第一核糖核酸序列,所述的第一核糖核酸序列包括anti-miRNA序列形式或siRNA序列形式;
B2为与B1基本互补或完全互补的序列,且B2与C不互补;
C为茎环结构序列;
A1和A2分别为无,或任选的由4-5个碱基组成的RNA序列;
其中,所述前体能在宿主中表达(或产生或富集)所述的第一核糖核酸序列,而不表达(或产生或富集)与所述第一核糖核酸序列互补的第二核糖核酸序列。
在另一优选例中,所述的第一核糖核酸序列为5p形式,而第二核糖核酸序列为3p形式。
在另一优选例中,所述的第一核糖核酸序列为3p形式,而第二核糖核酸序列为5p形式。
在另一优选例中,所述的第一核糖核酸序列为anit-miRNA和/或siRNA。
在另一优选例中,所述的B1为抗肿瘤的miRNA或siRNA。
在另一优选例中,所述的B1为anti-miRNA-214-5p。
在另一优选例中,第一核糖核酸序列为anti-miRNA-214-5p,而第二核糖核酸序列为anti-miRNA-214-3p。
在另一优选例中,所述的制剂为液体剂型。
在另一优选例中,所述的制剂为注射剂。
在另一优选例中,所述的表达载体包括质粒。
在另一优选例中,所述的表达载体或质粒含有启动子、复制起点和标记基因。
在另一优选例中,所述的表达载体中含有表达anti-miRNA和/或siRNA的表达盒。
在另一优选例中,所述的表达盒(即多核苷酸)为双链,并且具有以下结构:
启动子-attB1-任选的标签蛋白(如GFP或emGFP)-5’miR侧翼区序列-式I所示的序列-5’miR侧翼区序列-attB2-任选的TKPA元件。
在另一优选例中,所述的制剂为脂质体制剂。
本发明第二方面提供一种施用药物的方法,包括步骤:
将本发明第一方面所述的药物制剂施用于哺乳动物的第一部位,从而使得所述表达载体在所述哺乳动物体内被加工形成微粒子(microvesicle),并被运输到所述哺乳动物的第二部位,并在所述的第二部位表达所述的anti-miRNA和/或siRNA。
在另一优选例中,所述的哺乳动物包括人和非人哺乳动物。
在另一优选例中,所述的第一部位包括皮下、静脉或肠胃道。
在另一优选例中,所述的第二部位包括肝脏、肺、肾脏。
在另一优选例中,所述的施用包括口服、皮下注射、肌内注射、静脉注射。
本发明第三方面提供一种前体序列,其5'至3'端具有式I所示的结构:
式I,
B1为所需要的第一核糖核酸序列,其中所述的第一核糖核酸序列包括anti-miRNA序列形式或siRNA序列形式;
B2为与B1基本互补或完全互补的序列,且B2与C不互补;
C为茎环结构序列;
A1和A2分别为无,或任选的由4-5个碱基组成的RNA序列;
其中,所述前体能在宿主中表达(或产生或富集)所述的第一核糖核酸序列,而不表达(或产生或富集)与所述第一核糖核酸序列互补的第二核糖核酸序列。
本发明第四方面,提供了一种前体序列,其5'至3'端具有式I所示的结构:
式I,
B1为anti-miRNA-214-5p;
B2为与B1基本互补或完全互补的序列,且B2与C不互补;
C为茎环结构序列,较佳地为SEQ ID NO.:1所示的序列(GUUUUGGCCACUGACUGAC);
A1和A2分别为无,或任选的由4-5个碱基组成的RNA序列;
其中,所示的前体序列能在宿主中加工形成anti-miRNA-214,且在所述anti-miRNA-214中,只表达anti-miRNA-214-5p,不表达anti-miRNA-214-3p。
在另一优选例中,所述的“只表达anti-miRNA-214-5p,不表达anti-miRNA-214-3p”表示F5/F3之比≥5,较佳地≥10,更佳地≥20,最佳地≥50,其中F5为anti-miRNA-214-5p的表达量,而F3为anti-miRNA-214-3p的表达量。在另一优选例中,所述的anti-miRNA-214-5p如SEQ ID NO.:2所示(ACUGCCUGUCUGUGCCUGCCUGU)。
在另一优选例中,所述的anti-miRNA-214-3p如SEQ ID NO.:3所示(ACAGGCAGGC AGACAGGCAGU)。
在另一优选例中,所述B2与B1有2-8个碱基不互补,较佳地,所述B2与B1有3-5个碱基不互补。
在另一优选例中,所述B2较B1添加或缺失1-2个碱基。
在另一优选例中,所述的B2较B1缺失1-2个碱基,更佳地,缺失2个碱基。
在另一优选例中,所述的被缺失的1-2个碱基位于B1的中部,即9-14位中的1-2个碱基,如第9-10位,第10-11位,第11-12位,第12-13位或第13-14位。
在另一优选例中,所述的A1为UGCUG;和/或
所述的A2为CAGG或CAGGA。
在另一优选例中,A2优选为CAGG。
本发明第五方面,提供了一种多核苷酸,所述的多核苷酸能被宿主转录形成本发明第四方面中所述的前体序列。
在另一优选例中,所述的多核苷酸为双链,并且具有以下结构:
attB1-任选的标签蛋白(如GFP或emGFP)-5’miR侧翼序列-式I所示的序列-5’miR侧翼序列-attB2。
