CN112980838A - 一种靶向型针对PTP1B的siRNA及其前体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种靶向型针对PTP1B的siRNA及其前体和应用，具体地，本发明提供了一种siRNA前体序列以及由其产生的siRNA，本发明的siRNA及其前体可有效(a)预防和/或治疗肥胖相关疾病；(b)预防和/或治疗心血管相关疾病；和/或(c)预防和/或治疗代谢异常相关疾病。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及种靶向型针对PTP1B的siRNA及其前体和应用。
背景技术
随着社会的发展，生活条件的改善，肥胖逐渐成为困扰健康问题的一类疾病。从1975年到2014年，在这过去的40年里，全世界的肥胖总人口数飞速增长：从1975年的一亿五百万上升至2014年的六亿四千一百万，而中国的肥胖人数居全球首位。在肥胖高发的几十年里，糖尿病的发病率也增加了90％，大多数情况下二者偶联发生。除此之外，越来越多的研究还表明肥胖和多种癌症发生存在密切联系。因此，寻找安全有效无毒副作用的减肥方法十分必要。
PTP1B是一个重要的肥胖、2型糖尿病药物靶点。PTP1B-/-小鼠能抵抗高脂诱导导致的体重增加，同时较正常小鼠表现出更高的胰岛素敏感性；神经系统的PTP1B发挥主要的代谢调控作用，可以同时调节胰岛素信号通路和瘦素信号通路，对体重和血糖都有很好的控制作用。目前对PTP1B抑制分子的开发主要分为两类，小分子抑制剂和RNA干扰药物。小分子抑制剂特异性差，容易结合与PTP1B同源的其他蛋白，而且很难通过血脑屏障，因此对肥胖和2型糖尿病的改善作用非常有限；RNA干扰药物特异性好，但是不稳定，易降解且生产成本高，同样存在不能通过血脑屏障的问题。
因此本领域迫切需要开发一种能够调控PTP1B活性或表达量的siRNA。
发明内容
本发明提供了一种能够调控PTP1B活性或表达量的siRNA。
本发明第一方面提供了一种前体序列，其5’至3’端具有式I所示的结构：
B1为所需要的第一核糖核酸序列，其中所述的第一核糖核酸序列包括PTP1BsiRNA正义链序列；
B2为与B1基本互补或完全互补的序列，且B2与C不互补；
C为茎环结构序列；
其中，所述PTP1B siRNA正义链的核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、或其组合。
在另一优选例中，所述前体序列如SEQ ID NO.:5所示。
本发明第二方面提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成本发明第一方面所述的前体序列。
本发明第三方面提供了一种表达载体，所述的表达载体含有本发明第一方面所述的前体序列或本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的表达载体还含有编码狂犬病毒表面糖蛋白短肽(RVG肽)的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的表达载体包括病毒载体、非病毒载体。
在另一优选例中，所述的表达载体为质粒。
本发明第四方面提供了一种药物制剂，所述的制剂含有：
(a)用于表达抑制PTP1B基因表达的siRNA的表达载体；以及
(b)药学上可接受的载体；
其中，所述的表达载体含有表达本发明第一方面所述的前体序列或本发明第二方面所述的多核苷酸，或表达本发明第一方面所述的前体序列。
在另一优选例中，所述的表达载体还含有编码狂犬病毒表面糖蛋白短肽(RVG肽)的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的制剂为液体剂型。
在另一优选例中，所述的制剂为注射剂。
在另一优选例中，所述的表达载体包括质粒。
在另一优选例中，所述的表达载体或质粒含有启动子、复制起点和标记基因。
在另一优选例中，所述的表达载体中含有表达PTP1B siRNA的表达盒。
在另一优选例中，所述的表达盒(即多核苷酸)为双链，并且具有以下结构：
启动子-attB1-任选的RVG-任选的标签蛋白(如Lamp2b)-5’siRNA侧翼区序列-式I所示的序列-3’siRNA侧翼区序列-attB2。
在另一优选例中，所述的制剂为脂质体或外泌体制剂。
本发明第五方面提供了一种抑制PTP1B基因表达的siRNA，所述siRNA的正义链核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO:1、2、3、4、或其组合。
本发明第六方面提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有本发明第一方面所述的前体序列、或本发明第三方面所述的表达载体，和药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括PTP1B siRNA质粒。
在另一优选例中，所述的药物组合物为本发明第三方面所述的表达载体，较佳地，为含有本发明第一方面所述前体序列的质粒。
