CN109641010A - 用于治疗急性肝功能衰竭的药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用作治疗或预防急性肝衰竭的药物的化合物，其中所述急性肝衰竭是在给予该化合物之前或之后由于中毒而诱发的。因此，本发明涉及用于治疗中毒的化合物，其中该中毒未经治疗预期会导致急性肝功能衰竭或未经治疗会足以诱发急性肝功能衰竭。本发明还提供用于治疗的化合物，以及治疗足以诱发急性肝衰竭的中毒的相应方法。

Description

用于治疗急性肝功能衰竭的药物

本发明涉及用作治疗或预防急性肝功能衰竭的药物的化合物，该急性肝功能衰竭例如是在给予该化合物之前或之后由于中毒而诱发的。因此，本发明涉及用于治疗中毒的化合物，该中毒如果未经治疗预期会导致急性肝功能衰竭或如果未经治疗足以诱发急性肝功能衰竭。本发明还提供用于所述治疗的化合物，以及治疗足以诱发急性肝功能衰竭的中毒的相应方法。优选在中毒后的最多4天内给予该化合物，以防止由中毒引起的急性肝功能衰竭。该化合物可以配制成药物组合物，优选用于静脉注射，例如作为溶液(优选作为水溶液)、作为脂质体和/或作为胆固醇酯和/或作为纳米颗粒(例如与载体一起)。

已经显示，给予该化合物显著地防止了由于事先注射过量对乙酰氨基酚或注射足以诱发细胞凋亡的FAS激动剂抗体而人工诱发的急性肝功能衰竭。该化合物适用于静脉注射，并且已显示出预防或防止急性肝功能衰竭的显著活性，在不存在所述化合物的情况下，预期所述急性肝功能衰竭是由中毒(例如存在毒性剂，如非病毒毒性剂或病毒)引起的。

现有技术的说明

US 2012/0264805描述了大量与编码p53上调细胞凋亡调节因子(PUMA)的mRNA杂交的siRNA分子，其用于在治疗功能性肝功能受损中和在预防急性肝功能衰竭中减少或防止PUMA的表达。已知用于治疗急性肝功能衰竭的治疗包括在病毒诱发的肝功能衰竭的情况下使用抗病毒治疗和在药物滥用的情况下(例如在对乙酰氨基酚中毒的情况下)给予化学解毒剂(例如乙酰半胱氨酸)。

Ward等人,Proc Natl Acad Sci USA 111,12169-12174(2014)描述了患有扑热息痛(对乙酰氨基酚)肝毒性或缺血性肝炎的患者中miR-125b-5p的血清水平升高。

EP2 261 334 B1描述了稳定的RNA分子，其5′核苷酸在5′碳上具有磷酸化和/或在3个5′-末端核苷酸中至少一个的2′碳上具有O-烷基化。

EP 2 123 579 B1描述了稳定的RNA分子，其具有2个5′-末端核苷酸的2′-O-烷基修饰和至少一个嘧啶的2′-O-烷基修饰。

Sharma等人,Hepatology 53,1651-1661(2011)描述了microRNA-221调节FAS诱导的暴发性肝功能衰竭。

EP 2 203 559 B1描述了一种反义寡核苷酸，用于在HCV的治疗中抑制miR-122，该反义寡核苷酸是锁核酸。

EP 2 205 737 B1描述了具有7-10个核碱基的寡聚物，其是锁核酸。

发明目的

本发明的一个目的是提供一种化合物，其用于预防或至少显著减少急性肝功能衰竭，优选用于由于存在毒性剂而预期会发生的急性肝功能衰竭。

发明描述

本发明通过权利要求的特征、特别是通过提供具有miR-125b-5p的核碱基序列(UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA，SEQ ID NO:1)的化合物实现了该目的，其用于治疗足以引起急性肝功能衰竭的中毒。化合物miR-125b-5p优选包含在药学上可接受的注射用(例如静脉注射用)制剂中。该制剂例如可以是脂质体制剂，其含有该化合物、化学修饰物(例如通过连接的胆固醇酯)、与纳米颗粒结合的miR-125b-5p模拟物、或使用腺相关的载体，或这些中至少两种的组合。本文中，关于miRNA是指21至22nt，通常为22nt的功能性miRNA分子，其在细胞中由通常具有66nt的前体miRNA产生，该前体miRNA是初级miRNA的转录产物。