本发明第六方面,提供了一种表达载体,所述的表达载体含有本发明第四方面所述的前体序列或本发明第五方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述的表达载体包括病毒载体、非病毒载体。
在另一优选例中,所述的表达载体为质粒。
在另一优选例中,所述的本发明第五方面所述的多核苷酸的上游为启动子,并且其下游为TKPA元件。
本发明第七方面,提供了一种药物组合物,所述的药物组合物含有本发明第四方面所述的前体序列、或本发明第六方面所述的表达载体,和药学上可接受的载体。
在另一优选例中,所述的药物组合物包括anti-miR-214质粒。
在另一优选例中,所述的药物组合物为本发明第六方面所述的表达载体,较佳地,为含有本发明第四方面所述前体序列的质粒。
在另一优选例中,所述的药物组合物的剂型包括:
片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液、混悬液、乳剂、混悬剂、注射液、或粉针剂。
在另一优选例中,所述的药物组合物的剂型还包括喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、挥发性液体、外用溶液剂、洗剂、浇淋剂、搽剂、巴布膏剂、膏药、橡胶膏剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂或栓剂。
在另一优选例中,所述的剂型为注射剂,较佳地,为静脉注射剂、腹腔注射剂。
本发明第八方面,提供了本发明第四方面所述前体序列、或本发明第六方面所述表达载体的用途,包括,(i)用于制备miRNA-214的抑制剂;和/或(i i)用于制备抗miRNA-214高表达恶性肿瘤的药物组合物。
在另一优选例中,所述的恶性肿瘤包括肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、结直肠癌、宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、或乳腺癌。
本发明第九方面,提供了一种体外非治疗性抑制miRNA-214高表达恶性肿瘤细胞生长的方法,包括步骤:
在本发明第七方面所述药物组合物存在情况下培养miRNA-214高表达恶性肿
瘤细胞,从而抑制miRNA-214高表达恶性肿瘤细胞的生长。
本发明第十方面,提供了一种治疗miRNA-214高表达恶性肿瘤的方法,将安全有效量的本发明第六方面所述的表达载体或本发明第七方面所述的药物组合物施用于所需对象,从而治疗miRNA-214高表达恶性肿瘤。
在另一优选例中,所述施用的剂量为0.05-10mg/kg,较佳地,为0.1-5mg/kg。
在另一优选例中,所述施用包括:口服、呼吸道、注射、透皮、粘膜或腔道给药;
在另一优选例中,所述施用包括注射质粒。
本发明第十一方面,提供了一种治疗miRNA-214高表达恶性肿瘤的方法,其特征在于,将含有本发明第四方面所述的前体序列的anti-miR-214质粒通过静脉注射施用于所需对象,从而治疗miRNA-214高表达恶性肿瘤。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
图1本发明的代表性的质粒图谱。其中,“flanking region”表示侧翼区(序列)。
图2显示了从小鼠尾静脉注射anti-miR-214过表达质粒后,在1h,3h,6h,24h等时间节点后检测各组织或脏器中该siRNA的含量。
图3显示了CD4+T细胞的数量变化。
图4显示了各个组织anti-miR-214含量。
图5显示了Anti-miR-214对荷瘤鼠体重影响。
图6显示了Anti-miR-214对小鼠Lewis肺癌治疗作用组织切片图,其中A:×40;B:×100;C:×400。
图7显示了肿瘤末期志愿者注射质粒前后血细胞和血浆中anti-miR-214的含量。
图8显示了血清中miR-214的表达水平。
图9显示了pcDNA3质粒的图谱结构。
本发明人经过广泛而深入地研究,首次设计制备了一种能够高效表达anti-miRNA-214的前体miRNA。本发明前体miRNA经过宿主细胞的加工后,能够高效地表达anti-miRNA-214-5p,而不产生或基本不产生anti-miRNA-214-3p,从
而有效地避免了目的序列的反向互补序列对目的序列发挥功能的干扰作用。实验证明,本发明前体miRNA能够在体内有效表达anti-miRNA-214-5p序列,并对多种恶性肿瘤都具有更有效的治疗作用。在此基础上,完成了本发明。
miRNA及其前体
如本文所用,所述的“miRNA”是指一类RNA分子,从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt),也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。
人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA,Pre-miRNA)加工而来,所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构,所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构,茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。