在另一优选例中，所述的药物组合物还包括其他(a)预防和/或治疗肥胖相关疾病；(b)预防和/或治疗心血管相关疾病；和/或(c)预防和/或治疗代谢异常相关疾病的药物。
在另一优选例中，所述其他(a)预防和/或治疗肥胖相关疾病；(b)预防和/或治疗心血管相关疾病；和/或(c)预防和/或治疗代谢异常相关疾病的药物选自下组：奥利司、二甲双胍、卡托普利、卡维地洛片、格列奇特、二甲双胍、或其组合。在另一优选例中，所述的药物组合物为权利要求3所述的表达载体，较佳地，为含有权利要求1所述前体序列的质粒。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括：
片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液、混悬液、乳剂、混悬剂、注射液、或粉针剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型还包括喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、挥发性液体、外用溶液剂、洗剂、浇淋剂、搽剂、巴布膏剂、膏药、橡胶膏剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂或栓剂。
在另一优选例中，所述的剂型为注射剂，较佳地，为静脉注射剂、腹腔注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物的施用方法包括：口服、呼吸道、注射、透皮、粘膜或腔道给药；较佳地，所述施用方法包括直接注射质粒。
本发明第七方面提供了本发明第六方面所述siRNA、本发明第一方面所述前体序列、或本发明第三方面所述表达载体的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于(a)预防和/或治疗肥胖相关疾病；(b)预防和/或治疗心血管相关疾病；和/或(c)预防和/或治疗代谢异常相关疾病。
在另一优选例中，所述肥胖相关疾病选自下组：肥胖、高血脂、或其组合。
在另一优选例中，所述心血管相关疾病选自下组：高血压、动脉粥样硬化、或其组合。
在另一优选例中，所述代谢异常相关疾病选自下组：糖尿病、脂肪肝、或其组合。
在另一优选例中，所述组合物或制剂还用于选自下组的一种或多种用途：
(i)降低肝脏、下丘脑组织中PTP1B的表达水平；和/或
(iii)提高哺乳动物的基础代谢水平；和/或
(iii)减缓哺乳动物的体重增长速度；和/或
(iv)提高哺乳动物的胰岛素的敏感性；和/或
(v)提高哺乳动物的瘦素的敏感性；和/或
(vi)降低哺乳动物的总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平；和/或
(vii)提高哺乳动物的高密度脂蛋白水平；和/或
(viii)减少血脂积累；和/或
(ix)减少肝脏中的脂肪积累。
在另一优选例中，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括：啮齿动物(如鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。
本发明第八方面提供了一种(a)预防和/或治疗肥胖相关疾病；(b)预防和/或治疗心血管相关疾病；和/或(c)预防和/或治疗代谢异常相关疾病的方法，将安全有效量的本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的药物制剂、或本发明第六方面所述的药物组合物施用于所需对象，从而(a)预防和/或治疗肥胖相关疾病；(b)预防和/或治疗心血管相关疾病；和/或(c)预防和/或治疗代谢异常相关疾病。
在另一优选例中，所述施用的剂量为1－20mg/kg，较佳地，为5－10mg/kg。
在另一优选例中，所述施用频率为12小时－72小时，较佳地，12小时－24小时。
在另一优选例中，所述施用包括：口服、呼吸道、注射、透皮、粘膜或腔道给药；
在另一优选例中，所述施用包括注射质粒。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是本发明的质粒骨架图。
图2是质粒分子体外干扰效率检测和细胞毒性检测；按照图1所示方法构建4个不同干扰序列的质粒，利用细胞实验筛选干扰效率最高的质粒分子并检测其细胞毒性。A：不同质粒分子分别转染细胞，并利用western检测PTP1B的表达水平；B：western定量图；C：CCK-8实验检测质粒的细胞毒性；其中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.005。
图3是质粒分子表达的siRNA在不同组织的分布以及对PTP1B的抑制效果；其中，A：注射质粒12小时后，小鼠肝组织中siRNA的原位杂交检测结果，蓝色荧光为DAPI，绿色荧光为PTP1B siRNA，control指对照质粒；B：注射质粒12小时后，小鼠下丘脑组织中siRNA的原位杂交检测结果，蓝色荧光为DAPI，绿色荧光为PTP1B siRNA；C：每两天注射一次质粒，注射七次后利用western检测小鼠肝组织和下丘脑组织的PTP1B水平。