化合物miR-125b-5p可以是化学修饰的(如现有技术所知，用于增强在血液中的稳定性)，例如以锁核酸的形式，通过在5′-末端核苷酸的5′碳上的磷酸化和/或3个5′-末端核苷酸中至少一个的2′碳上的O-烷基化、2个5′-末端核苷酸的2′-O-烷基修饰和至少一个嘧啶的2′-O-烷基修饰，或以肽核酸的形式，或这些中至少两种的组合，其中该化合物具有SEQID NO:1的核碱基序列。对于锁核酸，胞嘧啶部分可以是5′-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键可以是硫代磷酸酯键。

该化合物作为药物的用途具有直接减少或预防急性肝功能衰竭的优点，因为在给予患者后不需要来自编码序列的转录。

该化合物优选被配制成在中毒后最多4天内、最多3天内、优选最多2天内、更优选最多1天内、最优选最多12小时至6小时内给予患者。其中，在没有合适治疗的情况下，该中毒足以造成急性肝功能衰竭。

没有治疗导致急性肝功能衰竭的中毒可以例如是由于病毒剂(如乙型肝炎病毒)和/或由于药物的存在(例如由于药物滥用)引起的，所述药物例如选自扑热息痛(对乙酰氨基酚)和/或酒精。优选地，该化合物用于治疗足以引起急性肝功能衰竭的中毒，其中该中毒是由合成或天然化合物(例如对乙酰氨基酚)引起的，并且优选不包括病毒感染，其中进一步优选所述中毒是在治疗前最多4天、更优选在治疗前最多3天、2天或1天发生的。

出于本发明的目的，急性肝功能衰竭包括暴发性和亚暴发性(subfulminant)肝功能衰竭，并且例如与未患病(如健康的个人)的相应参数相比，其特征在于谷胱甘肽的消耗，例如较低的血清谷胱甘肽与谷胱甘肽二硫化物的比例(GSH/GSSG水平)、增加的TUNEL阳性细胞核、较高的丙氨酸转氨酶血清水平、较高的天冬氨酸转氨酶血清水平、增加的血清谷氨酸脱氢酶的血清水平、增加的血清线粒体DNA水平和肝脏形态恶化。

优选地，用于本发明目的的急性肝功能衰竭不包括肝癌。

实施例表明，在发生足以导致急性肝功能衰竭的中毒(例如由致死剂量的对乙酰氨基酚或由诱发细胞凋亡的致死剂量的抗-CD95抗体导致的中毒)之后，将具有miR-125b-5p的核碱基序列的化合物给予哺乳动物(例如小鼠)可以预防急性肝功能衰竭。关于对乙酰氨基酚，将小鼠中获得的结果作为外推的基础，在人类中，在中毒后最多4天、优选最多3天、更优选最多2天或1天给予该化合物将使急性肝功能衰竭被减少或预防到至少能够存活的程度。

现在通过实施例描述本发明，使用对乙酰氨基酚或FAS激动剂抗体来代表导致急性肝功能衰竭的中毒。在本文中，并且在实施例中，miRNA也称为模拟物，因为它可以通过合成产生。模拟物可任选地具有化学修饰。在附图中，在没有用于抵抗急性肝功能衰竭(例如通过施用对乙酰氨基酚或通过抗-CD95抗体引起的急性肝功能衰竭)的化合物的情况下的数据被指定为对照，在没有毒剂以及没有用于抵抗急性肝功能衰竭的化合物的情况下产生的数据被指定为未受损伤的，在优选化合物miR-125b-5p存在下产生的数据被指定为miR-125b-5p模拟物。*表示P<0.05，双尾学生t检验；**表示P<0.01，双尾学生t检验。

这些实施例参考了附图，其中:

-图1显示用miRNA转染、随后用对乙酰氨基酚使之中毒的培养原代肝细胞中的GSH/GSSG比率，

-图2显示用miRNA抑制剂转染、随后用对乙酰氨基酚使之中毒的培养原代肝细胞中的GSH/GSSG比率，

-图3显示用miRNA或用miRNA抑制剂转染、随后通过抗-CD95抗体诱发细胞凋亡的培养原代肝细胞中的TUNEL试验结果，

-图4显示miR-125b-5p在病毒体转导的小鼠中的相对表达，

-图5显示在注射乙酰氨基酚诱发急性肝功能衰竭后过表达miR-125b-5p的小鼠的存活率，

-图6显示对照和本发明的病毒颗粒的AST(左栏)和ALT(右栏)的血清水平，

-图7显示注射乙酰氨基酚诱发急性肝功能衰竭后的肝组织的苏木精和曙红(HE)染色，

-图8显示注射乙酰氨基酚诱发急性肝功能衰竭后的血清GDH分析，

-图9显示注射乙酰氨基酚诱发急性肝功能衰竭后的血清GSH/GSSG比率的分析，

-图10显示注射乙酰氨基酚诱发急性肝功能衰竭后的血清mtDNA的分析，

-图11显示在模拟转导的小鼠和用miR-125b-5p的病毒表达载体转导的小鼠中的miR-125b-5p的相对表达水平，

-图12显示过表达miR-125b-5p、随后用FAS诱发细胞凋亡的小鼠的卡普兰-迈耶曲线(Kaplan-Meier curve)存活曲线，

-图13显示对照和本发明的病毒颗粒的AST(左栏)和ALT(右栏)的血清水平，

-图14显示由FAS诱发的细胞凋亡导致的急性肝功能衰竭后的肝组织的苏木精和曙红(HE)染色，

-图15显示由FAS诱发的细胞凋亡导致的急性肝功能衰竭后的相对半胱天冬酶-3/7活性，

-图16显示由FAS诱发的细胞凋亡导致的急性肝功能衰竭后的TUNEL结果，

-图17显示在对照小鼠(对照，无化合物)和已接受miR-125b-5p模拟物注射的小鼠(先前腹膜内注射对乙酰氨基酚)的肝组织中的miR-125b-5p的相对存在量，

-图18显示在已经接受miR-125b-5p模拟物注射或没有接受化合物(对照)的小鼠(先前腹膜内注射对乙酰氨基酚)中的卡普兰-迈耶曲线存活曲线，

-图19显示在已经接受miR-125b-5p模拟物注射或没有接受化合物(对照)的小鼠(先前腹膜内注射对乙酰氨基酚)中以及在健康小鼠(未受损伤)中的AST(左栏)和ALT(右栏)的血清水平，

-图20显示先前注射对乙酰氨基酚并随后注射miR-125b-5p模拟物或不注射化合物(对照)的肝组织的苏木精和曙红(HE)染色，

-图21显示在已经接受miR-125b-5p模拟物注射或没有接受化合物(对照)的小鼠(先前腹膜内注射对乙酰氨基酚)中的GDH血清水平，

-图22显示在已经接受miR-125b-5p模拟物注射或没有接受化合物(对照)的小鼠(先前腹膜内注射对乙酰氨基酚)中的GSH/GSSG血清水平，

-图23显示在已经接受miR-125b-5p模拟物注射或没有接受化合物(对照)的小鼠(先前腹膜内注射对乙酰氨基酚)中的mtDNA血清水平，

-图24显示在对照小鼠(对照，无化合物)和已接受miR-125b-5p模拟物注射的小鼠(先前腹膜内注射抗-CD95抗体)的肝组织中的miR-125b-5p的相对存在量，

-图25显示在已经接受miR-125b-5p模拟物注射或没有接受化合物(对照)的小鼠(先前腹膜内注射抗-CD95抗体)中的卡普兰-迈耶曲线存活曲线，

-图26显示在已经接受miR-125b-5p模拟物注射或没有接受化合物(对照)的小鼠(先前腹膜内注射抗-CD95抗体)中以及在健康小鼠(未受损伤)中的AST(左栏)和ALT(右栏)的血清水平，