在本发明中,所述的前体miRNA为人工合成的前体miRNA,且所述的前体miRNA具有式I所示的结构:
式I,
作为代表性的例子,B1为anti-miRNA-214-5p;
B2为与B1互补(包括基本互补和完全互补)的序列;
C为SEQ ID NO.:1所示的序列(GUUUUGGCCACUGACUGAC);
A1和A2分别为无,或任选的由4个-5个碱基组成的核苷酸序列;
其中,所示的前体miRNA能在宿主中加工形成anti-miRNA-214,且在所述anti-miRNA-214中,只表达anti-miRNA-214-5p,不表达anti-miRNA-214-3p。
在本发明中,形成anti-miRNA-214-5p的前体miRNA可被剪切生成与拮抗miRNA-214的miRNA,即anti-miRNA-214-5p(SEQ ID NO.:2)。
在式I中,B2和B1为基本互补。如本文所用,“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的,可以以一种可预见的方式发生相互作用,如形成二级结构(如茎环结构)。通常,两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70%的核苷酸是互补的;优选的,至少有80%的核苷酸是互补的;更优选的,至少有90%的核苷酸是互补的。一般地,两条足够互补的分子之间可以具有最多8个不匹配的核苷酸,优选地,具有1、2、3、4、5个不匹配的核苷酸。
如本申请所用,“茎环”结构也被称作“发夹”结构,是指一种核苷酸分子,
其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构,所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成,两个区域分列双链部分的两侧;其还包括至少一个“环”结构,包括非互补的核苷酸分子,即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的,核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如,插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构,然而,该两个区域仍可基本上互补,并在可预见的方式中发生相互作用,形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的,通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后,本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
本发明中,“茎环结构”可存在于式I所示前体miRNA的末端,例如由于B1和B2形成基本互补后,C会形成一固定的末端茎环结构;所述的“茎环结构”还可存在于式I所式前体miRNA内部,例如由于B1和B2之间并非完全互补,造成未互补结合的B1或B2的碱基会形成一内部的茎环(internal loop)。
本发明所述的miRNA-214是指:微小RNA-214(miRNA-214)家族,所述miRNA-214家族包括:miRNA-214或经修饰的miRNA-214衍生物,其功能与miRNA-214-相同或基本相同。
根据本发明所提供的miRNA序列,可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物,也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的anti-miRNA-214-5p的量,从而降低miRNA-214的量。因此,本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物),所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA,所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。
多核苷酸构建物
作为本发明的一种优选方式,所述的多核苷酸构建物自5'至3'端含有式II所示的结构:
a1-b1-c-b2-a2
式II
式II中,
b1为可在细胞中表达成所述的anti-miRNA-214-5p的核苷酸序列,b2为与b1基本上互补或完全互补的核苷酸序列;c为位于b1和b2之间的间隔序列,并且所述间隔序列与B1和B2不互补;
a1和a2分别为无,或任选的由4个-5个碱基组成的核苷酸序列;
式II所示的结构在转入细胞后,形成式I所示的二级结构:
式I
通常,所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此,本发明还包括一种载体,它含有所述的miRNA,或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