图4是质粒分子对高脂诱导的肥胖小鼠体重、食量、体长、脂肪含量的影响。其中，将高脂诱导的肥胖小鼠平均分组，每两天注射一次对照质粒或PTP1B siRNA/RVG质粒，为期3周，结束后检测小鼠的体重等指标。A：质粒给药期间肥胖小鼠的体重的变化曲线；B：质粒给药对肥胖小鼠食量的影响；C：质粒给药对肥胖小鼠体长的影响；D：质粒给药对小鼠性腺脂肪重的影响；其中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.005。
图5是质粒分子对高脂诱导的肥胖小鼠的胰岛素敏感性、葡萄糖耐受和瘦素敏感性的影响。其中，给药结束后对实验小鼠进行了ITT、GTT、瘦素敏感性检测，同时检测了小鼠血清瘦素含量和血清胰岛素含量。A：质粒给药对小鼠胰岛素敏感性的影响；B：质粒给药对小鼠葡萄糖耐受的影响；C、D：质粒给药对小鼠瘦素敏感性的影响，C为小鼠体重变化图，D为小鼠食量变化图；E：质粒给药对小鼠血清瘦素含量的影响；F：质粒给药对小鼠血清胰岛素含量的影响；其中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.005。
图6是代谢笼检测质粒分子对高脂诱导的肥胖小鼠的氧气消耗、呼吸交换比、活动量和产热量的影响。其中，A-B：质粒给药对小鼠氧气消耗的影响，A：氧气消耗折线图，B：氧气消耗统计图；C-D：质粒给药对小鼠呼吸交换比的影响，C：呼吸交换比折线图，D：呼吸交换比统计图；E-F：质粒给药对小鼠活动量的影响，E：小鼠活动量折线图，F：小鼠活动量统计图。G-H：质粒给药对小鼠产热量的影响，G：小鼠产热折线图，H：小鼠产热统计图；其中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.005。
图7是质粒分子对高脂诱导的肥胖小鼠的血脂四项的影响。其中，A-D：质粒给药对小鼠血脂含量的影响，A：总胆固醇含量，B：甘油三酯含量，C：高密度脂蛋白含量，D：低密度脂蛋白含量；其中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.005。
图8是质粒分子对高脂诱导肥胖小鼠脂肪肝的改善状况。
图9是质粒分子的体内安全性检测。其中，A：质粒给药对高脂诱导肥胖小鼠血清谷丙转氨酶含量的影响；B：质粒给药对高脂诱导肥胖小鼠血清谷草转氨酶含量的影响。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次筛选了大量核酸序列，首次发现某些特定siRNA对于PTP1B具有非常高的抑制能力。
并且本发明首次制备了一种能够高效表达PTP1B siRNA的前体siRNA。本发明前体siRNA经过宿主细胞的加工后，能够高效地表达siRNA,从而有效地避免了目的序列的反向互补序列对目的序列发挥功能的干扰作用。实验证明，本发明前体siRNA能够在体内有效表达PTP1B siRNA序列，并对肥胖相关疾病；心血管相关疾病；和/或代谢异常相关疾病都具有更有效的治疗作用。在此基础上，本发明人完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文使用的，术语“宿主”、“受试者”、“所需对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类，如牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊、骆驼、大鼠、小鼠、野兔和家兔。
狂犬病毒糖蛋白
狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein,RVG)是一种嗜神经性的蛋白质，能够与神经细胞表达的乙酰胆碱受体相结合。狂犬病毒为弹状病毒科狂犬病毒属，具有囊膜的单股负链RNA病毒。该病毒主要编码糖蛋白G，G蛋白以三聚体的形式锚定于病毒囊膜表面，并能够与细胞表面的受体结合，介导膜融合使病毒侵入细胞。同时，G蛋白是狂犬病毒主要的抗原蛋白，刺激机体产生中和抗体。RVG肽特异性结合神经元细胞所表达的胆碱体，RVG靶点在细胞膜外表达，引导外泌体通过血脑屏障，运输到神经细胞。
siRNA及其前体
如本文所用，所述的“siRNA”是指一类RNA分子，从可形成siRNA前体的转录物加工而来。成熟的siRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的siRNA分子。siRNA通常可被Northern印迹检测到。
人来源的siRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
值得说明的是，siRNA一般通过模拟miRNA产生机制来产生的，这样的siRNA就可从前体RNA(Precursor RNA，Pre-RNA)加工而来。所述的前体RNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体RNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体RNA可以是天然的或是人工合成的。
