KR960012069B1 - 파필로마바이러스(Papillomavirus)를 억제하는 항감작 올리고뉴클레오타이드 - Google Patents

파필로마바이러스(Papillomavirus)를 억제하는 항감작 올리고뉴클레오타이드 Download PDF

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티. 크룩 스탠리
케이. 미라벨리 크리스토퍼
제이. 엑커 데이비드
엠. 카우서트 렉스
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아이시스 파마슈티칼스, 인코포레이티드
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Abstract

내용없음

Description

[발명의 명칭]
파필로마바이러스(Papillomavirus)를 억제하는 항감작 올리고뉴클레오타이드
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 파필로마바이러스(PV)의 억제와 파필로마바이러스(이하 PV)에 의해 야기된 동물감염을 진단하고 이를 치료하는데 관한 것이다. 또한 본 발명은 PV를 함유하고 있는 표본(Sample)에서의 PV의 감지와 정량에 직접 관계된 것이다. 덧붙여 본 발명은 PV에서 유래된 mRNA의 기능을 방해하거나 조절하는 올리고뉴클레오타이드나 올리고뉴클레오타이드 유사체에 관한 것이다. 그러한 방해는 PV 감염의 진단과 치료에 이용될 수 있다. 본 발명은 실험시약의 기초가 될 수도 있고 실험과 진단의 도구가 될 수도 있다. 본 발명은 미합중국 특허출원 제445,196호의 파필로마바이러스를 억제하는 항감작 올리고뉴클레오타이드의 부분적인 연속출원이다.
[발명의 배경]
PV는 자연에 널리 분포하고 있으며, 보통 우췌(wart)로 간주되는 양성의 상피세포와 섬유상피세포 병소에 관련된다. PV는 인간, 소, 토끼, 사슴 및 몇몇 조류(avian)에서 검출, 분리되어 왔다 비록 상기 PV들이 양성 병소에 관련되지만 특별한 부류의 PV들은 악성종양(Carcinoma)으로 발전할 병소와 관련된다. 이들 바이러스들이 몇가지 인간종양의 발달에 병인적인 역할을 할 것이라는 암시는 그러한 종양성 병소의 퍼센티지가 높은 인간 파필로마바이러스(HPV) DNA내의 전사되는 활동의 존재가 보여주는 많은 실험에서 나타난다(쮸어 하우젠, 하, 그리고 슈나이더, 아 1987 The Papovarididae : 내, 제2권, PP 245-264. 플레넘 출판사, 뉴욕)
인간에 있어서, HPV는 일반적인 수족의 우췌, 후두우췌, 생식성우췌등의 일반적인 우췌를 포함하는 다양한 병의 원인이다. 57형태 이상의 HPV가 동정되었다. 각 HPV는 바람직한 감염부위를 가진다 ; 각 바이러스는 일반적으로 특별병소와 관련된다. 성병 우췌와 급성습우(condylomata acuminata)같은 생식성 우췌는 PV감염의 가장 중요한 확증가운데 하나이다. 질병제어센터(Center for Disease Control)의 발표처럼, 생식성 우췌의 성적 형태전이는 잘 알려져 있고 생식성 종의 발생은 점증하고 있다. 최근의 연구결과인 HPV DNA가 경부내 상피세포 신생체(CIN I -III)와 특별한 HPV 형태가 경부 in situ에서의 악성종양에서 발견될 수 있다는 사실은 생식성 우췌의 심각성을 강조해준다. 결과적으로, 특별한 HPV 형태의 생식성 우췌를 가진 여성들은 경부암의 발달위험이 큰 것으로 간주된다. 생식성 우췌의 치료는 아직 충분하지 못하다.
아직 만족스럽지는 않지만, PV를 억제할 수 있는 물질의 합성에 대한 요청이 절박하다. 또한 동물에 있어서의 PV 감염의 치료와 진단을 위한 방법이 절실히 요구되고 있다. 또한 PV의 연구에 진보된 기법과 실험시약이 절실하다.
[발명의 목적]
본 발명의 목적은 PV의 mRNA와 하이브리드되어 mRNA의 기능을 억제할 수 있는 올리고뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드의 유사체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 PV의 mRNA와 항감작 반응을 통하여 PV DNA의 기능적인 발현을 조절하는 올리고뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드의 유사체를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 동물에서의 PV용 진단과 치료방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 의심가는 표본내에 PV의 존재여부를 감지하는 방법, 물질 및 수단을 제공하는 데 있다.
본 명세서와 첨부한 청구항에 의한 본 발명의 목적들은 본 발명의 당업자들에게는 명백할 것이다.
[발명의 요약]
본 발명의 바람직한 구체예에 의하여, 올리고뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드의 유사체는 PV로부터 mRNA와 하이브리드될 수 있도록 제공된다. 이러한 관계는 일반적으로 항감작이라고 불린다. 올리고뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드의 유사체는 RNA의 기능을 방해할 수 있고, 또한 RNA의 단백질로의 전사, 단백질의 세포질로의 전위, 또는 전체적인 생물학적 기능에 필요한 다른 어떤 활성도 억제할 수 있다. 기능의 전체 또는 일부를 수행하는 mRNA의 실패는 PV 게놈의 적절한 발현이 실패하는 결과를 낳게 된다 ; 배수화의 실패, 효과적인 수효의 적당한 후예(progeny)가 생기지 못하는 것, 그리고 PV에 감염된 동물에 미치는 그 후예들의 해로운 효과들은 조절되었다.
항감작공격(antisense attack)을 위하여 어떤 mRNA들에게서 보여진 바와같이, PV 게놈의 바람직한 목표부위가 발견되었다. PV의 E2, El, E7 및 E6-7 mRNA 수단들은 모두 이러한 실험용으로 특별히 유용하다고 밝혀졌다. 그래서, 올리고뉴클레오타이드나 올리고뉴클레오타이드 유사체에 의해 하이브리드되는 것이 요구되는 E2, E1, E7 및 E6-7 mRNA가 바람직하다. 나아가서 바람직한 구체예에 의하여, 올리고뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드의 유사체는 예를들어 보바인(bovine) PV의 뉴클레오타이드 2443∼3080 또는 89∼304와 같이 PV의 5' 미번역부위나 E2 트랜스액티베이터부위로부터 전사된 RNA 부위에 상보적으로 디자인된 뉴클레오타이드 베이스를 구성하도록 제공된다.
바람직한, 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 mRNA 캡(CAP) 부위와 E2 트랜스액티베이터용의 번역 코돈을 목표로 하도록 제공된다. 이들 올리고뉴클레오타이드들은 BPV-1 뉴클레오타이드 2443∼4180에 의해 코드되는 E2 mRNA와 하이브리드되도록 디자인된다.
PV의 발현을 조절하는 방법은 올리고뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드의 유사체와 하이브리드될 상기 PV 유래의 mRNA가 하이브리드되었을때 올리고뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드의 유사체에 의해 기능이 억제되는 것을 발견함으로써 알려지게 되었다. PV의 E2, El, E7 또는 E6-7 mRNA와 하이브리드될 수 있는 올리고뉴클레오타이드나 올리고뉴클레오타이드 유사체의 이용이 바람직하다.
덧붙여, 동물에 감염된 PV의 효과를 조절하는 방법이 발견되고 있는데, 하이브리드되었을때 mRNA의 기능을 억제할 수 있는 올리고뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드의 유사체가 PV 유래의 mRNA와 하이브리드되어 동물에 나타난 것 등이 감지되고 있다. PV의 E2, El, E7 또는 E6-7 mRNA와 하이브리드될 수 있는 올리고뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드의 유사체가 바람직하다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드의 유사체를 이용한 PV 존재여부 감지용의 진단법은 하이브리드화에 의존하는 진단활동이나 실험시약의 도구가 된다.