-图27显示在已经接受miR-125b-5p模拟物注射或没有接受化合物(对照)的小鼠(先前腹膜内注射抗-CD95抗体)中的肝组织的苏木精和曙红(HE)染色，

-图28显示在已经接受miR-125b-5p模拟物注射或没有接受化合物(对照)的小鼠(先前腹膜内注射抗-CD95抗体)的肝组织中的相对半胱天冬酶-3/7活性，和

-图29显示在已经接受miR-125b-5p模拟物注射或没有接受化合物(对照)的小鼠(先前腹膜内注射抗-CD95抗体)的肝组织中的TUNEL结果。

实施例1:筛选miRNA体外对抗由对乙酰氨基酚中毒诱发的急性肝功能衰竭的活性

通过将来自Liberase(Roche)灌注和解离的小鼠肝脏低速离心来收集肝细胞，丢弃与非实质细胞在一起的上清液。将肝细胞以每孔10000个细胞接种，在预先涂有胶原蛋白(BD)的细胞培养板中培养。在无偏筛选中，在培养12小时后，以25nM miRNA模拟物向原代小鼠肝细胞中加入302种不同的模拟miRNA分子(其具有在小鼠和人之间保守的序列，并且其具有化学修饰以增强抗RNase的稳定性，可作为模拟库(来自Thermo Scientific,Germany)获得)用于转染。通常对于转染，使用在Virofect增强剂(得自Targeting Systems)存在下的Targefect试剂，在肝细胞培养基(得自Lonza)中培养。转染后36小时，加入对乙酰氨基酚至终浓度为3mg/ml。为了评估miRNA对由对乙酰氨基酚或抗体诱发的毒性的作用，在加入抗体或对乙酰氨基酚后6小时通过WST-1测定(Roche)测量细胞活力，在440nm测量吸光度。

结果发现，通过以下7种miRNA可以获得超过20％的抗对乙酰氨基酚毒性效果的保护作用，这些miRNA在正常人肝脏中表现出适度至高度的表达:

miRNA	细胞活力(倍数变化)
		miR-194-5p(SEQ ID NO:2)	1.57
miR-125b-5p(SEQ ID NO:1)	1.45
		miR-21-5p(SEQ ID NO:3)	1.41
let-7a-5p(SEQ ID NO:4)	1.38
		miR-122-5p(SEQ ID NO:5)	1.66
miR-30c-5p(SEQ ID NO:6)	1.41
		miR 193a-3p(SEQ ID NO:7)	1.46

使用混杂miRNA(scramble miRNA，得自Qiagen)替换转染中的miRNA模拟物，确定细胞活力相对于对照的变化。

作为对照实验，在加入对乙酰氨基酚之前，通过将25nM反向互补寡核苷酸转染到培养的原代肝细胞中来抑制这些miRNA。结果发现，与混杂物对照相比，let-7a、miR-125b-5p或miR-122-5p的抑制导致较低的细胞活力。这表明与混杂物对照相比，let-7a、miR-125b-5p或miR-122-5p在肝细胞中的存在与否与在毒性剂存在下的保护作用或较低的细胞活力相关。

在用miRNAs miR-194-5p、miR-125b-5p、miR-21-5p、let-7a-5p、miR-122-5p、miR-30c-5p或miR 193a-3p或其特异性抑制剂之一转染的培养的原代肝细胞中，测定谷胱甘肽与谷胱甘肽二硫化物的比例(GSH/GSSG比例)。结果示于图1和图2中，其显示，相对于混杂miRNA，miR-125b-5p的模拟物、miR-194-5p的模拟物、miR-21-5p的模拟物和miR-122-5p的模拟物各自显著恢复谷胱甘肽的水平，但只有miR-125b-5p的抑制剂和miR-122-5p的抑制剂导致谷胱甘肽水平相应地显著降低。