在本发明中，所述的前体siRNA为人工合成的前体siRNA，且所述的前体siRNA具有式I所示的结构：
作为代表性的例子，B1为PTP1B siRNA正义链序列；
B2为与B1互补(包括基本互补和完全互补)的序列；
C为茎环结构；
其中，所示的前体siRNA能在宿主中加工形成PTP1B siRNA。
在本发明中，形成PTP1B siRNA的前体miRNA可被剪切生成调节PTP1B基因的siRNA，即PTP1B siRNA(例如，SEQ ID NO.:1、2、3、4)。
SEQIDNO1:ACAUGUGUUUGGUAAAGGGCC
SEQIDNO2:GAUUAGUGUCAACUUCAAACC
SEQIDNO3:UCUUGUCCAUCAGUAAGAGGC
SEQIDNO4:CUAACUUCAGUGUCUGGACUC。
前体RNA可被剪切生成siRNA，所述的siRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。在式I中，B2和B1为基本互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。
在一优选实施方式中，本发明的前体序列如SEQ ID NO.:5所示：
SEQIDNO5:GCTAACTTCAGTGTCTGGACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTCCAGACTGAAGTTAGC。
如本申请所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
本发明中，“茎环结构”可存在于式I所示前体siRNA的末端，例如由于B1和B2形成基本互补后，C会形成一固定的末端茎环结构；所述的“茎环结构”还可存在于式I所式前体siRNA内部，例如由于B1和B2之间并非完全互补，造成未互补结合的B1或B2的碱基会形成一内部的茎环(internal loop)。
本发明所述的siRNA是指：抑制PTP1B的siRNA家族的微小RNA，所述抑制PTP1B的siRNA家族的微小RNA包括：抑制PTP1B的siRNA或经修饰的抑制PTP1B的siRNA衍生物。
在本发明的一个优选例中，抑制PTP1B的siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1-4所示，分别对应于si-1、si-2、si-3、si-4。特别优选的是SEQ ID NO.:4。
本发明还包括siRNA变体和衍生物。此外，广义上的siRNA衍生物也可包括siRNA变体。本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对抑制酪氨酸激酶的siRNA进行修饰，修饰方式包括(但不限于)：甲基化修饰、烃基修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、核酸修饰(如“TT”修饰)等。
多核苷酸构建物
根据本发明所提供的siRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的siRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的siRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体RNA，所述的前体RNA可被人细胞剪切且表达成所述的siRNA。
作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有一个或多个式II所示的结构单元：
Seq正向-X-Seq反向
式II
式II中，
Seq正向为可在细胞中表达成所述的抑制PTP1B的siRNA的核苷酸序列，Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq反向为可在细胞中表达成所述的siRNA的核苷酸序列，Seq正向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
其中，各结构单元可表达相同或不同的siRNA；
式II所示的结构在转入细胞后，形成式III所示的二级结构：
式III中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述；
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的siRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