[발명의 상세한 설명]
생식성 우췌는 가장 자주 진단되는 바이러스성의 성적으로 매개되는 질병이다. 치료적으로 그것들은 크게 두 범주로 나누어진다. 급성습우(condyloma acuminata)와 편평경우췌(flat cervical warts)가 그것이다. 습우는 바이러스입자를 함유한 것이 관찰되었고 분자적 연구에서 이들 병소의 90% 이상의 HPV-6이나 HPV-1l DNA를 함유하고 있음이 밝혀졌다(L. 기스만, L. 윌닉, H. 기센버그, U. 콜도프스키, H. G.슈너흐와 H. 쥬어 하우젠, proc, Natl. Acad. Sci, USA 80,560-563,1983). 급성습우는 일반적으로 남경, 음문, 또는 그 주변부에서 발행한다. 급성습우는 자발적으로 퇴행하거나 몇년간 지속하고 매우 낮은 비율이지만 악성종양이 되기도 한다. 다른 생식성 우췌와 달리, 자궁경에 나타나는 우췌들은 돌기형태보다는 편평형태가 많고, 일반적, 치료적으로 팹스미어(Pap smear)에 의해 감지된다. 경의 형성불량을 위한 PV 병원학은 1970년대 말에 상기 불량형성과 관계된 HPV 감염에 기인한 팹스미어 세포학적 변화에 관련됨을 제시된 세포학자들의 연구에 의해 제기되었다. 다른 연구자들은 이들 병소들의 몇몇 형성불량세포들에서 바이러스 입자들의 존재와 바이러스성 카스피드항원의 존재를 보여주었다. 이런 관련은 종래의 치료적인 연구들이 경의 형성불량(CIN, 또는 경의 내부-표피 신형성)은, in situ에서 경의 침입형 비늘모양 상피세포 악성종양의 전구체로 차례차례 바꿜것으로 생각되는, 악성종양이 될 전구체라고 발표한 때문에 중요하다. HPV-16과 18형은 경 악성종양으로부터 직접 분지(clone out)되어 떨어진다.(M. 뒤르스트, L. 기센, H. 이켄버그, 및 H. 쮸어 하우젠, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3812-3815, 1983 ; M. 보샤르트, L. 기센, H. 이켄버그, A. 클라인하인쯔, W. 슐러렌, 및 H. 쮸어 하우젠, EMBO J. 3, 1151-1157, 1984) 이들은 하이브리드화 탐침으로 이용되어 인간 경 악성종양의 70% 이상과 각 HPV형의 존재에 양성으로 기록된 유도세포주를 보여준다. 다른 20%는 부가적인 HPV-31, HPV-33, 및 HPV-35와 같은 HPV형을 보여준다.
국가 치료지표에서 모은 자료들은 1984년에 224,990명의 생식성 우췌환자가 일차 진료기관을 찾았고 156, 720명의 생식성 헤르페스환자가 일차 진료기관을 방문하였다. 생식성 우췌의 발병은 1970년대와 1980년대를 통하여 꾸준히 증가하였고 최근의 역학조사는 1950년대에서 1978년까지 인구 1백만명당 106.5명이 발병하여 최고조에 달하였다. 25∼55세의 여성에서 경의 HPV 감염은 0.8%로 밝혀졌고 22세 여성의 경우 2.7%나 되었다. 보통 여성들에 대한 최근의 세포학적 연구는 잠재감염률이 11%에 이르는 것을 보여준다 그러므로, 커다란 발생과 유행을 보일 병의 잠재기가 나타날 것이다.
생식성 우췌의 발병은 미합중국 임산부의 약 2.5%에서 동정되었으며 매년 60,000∼90,000명의 임산부에게서 나타남을 암시하는 것이다. HPV 감염은 임산부에게서 2배나 더 유행함을 알 수 있다. 매년 후두 유두종증(Larynageal Papillomatosis)이 새로 1,500명 정도 발병할 것으로 평가되며 모체에서 신생아로의 감염위험은 1 : 80∼1 : 20 정도로 계산된다.
후두 유두종증은 후두의 양성 상피종양이다. 두가지 PV형인 HPV-6과 HPV-11은 가장 일반적으로 후두 유두종증과 관련된다. 치료적으로, 후두 유두종증은 두 그룹으로 나누어진다. 유년개시기(Juvenile onset)와 성인개시기(adult onset)가 그것이다. 유년개시기에서 신생하는 생식성 PV에 감염된 출생관(birth canal)을 통과하는 시간에 감염되는 것으로 생각된다. 병은 대개 2세경에 명백해지며 외과적인 개입이 없으면 공기통로를 궁극적으로 페색시키는 양성 유두종이 느리지만 점차적으로 자라는 특징이 있다. 이런 유두종들은 항상 재발한다. 환자들은 결국 많은 수술과 그로 인한 합병증등에 의해 죽게 된다. 후두 유두종증의 유년개시기용의 치료적 처리는 아직 없으며 자발적 퇴행도 흔하지 않다. 성인개시기 후두 유두종증은 위협적이지 않고 자주 자발적 차도가 진행된다.
PV 감염과 관련된 가장 흔한 질병은 양성 피부우췌이다. 일반적인 우췌들은 보통 HPV형 1,2,3,4 또는 10을 포함한다. 이들 우췌들은 전형적으로 발바닥, 또는 손등에 나타난다. 일반 피부우췌는 가장 흔하게 아이들과 청소년들에게서 나타난다. 인생의 후반기에는 일반우췌의 발병이 면역학적, 생리학적 변화에 의해 감소하는 듯하다. 발바닥우췌는 쇠약해질 수 있고 외과적 제거가 요구되며 종종 수술후 다시 재발하기도 한다. 아직은 발바닥우췌에 대한 믿음직한 치료법은 없는 실정이다.
상피형성불량우췌형성(Epidermodysplasia Verruciformis, EV)는보기드문 유전적 매개질병으로 작고 불그스레한 반점으로 보이는 널리 퍼진 편평우췌들에 의해 특징지워진다. HPV형의 다양한 것들이 EV와 관련되어 있다. 시간에 따라 대략 1/3가량의 EV 환자들이 비늘모양세포 악성종양(squamens cell carcinoma ; scc)가 피부곳곳에 다발한다. 보통 SCC는 태양에 노출되는 피부부위에 생긴다. PV와 연관된 EV의 한 부류의 EV가 SCC, HPV-5 및 HPV-8에서 발견된다. 유전적 배열, 면역학적 이상 및 UV 과 다방사와 HPV는 모두 이런 환자들에서 SCC의 발달에 공헌한다.
PV 게놈은 두줄로 된, 공유적으로 폐쇄상태의 약 8,000베이스페어의 원형 DNA 분자로 구성되어 있다. 완전한 뉴클레오타이드 시퀀스와 동물과 인간의 PV 유전적 구성의 수효는 보바인 PV-1형(BPV-1)으로 결정되어 왔다(E.Y. 첸, P.M. 하울리, A.D. 레빈슨 및 P.H. 시버그, Nature 299, 529-534, 1982). 몇몇 PV 게놈의 도면이 제l도에 도시되어 있다. 바이러스성 전사는 일방향적이다. 모든 바이러스 mRNA는 바이러스성 DNA의 같은 줄(strand)로부터 번역된다.(L. W. 엥겔. C. A. 헤일만, 및 P. M. 하울리 J. Viro1. 47, 516-528, 1983 ; C.A. 헤일만, L. 엥겔, D.R. 로위, 및 P.M. 하울리, Virology 119, 2234, 1982) 코딩 스트랜드는 10개의 지정된 리딩 프레임(ORFs)을 갖는다. 개개의 ORFs는 PV 게놈에서의 위치에 따라 초기와 후기 ORFs로 분류되고 감염된 세포에서의 비생산성 발현과 생산성 발현의 패턴에 따라 분류하기도 한다. 제2도는 BPV-1용의 몇몇 ORFs의 관계를 나타낸다.
설치류 동물세포를 형질전환시킬 수 있는 능력과 그 게놈을 형질전환된 에피좀(episome)으로 유지하는 능력때문에 BPV-1은 in vitro 연구에서 PV의 모델역할을 한다. 그 결과, BPV-1은 모든 PV 가운데 가장 특징적이다. BPV-1 게놈은 7976 염기쌍의 길이이며 분지되고 시퀀스되어 왔다(첸등, 1982, 아래).
BPV-1의 DNA 시퀀스 분석은 8개의 초기(ear1y ; E)와 2개의 후기(late ; L) 오픈리딩 프레임(ORFs)을 한정한다. 전기와 후기로서 ORFs를 지정하는 것은 비생산성으로 감염된 형질전환세포와 통과가능하게 감염된 세포들의 발현패턴에 기초해서이다.(하일만 등, 이하 ; C. C. 베이커 그리고 P. M. 하울리, EMBO J. 6, 1027-1035, 1987).
모든 ORFs는 같은 DNA 스트랜드를 포함하여 모든 mRNA는 코딩 스트랜드로부터 전사된 것으로 보이는 특성을 가진다(E. 암트만 및 G. 사우어, J. virol. 43, 59-66 1982) BPV-1 ORFs이 기능은 DNA 재조합 기술에 의해서 분석되며 시험관내(in vitro) 세포배양 시스템에서도 분석된다. 몇몇 ORFs는 다중기능을 가진 것으로 생각된다. E5와 E6 ORFs는 형질전환 단배질을 엔코드(encode)하는 것으로 보인다(Y. C. 양 H. 오카야마, 및 P. M. 하울리, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1030-1034, 1985). E1과 E7 ORFs는 감염된 세포내에서 BPV-1 게놈의 복제본(COPY) 수효를 높게 유지하는 것과 관련이 있다.(M. 러스키, 및 M. R. 보트찬, J. Virol. 53, 955-965, 1985).