在本发明中,所述表达载体没有特别限制,包括市售的或用常规制备的表达载体。代表性的例子包括(但并不限于):pcDNATM6.2-GW/miR、pcDNA3、pMIR-REPORT miRNA、pAdTrack-CMV、pCAMBIA3101+pUC-35S、pCMVp-NEO-BAN、pBI121、pBin438、pCAMBIA1301、pSV2、CMV4表达载体、pmiR-RB-ReportTM、pshOK-basic、mmu-mir 300-399miRNASelectTM、pshRNA-copGFP Lentivector、GV317、GV309、GV253、GV250、GV249、GV234、GV233、GV232、GV201、GV159或其他GV系列表达载体。
在另一优选例中,在所述表达载体中,与所述表达所述前体miRNA多核苷酸操作性相连的启动子包括组成型启动子或组织特异性启动子,优选在肝脏组织中特异性启动的启动子。换言之,这些启动子用于驱动前体miRNA的表达。
代表性的启动子包括(但并不限于):Pcmv启动子、U6、H1、CD43启动子、CD45(LCA)启动子、CD68启动子、Endoglin(CD105)启动子、Fibronectin启动子、Flt-1(VEGFR-1)启动子、GFAP启动子、GPIIb(IntegrinαIIb)启动子、ICAM-2(CD102)启动子、MB(Myoglobin)启动子、NphsI(Nephrin)启动子、SPB启动子、SV40/hAlb启动子、SYN1启动子、WASP启动子或其组合。
药物组合物及施用方法
如本文所用,术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用,术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的,即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体,包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配,本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度
等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等;患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常,当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予,能得到令人满意的效果。例如,由治疗状况的迫切要求,可每天给予若干次分开的剂量,或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于):水、盐水、脂质体、脂质、微粒子(micro particle)、微泡(micro vesicle)、外泌体(exosomes)、脱落囊泡(shedding vesicle)、纳米胶囊(Nanocapsules/Nanoparticles)、β环糊精胶囊(β-cyclodextriniclusion compound)蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配,这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
在本发明中,可将所述的表达载体直接施用于对象,也可将所述的表达载体与药学上可接受的载体制备成药物组合后进行施用。所述的施用包括静脉注射。
治疗方法
本发明还提供了一种治疗miRNA-214高表达恶性肿瘤的方法,即,将安全有效量的本发明表达载体或药物组合物施用于所需对象,从而治疗miRNA-214高表达恶性肿瘤。通常,“miRNA-214高表达恶性肿瘤”指的是所述的肿瘤中,miRNA-214的表达量E1与癌旁组织或正常组织中miRNA-214的量E0相比具有显著性差异,较佳地,所述“高表达”指的是E1≥1.5E0,更佳地E1≥2E0。肿瘤组织中,miRNA-214是否高表达可以通过常规方法检测。通常,所述的miRNA-214高表达恶性肿瘤包括(但不限于)肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、结直肠癌、宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、或乳腺癌。
本发明有益效果
本发明前体miRNA能够有效的避免在过表达目的序列得同时也过表达目的序列得反向互补序列,从而有效避免了目的序列得反向互补序列对目的序列发挥功能的干扰作用。
本发明前体miRNA能够在体内有效表达anti-miRNA-214-5p序列,并对多种恶性肿瘤都具有有效的治疗作用,从而用于开发新的肿瘤治疗药物。
实施例1:Anti-miR-214过表达载体构建