在本发明中，所述表达载体没有特别限制，包括市售的或用常规制备的表达载体。代表性的例子包括(但并不限于)：pcDNATM6.2-GW/miR、pcDNA3、pMIR-REPORT miRNA、pAdTrack-CMV、pCMVp-NEO-BAN、pSV2、CMV4表达载体、pmiR-RB-ReportTM、pshOK-basic、mmu-mir 300-399miRNASelectTM、pshRNA-copGFP Lentivector、GV317、GV309、GV253、GV250、GV249、GV234、GV233、GV232、GV201、GV159或其他GV系列真核表达载体。在另一优选例中，在所述表达载体中，与所述表达所述前体siRNA多核苷酸操作性相连的启动子包括组成型启动子或组织特异性启动子，优选Pcmv启动子。换言之，这些启动子用于驱动前体siRNA的表达。
代表性的启动子包括(但并不限于)：Pcmv启动子、U6、H1、CD43启动子、CD45(LCA)启动子、CD68启动子、Endoglin(CD105)启动子、Fibronectin启动子、Flt-1(VEGFR-1)启动子、GFAP启动子、GPIIb(IntegrinαI Ib)启动子、ICAM-2(CD102)启动子、MB(Myoglobin)启动子、NphsI(Nephrin)启动子、SPB启动子、SV40/hAlb启动子、SYN1启动子、WASP启动子或其组合。
药物组合物及施用方法
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、微粒子(micro particle)、微泡(micro vesicle)、外泌体(exosomes)、脱落囊泡(sheddingvesicle)、纳米胶囊(Nanocapsules/Nanoparticles)、β环糊精胶囊(β-cyclodextriniclusion compound)蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
在本发明中，可将所述的表达载体直接施用于对象，也可将所述的表达载体与药学上可接受的载体制备成药物组合后进行施用。所述的施用包括静脉注射。
治疗方法
本发明还提供了一种(a)预防和/或治疗肥胖相关疾病；(b)预防和/或治疗心血管相关疾病；和/或(c)预防和/或治疗代谢异常相关疾病的方法，即，将安全有效量的本发明表达载体或药物组合物施用于所需对象，从而(a)预防和/或治疗肥胖相关疾病；(b)预防和/或治疗心血管相关疾病；和/或(c)预防和/或治疗代谢异常相关疾病。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明首次开发了针对PTP1B特异性设计的siRNA序列，可有效抑制肝脏、下丘脑中PTP1B的表达，还可(a)预防和/或治疗肥胖相关疾病；(b)预防和/或治疗心血管相关疾病；和/或(c)预防和/或治疗代谢异常相关疾病。
(b)本发明前体siRNA能够有效的避免在过表达目的序列得同时也过表达目的序列得反向互补序列，从而有效避免了目的序列得反向互补序列对目的序列发挥功能的干扰作用。
(c)本发明将前体PTP1B siRNA与RVG多肽联用，从而更有效地(a)预防和/或治疗肥胖相关疾病；(b)预防和/或治疗心血管相关疾病；和/或(c)预防和/或治疗代谢异常相关疾病。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明实施例中所用原料或仪器，若非特别说明，均市售可得。
通用方法
1.细胞增殖实验使用CCK-8试剂检测。按照传代比例将细胞种入六孔板中，待细胞密度合适时，进行核酸转染。待细胞换液时将细胞消化下来，并计数。按照每孔100μL悬液，5000-10000个细胞的比例用2％DMEM重悬细胞，每个样设置6个重复，按照时间点种5块96孔板。在铺板后的第12、24、36、48、60小时，分别取出一块板。吸弃培液，加入100μL稀释后的CCK-8试剂(cck-8试剂与2％DMEM培液的比例为1:9)，然后放回培养箱孵育。2小时取出，用酶标仪测定450nm处的OD值。每个样品以12小时的平均OD值作为基点，绘制增值曲线。
2.ITT(胰岛素敏感性)实验1、开始实验前，需将小鼠禁食6小时；注：禁食时需将小鼠的垫料、食槽、饮用水全部更换，防止影响实验结果。2、禁食5.5小时左右时，将所有待测小鼠称重，计算胰岛素用量；注：普通小鼠、高脂小鼠、ob/ob小鼠的胰岛素用量分别为：0.75U/kg，1U/kg，1U/kg 3、将待测小鼠分开放置，不要弄混，待6小时到时按照顺序剪尾尖测血糖值，记录数据，此时为0min数据。4、按照体重分别腹腔给予胰岛素，所有小鼠匀速在15min内注射完；5、从第一只小鼠注射胰岛素结束开始计算时间，分别在15min、30min、45min、60min、90min、120min测量小鼠血糖并记录；6、实验结束后，将小鼠放回笼子，并添加饲料。7、每只小鼠以自己0min的血糖为100％，分别计算其他各个时间点的血糖百分数，每组小鼠相同时间点百分数再取平均值，绘制ITT血糖曲线。