3' El ORF는 바이러스성 게놈 복제와 바이러스성 게놈의 유지를 위해 요구되는 요소를 엔코드한다.(M. 러스키, 및 M. R. 보트찬, J. Virol 60, 729-742, 1986). 5' El ORF 바이러스성 DNA 복제의 한 기준 치수(modular)를 엔코드한다(J. M. 로버츠, 및 H. 와인트라움, Ce11 46,741-752, 1986). E2 ORF의 전체 길이는 바이러스성 전사를 트랜스액티베이트시키는 하나의 단백질을 엔코드하는데(B. A. 슈팔홀쯔, Y. C. 양 및 P. M. 하울리, Cel1 42, 183-191, 1985) 이것은 3' E2 ORF가 바이러스성 전사의 트랜스리프레셔를 엔코드하는 동안에 진행된다(P. F. 램버트, B. A. 슈팔홀쯔, 및 P. M. 하울리, Cell 50, 69-78, 1987). BPV-1의 E3, E4 및 E8의 기능이 정의되었다.
Ll(L. W 카우서트, W. P. 필라신스카, 및 A. B. 젠슨, Virology 165, 613-615, 1988)과 L2가 캡시드 단백질을 엔코드한다.
본 발명에 의하여, 당, 분야의 전문가는 손쉽게 DNA의 오픈리딩 프레임에 의한 mRNA의 동정을 이해할 수 있을 것이고 상기 DNA의 ORF로부터의 정보를 포함할 뿐만 아니라 5′캡부위, 5' 미번역부위, 3' 미번역부위로 알려전 부위들을 형성하는 뉴클레오타이드와도 관련이 된다. 그래서, 올리고뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드의 유사체는 부분 또는 전체적으로 정보가 되는 뉴클레오타이드와 관련된 리보뉴클레오타이드를 목표로 하는 본 발명에 의하여 수식화될 것이다.
BPV-1 게놈의 내에 1000 염기쌍의 길이로 7,094와 48 사이에 위치한 부위는 더 이상의 코딩 잠재력을 갖지 않는다. 이 부위는 롱 컨트롤 레젼(long control region ; LCR)로 언급되고 있다. LCR은 바이러스성 전사와 복제조절용에 필수적인 다중 CIS 조절인자를 갖는다. ORFs의 기능적 할당에 관한 요약은 테이블 1에 정리되어 있다.
BPV-1 게놈의 번역은 다중 프로모터의 존재와 복잡하고 변화되는 슬라이스패턴에 의해 완성된다. 다양한 방법으로 18가지의 다른 mRNA 종이 동정되었다(E. 암트만, 및 G. 사우어 J. Virol 43, 59-66, 1982 ; S. 베네트, J. 모레노-로페스, 및 U. 페더슨, Nucleic Acids Res. 15, 8607-8620, 1987 ; L. W. 엥겔, C. A. 하일만, 및 P. M. 하울리, J. Viro1. 47, 5l6-528, 1983 ; C. A. 하일만, L. 엥겔, D. R. 로우리 및 P. M. 하울리, Virology l19, 22-34, 1982 ; C. C. 베이커, P. M. 하울리, EMBO J. 6, 1027-1035, 1987; A. 슈텐룬트, J. 자비엘스키, H. 아홀라, J. 모레노-로페스, 및 U. 페터슨, J. Vol Biol, 182, 541-554, 1985, 그리고 Y. C. 양, H. 오카야마, 및 P. M. 하울리, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 82, 1030-1034, 1985).
모든 초기 mRNA는 초기 ORFs의 다운 스트림(down stream)에 위치하는 뉴클레오타이드(nt) 4180에서의 일반적인 폴리아데닐레이션 시그널(polyadenylation signal)을 이용하는 것으로 보이며, 반면에 후기 mRNA는 nt 7156에서 다음 폴리아데닐레이션 시그널을 이용하는 것으로 보인다. BPV-1 cDNA의 시퀀스 분석은 다중 5' 스플라이스자리(nt 304, 864, 1234, 2505, 3764 및 7385)와 3' 슬라이스자리(nt 528, 3225, 3605, 5609)가 변환적인 스플라이싱에 의해 결과됨을 밝혔다. 대개의 BPV-1 mRNA들의 5' 단부는 nt 89에 지도되며 nt 89와 초기 스플라이스 주게자리인 nt 304 사이에 일반 부위를 가진다. 다른 mRNA들의 5' 단부는 nt 890,2443 및 3080에 지도된다.
다른 종에서 유래한 PV DNA내에서의 차이가 있을 것으로 기대되며 한 종내에서도 차이가 예상된다. 그러나 현재는 다앙한 PV의 ORFs 사이의 유사성처럼 본 발명의 구체예의 효과가 나타나듯이 분명한 차이점도 있다. 그래서 예를 들자면, 다양한 PV의 E2 부위가 본질적으로 각각의 PV용의 길은 기능을 수행하고 E2 유전정보의 발현 방해는 다양한 종에서 유사한 결과를 가져오게 될 것으로 믿어진다. 이것은 PV 종들 사이에 존재가 의심스러운 뉴클레오타이드 시퀀스내의 차이가 있을지라도 그럴 것이라고 여겨진다.
따라서, 본 발명의 명세서에 기재된 뉴클레오타이드 시퀀스는 설명된 특정 종을 대표로 하여 이해될 수 있을 것이다. 다른 종의 PV용으로 상동 또는 유사 시퀀스는 본 발명의 영역내에서 특히 고려될 수 있다.
초기의 유전적 실험은 E2의 결실(deletion)이나 돌연변이(mutation)가 E2용의 형질변환 기능을 제공하는 C127 세포에 활성을 형성하는 BPV 초점의 손실을 가져온다. 후기의 연구는 E2가 바이러스성 번역의 조절자(regulator)이며 E2의 돌연변이에 의한 형질전환 능력의 상실은 E2의 조건적 신장을 통한 다른 형질전환 유전자의 조절하강에 기인한 것임을 보여준다. E2 ORF 전체길이는 바이러스성 초기 유전자들의 번역을 촉진하는 E2 트랜스액티베이터를 엔코드한다. E2 트랜스액티베이터는 제2도에 도시된 종 N과 같이 nt 2443에 지도되는 5' 단부를 가지는 비스플라이싱 mRNA로부터 번역된다. E2 트랜스리프레서는 E2 트랜스액티베이터의 N-말단부쪽을 절두한(truncated) 형태이고, nt 3089의 프로모터에 의해 E2 ORF내의 번역개시에 의해 생성된다. 제2도의 종 0에서 트랜스엑티베이팅(5′부위)와 DNA 바인딩도메인(3'부위)은 E2의 회문형(palindromic) DNA 인식 시퀀스(ACCN6GCT)와 같이 동정된다. E2 mRNA와 단백질은 60분 이하의 매우 짧은 하프라이프(half life)를 갖는 것으로 보인다. E2 트랜스레귤러터리(transnegulatory)회로는 PV의 일반적인 특징이다. E2 트랜스레귤레이터는 최근에 조사된 PV에서 모두 언급되었다.
PV 게놈은 나성의(naked) 55mm의 직경을 가진 정 20면체 캡시드이다. 바이러스성의 캡시드는 비포장상태이고 글라이코실화(glycosylated)되지 않았다. 두가지 바이러스성의 엔코드된 단백질들인 L1과 L2가 캡시드를 구성한다. L1은 캡시드 단백질의 주성분으로 비리온(virion)에 존재하는 단백질의 80%를 구성하고 50∼60KD 사이의 분자량을 가진다. L2는 이론상으로 51KD이나 76KD까지 이동하기도 하는 부성분이다. PV는 시험관내(in vitro)에서 생성될 수 없고 매우 적은 수의 성숙된 비리온(virion)을 만들기 때문에 PV의 혈청학적인 연구가 상세히 진행될 수 없었다.
PV 라이프 사이클은 복잡하며 아직 잘 이해되고 있지 않다. 오늘날까지 시험관내에서 성숙한 PV의 생성이 이루어지지 않았기 때문에 아직 PV의 라이프 사이클을 특성화시키는 작업이 수행될 수 없었다. PV는 종간의 장벽을 넘기 어려워 제한된 범위내에서 숙주(host)를 가진다. 더하여 PV는 상피, 점막, 및 케라틴화(keratinizing)의 분화를 통해 감염한다.
PV 유전자 발현의 조절은 숙주 상피세포의 분화 프로그램과 밀접하게 연계된다고 생각하고 있다. 최근에 생각하고 있는 PV 라이프 사이클은 다음과 같다 : 감염성의 PV 입자가 외상을 통하여 상피세포의 외부층으로 침투하고 숙주조직의 기저세포를 감염시킨다. 거기서 바이러스는 상대적으로 낮은 염색체성 요소의 카피(Copy)로 유지된다. 상피세포가 분화과정을 시작하고, PV 게놈의 다수의 복사본으로 복제됨에 따라, 세포는 분화의 말기상태를 행하기 시작하여 후기 유전자들이 발현되고 바이러스성 게놈은 캡슐화된다.