MicroRNA载体利用CMV启动子可以在众多哺乳动物细胞中快速、高效、持续表达pre-miRNA,经过Drosha(RNaseⅢ)作用形成small hairpin pre-miRNAs(约70nt),再过Dicer作用形成成熟的microRNA(约22nt),作用靶mRNA,
起到表达调控作用。利用优化过的载体,模拟anti-miR-214的表达模块,有效的避免了有些内源miRNA表达时产生-3p,-5p的问题。
1.anti-miR-214-5p序列
>anti-miR-214-5p
5’-ACUGCCUGUCUGUGCCUGCCUGU-3’(SEQ ID NO.:2)
2.anti-miR-214载体
2.1.Oligo DNA的设计与合成
根据基因序列设计并合成2对互补oligo DNA(oligo设计方法及架构请参见产品使用说明第6条),序列见表1。
设计合成的oligo结构如下:
表1、oligo DNA序列及其对应的前体miRNA元件
2.2miRNA载体的构建与验证
2.2.1材料
含有EmGFP的BLOCK-iTTM Pol II miR RNAi表达载体盒(购自Life)
oligo DNA(购自Life)
感受态细胞DH5α(购自Life)
2.2.2方法
(1)退火
将2对合成好的寡聚单链DNA用ddH2O溶解成100μM,互补单链各取5μl两两混合,按表2给出体系进行退火。将2份oligo混合物在95℃加热5分钟,然后放置室温20分钟,形成双链DNA。
表2、oligo DNA退火体系
(2)连接
将退火的双链DNA继续稀释成10nM浓度,按表3给出体系在室温连接30分钟。
表3、酶连接体系
注:pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR和pcDNA6.2-GW/miR的结构如图1所示。
(3)转化
取10μl连接产物转化100μl感受态细胞DH5α,涂LB平板(含50μg/ml壮观霉素)后,37℃孵育。
(4)测序验证
每个转化平板分别挑取3个克隆,摇菌抽提质粒后进行测序,以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的寡聚单链DNA序列一致。
实施例2:细胞实验验证过表达anti-miR-214的效率
在A549细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)中转染
anti-miR-214质粒,统一总RNA后分别利用从ABI公司定制的anti-miR-214-5p,anti-miR-214-3p,miR-214的引物Real-time-PCR检测anti-miR-214-5p、anti-miR-214-3p、miR-214的水平。结果均以Ct值代表每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数,其中,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小;起始拷贝数越少,Ct值越大。表4显示了利用Real-time PCR对anti-miRNA和miRNA表达水平进行测定。
表4、anti-miR-214-5p、anti-miR-214-3p、miR-214的表达水平
(Ct) | anti-miR-214-5p |
空白质粒 | 39.63±0.2928 |
anti-miR-214质粒 | 24.55±0.5052 |
(Ct) | anti-miR-214-3p |
空白质粒 | 30.45±0.7865 |
anti-miR-214质粒 | 33.87±0.5683 |
(Ct) | miR-214 |
空白质粒 | 20.55±0.6822 |
anti-miR-214质粒 | 23.63±0.5119 |
结论:在A549细胞中转染anti-miR-214质粒后,能检测到anti-miR-214-5p的急剧上升(p<0.01),基本检测不到anti-miR-214-3p(p>0.05),且不会引起miR-214的上升,相反会导致miR-214下降(p<0.05)。基于Ct值的差异,可以判断出F5/F3之比远大于50/1。
实施例3:体内实验验证过表达anti-miR-214的效率
给C57/BL6小鼠尾静脉注射anti-miR-214质粒,24h后灌流,取血、心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉组织,统一总RNA,然后进行q-PCR检测anti-miR-214-5p、anti-miR-214-3p、miR-214的水平。结果见表5。
表5、anti-miR-214-5p、anti-miR-214-3p的表达水平
实验结果说明:
从实验结果来看,注射0.1mg质粒后,小鼠全血,肝,肺中anti-miR-214-5p水平已经显著升高(p<0.05),而检测不到anti-miR-214-3p的变化(p<0.05)。
实施例4:体内实验验证过表达siRNA的代谢动力学