3.GTT(葡萄糖耐量)实验1、实验前一天晚上九点左右，将待测小鼠禁食过夜，同样更换新的垫料、食槽、饮用水；2、第二天上午九点左右，将所有待测小鼠称重，计算葡萄糖用量，所有小鼠的葡萄糖用量都是1g/kg；3、将待测小鼠分开放置，不要弄混，按照顺序剪尾尖测血糖值，记录数据，此时为0min数据。4、按照体重分别腹腔给予葡萄糖，所有小鼠匀速在15min内注射完；5、从第一只小鼠注射葡萄糖结束开始计算时间，分别在15min、30min、60min、90min测量小鼠血糖并记录；6、实验结束后，将小鼠放回笼子，并添加饲料。7、将数据所得血糖值换算成以mg/dl为单位的数值，(测量数据单位为mmol/L)组内同一个时间点取平均值绘制不同组的GTT曲线。
4.瘦素敏感性实验1、将待测小鼠分开放置，每笼1只，添加定量饲料，适应2天；2、正式实验前两天开始，每天上午8:30测量每只小鼠体重和食量。3、正式实验(第0天)当天和第1天8:30测量体重、食量，9:00am和7:00pm分别给每只小鼠按照0.5mg/kg的剂量腹腔注射稀释好的瘦素。4、第2天-第5天不再给予瘦素，只在上午8:30测量体重和食量。5、以实验前两天的平均体重和食量作为100％，之后每天的数据分别取百分数，组内小鼠的百分数平均数绘制曲线。
5.血清胰岛素酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，elisa)1、实验开始前半小时，将试剂盒取出恢复室温2、根据实验样品数，取适量10×Wash Buffer用双蒸水稀释到1×；3、计算样品量(包括标准品和质检孔)，将所需的板条取出，安装到配套微孔板架上，其余未用板条装回到锡箔袋中，4-8℃保存。每个样品孔用300μL稀释好的wash buffer洗涤三次，并弃掉多余液体，在吸水纸上拍干；4、在空白孔和样品孔中每空加10μL Assay Buffer；5、在空白孔、标准品孔、和对照孔中每空加入10μL Matrix Solution；6、标准品孔中按照顺序每空加10μL不同浓度标准品；7、质检孔1和质检孔2中分别加10μL相应质检液；8、在样品孔中加入10μL样品；注：根据样品来源不同，可能需要稀释样品，在本实验中正常小鼠血清样品不需要稀释，高脂小鼠稀释2-5倍，ob/ob小鼠稀释5-10倍；9、在每个待测孔中加80μL检测抗体，并用封板膜封板，摇床室温孵育2小时；10、2小时后，弃掉液体，用稀释好的wash buffer洗涤三次，每次都要弃净残留液体，在吸水纸上拍干；11、在孔中加入100μL Enzyme Solution，封板，摇床孵育30min；12、30min后，弃掉液体，用稀释好的washbuffer洗涤六次，每次都要弃净残留液体并在吸水纸上拍干；13、每孔加入100μLSubstrate Solution，封板，摇床孵育20min；14、每孔加入100μL Stop Solution，轻微混匀，不要产生气泡，在450nm和590nm
6.血清瘦素酶联免疫吸附测定1、试剂准备：检测之前，将所有试剂取出恢复室温；取适量20×浓缩洗液，用蒸馏水稀释成1×洗液，混匀取适量10×浓缩检测缓冲液，用蒸馏水稀释成1×检测缓冲液，混匀根据总样品数目(样品和标准品)用1×检测缓冲液按照1:100稀释浓缩抗体，并在30min内使用根据总样品数目用1×检测缓冲液按照1:100稀释试剂盒中提供的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，并在30min内使用不同来源样品在测量时需要用1×检测缓冲液进行稀释，本实验所用正常小鼠和高脂诱导小鼠检测血清瘦素含量时稀释10-20倍。小鼠瘦素标准品离心后用一定量蒸馏水稀释，形成8000pg/mL标准品，静置20min后用标准品稀释液按照2倍倍比稀释，形成0、62.5、125、250、500、1000、2000、4000、pg/mL的标准品梯度；2、将不用板条取下，放回铝箔袋中并重新封好封口；3、加入300μL稀释好的1×洗液，放置30秒并弃掉洗液，尽量将孔板里的水分在吸水纸上拍干，为了防止孔板干燥造成测量误差，洗板结束后需要立即使用；4、按照梯度将标准品加入到孔中，每孔100μL；5、将样品与1×检测缓冲液按照1:9混合，取100μL混合液加入到样品孔中；6、每孔加入50μL稀释的检测抗体，保证4-6步骤连续加样，15min内完成；7、封板，置于摇床上孵育，室温2小时；8、弃掉孔板中液体，每个孔加入约300μL洗液洗板，然后在吸水纸上拍干，重复洗涤6次。9、每孔加入100μL稀释好的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素；10、封板，置于摇床上孵育，室温45min；11、重复步骤8；12、每个孔加入100μL显色底物TMB，避光孵育，室温20min；13、每孔加入100μL终止液。轻叩板框，充分混匀；14、立即使用酶标仪进行双波长检测，测定450nm、570nm下的OD值；
7.血清总胆固醇/甘油三酯含量测定
血清总胆固醇、甘油三酯测定步骤相同，使用各自试剂盒中试剂即可。
8.血清高密度脂蛋白/低密度脂蛋白含量测定
血清高密度脂蛋白、低测定步骤相同，使用各自试剂盒中即可。