由于谷胱甘肽消耗是对乙酰氨基酚诱发的肝毒性的标志之一，这些结果表明给予miR-125b-5p和miR-122-5p可防止对乙酰氨基酚诱发的肝细胞毒性。

实施例2:筛选miRNA体外对抗由FAS激动剂抗体诱发的急性肝功能衰竭的活性

作为毒性模型，给予抗-CD95抗体，从而使用FAS诱发的细胞凋亡。通过如实施例1中所述的一组302种不同的模拟miRNA分子来转染原代小鼠肝细胞，并且在转染后24小时，加入Hamster抗小鼠CD95抗体(BD Pharmingen)至1μg/ml。

FAS抗体在体外和体内引起大量细胞凋亡，导致急性肝功能衰竭。在该培养测定中，发现以下miRNA模拟物可以减少细胞凋亡:

miRNA	细胞活力(倍数变化)
		miR-130a-3p(SEQ ID NO:8)	1.36
miR-125b-5p(SEQ ID NO:1)	1.32
		miR-29c-3p(SEQ ID NO:9)	1.29
miR-16-5p(SEQ ID NO:10)	1.22
		miR-23-3p(SEQ ID NO:11)	1.38

与混杂miRNA相比，选择这些miRNA使细胞凋亡减少了至少20％，并且用于在正常肝脏中适度至高度表达。

再次测试这五种模拟物及其各自的抑制剂以进行确认。发现仅对于miR-16-5p，在细胞活力测定中抗细胞凋亡的保护作用尚未得到证实。

作为进一步的测定，使用TUNEL测定试剂盒(得自Merck Millipore)分析TUNEL(末端脱氧核苷酸基转移酶-介导的dUTP缺口末端标记)。该TUNEL测定证实了miR-125b-5p和miR-29c-3p抗FAS诱发的培养肝细胞的细胞凋亡的保护作用。该TUNEL测定的结果显示在图3中，其中显示了对于指定的miRNA，每个显微镜视野的TUNEL阳性核的数目。

由于实施例1和实施例2的测定均将miR-125b-5p鉴定为这样的miRNA，即其在体外保护原代肝细胞免受对乙酰氨基酚导致的中毒以及免受FAS诱发的细胞凋亡，因此miR-125b-5p是用于治疗急性肝功能衰竭的优选化合物。

对于miR-125b-5p，在原代肝细胞培养物中发现剂量依赖性效应，其抗对乙酰氨基酚诱发的或FAS诱发的急性肝功能衰竭的浓度至少为25nM。

对于培养的人肝细胞，加入FAS-抗体(小鼠抗人CD95抗体，克隆Dx2，BDPharmingen)至1μg/ml。

实施例3:miR-125b-5p体内抗由对乙酰氨基酚中毒诱发的急性肝功能衰竭的用途

为了测试miR-125b-5p的体内作用，使用雄性BALB/c小鼠。向小鼠注射腺相关病毒(AAV)颗粒，该颗粒如Sharma等人，Hepatology(2011)中所大体描述。该AAV质粒含有在肝细胞特异性转甲状腺素蛋白(transthyretin，Ttr)启动子控制下的用于miR-12b-5p过表达的初级编码序列pri-miR-125b-5p。含有该miR-12b-5p表达盒的病毒体以高滴度血清型8制备，命名为AAV-Ttr-miR-125b-5p。简言之，通过磷酸钙(Ca-phosphate)转染用转基因质粒转染A-293细胞，并且三天后收获细胞并通过CsCl密度梯度离心纯化病毒体。使用跨越Ttr启动子的引物通过逆转录酶PCR确定滴度。

对于体内转导，将1x10¹⁰个病毒体注射到8至10周龄BALB/c小鼠的尾静脉中一次，并在4天后第二次注射1x10¹⁰个病毒体。经证实，miR-125b-5p在转导小鼠中的表达与对照病毒体相关。图4显示了在小鼠肝脏组织中确定的miR-125b-5p的相对表达。miRNA的表达使用Taqman Universal Real Time PCR试剂盒和SYBR green PCR master mix(得自AppliedBiosystems)由分离的50ng总RNA确定。对于常规基因表达分析，将数据标准化为β-肌动蛋白(Actb)表达。同样地，对于miRNA表达分析，将数据标准化为U6(小RNA)的表达。根据ΔΔCt方法分析数据。