从小鼠尾静脉注射anti-miR-214过表达质粒(以下实验中,anti-miR-214均指anti-miR-214-5p),在1h,3h,6h,9h,12h,24h,36h,48h后检测血浆、心脏、肝、脾、肺、肾、脑、骨骼肌、CD4+T细胞中该siRNA的含量,具体结果见图2。从图2可以看出,siRNA确实可以进入肺部并且在6h后达到最高浓度,在24h内均能够检测到。
实施例5:植瘤小鼠实验
从小鼠尾静脉注射LLC cell,构建肺癌转移模型,模型构建成功后,尾静脉注射anti-miR-214过表达质粒,观察治疗效果,处死小鼠后取小鼠各个组织进行Real-time PCR检测小鼠各个组织内anti-miR-214的分布,并进行组织切片检测以观察治疗效果。
(1)CD25+,Foxp3+T cell数量变化
具体结果见图3。从图3可以看出,anti-miR-214质粒可以有效抑制肿瘤小鼠体内抑制新T细胞CD25+,Foxp3+T cell(Treg)的数量,并且呈剂量依赖性,随着注射质粒浓度的提高,CD25+,Foxp3+T cell(Treg)的数量随之减少。
(2)各个组织anti-miR-214含量
具体结果见图4。从图4可以看出,注射anti-miR-214质粒后,anti-miR-214可以被肝脏运送到多个组织,并且使多个组织anti-miR-214水平急剧升高。
实施例6:Anti-miR-214对小鼠Lewis肺癌治疗作用研究
通过C57BL/6小鼠在体肿瘤造模,Anti-miR-214静脉给药对小鼠Lewis肺癌的治疗作用,为后续研究提供参考。
收集对数生长期的LCC肿瘤细胞,按1×106/鼠通过尾静脉注射建立原位Lewis肺癌模型。成模后,静脉注射给予系列浓度的Anti-miR-214,并观察给药期动物生活状况。给药结束后,取肺脏进行病理切片检查,观察肺肿瘤严重程度及Anti-miR-214治疗效果。
1.试验材料与方法
1.1试验材料
受试化合物:Anti-miR-214,含量:6.4mg/ml,由南京大学生命科学学院提供。试验时用注射用生理盐水稀释成所需浓度。
LCC细胞系:由南京大学生命科学学院提供。DMEM为Hyclone公司产品。胎牛血清为Gibco公司产品。试验时,LCC细胞系用含10%FBS、100ug/ml青霉素和100ug/ml链霉素的DMEM完全培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养。
动物:C57BL/6小鼠40只,雌雄各半,6周龄,由扬州大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK(苏)2007-0001。
1.2试验方法
将培养至对数生长期的LCC细胞用胰酶消化后,1000rpm离心,弃上清,用无菌生理盐水洗涤两次,将细胞悬浮于生理盐水中,台盼蓝染色观察细胞活力,并进行细胞计数,调整细胞密度为5×106/ml。试验时,取健康C57BL/6鼠,按0.2ml/只尾静脉缓慢注射,注射结束后,将所有造模小鼠分为模型组(阴性对照组)、大(5mg/kg)、中(0.5mg/kg)、小剂量组(0.05mg/kg)。造模期间,定期观察C57BL/6小鼠的精神、饮食、排便、体重和活动等情况。第14天开始,按0.1ml/10g体重尾静脉注射给药,对照组给予相应的生理盐水。给药期间,每3天给药一次,共7次。末次给药后第3天,小鼠乙醚麻醉,取血、肺及肝脏。将肺、肝脏放10%福尔马林中,做病理切片,观察肺癌成模情况及Anti-miR-214对肺癌治疗情况。
肺部肿瘤病理切片及评分
对所有肺组织进行病理切片观察。根据肉眼大体观察状况,取3个不同病变部位进行切片,根据肺部成瘤情况及严重程度,分为“-”表示镜下未见肿瘤灶;“±”表示轻微肿瘤灶;“+”表示轻度肿瘤灶;“++”表示中度肿瘤灶;“+++”表示重度肿瘤灶,并相应评分为0-4分。
1.3统计学处理
所有计量资料采用表示。采用SPSS 16.0软件包进行统计学分析处理,多组间比较采用方差分析F检验,组间比较采用成组t检验,P<0.05为具有统计学意义。
2.结果
2.1造模及给药期间动物一般状况观察
造模期间,所有动物生活状态良好,未见竖毛、目光呆滞、呼吸异常、活动迟缓、粪便异常等不良反应。造模后两周期间,动物体重均有增加,但与造模前相比无统计学差异(P>0.05)。给药期间,各给药组所有动物均未见药物引起的异常反应。给药期间,所有动物体重均出现不同程度的增加,且给药组体重增加较为明显,与造模前相比,从第3w开始具有显著的统计学差异(P<0.05);而阴性对照组(即模型组)增加较为缓慢,在第5w时才与给药前动物体重出现差异。
大、小剂量组动物体重与给药前(即第2w)相比,具有显著的统计学差异(P<0.05)。具体结果见图5。
2.2Anti-miR-214对小鼠Lewis肺癌治疗作用
C57BL/6小鼠Lewis肺癌造模2w后静脉注射给予Anti-miR-214治疗,给药期间,每3天一次,于末次给药后的第3天处死动物,采血、肺脏及肝脏。除部分肺脏用于Anti-miR-214含量测定外,其余肺脏与肝脏用福尔马林固定,进行组织病理切片检查该脏器肿瘤状况。具体结果见图6。从图6的结果可以看出,病理切片结果表明:所有各组肝脏切片未见有肿瘤灶。在肺部,各治疗组可见不同程度的片状核大深染的肿瘤细胞聚集灶。各给药组中,大剂量即5mg/kg micro-214对在体Lewis肺癌有很好的治疗作用,其分值与严重程度均较对照组轻,光镜下未见肿瘤灶个体鼠数也多于对照组;小剂量组即0.05mg/kg对原位Lewis肺癌亦有一定的治疗作用,可能与该品体内复制有关,结果见表6、7。