PV는 항감작요법의 이상적인 목표로 밝혀졌다. 첫째, PV 병소는 외부적이고, 항감작 올리고뉴클레오타이드의 전달에 대한 주체적인 접근을 허용하고 급격한 사라짐등의 많은 문제를 없애며, 합성된 올리고뉴클레오타이드의 시스템적 복용과 관련된 치료적으로 활성을 가진 올리고뉴클레오타이드의 조직농도를 얻는 것이다. 둘째, 바이러스성 게놈은 각각 분리된 유전적 요소로 감염된 세포내에 유지된다. 이는 치료적 요법의 가능성의 문을 여는 것으로 바이러스의 복제기능을 공격한다.
PV 게놈의 E2 ORF는 특히 항감작 올리고뉴클레오타이드 디자인에 안성맞춤이다. E2는 BPV-1과 HPV 시스템의 바이러스성 전사의 주요한 트랜스엑티베이터로 보여졌다. E2 ORF의 돌연변이는 형질전환과 외부염색체성 DNA 복제에 다중효과를 나타낸다.(D. 디마이오, J. Virol. 57, 476-480, 1986 ; D. 디마이오, 및 J. 세틀맨, EMBO J. 7, 1197-1204, 1988 ; D. F. 그로프 및 W. D. 랭카스터, Virology 150, 22l-230, 1986, M. S. 랩슨, C. 이이, Y. C. 양 및 P. M. 하울리, J. Virol. 60, 626-634, 1986 ; 그리고 N. 사버, M. S. 랩슨, Y. C. 양, J. C. 번, 및 P. M. 하울리, J. Virol 52, 377-388, 1984). E2 ORF는 전사의 트랜스엑티베이터를 엔코드하는 것으로 보인다(B. A. 슈팔홀쯔, Y. C. 양, 및 P. M. 하울리, Cel1 42, 183-19l, 1985). 내부 AUG의 번역개시에 의해 생성된 E2의 절두된(truncated) 번역은 전사의 트랜스리프레서로 보인다(P. F. 램버트, B. A. 슈팔홀쯔, 및 P. M. 하울리, Cell 50, 69-78, 1987). DNA 바인딩 도메인, 100 아미노산의 카르복시말단(A. A. 맥브라이드 R. 쉘레겔, 및 P. M. 하울리, EMBO J. 7, 533-539, 1988)과 DNA 인식 시퀀스, ACCN6GGT(E. J. 안드로피, D. R. 로위, J. T. 쉴러, Nature 325, 70-73, 1987, 그리고 C. 모스칼루크, 및 D. 바스티아, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1215-1218, 1987)이 동정되었다. E2의 전사 조절회로는 PV에서 일반적인 특징을 가진다. E2 트랜스 레귤레이션은 최근에 조사된 각각의 다른 PV에서 나타났다.(D. 기우스, S. 그로센, M. A. 베델 및 L. A. 라미니스, J. Viro1 62, 665-672, 1988 : H. 히로치카, T. R. 브로커, L. T. 초우, J. Viro1 61, 2599-2606, 1987 ; M. T. 친, R. 히로치카, T. R. 브로커, 및 L. T. 초우, J. Virol 62, 2994-3002, 1988 : W. C. 펠프스, 및 P. M. 하울리, J. Viro1, 61, 1630-1638; 그리고 F. 티에리, 및 M. 야니프, EMBO J. 6, 3391-3397, 1987).
본 발명자는 동물과 인간이 공유하는 PV의 강제적인 바이러스성 전사요소의 동정(identification)은 E2를 PV 연구, 진단 및 치료로 향하는 항감작연구의 제일목표가 되도록 함을 밝혔다.
본 발명자는 E1 자리(locus)가 PV를 공격하는 자리로서 유망함을 천명하였다. 설치류의 섬유아세포 BPV-1 형질전이의 개시 돌연변이분석은 바이러스성 DNA 복제의 조절자를 E1으로 동정하였다. 3' El ORF는 바이러스성 게놈의 복제와 유지에 필요한 요소를 엔코드한다(N. 사버, M. S. 랩슨, Y. C. 양, J. C. 번, 및 P. M. 하울리, J. Viro1 52, 377-388, 1984; M. 러스키, M. R. 보트찬, J. Viro1 53, 955-965; 그리고 M. 러스키, M. R. 보트찬, J. Viro1 60, 729-742, 1986). E1 전사의 발현억제는 BPV-1(잠재적으로 HPV)이 감염된 세포내에서 그들의 DNA를 복제하는 능력을 저해하는 것이라고 믿고 있다.
본 발명자는 E7 위치가 PV에 대한 치료, 진단, 연구를 향한 더 큰 문을 열어줄 것이라고 생각한다. BPV-1내에서 E7은 바이러스성의 DNA 복제와 연관된다고 생각된다(L. J. 버그, K. 싱, 및 M. 보트찬, Mol. Cell. Bio1. 6, 859-869, 1986) HPV-16에서 E7은 형질전환과 불멸성에 관련있음이 나타난다. 이때 HPV의 E7이 바이러스성의 DNA 복제와 관련되어 있는지는 확실하지 않으나 E7의 특정 항감작 올리고뉴클레오타이드나 그 유사체는 바이러스성의 BPV 복제를 억제한다고 믿고 있다.
HPV는 E6-E7 부위는 형질전환되는 부위이다. 바이러스의 라이프 사이클에서 이 부위의 정확한 목적은 아직 잘 알려져 있지 않다. 그러나, 이 부위가 바이러스 유도성 병소의 생물학의 중심이 되기 때문에 이 부위를 목표로 하는 올리고뉴클레오타이드는 본 발명의 목적에 유용할 것이다.
최근의 연구는 mRNA의 5'와 캡부위와 시작 코돈을 지향하는 올리고뉴클레오타이드가 유전자발현을 저해하는데 가장 효과적임을 제시하고 있다. PV 전사의 한 특징은 많은 mRNA가 번역되지 않은 5' 부외와 캡을 가진다는 것이다. 그래서 이 부위를 지향하는 항감작 올리고뉴클레오타이드가 하나 이상의 mRNA를 무력화시킬 잠재력을 갖는다. 다수 바이러스성 유전자의 폐색(shut down)은 부가적 형태에서 바이러스성 게놈의 근절에 상승작용을 할 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예의 실시예 따른 항감작 공격의 바람직한 목표가 되는 mRNA로 결정될 PV 게놈의 ORFs는 역시 다른 mRNA의 부위도 엔코드한다.
앞서 나온 ORF가 테이블 1에 요약되어 있다.
[표 1]
본 발명은 PV mRNA의 기능의 항감작 억제에 쓰이는 올리고뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드의 유사체를 채택하고 있다. 본 발명의 내용에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 자연생성염기와 원래의 포스포다이에스터(phosphodiester) 결합에 의하여 조합된 사이클로퓨라노실 그룹으로부터 형성되는 폴리뉴클레오타이드를 말한다. 이 용어는 자연발생종이나 자연발생적 단위나 유사체로부터 형성되는 합성종을 효과적으로 언급할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 유사체는 본 발명에서 올리고뉴클레오타이드와 기능이 비슷하지만 비자연발생적 부분을 갖고 밀접한 상동성을 갖지 않는 일부분을 언급한다. 그래서, 올리고뉴클레오타이드 유사체는 당 부분(sugar moiety)나 당 관련물(inter-sugar linkage)로 변형될 수 있다. 이들 가운데에서 예를 들자면 포스포로티오에이트(phosphorothioate)와 다른 황을 포함하는 종물을 들 수 있다. 몇몇 바람직한 구체예에 의하여, 적어도 약간의 올리고뉴클레오타이드 포스포다이에스터 결합은 RNA의 기능이 조절될 수 있는 위치의 세포부위속으로 침투하는 조성물의 능력을 신장시킬 기능을 가진 구조로 대체될 수 있다. 그러한 대체물들은 포스포티오에이트 결합, 메틸 포스포티오에이트 결합, 또는 짧은 사슬의 알킬이나 사이클로로 알킬구조로 이루어진다. 다른 바람직한 구체예에 따르면, 포스포다이에스터 결합은 즉시, 본질적으로 비이온, 비수형(non-chiral) 구조로 대체될 수 있다. 당 분야의 전문가는 본 발명의 실시예 이용될 다른 연관을 선택할 수도 있을 것이다.
올리고뉴클레오타이드 유사체는 또한 적어도 몇가지 변형된 염기형태를 포함할 수 있다. 그래서 자연에서 일상적으로 발견되는 것과 다른 퓨린과 피리미딘이 채용될 수 있다. 유사하게, 뉴클레오타이드 서브유니트의 사이클로 퓨라노스 부위의 변형이 본 발명의 핵심적인 교의에 따르는 한 발생할 수 있다.
그러한 유사체들은 자연적인 올리고뉴클레오타이드 또는 합성된 올리고뉴클레오타이드와 기능적으로 교환 가능한 것으로 가장 잘 설명되지만, 자연적인 구조와는 하나 이상의 차이점을 가진다. 상기의 모든 유사체들은 PV의 mRNA와 효과적으로 하이브리드되어 mRNA의 기능을 억제하는 한 본 발명에 의하여 이해될 수 있다.