转导后3天，将一部分转导的小鼠腹膜内注射350mg/kg对乙酰氨基酚，该剂量是先前当测试由150至800mg/kg的剂量时，发现在小鼠中具有100％致死率的剂量。存活曲线显示在图5中，表明与用对照病毒体(具有空表达盒)转导的小鼠相比，表达miR-125b-5p的小鼠的存活率显著提高。在诱发对乙酰氨基酚毒性后，将已接受AAV-Ttr-miR-125b-5p并经历乙酰氨基酚后存活下来的小鼠再监测另外6个月。该长期存活表明，miR-125b-5p在小鼠肝脏中的过表达产生了针对急性肝功能衰竭的抵抗性，该急性肝功能衰竭由致死剂量的对乙酰氨基酚所代表的中毒诱发的。

在进一步的实验中，将经转导以过表达miR-125b-5p的小鼠如上所述经腹膜内注射350mg/kg对乙酰氨基酚，并在6小时后杀死以检测丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的血清水平，并检测组织学上的肝损伤。从每只小鼠中抽取0.1ml血液，分析其中的ALT和AST。在室温下30分钟后，通过以8000xg离心8分钟制备血清，并使用Olympus AU 400分析仪(Beckman Coulter)通过全自动常规实验室操作分析澄清的上清液。

在来自小鼠肝组织的10μm冰冻切片上对裂解的半胱天冬酶-3(得自CellSignaling,商品目录号9661,1:400稀释度)、裂解的半胱天冬酶-7(得自Cell Signaling,商品目录号8438,1:400稀释度)和Ki67(得自Labvision,商品目录号RM9106,1:400稀释度)进行免疫荧光和免疫组织化学染色。简而言之，将通过Dounce匀浆制备的、在含有完全迷你蛋白酶抑制剂混合物(Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail)(Roche)的低渗提取缓冲液中的小鼠肝脏裂解物在4℃下以13000rpm离心15分钟，在半胱天冬酶-Glo检测试剂盒(得自Promega)中使用1μg。对于信号检测，使用AlexaFluor结合的第二抗体，在白色96孔板中测量发光。对于苏木精和曙红(HE)染色，将肝组织固定在4％福尔马林中，包埋在石蜡中并切成5μm切片用于组织化学分析。

图6的ALT和AST分析结果显示，miR-125b-5p过表达的小鼠的血清中ALT和AST的血清水平较低，这表明在注射对乙酰氨基酚后6小时肝损伤减少。图7中显示的HE染色表明，在通过注射对乙酰氨基酚诱发急性肝功能衰竭后6小时，在miR-125b-5p过表达的肝脏中的肝损伤减少。

图8、9和10中显示的血清谷氨酸脱氢酶(GDH)、GSH/GSSG血清比率和血清mtDNA的分析证实了miR-125b-5p的过表达在抗急性肝功能衰竭中的保护作用，所述急性肝功能衰竭是注射对乙酰氨基酚导致的。

在图9中，未注射对乙酰氨基酚的小鼠(未受损伤)显示为对照。使用GDH检测试剂盒(得自Abcam)，使用在测定缓冲液中稀释的5μl血清，在450nm下使用比色测量来测定GDH。使用GSH/GSSG Glo检测试剂盒(得自Promega)在于5％w/v偏磷酸(Sigma)中的小鼠肝匀浆上测量GSH和GSSG，随后在4℃下以13000rpm离心10分钟，然后中和并稀释。通过发光检测法测量GSH及其氧化形式GSSG。使用QIAamp血液和迷你试剂盒(QIAamp Blood and Mini Kit，Qiagen)，在由血清样品中分离的总DNA上通过定量实时PCR测量血清mtDNA。绘制小鼠肝组织的mtDNA的标准曲线，所述肝组织是从线粒体DNA分离试剂盒(Abcam)分离的，通过实时PCR验证小鼠细胞色素c氧化酶亚基III和β-肌动蛋白的mtDNA的纯度。