实施例1 PTP1B siRNA/RVG质粒的构建以及干扰效率、安全性的检测
利用限制性内切酶对对照质粒进行处理，回收线性载体后，利用T4连接酶将RVG-PTP1B siRNA组合片段与载体进行连接；得到的连接产物进行转化实验并涂布于抗性平板；第二天挑取单克隆，测序确定质粒序列的正确性。按照这种方法，将4个含有不同的针对PTP1B的组合片段连入载体，构成质粒分子，分别命名为PTP1B si-1、PTP1B si-2、PTP1Bsi-3、PTP1B si-4(图1)。
将四种质粒分子分别转染汇合度60-70％的小鼠肝癌细胞系Hepa1-6，30小时后利用western实验检测细胞中PTP1B的表达水平。结果表明PTP1B si-4对PTP1B蛋白的干扰效率最高(图2A-B)。
将干扰效率最高的质粒和对照质粒分别转染汇合度60-70％的Hepa1-6，6-8小时后将细胞消化下来，并计数。按照每孔100μL悬液，5000个细胞的比例用2％DMEM重悬细胞，每个样设置6个重复，按照时间点种4块96孔板。在0、12、24、36小时，分别取出一块板。吸弃培液，加入100μL稀释后的CCK-8试剂(cck-8试剂与2％DMEM培液的比例为1:9)，然后放回培养箱孵育。2小时取出，用酶标仪测定450nm处的OD值。每个样品以12小时的平均OD值作为基点，绘制增值曲线(图2C)。结果表明，干扰质粒对细胞生长增殖没有毒性作用。
实施例2质粒表达的siRNA在体内分布以及对PTP1B的抑制效果
将对照质粒和PTP1B siRNA-4/RVG质粒按照10mg/kg的剂量对正常小鼠进行尾静脉注射；12小时后，处死小鼠，取小鼠的肝组织和下丘脑组织分别进行原位杂交实验。在本组实验中，将与PTP1B siRNA-4序列完全互补配对的序列添加绿色荧光修饰作为检测探针，以指示siRNA-4在组织切片中的分布情况；结果表明，在小鼠的肝脏组织中有大量siRNA-4的分布(图3A)，而在下丘脑组织中也能检测到siRNA-4，证明PTP1B siRNA-4/RVG质粒确实具有脑靶向的效果(图3B)。
为了证明这些分布的siRNA是否能够在体内有效抑制PTP1B的表达情况，我们同样按照10mg/kg的剂量将对照质粒和PTP1B siRNA-4/RVG质粒对小鼠进行尾静脉注射，每两天注射一次，共注射7次，最后一次注射24小时后处死小鼠，同样取小鼠的肝组织和下丘脑组织进行western实验。结果表明，质粒分子在体内可以有效降低肝脏、下丘脑组织中PTP1B的表达水平(图3C)。
实施例3 PTP1B siRNA-4/RVG质粒对高脂诱导的肥胖小鼠的代谢改善效果
为了进一步确认PTP1B siRNA-4/RVG质粒在体内的治疗效果，利用高脂诱导的肥胖小鼠模型作为实验对象，确认PTP1B siRNA-4/RVG质粒对代谢异常的改善效果。
将高脂诱导的肥胖小鼠按照体重平均分为两组，分别按照10mg/kg的剂量注射对照质粒和PTP1B siRNA-4/RVG质粒。每两天注射一次，共注射三周。注射期间，每两天测量一次体重、食量，并在给药结束后检测其他代谢相关指标。
结果表明，在为期三周的治疗过程中，PTP1B siRNA-4/RVG质粒注射小鼠体重增长速度明显低于对照质粒注射小鼠(图4A)，性腺脂肪重也明显减轻(图4D)；而两组小鼠的食量和体长没有明显差异(图4B-C)，表明PTP1B对小鼠体重的调控作用是不依赖于摄食减少。
高脂诱导的肥胖模型通常都表现为胰岛素抵抗和瘦素抵抗，提高两者的敏感性对于改善肥胖造成的代谢紊乱有重要意义。对两组小鼠的胰岛素敏感性进行检测发现，PTP1BsiRNA-4/RVG质粒注射小鼠对胰岛素刺激反应更加迅速、剧烈，表现为血糖下降速度更快(图5A)；同时对葡萄糖刺激反应更加缓和，表现为血糖上升速度更慢(图5B)。而在瘦素敏感性实验中，PTP1B siRNA-4/RVG注射小鼠对于外源瘦素的刺激，无论是食量还是体重都比对照组出现了明显的下降(图5C-D)。胰岛素抵抗和瘦素抵抗另一个重要的表现就是血清中胰岛素、瘦素含量代偿性上升，改善后含量则会随之降低。对这两组小鼠血清胰岛素含量、瘦素含量的检测发现，PTP1B siRNA-4/RVG质粒注射小鼠血清中两者水平均明显下降，表明机体对两者的反应敏感程度增加(图5E-F)。
由于PTP1B对体重的调节是不依赖于减少摄食，猜测有可能是通过增加能量代谢。因此，又利用代谢笼对小鼠的基础代谢、活动量和产热等指标进行检测。结果表明，PTP1BsiRNA-4/RVG质粒注射小鼠相比于对照组小鼠其氧气消耗量明显增加(图6A-B)，而呼吸商则明显下降(图6C-D)，表明，这组小鼠在正常生理状态下，基础代谢率更高，且比对照组小鼠更倾向于利用脂肪作为自己的能量来源。不仅如此，PTP1B siRNA-4/RVG质粒注射小鼠的活动量(图6E-F)和产热量(图6G-H)也有一定量的增加。这组结果很好的解释了PTP1BsiRNA-4/RVG质粒注射小鼠体重增长率低的原因。