본 발명에 마른 올리고뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드 유사체는 3∼50 서브유니트로 구성된다. 상기 올리고뉴클레오타이드와 유사체는 8∼25 서브유니트로 되는 것이 좋으며 12∼20 서브유니트로 되는 것이 가장 바람직하다. 한 서브유니트는 염기와 당 조합물로 포스포다이에스터나 다른 결합을 통하여 주위의 서브유니트와 적절하게 곁합한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드나 올리고뉴클레오타이드 유사체는 PV mRNA의 일반적인 기능을 방해하여 바이러스에 대한 이용성을 상실하게 된다. 방해받는 mRNA의 기능은 단백질 번역용 자리로의 mRNA의 전좌, RNA로부터 단백질의 실질적인 번역, 심지어 RNA에 의해 관련되는 독립적인 효소작용같은 활성기능을 포함한다. RNA 기능을 방해하는 전체적인 효과는 PV가 RNA의 이점을 상실하게 하여, 바이러스성의 게놈발현의 방해를 경험하게 한다. 그러한 방해는 보통 치명적이다.
본 발명에 의하여, 바이러스에 대한 메타볼리즘적인 중요성을 신장시키는 mRNA를 방해하도록 구성된 올리고뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드의 유사체를 제공하는 것이 좋다. 위에 설명한 것처럼, El, E2, E7, 또는 E6-7 PV mRNA가 바람직한 목표이다.
뉴클레오타이드에 의해 코드된 RNA를 억제하는 것이 기본적으로 2443-3080 또는 89∼304 뉴클레오타이드의 보바인(bovine) PV-1과 등가되어서 바람직하여 특히 공격을 위한 약점부위를 특히 대표한다고 믿어지는 이들이 필수적인 단백질을 이끄는 RNA의 복수성을 코딩(coding)한다고 믿어진다. PV를 차별화하는 것이 BPV-1으로부터 다소간 구조를 얻지만, 기본적으로 유사한 지역이 일상적으로 결정된다.
제3도, 제4도 및 제5도는 BPV-1 게놈위의 이 지역을 나타내며 특별한 PV 내의 대조부분에 의해 코드된 RNA를 방해하도록 디자인된 어떤 올리고뉴클레오타이드나 올리고뉴클레오타이드 유사체는 이들 PV의 작동을 방해하는 특별한 유틸리트(utility)를 가지는 것 같다. 테이블 2에 BPV-1의 E2 mRNA를 목표하는 올리고뉴클레오타이드의 예가 나타나 있다.
[표 2]
테이블 3에 HPV-11의 번역개시코돈을 목표로 하는 올리고뉴클레오타이드의 예가 나타나 있다.
[표 3]
HPV-11의 번역개시 코돈을 목표로 하는 항감작 올리고뉴클레로타이드
그러므로, 위에 나온 20개의 올리고뉴클레오타이드(또는 그 유사체)나 당 분야의 전문가들이 손쉽게 준비할 수 있는 비슷한 올리고뉴클레오타이드(또는 그 유사체)를 사용하는 것이 바람직하여 상기한 바와 같이 PV 게놈의 E2 ORF의 부위가 바람직하다. 각 부위에 관한 시퀀스의 지식으로부터 다른 바람직한 PV, El, E7, 및 E6-7의 ORF 목표에 관한 테이블이 만들어질 수 있을 것이다.
올리고뉴클레오타이드나 올리고뉴클레오타이드 유사체는 상기 테이블과 정확히 들어맞거나 PV 게놈의 지도를 그대로 따른 해석이 필요한 것은 아니다. 오히려 본 발명의 게놈구조에의 엄밀한 집착과 올리고뉴클레오타이드로의 문자적 번역으로부터 약간의 이탈을 허용한다. 그러한 구조적인 변경은 필수적인 올리고뉴클레오타이드와 그 유사체의 하이브리드와 기능이 결과적으로 나타나는 한 일어날 수 있다.
비슷하게, 다양한 PV 사이에서 종다양성(Species Variation)이 일어날 수 있다. 반면에 예를 들어, E2, El 등의 다양한 부위가 종에 따라 매우 유사하여 약간의 분화가 일어난다. 이 다양성을 설명하는 올리고뉴클레오타이드와 그 유사체내의 변화는 본 발명에 의해 특별히 숙고하게 될 것이다.
본 발명에 쓰이는 올리고뉴클레오타이드나 그 유사체는 고체상 합성(solid phase synthesis) 기술에 의하여 손쉽고 일상적으로 만들어질 수 있다. 그러한 합성을 위한 장비는 응용생물시스템을 포함하는 몇몇 제조회사에서 구입할 수 있다. 그러나 상기 합성을 위해서 사용할 수 있는 다른 어떤 수단도 이용가능할 것이다. 다량의 물질이 필요할 때는 발효기술을 사용하여 적절한 올리고뉴클레오타이드를 준비할 수 있을 것이다. 올리고뉴클레오타이드 실제적인 합성은 전문가의 수완에 의하여 잘 이루어질 것이다.
포스포티오에이트와 알킬화된 유도체와 같은 다른 올리고뉴클레오타이드 유사체도 비슷한 기술로 준비될 수 있다고 알려져 있다.
E2의 발현을 억제하는 E2 특이적인 항감작 올리고뉴클레오타이드의 능력을 확인하기 위한 바람직한 시험은 E2의 트랜스액티베이션 성질을 나타낸 글들에서 잘 알 수 있다. (슈팔홀쯔 등, J. Viro1 61, 2128-2137, 1987). 리포터 플라스미드(E2RECAT)는 E2 의존확장자(enhancer)로 기능하는 E2 반응적인 요소를 포함하도록 구축된다.
E2RECAT는 또한 SV40 초기 프로머터, 초기 폴리아데닐레이션 시그널, 및 클로람페니콜 아세틸 전이효소유전자(Chloramphenicol acetyl transferase gene)을 포함한다. 이 플라스미드의 내용내에서, CAT 발현은 E2의 발현에 의존한다. E2의 존재하여 CAT 발현의 의존은 BPV-1, 비감염 C127 세포, 및 E2 RECAT와 E2 발현벡터로 대조감염된 C127 세포로 이 플라스미드를 옮겨 실험되었다.
항감작 올리고뉴클레오타이드 E2 트랜스액티베이터 mRNA의 주요 부분을 목표로 고안되었다. (제6도) 목표는 mRNA 캡(CAP) 부위, 번역종결코돈, 폴리아데닐레이션 시그널 등을 포함하지만 거기에 제한되지는 않는다. 다양한 목표에 상보하는 15∼30 잔기의 올리고뉴클레오타이드는 야생형의 포스포다이에스터 인터뉴클레오시딕 연관(phosphodiester internucleosidic linkage) 이나 변형된 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시딕 연관(modified phosphorthioate internucleosidic linkage)과 합성된다. mRNA 캡부위 (I1751)와 E2 트랜스엑티베이터(I1753)용의 번역코돈을 목표로 하는 올리고뉴클레오타이드는 초기 스크린(screen)의 1마이크로 몰농도에서 E2 트랜스액티베이션의 감소를 나타낸다. (제7도)
E2 트랜스리프레서(제6)의 번역개시코돈을 목표로 하는 올리고뉴클레오타이드(I1756)은 나타난 것처럼 트랜스리프레션에 부분적인 도움을 줄 수 있고 CAT 활성에서 증가한다. (제7도). 비슷한 길이와 염기조성을 갖는 다른 올리고뉴클레오타이드가 E2 mRNA의 다른 부위를 목표로 하는 것은 다른 비감수성 대조구(nonsense control) 처럼 항감작효과를 나타내지 못한다. 일반적으로, 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시딕 연관이 변성된 올리고뉴클레오타이드는 자연적인 포스포다이에스터 인터뉴클레오시딕 연관을 포함하는 같은 시퀀스의 올리고뉴클레오타이드보다 효과적이다. 이것은 혈청내에 포함되고 세포내에 있는 뉴클리에이즈(nuclease)에 대해 증가된 포스포로티오에이트 저항때문인 것 같다. 복용반응곡선은 50∼100nM의 범위내에서 50% 방해농도(IC50)를 가지는 반면에 500nM의 I1751은 10배 높은 IC50을 갖는다. (제8도)
E2 트랜스액티베이터의 번역개시코돈의 확인과 성공적인 항감작 목표로서의 트랜스리프레서의 확인 후에 포스포티오에이트의 부가적인 세트는 부위의 보다 주의깊은 탐침을 위하여 고안되었다. (제9도).
이 데이타는 적절한 AUG로 싸인 15∼20개의 올리고뉴클레오타이드가 E2 트랜스액티베이션이나 트랜스리프레션을 방해할 수 있음을 보여준다. (제10도 및 제11도).
BPV-1의 생물학적인 in situ에서의 E2 트랜스액티베이터의 감소 결과를 결정하기 위하여, 항감작 올리고뉴클레오타이드는 C127 세포의 BPV-1 형질전환을 방해하거나 약화시킬 수 있는 능력이 시험되었다. (제12도).