在通过先后两次、每次注射1x10¹⁰个病毒体来转导小鼠的替代方案中，可以在一次注射中使用2x10¹⁰个病毒体以增强抗中毒的保护作用。通过染色Ki67和定量分析显示，抗急性肝功能衰竭的保护作用是通过miR-125b-5p来抑制细胞死亡，并不是由于肝细胞的增殖增加。

实施例4:miR-125b-5p体内抗FAS-诱发的急性肝功能衰竭的用途

作为诱发急性肝功能衰竭的中毒的另一个实例，在过表达miR-125b-5p的BALB/c小鼠中分析FAS诱发的肝功能衰竭。如实施例3中所述，通过先后两次注射1x10¹⁰个病毒体来产生这些小鼠，并发现其过表达miR-125b-5p。在第二次注射AAV-Ttr-miR-125b-5p病毒体后第3天，注射一定剂量的FAS抗体，该剂量先前被确定为对模拟转导的小鼠(对照AAV)或天然小鼠是致命的。图11中显示了模拟转导的小鼠(对照AAV)和用AAV-Ttr-miR-125b-5p转导的小鼠的miR-125b-5p的表达。图12的存活曲线显示，miR-125b-5p的过表达显著增加了注射其他致命FAS诱发的细胞凋亡时的存活率。而且，图13中描述的AST和ALT的血清水平、图14的HE染色、图15的半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7活性的比率、以及图16的TUNEL测定显示对由其他致死剂量的抗-CD95抗体诱发的急性肝功能衰竭的显著保护作用。对裂解的半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7的染色支持了该发现结果。

实施例5:miR-125b-5p体内抗对乙酰氨基酚诱发的急性肝功能衰竭的用途

作为miR-125b-5p用作药物治疗急性肝功能衰竭(因先前中毒而预期会在患者中发生该急性肝功能衰竭)的实例，将miR-125b-5p给予先前已接受致死剂量的对乙酰氨基酚的小鼠。

向BALB/c小鼠腹膜内注射350mg/kg对乙酰氨基酚。1小时后，将10μg稳定RNA形式的miR-125b-5p(miRIDIAN,得自GE Dharmacon)注射到小鼠的尾静脉中。对注射这种稳定的miR-125b-5p(miR-125b-5p模拟物)的小鼠肝脏中的miR-125b-5p的存在进行分析，与未接受miR-125b-5p的小鼠肝脏中的miR-125b-5p的水平相比较，示于图17中，结果表明，在已接受稳定的miR-125b-5p模拟物的小鼠的肝脏中，miR-125b-5p的存在显著增加。图18的卡普兰-迈耶曲线存活曲线显示，给予致死剂量的对乙酰氨基酚后接受miR-125b-5p模拟物的小鼠的存活率大幅提高。

AST和ALT血清水平的分析(图19中所示的结果)显示，在被给予miR-125b-5p的动物中，AST和ALT水平降低。图20的HE染色显示，在被给予miR-125b-5p的组中，肝损伤显著减少。与未接受miR-125b-5p的对照小鼠相比，较低的GDH水平(图21)、增加的GSH/GSSG比率和降低的mtDNA血清水平(图23)表明，miR-125b-5p具有抗先前发生的足以诱发急性肝功能衰竭的中毒的活性。

实施例6:miR-125b-5p体内抗FAS-诱发的急性肝功能衰竭的用途

作为化合物(具有miR-125b-5p的核碱基序列)在治疗引起急性肝功能衰竭的中毒中的用途的另一个实例，给小鼠注射致死剂量的抗-CD95抗体，该致死剂量由于细胞凋亡而诱发急性肝功能衰竭，1小时后接受10μg稳定的miR-125b-5p模拟物或不接受化合物(对照)。图24显示的是在已经接受miR-125b-5p模拟物(miR-125b-5p模拟物)的小鼠和对照小鼠中，对miR-125b-5p存在情况的分析结果。图25的存活曲线显示，在注射抗-CD95抗体发生FAS-诱发的细胞凋亡后，给予miR-125b-5p大幅增加了存活。