高血脂也是肥胖的一个重要表征。通过检测小鼠的血脂四项发现，PTP1B siRNA-4/RVG质粒注射小鼠的总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白明显下降(图7A-B、D)，而“清道夫”高密度脂蛋白含量一定程度的增加(图7C)。该结果表明小鼠的糖脂代谢得到改善，血脂积累减少。
高脂诱导的肥胖小鼠因为过量脂肪的摄入，导致机体脂肪的大量积累，在肝脏的HE染色切片中会有脂肪变性造成的空泡。而PTP1B siRNA-4/RVG质粒注射小鼠的肝组织切片中空泡明显减少，表明肝脏中脂肪积累减少，脂肪肝改善(图8)。
为了检测该治疗手段的安全性，我们又检测了未处理高脂小鼠、对照组小鼠和实验组小鼠血清中转氨酶的水平。结果显示，三组小鼠的谷丙转氨酶和谷草转氨酶的含量没有明显差异，表明尾静脉注射质粒不会造成肝损伤，是一种比较安全的给药方式(图9A-B)。
在本发明中，注射PTP1B siRNA-1/RVG质粒、PTP1B siRNA-2/RVG质粒、PTP1BsiRNA-3/RVG质粒也可获得PTP1B siRNA-4/RVG质粒类似的效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 南京大学
<120> 一种靶向型针对PTP1B的siRNA及其前体和应用
<130> P2019-0391
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
acauguguuu gguaaagggc c 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
gauuaguguc aacuucaaac c 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
ucuuguccau caguaagagg c 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
cuaacuucag ugucuggacu c 21
<210> 5
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
gctaacttca gtgtctggac tcgttttggc cactgactga cgagtccaga ctgaagttag 60
c 61
Claims (10)
1.一种前体序列，其5’至3’端具有式I所示的结构：
B1为所需要的第一核糖核酸序列，其中所述的第一核糖核酸序列包括PTP1B siRNA正义链序列；
B2为与B1基本互补或完全互补的序列，且B2与C不互补；
C为茎环结构序列；
其中，所述PTP1B siRNA正义链的核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、或其组合。
2.如权利要求1所述的前体序列，其特征在于，所述前体序列如SEQ ID NO.:5所示。
3.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸能被宿主转录形成权利要求1所述的前体序列。
4.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求1所述的前体序列或权利要求3所述的多核苷酸。
5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体还含有编码狂犬病毒表面糖蛋白短肽(RVG肽)的多核苷酸。
6.一种药物制剂，其特征在于，所述的制剂含有：
(a)用于表达抑制PTP1B基因表达的siRNA的表达载体；以及
(b)药学上可接受的载体；
其中，所述的表达载体含有表达权利要求1所述的前体序列或权利要求3所述的多核苷酸，或表达权利要求1所述的前体序列。
7.如权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，所述的表达载体还含有编码狂犬病毒表面糖蛋白短肽(RVG肽)的多核苷酸。
8.一种抑制PTP1B基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA的正义链核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO:1、2、3、4、或其组合。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有权利要求1所述的前体序列、或权利要求4所述的表达载体，和药学上可接受的载体。
10.权利要求8所述siRNA、权利要求1所述前体序列、或权利要求4所述表达载体的用途，其特征在于，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于(a)预防和/或治疗肥胖相关疾病；(b)预防和/或治疗心血管相关疾病；和/或(c)预防和/或治疗代谢异常相关疾病。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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