I1751과 I1753의 복용반응곡선은 10nM의 범위에서 I1753의 IC5을 가져 본 실험에서 이들 두 화합물의 IC50이 차이를 나타내고 번역개시코돈이 보다 좋은 목표라는 가정을 트랜스액티베이션의 방해에서 관찰하게 된다.
게놈위로 복제하는 BPV-1의 능력에 관한 E2를 목표로 하는 항감작 올리고뉴클레오타이드의 효과를 시험하기 위하여, BPV-1에 의해 안정되게 형질전환되는 I-38 세포는 I1753과 I1751과 바이러스성 DNA로 처리된다(제14도).
세포 당 1마이크로 몰농도의 바이러스성 DNA 복사본이 처리된 48시간 후 기부(basis)는 약 3 정도의 요소(factor)로 감소된다. 이 실험 도중에 세포는 2∼3번 분열한다. 이 데이타는 바이러스성 DNA가 세포성 DNA와 동조적으로 복제되는데 실패했음을 암시한다.
E2 단백질 합성에 관한 I1753의 효과를 시험하기 위하여 I-38 세포는 대사적으로 표지되고 E2 특정성 모노클로날항체와 면역침전 된다. 올리고뉴클레오타이드에 노출되지 않은 세포안, 또는 감작처리된 세포 또는 부적절한 올리고뉴클레오타이드 내에서 42kd의 E2 단백질이 존재한다(제15도). E2를 목표로 하는 올리고뉴클레오타이드로 처리된 세포내에서, 46kd 밴드(band)는 분실되어 올리고뉴클레오타이드가 번역의 하이브리드화 저지에 의해 작동됨을 제시한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드의 유사체는 진단, 치료, 및 실험시약과 기법으로 사용될 수 있다. 치료적인 이용을 위하여, 올리고뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드의 유사체는 손의 우췌, 발의 우췌, 후두의 우췌, 급성습우(condylomata acuminata), 상피형성불량 우췌형성(Epidermodysplasia Verruciformis), 편평경우췌(flat cerevical warts), 경의 내부표피신형성(Cerevical in traepithlial neoplasia), 또는 PV를 포함하는 다른 감염으로 고통 받는 동물에게 투여된다.
본 발명에 의하여 주제적으로, 병소적으로 치료시약을 적용하는 것이 바람직하다. 피부나 근육을 통한 투여도 유용할 수 있다. 좌약삽입도 현재로는 매우 유용한 것으로 생각된다. 예방적 차원에서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드나 올리고뉴클레오타이드의 유사체를 사용하는 것도 역시 유용할 것이다.
예를 들어 콘돔등에 약물을 도포하여 제공함으로써 투여가 이루어질 수도 있을 것이다. 약학적으로 수용가능한 운반체(carrier)의 사용은 몇가지 구체예를 위해 바람직할 것이다.
본 발명은 진단과 실험에 유용하다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드의 유사체는 PV와의 하이브리드가 가능하기 때문에, 이러한 면을 개발하는 샌드위치와 다른 실험(assay)들이 구축될 수 있다. 샘플내의 PV와 하이브리드되는 올리고뉴클레오타이드와 그 유사체를 검출하기 위한 방법용 설비가 손쉽게 이루어질 수 있다. 그러한 설비는 효소접합(engyme conjugation), 방사능표지, 또는 적절한 검출시스템을 포함한다. PV의 존재여부를 검출하는 수단도 역시 준비될 수 있다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 몇가지 PV 게놈의 유전적 지도이다.
제2도는 보바인 파필로마바이러스, BPV-1의 부분적 유전지도로서 게놈은 열려진 리딩프레임(reading frame)과 ORF, 및 게놈으로부터 전사된 mRNA를 보여준다.
제3도는 뉴클레오타이드 2443∼4203을 보여주는 BPV-1 E2 트랜스액티베이터 유전자 mRNA의 뉴클레오타이드 시퀀스이다.
제4도는 뉴클레오타이드 2443∼3080을 보여주는 BPV-1 E2 트랜스액티베이터 유전자 mRNA의 뉴클레오타이드 시퀀스이다.
제5도는 뉴클레오타이드 89∼304를 보여주는 초기 mRNA를 코딩(coding)하는 BPV-1의 번역 되지 않는 5' 부위이다.
제6도는 본 발명의 실시예에 따르는 항감작 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 시퀀스와 E2 mRNA 위에서의 올리고뉴클레오타이드의 상대적 위치이다. 올리고뉴클레오타이드 아이덴피파이어(Identifier)와, 시퀀스 및 기능적인 역할이 묘사되어 있다.
제7도는 본 발명의 실시예의 E2 발현에 따른 항감작 올리고뉴클레오타이드의 효과를 그래프로 묘사한 것이다. 올리고뉴클레오타이드는 mRNA CAP 부위(I 1751)을 목표로 하고 E2 트랜스액티베이터용의 전사코돈이 마이크로몰 농도에서 E2 트랜스액티베이션을 감소시킴을 보여준다.
제8도는 본 발명의 실시예에 따른 항감작 올리고뉴클레오타이드의 복용반응을 그래프로 나타낸 것이다. 상기의 복용반응곡선은 E2 트랜스액티베이터 mRNA에 대해 상보적인 항감작 올리고뉴클레오타이드(I l753)가 같은 메시지(I 175l)의 CAP 부위를 목표로 하는 올리고뉴클레오타이드가 500mM의 범위내에서 IC50을 가질 동안 50-100nM의 범위에서 50% 방해농도(IC50)을 갖는 전사초기코돈을 포함하는 영역내에 있음을 보여준다.
제9도는 E2 mRNA의 트랜스액티베이터와 트랜스리프레서를 목표로 하는 본 발명의 실시예에 따른 항감작 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 시퀀스이다.
제10도는 E2 mRNA의 트랜스액티베이터를 목표로 하는 선택된 올리고뉴클레오타이드의 효과를 나타낸 그래프이다. 15-20 부분은 E2 트랜스액티베이션의 억제를 보여주는 본 발명의 실시예에 따른 항감작 올리고뉴클레오타이드 부위이다.
제11도는 E2 mRNA의 트랜스액티베이터를 목표로 하는 선택된 올리고뉴클레오타이드의 효과를 나타낸 그래프이다. 15-20 부분은 E2 트랜스리프레션의 억제를 보여주는 본 발명의 실시예에 따른 항감작 올리고뉴클레오타이드 부위이다.
제12도는 BPV-1의 생물학적 in situ에서의 E2 트랜스액티베이터 시퀀스의 감소를 보여주는 사진이다. 본 발명의 실시예에 따라 제조된 항감작 올리고뉴클레오타이드는 C127 세포의 BPV-1 형성에 대한 저해능력과 약화능력이 시험되었다. 사진은 시험세포를 바닥에 깐 페트리디쉬이다.
제13도는 E2 mRNA의 트랜스액티베이터 부위를 목표로 하는 선택된 올리고뉴클레오타이드의 효과를 나타낸 그래프이다. 본 발명의 실시예에 따른 항감작 올리고뉴클레오타이드에 의해 만들어진 BPV-1 포커스의 억제가 나타나 있다. 상기 복용반응곡선은 I 1751과 I 1753을 실험한 것이며 I 1751이 100nM의 범위에서 IC50을 가지는 동안 I 1753은 10nM의 범위에서 IC50을 가지는 것을 보여준다.
제14도는 BPV-1이 자신의 게놈 위로 복제될 수 있는 본 발명의 실시예에 따라 만들어진 항감작 올리고뉴클레오타이드의 효과를 나타낸 그래프이다. 바이러스에 의해 변형된 세포들은 I 1753,I 1751 및 정량된 바이러스성 DNA로 처리되었다.
제15도는 올리고뉴클레오타이드가 대사적으로 표지된 처리세포나 모노클로날항체(monoclonal antibody)를 이용하여 면역침전(immunoprecipitated)된 비처리 대조구의 면역침전 실험의 결과를 보여준다.
제16도는 E2의 전사개시코돈부위의 HPV-11의 뉴클레오타이드 시퀀스이다.