表6、Anti-miR-214对小鼠Lewis肺癌的治疗作用
表7、Anti-miR-214对Lewis肺癌的治疗作用
3.结论
给药期间,所有动物生活状况良好,未见与用药相关的异常反应,且给药组动物体重明显增加,与造模或给药前相比,有显著差异(P<0.05)。病理切片表明,各给药组肿瘤严重程度均较对照组有所减轻,Anti-miR-214在5mg/kg时抑瘤作用明显。
Anti-miR-214对在体小鼠Lewis肺癌有一定剂量依赖性的治疗作用,其中浓度到达5mg/kg治疗作用最明显,给药期间未见与用药相关的异常反应。
实施例7、临床实验
给乳腺癌转移终末期的志愿者注射anti-miR-214质粒,每周两次点滴,每次1mg。在开始用药一个月后检测志愿者的各项指标。
(1)anti-miR-214检测
具体结果见图7。从图7可以看出,肿瘤末期志愿者注射质粒后(治疗后),肿瘤末期志愿者血细胞和血浆中都能够检测到高含量的anti-miR-214,这充分说明通过静脉注射anti-miR-214质粒,确实可以在体内高表达anti-miR-214。
(2)血清中miR-214结果
图8显示了血清中miR-214的表达水平。从图8可以看出,注射质粒后,志愿者患者血清中miR-214相比于治疗前显著下降,几乎降至和正常人相当的水平,这不仅提示了注射anti-miR-214质粒可以在体内表达,而且还具有功能,能够吸附体内miR-214,从而使它的表达水平显著下降。
(3)肿瘤的变化情况
注射anti-miR-214质粒后,乳腺癌转移终末期志愿者的情况得到一定改善,肿瘤大小、体积没有变化,肿瘤没有发生转移,由此可见,miR-214抑制剂对肿瘤生长有抑制作用,miR-214抑制剂可用于肿瘤治疗。
实施例8前体miRNA适用于其他过表达载体
前体miRNA结构插入表达载体pcDNA3,构建的表达模块,同样有效的避免了有些内源miRNA表达时产生-3p,-5p的问题。pcDNA3图谱结构如图9所示。
1.anti-miR-214-5p序列
>anti-miR-214-5p
5’-ACUGCCUGUCUGUGCCUGCCUGU-3’(SEQ ID NO.:2)
2.anti-miR-214载体
2.1.Oligo DNA的设计与合成
根据anti-miR-214设计并合成2对互补ol igo DNA如实施例1中的2.1所述,即前体miRNA的结构。
2.2miRNA载体的构建与验证
具体操作步骤如实施例1中的2.2所述。过表达anti-miR-214的效率验证方法同实施例2。表8显示了利用Real-time PCR对anti-miRNA和miRNA表达水平进行测定。
表8、anti-miR-214-5p、anti-miR-214-3p、miR-214的表达水平
(Ct) | anti-miR-214-5p |
空白质粒 | 38.25±0.2564 |
anti-miR-214质粒 | 25.43±0.5123 |
(Ct) | anti-miR-214-3p |
空白质粒 | 31.25±0.4585 |
anti-miR-214质粒 | 32.89±0.6245 |
(Ct) | miR-214 |
空白质粒 | 21.03±0.5874 |
anti-miR-214质粒 | 24.08±0.1254 |
结论:在A549细胞中转染前体miRNA构建的其他过表达载体质粒后,能检测到anti-miR-214-5p的急剧上升(p<0.01),检测不到anti-miR-214-3p,且不会引起miR-214的上升,相反会导致miR-214下降(p<0.05)。前体miRNA结构插入其他表达载体,同样有效的避免了有些内源miRNA表达时产生-3p,-5p的问题。
对比例1
利用anti-miR-214构建与本发明不同的前体miRNA,将所构建的前体miRNA插入与本发明相同的载体pcDNATM 6.2。在A549细胞中转染anti-miR-214质粒,统一总RNA后分别利用从ABI公司定制的anti-miR-214-5p,anti-miR-214-3p,miR-214的引物q-PCR检测anti-miR-214-5p、anti-miR-214-3p、miR-214的水平。
1.anti-miR-214-5p序列
>anti-miR-214-5p
5’-ACUGCCUGUCUGUGCCUGCCUGU-3’(SEQ ID NO.2:)
2.anti-miR-214载体
2.1.Oligo DNA的设计与合成
根据基因序列设计并合成2对互补oligo DNA,序列见表9。
设计合成的oligo结构如下:
表9、oligo DNA序列及其对应的前体miRNA元件
2.2miRNA载体的构建与验证
具体操作步骤如实施例1中的2.2所述。结果见表10。