图26中，与对照相比，在已经接受miR-125b-5p的小鼠中AST和ALT的血清水平降低，但与健康小鼠(未受损伤)相比升高。

图27的HE染色表明，在由抗-CD95抗体诱发急性肝功能衰竭后6小时，与对照中的显著细胞凋亡相比，在已经接受miR-125b-5p的小鼠中，肝组织细胞中的细胞凋亡较少。

图28显示，与对照相比，在已经接受miR-125b-5p模拟物的小鼠中半胱天冬酶-3/7的活性较低，但与健康(未受损伤)的小鼠相比具有较高的活性。

TUNEL分析中的染色减少证实，与对照相比，在注射miR-125b-5p的小鼠中，给予miR-125b-5p导致细胞凋亡减少，所述细胞凋亡是通过注射抗-CD95抗体中毒后发生的。图29显示TUNEL分析的结果。

该实施例表明，在发生足以诱发急性肝功能衰竭的中毒后，给予miR-125b-5p抑制急性肝功能衰竭并导致存活增加。

序列表

<110> 汉诺威医学院(Medizinische Hochschule Hannover)

<120> 用于治疗急性肝功能衰竭的药物

<130> M1068PCT

<150> EP16173158

<151> 2016-06-06

<160> 11

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR-12b-5p

<400> 1

ucccugagac ccuaacuugu ga 22

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR-194-5p

<400> 2

uguaacagca acuccaugug ga 22

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR-21-5p

<400> 3

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> let-7a-5p

<400> 4

ugagguagua gguuguauag uu 22

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR122-5p

<400> 5

uggaguguga caaugguguu ug 22

<210> 6

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR-30c-5p

<400> 6

uguaaacauc cuacacucuc agc 23

<210> 7

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR 193a-3p

<400> 7

aacuggccua caaaguccca gu 22

<210> 8

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR-130a-3p

<400> 8

cagugcaaug uuaaaagggc au 22

<210> 9

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR-29c-3p

<400> 9

uagcaccauu ugaaaucggu ua 22

<210> 10

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR-16-5p

<400> 10

uagcagcacg uaaauauugg cg 22

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> miR-23-3p

<400> 11

aucacauugc cagggauuuc c 21

Claims (9)

1.化合物，其用于治疗足以引起急性肝功能衰竭的中毒，其特征在于所述化合物具有SEQ ID NO:1(miR-125b-5p)的核碱基序列。

2.根据权利要求1的化合物，其特征在于该化合物具有由SEQ ID NO:1组成的核碱基序列。

3.根据前述权利要求中任一项的化合物，其特征在于所述核碱基序列是RNA、化学稳定的RNA、化学修饰的RNA的形式和/或被配制成脂质体和/或纳米颗粒的形式。

4.根据前述权利要求中任一项的化合物，其特征在于所述中毒发生在治疗前最多4天。

5.根据前述权利要求中任一项的化合物，其特征在于所述中毒是由对乙酰氨基酚和/或其他药物和/或酒精和/或病毒引起的。

6.根据前述权利要求中任一项的化合物，其特征在于所述急性肝功能衰竭是由肝细胞凋亡和/或坏死引起的。

7.根据前述权利要求中任一项的化合物，其特征在于该化合物与至少一个具有如下核碱基序列的化合物组合存在:miR-194-5p(SEQ ID NO:2)、miR-21-5p(SEQ ID NO:3)、let-7a-5p(SEQ ID NO:4)、miR-122-5p(SEQ ID NO:5)、miR-30c-5p(SEQ ID NO:6)、miR 193a-3p(SEQ ID NO:7)、miR-130a-3p(SEQ ID NO:8)、miR-29c-3p(SEQ ID NO:9)、miR-16-5p(SEQ ID NO:10)和/或miR-23-3p(SEQ ID NO:11)。

8.根据前述权利要求中任一项的化合物，其特征在于中毒是由合成或天然化合物引起的，不包括病毒感染。

9.治疗足以引起急性肝功能衰竭的中毒的方法，其特征在于给予具有SEQ ID NO:1(miR-125b-5p)的核碱基序列的化合物。