[실시예 1]
항감작 올리고뉴클레오타이드에 의한 BPV-IE2 발현의 방해 C127 세포로 형질전환된 BPV-1은 12개의 우물(well)을 가진 판에 놓여진다. E2RE1으로 전염시키기 24 시간전에 세포들은 최종농도 5,15, 및 30nm의 성장배지에 항감작 뉴클레오타이드로 전처리하였다. 다음날 세포들은 칼슘 포스페이트(calsium phosphate) 침전에 의해 10μg의 E2RElCAT가 전염되었다. 10μg의 E2RElCAT와 10μg의 운반체 DNA(PUC 19)는 H2O 25μl의 최종부피에서 2M CaCl262μl와 혼합되었고, 다음에 250μl의 2×HBSP (1.5nM Na2PO2·10nM Kcl, 280nM Nacl, 12nM 글루코 오스, 및 50n M HEPES, PH 7.0)이 첨가되어 30분간 상온에서 인큐베이트 되었다. 이 용액 100μl가 각 시험우물에 첨가 되었고 37℃에서 4시간 동안 인큐베이트하였다. 인큐베이션 후에 세포들은 상온에서 1분동안 0.75nM Na2PO2,5nM Kcl,140nM NaCl,6nM 글루코오스와 25nM HEPES, PH 7.0내의 15% 글리세롤로 글리세롤 쇼크를 받았다. 쇼크를 받은 후에, 세포들은 자유 DMEM 혈청으로 2번 세척되고, l0% 치명적 보바인(bovine) 혈청과 원래농도에서 항감작 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 DMEM이 되먹여진다. 48시간 후에 전염된 세포들은 거두어지고 CAT 활성용으로 실험된다. CAT 활성을 결정하기 위하여, 세포들은 염분(saline)으로 완충된 포스페이트로 2번 세척되고 스크래핑(scraping)으로 수집되었다. 세포들은 100μl의 250nm. PH 8.0 트리스(tris)-Hcl로 재현탁되었고 3번 결빙-해빙에 의해 폐쇄되었다. 세포추출물의 24μl 가 각 실험을 위하여 이용되었다.
각 실험을 위하여 1.5ml 에펜도르프 튜브(Eppendorff tube)안에 다음 것들이 혼합되었다 : 세포추출물 25μl,4nM 아세틸 조효소 A 5μl, l8μl H2O와 1μl14C-클로람페니콜, 40-60mCi, nM과 37℃에서 1시간 동안 인큐베이트되었다. 인큐베이션 후 클로람페니콜(아세틸레이트된 형과 아세틸레이트되지 않은 형)이 에틸아세테이트와 증발로 추줄되었다. 표본은 25μl의 에틸 아세테이트에서 재현탁되었고 TLC 판위로 찍혀졌고 클로로포름 : 메탄(19 : 1)에서 크로마토그래프하였다. TLC는 자기방사(autoradiography)에 의해 분석되었다. 아세틸레이트된 것과 아세틸레이트되지 않은l4C-클로람페니콜에 따라 찍혀진 점들은 TLC 판으로부터 이동하였고 CAT 활성정량용의 액체 신틸레이션(scintillation)에 계수되었다. 복용의존형태에서 CAT 활성을 억제하는 항감작 올리고뉴클레오타이드는 양성으로 사료된다.
[실시예 2]
항감작 올리고뉴클레오타이드에 의한 HPV E2 발현의 방해
항감작 올리고뉴클레오타이드에 의한 HPV E2 억제용 실험은 BPV-l E2의 실험과 본질적으로 동일하다. HPV 실험은 CV-1이나 PSV2NE0 세포를 가진 A431 세포로 적절한 HPVs가 상기한 칼슘포스페이트 방법에 의하여 함께 감염된다. DNA를 채택하는 세포는 항생제 G418을 포함하는 배지내의 배양에 의해서 선택된다. G418 저항세포는 HPV DNA와 RNA로 분석된다. E2를 발현하는 세포는 항감작 연구의 목표세포로 이용된다. 각각의 항감작 올리고뉴클레오다이드 세포들은 상기한 바와 같이 L243ICAT의 전염과 CAT 활성의 분석이 뒤따른다. 항감작 올리고뉴클레오타이드는 만약 복용의존형태에서 그들이 CAT 활성을 억제할 수 있다면 양성효과를 가지는 것으로 간주된다.
[실시예 3]
항감작 올리고뉴클레오타이드에 의한 HPV E7 발현의 방해
HPV-16의 E7은 Ad·E2 프로모터를 트랜스액티베이팅시킬 수 있는 것으로 보인다 (W.C. 펠프스, C. L. 이, K. 멍거, 및 P. M. 하울리. 트랜스액티베이션을 엔코드하는 인간 PV l6형 E7 유전자와 아데노바이러스(Adenovirus) EIA와 유사한 형질전환기능들. Cel153 : 539-547). 이 활성을 감시하기 위하여 플라스미드는 Ad E2 프로모터(AdE2 CAT)의 조절하에 클로람페니콜 전이효소 유전자를 포함하도록 구축된다. 본 실험의 조건하에서 CAT 발현은 HPV E7의 발현에 의존한다. 이 실험용의 세포계(Cell line)은 SV 40초기 프로모터 조절하에서 HPV E7을 함유하는 것으로 발달하였다. 각각의 항감작 올리고뉴클레오타이드 세포를 위해 상기한 AdE2CAT의 감염과 CAT 활성분석이 뒤따른다.
[실시예 4]
항감작 올리고뉴클레오타이드에 의한 BPV-l E1 발현의 방해
BPV-1의 E1은 바이러스성 게놈복제의 조절자로 보인다. 바이러스성 복제에 대한 항감작 올리고뉴클레오타이드의 효과를 실험하기 위하여 BPV-1으로 감염된 C127 세포에 최종농도 5,15, 및 30μM에서 성장배지에 올리고뉴클레오타이드를 첨가하여 E1 특성 항감작 올리고뉴클레오타이드를 처리하였다. 올리고뉴클레오타이드의 효과는 전체 바이러스 RNA와 E1 특성 RNA 정량용의 노던 블랏(Northern Blot) 분석에 의하여 평가될 수 있다. 부가하여, 바이러스성 게놈복사본수에 관한 항감작 올리고뉴클레오타이드의 효과는 전체 게놈성 DNA에 관한 사우던 블랏(Southern Blot)에 의해 결정된다.
[실시예 5]
실험적으로 유도된 보바인 파이브로 파필로마(bovine Fivropapillomas)에 관한 BPV-1 항감작 올리고뉴클레오타이드 효능의 결정
다수의 보바인 파이브로 파필로마가 정제된 BPV-1을 송아지의 상피에 직접 감염시켜 유도된다. 발달함에 따라 시험관과 대조구에서 모두 양성으로 나타나는 올리고뉴클레오타이드 파이브로 파필로마를 처리한다. 파이브로 파필로마의 퇴행을 유도하는 항감작 올리고뉴클레오타이드는 양성으로 간주된다.
[실시예 6]
E2 mRNA에 상보되는 올리고뉴클레오타이드의 고안과 합성
항감작 올리고뉴클레오타이드는 간행된 뉴클레오타이드 시퀀스에 대한 바처럼 다양한 부위의 E2 mRNA에 상보적이고(E. Y. 첸, 하울리,A. D. 레빈슨, 및 P. H. 시버그, 1982, 보바인 파필로마 바이러스 1형 게놈의 유전적 구성과 초기 구조
Nature 299 : 529-534) 주요 E2 트랜스액티베이터 mRNA의 cDNA 구조와 상보적이다. (Y. C. 양, H. 오카야마, 및 P. M. 하울리, 1985, 다수의 형질전환 유전자를 포함하는 보바인 파필로마 바이러스. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 1030-1034). HPV-11 E2의 번역개시코돈을 목표로 하는 항감작 올리고뉴클레오타이드는 HPV-l1의 번역개시코돈을 목표로 하는 항감작 올리고뉴클레오타이드는 HPV-11 E2의 공개된 시퀀스에 기초되었다. (K. 다트만, E. 슈바르쯔, L. 기삼, 및 쮸어 하우젠. 1986, Virology 151 : 124-130). 고체상 올리고디옥시리보뉴클레오타이드 합성(Solid-phase oligodeoxyribo-nucleotide synteses)은 어플라이드 바이오시스템즈 380B 자동 DNA 합성기를 이용하여 수행되었다. 포스포티오에이트 올리고뉴클레오타이드를 위한 황화(sulfurization)은 아세토니트릴에 용해된 0.2M3H-1, 2-벤조디티올-3-원, 1, 1-다이옥사이드를 이용한 각각의 커플링후에 수행된다. (R. P. 아이어, L. R. 필립스, W. 에간, J. 레간, 및 S. L. 뷰커지,1990, 황전이 시약으로서의3H-1,2-벤조디티올-3-원 1, 1-다이옥사이드를 이용한 황을 함유한 올리고디옥시리보뉴클레오타이드의 자동합성, J. Org. Chem. 55 : 4693-4699). 완전한 황화(thioation)를 보증하기 위하여, 성장하는 올리고뉴클레오타이드는 각 황화과정 이후에 캡트(capped)된다. 합성기질로부터 분리, 방호제거 및 디트릴레이션(detrylation) 이후에 Nacl 외에서 두 배로 에틴올 침전되고 물속에서 현탁된다.