表10、anti-miR-214-5p、anti-miR-214-3p、miR-214的表达水平
(Ct) | anti-miR-214-5p |
空白质粒 | 35.92±0.1545 |
anti-miR-214质粒 | 26.45±0.1535 |
(Ct) | anti-miR-214-3p |
空白质粒 | 32.12±0.1657 |
anti-miR-214质粒 | 25.48±0.1456 |
(Ct) | miR-214 |
空白质粒 | 21.26±0.5652 |
anti-miR-214质粒 | 21.43±0.4586 |
从表10可以看出,在A549细胞中转染与本发明不同的前体miRNA质粒后,虽然能检测到anti-miR-214-5p的急剧上升(p<0.05),但是anti-miR-214-3p表达水平也非常高(p<0.05),且miR-214水平没有发生显著改变。这是因为与本发明不同的前体miRNA质粒不仅能够表达anti-miR-214-5p,也能够表达anti-miR-214-3p,由于竞争性结合,大量的anti-miR-214-5p被anti-miR-214-3p吸附,从而不能降低miR-214的表达水平。
实施例9
重复实施例1和2,不同在于:将A2的结构从CAGG改为CAGGA。
结果表明,将A2的结构从CAGG改为CAGGA,F5/F3之比进一步上升了约50%。这表明,采用CAGGA更有助于提高F5/F3之比。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (12)
- 一种药物制剂,其特征在于,所述的制剂含有:(a)用于表达anti-miRNA和/或siRNA的表达载体;以及(b)药学上可接受的载体。
- 一种施用药物的方法,其特征在于,包括步骤:将权利要求1所述的药物制剂施用于哺乳动物的第一部位,从而使得所述表达载体在所述哺乳动物体内被加工形成微粒子(microvesicle),并被运输到所述哺乳动物的第二部位,并在所述的第二部位表达所述的anti-miRNA和/或siRNA。
- 一种前体序列,其特征在于,其5'至3'端具有式I所示的结构:B1为所需要的第一核糖核酸序列,其中所述的第一核糖核酸序列包括anti-miRNA序列形式或siRNA序列形式;B2为与B1基本互补或完全互补的序列,且B2与C不互补;C为茎环结构序列;A1和A2分别为无,或任选的由4-5个碱基组成的RNA序列;其中,所述前体能在宿主中表达(或产生或富集)所述的第一核糖核酸序列,而不表达(或产生或富集)与所述第一核糖核酸序列互补的第二核糖核酸序列。
- 如权利要求3所述的前体序列,其特征在于,其5'至3'端具有式I所示的结构:B1为anti-miRNA-214-5p;B2为与B1基本互补或完全互补的序列,且B2与C不互补;C为茎环结构序列,优选为SEQ ID NO.:1所示的序列;A1和A2分别为无,或任选的由4-5个碱基组成的RNA序列;其中,所示的前体序列能在宿主中加工形成anti-miRNA-214,且在所述anti-miRNA-214中,只表达anti-miRNA-214-5p,不表达anti-miRNA-214-3p。
- 如权利要求4所述的前体序列,其特征在于,所述的基本互补指所述B2 与B1有2-8个碱基不互补,较佳地,所述B2与B1有3-5个碱基不互补;更佳地,所述的B2较B1缺失1-2个碱基。
- 如权利要求4所述的前体序列,其特征在于,所述的A1为UGCUG;和/或所述的A2为CAGG或CAGGA。
- 一种多核苷酸,其特征在于,所述的多核苷酸能被宿主转录形成权利要求4中所述的前体序列。
- 一种表达载体,其特征在于,所述的表达载体含有权利要求4所述的前体序列或权利要求7所述的多核苷酸。
- 一种药物组合物,其特征在于,所述的药物组合物含有权利要求4所述的前体序列、或权利要求8所述的表达载体,和药学上可接受的载体。
- 如权利要求9所述的药物组合物,其特征在于,所述的药物组合物为权利要求8所述的表达载体,较佳地,为含有权利要求4所述前体序列的质粒;和/或所述药物组合物的剂型包括片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液、混悬液、乳剂、混悬剂、注射液、或粉针剂;较佳地,所述的剂型为注射剂,如静脉注射剂、腹腔注射剂。
- 如权利要求9所述的药物组合物,其特征在于,所述的药物组合物的施用方法包括:口服、呼吸道、注射、透皮、粘膜或腔道给药;较佳地,所述施用方法包括直接注射质粒。
- 权利要求4所述前体序列、或权利要求8所述表达载体的用途,其特征在于,(i)用于制备miRNA-214的抑制剂;和/或(ii)用于制备抗miRNA-214高表达恶性肿瘤的药物组合物;较佳地,所述的恶性肿瘤包括肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、结直肠癌、宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、或乳腺癌。
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