올리고뉴클레오타이드의 농도는 260nM에서 광학 밀도(optical density)에 의해 결정된다. 세포배양실험에 이용하기 위하여, 올리고뉴클레오타이드는 100μM 원료로 희석되고 사용할 때까지 80℃에서 저장한다. 준비된 올리고뉴클레오타이드의 정화, 보전 및 정량은 7M 요소겔 20% 아크닐아마이드에서의 전기영동에 의하여 결정된다.(40cm×20cm×0.75mm) 이는 마니아티스등의 기술을 따라 준비되었다. (T. 마니아티스, E. F. 프리츠, 및 J. 삼부록, Molecular Cloning ; A Laboratory Manual : Cold Spring Harbor Laborotory : 뉴욕,1982). 전기영동된 올리고뉴클레오타이드는 stains-all,1-에틸-2[3-(1-에틸나프톨[1,2,-d]-티아졸린-2-일리덴)-2-메틸-프로페닐[나프톨[1,2d]-티아졸리움 브로마이드를 시그마회사에서 구입하여 겔(gel) 속에서 염색하여 볼 수 있다. (A. E. 달버그, C. W. 딕면, A. C. 피콕, 1969, J. Mol. Bid. 41: 39)
[실시예 7]
E2 클로람페니콜 아세틸 전이효소(CAT) 레포터 플라스미드는 앞서 기술한 바와 같다.(B.A. 슈팔홀쯔, J. C. 번, P. M. 하울리, 1988, 보바인 파필로마바이러스 1형의 트랜스-레귤레이션과 E2 바인딩 위치의 협동성의 증거 J. Virol. 62 : 3143-3150). BPV-1의 E2 반응요소, E2REl(nt 7611-7806)은 올리고 뉴클레오티아디를 이용하여 재구성되고 SV40 확장자인 Sph1 절편이 결실된 PSV2CAT로 클론된다. 이 플라스미드로부터의 CAT을 발현은 E2 전체길이에 의존하는 것으로 보인다. 플라스미드는 C59는 시미안(Simian) 바이러스 40 프로모터와 확장자에서 발현된 E2 cDNA를 포함한다. (Y. C. 양, H. 오카야마 및 P. M. 하울리, 1985, 다중 형질전환 유전자들을 포함하는 보바인 파필로마바이러스, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 82 : 1030-1034). 두개의 HPV-11의 전체길이 E2 발현구조가 만들어진다. IPV 115는 파마시아(카탈로그 번호 27-4506)로부터 구입한 pMSG의 Smai 위치로 클론되는 HPV-11(nt2665-4988)의 XmnI를 포함하고, IPV118은 pSVL의 SmaI로 클론되는 같은 HPV-11 XmnI 절편을 포함한다. (파마시아, 카탈로그 번호 17-4509).
[실시예 8]
세포계 (Cell Lines)
마우스 C127 세포(I. 드보레츠키, R. 쇼버, 및 D. 로위,1980, 보바인 파필로마바이러스 1형용의 마우스세포의 실험에서의 초점, Virology l03 : 369-375)는 10% 치사보바인 혈청, 페니실린(100U/ml), 스트렙토마이신(100μg/ml), 및 L-글루타민(4mM)이 보장된 둘베코의 변경된 이글스 배지에서 성장된다. I-38 세포계는 순화된 BPV-1에 의해 형질전환된 C127 세포의 단일 전원(focus)로부터 유래되었다. (L. M. 카우서트, P. 레이크, 및 A. B. 젠슨, 1987, Topographical and conformational Epitopes of Bovine Papillomavirus type 1 Defined by Monoclonal Antibodies. JNCI 79 : 1053-1057).
[실시예 9]
E2 의존 트랜스액티베이션 실험의 올리고뉴클레오타이드 방해
E2 트랜스액티베이션이나 트랜스리프레션을 방해하는 올리고뉴클레오타이드의 능력을 시험하기 위하여, I-38 세포는 감염시키기 전에 24시간동안 60mm 페트리디쉬에 1×104세포/cm2으로 옮긴다. 전염시키기 16시간전에 배지는 흡기되고 적절한 농도에서 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 배지로 교체된다. 전염시키기 한시간전 배지는 흡기되고 올리고뉴클레오타이드가 없는 신선한 배지로 교체된다. 칼슘 포스페이트 침전방법에 의하여 전염되고(F. L. 그래험, 및 A. J. 반더엡, 1973, 인간의 아데노바이러스 5 DNA의 감염도를 실험하는 새로운 기법, Virology 52 : 456-461) 침전물 1ml에 총 20μg의 DNA가 사용된다. 각각의 60mm 디쉬는 4마이크로그람의 DNA를 포함하는 침전 200ml를 수용한다. 침전된 DNA의 첨가 4시간후 상징액(supernatnat)은 흡기되고 세포는 15% 글리세롤로 처리된다. (E. 프로스트, 및 J. 윌리암스, 1978 표지구출에 의한 아네노바이러스 5형의 숙주범위 돌연변이와 온도감지의 지도, Virology 91: 39-50). 세포를 씻은 후 원래 농도에서 올리고뉴클레오타이드를 포함한 배지를 되먹이고 48시간동안 인큐베이트한다.
몇가지 특정 구체예에 대해서만 앞에서 언급하였지만, 본 발명은 첨부한 청구범위에 의해서만 제한된다.
시퀀스 리스팅
(l) 일반적인 정보
(i) 출원인 : 티. 스탠리 크룩, 케이, 크리스트퍼 미라벨리, 제이, 데이비드 에커, 엠 렉스 코스워트
(ii) 발명의 명칭 : 파필로마바이러스(Papillomavirus)를 억제하는 항감작 올리고뉴클레오타이드
(iii) 시퀀스의 수 : 6
(iv) 통신구조
(A) 수신인 : 우드콕 워쉬번 쿠르쯔 맥키비스 노리스
(B) 스트리트 : 원 리버티 플레이스-46층
(C) 시 : 필라델피아
(D) 주 : 펜실바니아
(E) 국가 : 미합중국
(F) ZIP : 19103
(v) 컴퓨터 판독형태
(A) 미디움 타잎 : 3.5인치 디스켓,1 44Mb 저장
(B) 컴퓨터 : IBM PS/2
(C) 작동시스템 : PC-DOS
(D)소프트웨어 : 워드퍼팩트5.0
(vi) 출원자료
(A) 출원번호 : PCT/US90/07067
(B) 출원일 : 1990년 12월 3일
(C) 분류 :
(vii) 선출원자료
(A) 출원번호 :
(B) 출원일 :
(vii) 변리사/대리인
(A) 성명 : 제인 메시 리카타
(B) 등록번호 : 32,257
(C) 참고/명부번호 : ISIS-0033
(ix) 통신정보
(A) 전화 : (215) 568-3100
(B) 팩스 : (215) 568-3439
(2) 시퀀스ID NO : 1의 정보
(i) 시퀀스 특징
(A) 길이 : 15
(B) 타잎 : 핵산(nucleic acid)
(xi) 시퀀스 ID NO : 1의 기재
GCTTCCATCT TCCTC 15
(2) 시퀀스 ID NO : 2의 정보
(i) 시퀀스 특징
(A) 길이 : 15
(B) 타잎 : 핵산
xi) 시퀀스ID NO : 2의 기재
GCTTCCATCT TCCTCG 16
(2) 시퀀스 ID NO : 3의 정보
(i) 시퀀스 특징
(A) 길이 : 17
(B) 타잎 : 핵산
(xi) 시퀀스 ID NO : 3의 기재
TGCTTCCATC TTCCTCG 17
(2) 시퀀스 ID NO : 4의 정보
(i) 시퀀스 특징
(A) 길이 : 18
(B) 타잎 : 핵산
(xi) 시퀀스 ID NO : 4의 기재
TGCTTCCATC TTCCTCGT 18
(2) 시퀀스 ID NO : 5의 정보
(i) 시퀀스 특징
(A) 길이 : 19
(B) 타잎 : 핵산
(xi) 시퀀스 ID NO : 5의 기재
TTGCTTCCAT CTTCCTCGT l9
(2) 시퀀스 ID NO : 65의 정보
(i) 시퀀스 특징
(A) 길이 : 20
(B) 타잎 : 핵산
(xi) 시퀀스 ID NO : 6의 기재
TTGCTTCCAT CTTCCTCGTC 20

Claims (5)

  1. 하기 염기서열중 어느 하나로 구성되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 유사체 :
  2. 제1항의 염기로 구성되고, 파필로마바이러스의 E2 메신저 RNA와 혼성화 가능하여 상기 메신저 RNA의 기능을 억제하는 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 유사체를 시험관 내에서 또는 생체외에서 상기 파필로마바이러스의 메신저 RNA와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 파필로마바이러스의 발현을 조절하는 방법.
  3. 제1항의 염기로 구성되고, 파필로마바이러스의 E2 메신저 RNA와 혼성화 가능하여 상기 메신저 RNA의 기능을 억제하는 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 유사체와 인간을 제외한 동물을 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물의 파필로마바이러스 감염의 효과를 조절하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 E2 메신저 RNA가 파필로바이러스 RNA의 트랜스액티베이터 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 E2 메신저 RNA가 파필로마바이러스 RNA의 트랜스액티베이터 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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